Kémia | Biokémia » Gélelektroforézis elve, szérumfehérjék szétválasztása polikrilamid gélen, azonosítás immun-blot technikával

BIOKÉMIA I. – GYAKORLAT Gélelektroforézis elve. Szérumfehérjék szétválasztása polikrilamid gélen, azonosítás immun-blot technikával.  Western-blot technika          A gél szerepe hasonló ahhoz, mint amint az oszlopkromatográfiánál leírtunk. A lényeges különbség az, hogy itt a „futást” nem a gravitáció, hanem elektromos erőtér biztosítja. A vándorlás sebességét a molekulák fajlagos töltése (C/m) határozza meg. Ha a mintát SDS-t és merkaptoetanolt tartalmazó mintapufferrel futtatjuk, akkor az összes molekulának megközelítően azonos lesz a fajlagos töltése. A merkaptoetanol a hidrogénhidakat bontja, az SDS a molekulafelülettel arányos negatív töltést biztosít a molekulának. Így a vándorlás sebessége csak a molekula méretétől függ. Kisebb molekula gyorsabban vándorol. A vándorlás a negatív pólus

felől a pozitív pólus felé fog történni. Futtatás után a blottolás történik. Szendvicset készítünk, a negatív pólustól a pozitív felé: szűrőpapír  gél  nitrocellulóz membrán  szűrőpapír. Újabb elektromos tér hatására a már szétválasztott minta a géllel egyező pozícióban a NC lapra vándorol.  A nem antigén jellegű fehérjéket a NC-on indifferens fehérjével blokkoljuk.  A mintát antitesttel reagáltatjuk, majd azt egy jelzett (izotóp, vagy enzim) második antitesttel.  A detektálás történhet autoradiográfiás módszerrel, fluoreszcencia alapján, vagy egyszerűen festéssel. Ha a blottolás tökéletes volt, akkor a visszamaradt gélen nem tudunk fehérjét detektálni.   Az ismeretlen oldatot összehasonlíthatjuk az előtte lévő mintákkal, és azonosíthatjuk annak összetételét