Kémia | Biokémia » Tripszin amidolítikus aktivitásának mérése

BIOKÉMIA II. – GYAKORLAT Tripszin amidolítikus aktivitásának mérése  Tripszin    A pancreas exocrin funkciójának egyik terméke, mely inaktív proenzim (tripszinogén) formájában termelődik. A duodenumban lévő bázikus közegben limitált proteolízis segítségével aktiválódik (részben az intermedier π-kimotripszin autokatalízise révén). A duodenumban fejti ki proteáz aktivitását. Specificitása, hogy bázikus aminosavak (Lys; Arg) mellet hasítja a peptidkötést.  BAPNA     Arginin aminosavat tartalmazó, mesterségesen előállított kvázi peptidkötést hordozó vegyület. Benne az arginin karboxil- és a paranitroanilin aminocsoportja között van amidkötés, ami a peptidkötést modellezi. A paranitroanilin λ = 405 nm hullámhosszon abszorpciós maximumot mutat, ezen a hullámhosszon fotometrálható (ε = 8270 cm-1M-1; d = 1

cm). A BAPNA mesterséges szubsztrátja a tripszinnek, az enzim az amidkötést hidrolizálja  arginin és paranitroanilin keletkezik. A sztöchiometria 1:1  Lambert – Beer-törvény lg I0 = ε⋅d ⋅c I ΔOD = Δc ΔOD = A= Δt ε ⋅d  Minták   Δc ⋅ε ⋅ d Δt Vak: 1000 μl BAPNA Minta: 980 μl BAPNA + 20 μl tripszin  Mérés Inkubációs idő OD 0’ 0” 0,099 0’ 30” 0,149 1’ 0” 0,201 1’ 30” 0,254 2’ 0” 0,306 2’ 30” 0,358 3’ 0” 0,407 3’ 30” 0,455 4’ 0” 0,503 4’ 30” 0,549 5’ 0” 0,595 BIOKÉMIA II. – GYAKORLAT  Ábrázolás Δt = 1 min ΔOD = 0,101  Számítás A= 0,101 M = 1,221 ⋅ 10 −5 8270 ⋅ 1 min