Kémia | Tanulmányok, esszék » Aminosavak, peptidek, fehérjék

AMINOSAVAK, PEPTIDEK, FEHÉRJÉK Aminosavak szerkezete, fizikai, kémiai tulajdonságai, biokémiai szerepük. Konvenció szerinti rövidítések. Aminosavak szintézise A peptidkötés szerkezete Peptidszintézisek, védőcsoportok, kapcsolási eljárások, a szilárd fázisú technika. A fehérjék primer, szekunder, tercier, illetve kvaterner szerkezete. A Ramachandram diagram A fehérjék csoportosítsa és biokémiai szerepük. Aminosavak szerkezete Az aminosavak amino-, illetve karboxilcsoportot egyaránt tartalmazó vegyületek. Az aminocsoport helyzete alapján megkülönböztethetünk α-, β-, γ--aminosavakat. A köznapi nyelvhasználatban aminosavak alatt általában az α-aminosavakat értjük.  H3N   H3N COO   H3N COO  -alanin -aminovajsav COO glicin Az α-aminosavakban egy szénatom választja el egymástól a karboxil-, és az aminocsoportot. A glicint kivéve ezért minden α-aminosav királis A természetben általában

L-térállású aminosavak fordulnak elő. A természetes L-aminosavak a CIP szabály szerint többnyire (S)-térállásúak. Ez alól kivétel az L-cisztein, ami (R) Ennek oka, hogy a cisztein királis szénatomjához kapcsolódó CH2-SH a CIP nomenklatúra szerint magasabb rendű, mint a COOH. COO H3N H R R H3N -L-aminosavak CH2OH COO H3N COO (S) L-szerin CH2SH H3N (R) COO L-cisztein Sav-bázis tulajdonságok Az aminosavakban egyszerre van jelen egy savas jellegű (karboxil-), illetve bázikus jellegű (amino-) csoport, tehát sav-bázis tulajdonságaik tekintetében amfoterek. A molekula karboxilcsoport része általában elég erős sav ahhoz, hogy protonálja a molekula bázikus jellegű részét. Tehát a savas csoport pKa-ja kisebb a bázikus jellegű csoport pKa-jánál Emiatt az aminosavak jellemzően ikerionos (A–)(BH+) formában fordulnak elő. A karboxilcsoport deprotonált, azaz negatív töltésű az aminocsoport pedig protonált, azaz pozitív töltésű.

Ez azt jelenti, hogy bár a molekula össztöltése semleges, a benne található két molekularészlet pozitív, illetve negatív töltéssel rendelkezik. Ennek következtében az aminosavak ionrácsban kristályosodnak, illetve magas az olvadáspontjuk. Az aminosavak oldatban is ionos formában vannak jelen, azonban a molekulák protonáltsága pH függő. Savas környezetben mindkét funkciós csoport protonált formában van jelen. Így az aminosav össztöltése pozitív lesz, tehát az aminosav kationos (HA)(BH+) formában lesz jelen. Bázikus környezetben mindkét csoport deprotonálódik Az aminosav így negatív, anionos (A–)(B) formában lesz jelen. A két véglet között van egy olyan pH érték, amelyen az aminosavmolekulák össztöltése semleges. Ez az ikerionos (A–)(BH+) formára jellemző pH az aminosav izoelektromos pontja (pI). Ez nem feltétlenül pH 7-nél van, hiszen függ az aminosavak oldalláncától is. 1 Az aminosavak titrálási görbéjét

tekintve a fent leírtak jól látszanak. Alacsony pH-n az aminosav 100%-ban (HA)(BH+) formában van jelen. Az a pH, amelyen 50% a kationos, és 50% az ikerionos forma aránya, megegyezik a (HA) csoport pKa-értékével. Az izoelektromos pontnak megfelelő pH-n az aminosav össztöltése semleges, ikerionos formában van jelen. Az a pH, amelyen 50%-ban van jelen az ikerionos és az anionos forma, megegyezik a (BH+) csoport pKa értékével. Az alanin titrálási görbéje. Forrás: https://chem.libretextsorg Az aminosav protonáltságának leírása akkor bonyolultabb, ha az aminosav az oldalláncán is protikus csoportot tartalmaz. Példaként az amfoter oldalláncú hisztidint mutatjuk be. HN HN NH N N NH OH- N N H+ Stabil aromás kation Stabil aromás anion Biológiai funkciók Biológiai szempontból az α-aminosavaknak van a legnagyobb jelentősége, hiszen eukariótákban ezek alkotják a sejtműködés szempontjából kulcsfontosságú makromolekulákat, a

fehérjéket. Az eukarióta szervezetekben a glicinen kívül 19 fehérjeépítő L-α-aminosav fordul elő, melyeket oldalláncuk alapján csoportosíthatunk. Nemzetközi megállapodás alapján ezen aminosavakat nevükből képzett hárombetűs rövidítéssel jelölhetjük, bonyolultabb esetben egybetűs rövidítés is használható. Mindezt az alábbi ábra foglalja össze. A számunkra szükséges aminosavak egy részét szervezetünk képes előállítani, de vannak olyan aminosavak, melyeket táplálékkal kell bevinnünk. Az aminosavak fehérjeépítő szerepük mellett egyéb fontos funkciókat is elláthatnak. A glutaminsav, illetve a GABA (γ-aminovajsav) például egymással ellentétes hatású ingerület átvivő anyagok, a β-alanin pedig a koenzim-A alkotórésze. 2 H3N COO Q Név Kód pI Oldallánc (Q) Név Oldallánc (Q) pI Kód Poláris aprotikus oldalláncú aminosavak Szerin Ser (S) 5,68 -CH2OH Cisztein Cys (C) 5,05 -CH2SH Me Treonin Thr (T)

5,60 iPr Tirozin Tyr (Y) 5,64 Alifás oldalláncú aminosavak Glicin Gly (G) 6,06 -H Alanin Ala (A) 6,11 -CH3 Valin Val (V) 6,00 H3C H3C OH CH3 Leucin Leu (L) 6,01 HO H3C iBu CH3 Izoleucin Ile (I) 6,05 Prolin Pro (P) 6,30 CH3 sBu H3C Aszparagin Asn(N) 5,41 -CH2CONH2 Glutamin Gln (Q) 5,65 -CH2CH2CONH2 Metionin Met (M) -CH2CH2SCH3 5,74 Savas oldalláncú aminosavak N H2 COO (aminosav képlete) Aszparaginsav Asp (D) 2,85 -CH2COOH Glutaminsav Glu (E) -CH2CH2COOH 3,15 Bázikus oldalláncú aminosavak Aromás apoláris oldalláncú aminosavak Fenilalanin Phe (F) 5,49 Triptofán Trp (W) 5,89 -CH2Ph H N Lizin Lys (K) 9,60 -[CH2]4-NH2 Arginin Arg (R) 10,76 -[CH2]3-NH Bn HN NH2 Amfoter oldalláncú aminosavak Hisztidin His (H) H N 7,60 Bázikus N Savas N N Előállítás Az aminosavak kémiai szintézise azért fontos kérdés, mert a fehérjékből történő kinyerésük nem robosztus, viszont számos esetben nagy mennyiségű, tiszta

aminosavra lehet szükség (gyógyszeripar, élelmiszeripar, peptidszintézisek). Az alábbiakban a fontosabb módszereket vesszük át. 1. Aminocsoport beépítése a karbonsav α-helyzetébe A karbonsavból kiindulva formálisan az α-szénatomon lévő H-atomot cseréljük le aminocsoportra. Ez közvetlenül nem lehetséges, először halogénatomot kell beépítenünk Az α-szénatomra történő bróm beépítése például úgy lehetséges, hogy a karbonsavat reagáltatjuk tionil-kloriddal (SOCl2 savkloridot előállítva), majd brómmal (α-brómozott savklorid keletkezik), végül hidrolízissel kapjuk meg az α-brómozott savat (lásd: α-helyettesített savak előállítása). 3 A halogénezett savat például ammóniafeleslegben (a), alakíthatjuk tovább. Nagyon fontos, hogy ez esetben az ikerionos szerkezet keletkezése miatt lesz szelektív a reakció, a primer aminocsoport így nem tud tovább alkileződni. A Gabriel-szintézis alkalmazásakor észterből kell

kiindulnunk (a ftálimid-sót protonálná a sav), illetve a ftálimidet vissza kell nyernünk a reakció után, hogy növeljük a reakció atomhatékonyságát. E módszerrel elsősorban olyan aminosavakat tudunk előállítani, amelyekhez a kiindulási karbonsav (pl. ecetsav, propionsav, izovaleriánsav) rendelkezésre áll. ε-Kaprolaktámból kindulva az εaminocsoportot benzoil-kloriddal védve, ugyancsak a Gabriel-szintézist alkalmazva kaphatjuk a lizint. a) Ammóniafelesleggel Hlg R NH3 felesleg R H3N COOH COO Gly, Ala, Val b) Gabriel-szintézissel (ftálimiddel) R O N K Br O COOEt COOEt N DMF Melegítés O R H+/H2O H3N COOH R O 1. NH3 2. KOH Gly, Ala, Val COOH COOH NH 1. SOCl2 2. Cl2 3. EtOH 1. H+/H2O 2. PhCOCl/ KOH BzHN [CH2]4 COOH BzHN COOEt [CH2]4 O Cl O N K O H3N [CH2]4 COO NH3 H+/H2O BzHN [CH2]4 COOEt NFt Lys 2. Szénlánchosszabbítás és aminocsoport beépítés az aktivált ecetsav α-szénatomján Az előbbi módszernek az a

hátránya, hogy a megfelelő karbonsav kiindulási anyagnak rendelkezésre kell állnia, amely bonyolultabb oldalláncú aminosavaknál nem triviális. Karbonsavak α-szénatomjára nem tudunk közvetlenül szénatomot kapcsolni, erre alkalmas módszerek a korábban is tanult acetecetészter-, illetve malonészter-szintézisek. 4 COOH a) Acetecetészter szintézis R COOH R COOH NH2 R 1. NaOEt 2. RBr COOEt COOEt O O iBuONO R cc.H2SO4 O PhN2+ClNaOH 1. ccNaOH 2. H+ COOH R N NH Ph N COOEt O R O N COOEt N Ph R H2/Pd/C H2/Pd/C COOH N OH R COO NH3 Val, Leu, Ile, Phe Az acetecetészter-szintézis során elsőként az oldallánc beépítése történik meg, majd ezt követi az aminocsoport kialakítása. Ehhez pozitív töltésű nitrogéntartalmú reagenst kell alkalmazni, ami egyrészt lehet az izobutil-nitritből (iBuONO) savas közegben képződő NO(+), vagy másrészt a benzoldiazónium-klorid. A köztitermék nitrozo-, illetve diazenilszármazék az

erősen savas, illetve lúgos közegben spontán retro-Claisen reakcióval fragmentálódik. A keletkezett karbonsav-α-oximot, illetve -α-fenilhidrazont katalitikus redukcióval alakítjuk a kívánt végtermékké. A malonészter-szintézis során fordított sorrendet alkalmazunk, először történik a védett aminocsoport kialakítása, és ezt követi az oldallánc kiépítése. A savas közegű nitrozálással kialakított oxim katalitikus redukciója során ecetsav-anhidridet alkalmazunk, hogy a keletkező aminocsoportot in situ acetilezéssel védjük. Ezt követően az oldalláncot bázikus közegben alkilezéssel (RBr), aldehiddel (RCHO), vagy telítetlen savszármazékkal (pl. akrilnitril) történő reakcióval alakítjuk ki. A végterméket vagy savas hidrolízissel kapjuk, vagy további reakciólépések is szükségesek. Pl: A nitrilcsoportot katalitikusan redukáljuk, a keletkező amino-észter spontán laktámgyűrűvé záródik. A savas hidrolízissel kapott

ornitint ciánamiddal lehet a végtermék argininné alakítani. A malonészter-szintézist kombinálhatjuk a Gabriel-szintézissel is. Ez esetben a brómmalonésztert reagáltatjuk ftálimid-kálium-sóval. Ezt követően az oldalláncot bázikus közegben alkilezéssel (RBr), aldehiddel (RCHO), vagy telítetlen savszármazékkal (pl. akrilészter) történő reakcióval alakítjuk ki. A végtermékeket savas hidrolízissel kapjuk 5 COOH b) Malonészter szintézis H2N COOH R COOH NH2 1. NH2 beépítés nitrozálással NaNO2 EtOOC EtOOC COOEt HCl EtOOC COOEt COOEt NOH NO COOEt EtOOC Ac2O H2/Pt/C NHAc NaOEt AcHN COOH H3N H+/H2O O H2N ornitin CN COOEt Na Ni/H2 EtOOC N H CH2CHCN COOEt C NHAc NH2CN Bázis RCHO H3N COO H+/H2O COOH HO EtOOC H3N Arg R HN HN EtOOC OH CH2OOEt C NHAc 1. RBr 2. H+/H2O R COOEt C NHAc R COO NH3 NH2 Ser (R=H), Thr (R=Me) Val, Leu, Ile, Phe 2. NH2 beépítés ftálimiddel O EtOOC COOEt Br2 EtOOC CCl4 COOEt

COOEt N O Br COOEt O N K NaOEt O O O COOEt COOEt N C COOEt COOEt N C COOEt O O H+/H2O COOEt 1. RCHO 1. RBr 2. H+/H2O 2. H+/H2O H3N COOH H3N R Glu COOEt Na COOH Val, Leu, Ile, Phe OH R COO NH3 Ser (R=H), Thr (R=Me) 6 3. Addíciós reakciók Telítetlen karbonsavra közvetlenül addícionáltatható az ammónia (lásd: aszparaginsav előállítása). Számos esetben azonban az aminosav-szintézis köztitermékének kialakítását végzik addícióval. NH3 COOH COO HOOC HOOC HOBr COOH CHO HO MeSH Asp NH3 COOH 1. EtOH/H+ Br 2. Ftálimid-K 3. H+/H2O CHO MeS HO COO Thr NH3 Strecker-Zelinszkij NH4Cl/ KCN COO MeS NH3 Met 4. Strecker-Zelinszkij szintézis: amino- és karboxilcsoport one-pot kiépítése A StreckerZelinszkij-, vagy rövidebben csak Strecker-szintézis során oxovegyületeket reagáltatunk NH4Cl-dal és KCN-dal. A reagens valójában az in situ keletkező instabil NH4CN. Az enyhén savas pH (erősen savas pH-n HCN távozna a

reakcióelegyből) és az egyensúly eltolása érdekében ammónium-klorid felesleget kell alkalmazni. A köztitermék aminosav-nitril további sav hozzáadására könnyen hidrolizál, kialakítva ezzel az α-aminosav terméket. NH4Cl, KCN in situ: O X NH4CN NH3 + HCN NH2 NH2 X X CN aminosav-nitril H+/H2O NH3 Phe, Tyr X=H, OH X COOH 7 5. Azlakton szintézis: oldallánc beépítése a glicin α-szénatomjára A szintézis során a glicinre, mint a legegyszerűbb aminosavra aldehidek segítségével építjük be a megfelelő oldalláncot. Ehhez a glicin aminocsoportját védeni, az α-helyzetű CH2csoportot aktiválni kell A védést és aktiválást az aminocsoport benzoilezésével, és az Nbenzoilglicin (hippursav) ecetsav-anhidriddel, mint vízelvonószerrel történő gyűrűzárásával oldjuk meg. Azolakton gyűrűre kondenzáltathatóak aromás gyűrűt tartalmazó aldehidek O H2N BzHN COOH COOH PhCOCl NaOH O N Ac2O NaOAc RCHO NaOAc Ac2O R Phe/ Thr/

Trp/ His COO- 1. Na/ Hg/ KOH 2. H+/ H2O vagy 1. H2/Pt/C 2. H+/ H2O NH3+ O R N O 6. Rezolválás A fenti módszerek egyike sem alkalmas enantiomertiszta termékek előállítására. Ehhez a korábban előállított racém vegyületet rezolválni kell. Egy igen gyakori módszer a rezolválásra a diasztereomer sópár-képzés. Ez aminosavak esetén azért problémás, mert egyszerre tartalmaznak savas, illetve bázikus csoportot. Sóképzés előtt ezért védeni kell valamelyik csoportot, ha például az alanin esetén az aminocsoportot acilezéssel védjük, királis bázissal (sztrichnin, brucin) megoldható a rezolválás. H2N BzHN COOH COOH brucin BzHN COO PhCOCl NaOH csapadék (Bz-L-Ala-só oldatban marad) D,L-Ala sztrichnin +H3N brucin-H COO- H+/ H2O/ OH- H+/ H2O/ OH+H3N BzHN COO COO- sztrichnin-H csapadék (Bz-D-Ala-só oldatban marad) D-Ala L-Ala A rezolválás során a rosszabbul oldódó sót kiszűrjük az oldatból, és az átkristályosított

anyagból savas hidrolízissel kapjuk az enantiomer-tiszta terméket. 8 Peptidek, fehérjék Bevezetés A peptidek 2-50 aminosavegységből felépülő polimerek. Fehérjéknek az 50-nél több építőegységből felépülő polipeptideket (proteinek) és a nemcsak polipetid-típusú alkotórészeket tartalmazó komplex molekula-társulásokat nevezzük. Az aminosavak a karboxil- és az aminocsoportjaik révén peptidkötéssel kapcsolódnak össze. A peptidkötés a CO és az NH csoport között lévő kovalens (savamid) kötés. Nagyon fontos, hogy a C(O)NH szerkezeti rész egy síkban van. Ennek oka az, hogy a nitrogén nemkötő elektronpárja, valamint az oxigén π-elektronjai delokalizálódnak. Az N-terminális a peptid szabad aminocsoportja, a C-terminális a szabad karboxilcsoportja. A peptideket alkotó aminosavakat az N-terminálistól kezdve soroljuk fel Az alkotó aminosavaknak a hárombetűs kódját használjuk, hosszabb peptidek esetén pedig az egybetűs

kódokat. R1 N-terminális H N H3N O COO C-terminális R2 peptidkötés H C N O delokalizált elektronrendszer Peptidszintézisek A peptidek szintézise az alkotó aminosavak kapcsolásával történik. Az aminosavak azonban bifunkciós vegyületek. Két aminosav kapcsolásával tehát több termék is keletkezhet Ezért a leendő dipeptid N-terminális, valamint a C-terminális csoportját le kell védenünk, a kapcsolódó karboxil-csoportot pedig aktiválni kell. A védőcsoporttal szemben alapvető elvárás, hogy a mind a kiépítési, mind az eltávolítási reakció minél egyszerűbb legyen, illetve jó termeléssel menjen végbe. Q Lys Q Ala-Q Q-Leu N-terminálison védett as. C-terminálison védett as. Q-Leu-Ala-Q Dipeptid Q-Leu-Ala . Oldalláncon is védett as. NH2-védése A következő táblázat összefoglalja az aminocsoport védésére alkalmas reakciókat, illetve a védőcsoportok eltávolítását. 9 Név Kiépítés Eltávolítás Termék O O

Benziloxikarbonil-csoport (jele: Z) terc-Butoxikarbonil-csoport (jele:Boc) K2CO3 Z tBuOCON / 3 Et3N vagy (tBuOCO)2O/ KOH O Fluorenilmetoxikarbonil csoport (jele: FMOC) Cl Boc H N H N Cl O Pd/C/H2 FMOC H+ H N Me2NH Et3N O Ftaloil-csoport (jele:Ft) O Ft N MeNHNH2 H N Na/NH3 O Tozil-csoport (jele: Tos, vagy Ts) SO2Cl Piridin Tos COOH-védése Az alábbi táblázat ábra összefoglalja a karboxilcsoport védésére alkalmas reakciókat, illetve a védőcsoportok eltávolítását. Név Benzil-csoport (jele: Bn) Metil-csoport (jele: Me) Kiépítés Termék Eltávolítás COOBn OH Pd/C/H2 TosOH MeOH SOCl2 COOMe NaI 10 Uretán-típusú védőcsoportok kiépítése és eltávolítása: O R H3N Ph O COO Ph K2CO3 R O Ph O Cl O N H COOH H2/Pd/C peptid N H O kapcsolási reakciók R Ph R CO2 CH3 peptid H2N O O O R O kapcsolási reakciók R O O 2 H3N COO O KOH R O O N H TFA N H peptid H2N O O O O Cl O H R O

COO R CO2 peptid H H3N COOH kapcsolási reakciók R N H COOH Et3N O CO2 R O H N H peptid R Me2NH O peptid H2N O Ftaloil-védőcsoport kiépítése és eltávolítása O O R kapcsolási reakciók R H3N O N O COOH COO O O O R peptid N MeNHNH2 Me N H2N NH O O R peptid O O 11 Tozil-védőcsoport kiépítése és eltávolítása SO2Cl R H3N kapcsolási reakciók O O R S N COOH H Me COO Me Py O O R S N H Me SO2H H2N peptid Na/NH 3 O Me R peptid O Észter-típusú védőcsoportok kiépítése és eltávolítása: SO3H R H3N SO3 Me COO H3N Me PhCH2OH R Peptid H2/Pd/C Peptid O R H3N COOBn R OBn N H kapcsolási reakciók R MeOH H3N + PhMe O R SOCl2 COO OH N H kapcsolási reakciók COOMe Cl R Peptid N H R OMe O NaI Peptid N H O O Na + MeI Fontos megjegyezni, hogy az észterek aminocsoportjának mindig protonált formában kell lennie (pl.: tozilát-, klorid-só), az önkapcsolás elkerülése miatt Aktiválás A

karboxilcsoportot valamilyen erősebb acilezőszerré (pl.: savklorid, savazid, vegyes anhidrid) alakítjuk. 12 QHN COCl Savklorid R PCl5 MeOH/ SOCl2 QHN QHN COOH H2N-NH2 COOMe QHN R R CONHNH2 R NaNO2/ HCl O Cl OMe O QHN O QHN Savazid O OMe CON3 R Savanhidrid R Kapcsolás 1. Hagyományos módon Ez esetben a megfelelően védett és aktivált aminosavakat egyesével reagáltatjuk, a köztitermék peptideket pedig kipreparáljuk, Lineáris szintézis során az alkotó aminosavakat sorban kapcsoljuk hozzá az egy aminosavval rövidebb peptidre. Itt a hátrány, hogyha például egy lépésre 90%-os termelést feltételezünk, akkor az n aminosavból álló peptidre a végső termelés csupán 0,9n lesz. Konvergens szintézisnél külön-külön szintetizáljuk a peptidek nagyobb darabjait, majd ezeket kapcsoljuk össze. Ekkor a termelés magasabb lesz A QHN R2 O R1 H3N Cl O O Et3N QHN OR R1 R2 O N H OR y = 90% Konvergens szintézis A C E G B D F H

AB A ABCD CD EF Lineáris szintézis B AB C ABC D ABCD GH y=0,93 ABCDE F ABCDEFGH EFGH E ABCDEFGH H ABCDEFG G ABCDEF y=0,97 2. Leuchs-anhidriddel A Leuchs-anhidrid képzése során ugyanazzal a reagenssel a karboxilcsoportot aktiváljuk az aminocsoportot pedig védjük. Nagy előnye a hagyományos módszerhez képest, hogy a kapcsolás során a védő-aktiváló csoport szén-dioxidként távozik, nem kell tisztítani a köztes termékeket, ezért jobb termelés érhető el. Így kb 10 aminosav kapcsolható össze lineáris módon, amely 10 tagú fragmenseket konvergens szintézisstratégia alkalmazásával hagyományos úton kapcsoljuk össze hosszabb peptiddé. 13 O H3N COO R2 + R1 HN R2 Et3N O O Leuchs-anhidrid Et3N H3N COO R3 10-tagú peptidek szintézise Lineáris Leuchs-szintézis A B BA HGFEDCBA C CBA H D DCBA E G GFEDCBA J R1 EDCBA pep1 F pep2 FEDCBA pep3 H N O COO R1 pep2-pep1 peptid pep4-pep3 pep4 pep1 JIHGFEDCBA

N H R2 10-tagú peptidek kapcsolása Konvergens szintézis I IHGFEDCBA + CO2 O O O R2 H3N COO R3 HN OMe O O O Cl H N H3N hasonlóképpen pep2, pep3 és pep4 fragmens 3. Szilárd fázisú szintézis A módszer lényege, hogy a C-terminális aminosavat észter-kötéssel szilárd fázisú polimerhez kötjük. A soron következő, aminocsoportján védett aminosavat DCC-vel (diciklohexilkarbodiimid) együtt adagoljuk. A DCC in situ aktiválószerként működik, vegyes anhidridet képez az aminosavval. A kapcsolási lépés után az N-védőcsoportot eltávolítjuk, majd a következő aminocsoportján védett aminosavat kapcsoljuk a polimeren növekedő peptidlánchoz. A végén HF-dal hasítjuk le a termék peptidet a szilárd fázisról R2 Cl N C N BOC DCC R2 R1 H3N BOC Et3N COO N H O N R1 NH2 HF . N H H N BOC R2 TFA R1 COOH O DCC O N H O H H N C N O DCU R3 BOC Termék in situ aktiválás O O F COOH HN O R2 O N H O O N H NH2 R2 14 A

módszer előnye, hogy folytonos-átfolyásos üzemű csőreaktorban automatizálható; a reagensek feleslege, illetve a melléktermékek az szilárd fázisról könnyen lemoshatóak; illetve a reagensoldat recirkuláltatásával a konverzió nagy reagensfelesleg alkalmazása nélkül is növelhető. Így az egyes kapcsolások során közel 100%-os termelés érhető el Ezzel az eljárással 100-nál több aminosavból álló peptidlánc is szintetizálható. 4. Bioszintézis Teljes fehérjemolekulák legújabb szintézismódszere az itt részleteiben nem ismertetett bioszintézis. Ehhez először a fehérje aminosav-sorrendjét kódoló m-RNS-t állítják elő szilárdfázisú szintézis alkalmazásával, majd a kész m-RNS-t megfelelő baktériumsejtbe juttatva szintetizáltatják a fehérjét. Oldalláncok védése Egyes esetekben a szelektivitás megőrzése érdekében szükség lehet az oldalláncon lévő funkciós csoportok védésére is. Az alábbi ábra a védőcsoportok

kiépítését, illetve eltávolítását mutatja be. Cisztein Q NH OOC Q NH Na SH kapcsolási reakciók BnCl OOC S Bn BnCl Q NH R pep S Bn Na pep NH3 SH Szerin / Treonin Q NH R OOC OH BnOOC kapcsolási reakciók Q NH OH H BnOOC TFA R R H2/Pd/C OtBu Q NH R OOC OtBu R pep pep OtBu vagy HF OH Arginin Q NH 3 OOC NH2 HN HNO3 Q NH H2SO4 OOC NH Lizin H2N H3N CuSO4 OOC NH2 kapcsolási reakciók pep Z HN O 4 O H2N O O Cu NH2 4 O2N NH 3 HN NH BnO Cl NaHCO3 4 O2N H2/Pt/C pep NH 3 3 HN HN NH NH2 NH O H2N O O Cu NH2 H2S H3N 4 OOC HN Z O O 4 4 HN Z H2N kapcsolási reakciók pep 4 HN Z H2/Pd/C pep 4 NH2 15 Aszparaginsav / Glutaminsav HOOC H3N CuSO4 COOH n=1,2 O BnI H2N O O Cu NH2 n OOC BnOOC n n O H2N O O Cu NH2 NaHCO3 H2S H3N n OOC COOBn O O n n BnOOC HOOC kapcsolási reakciók pep n H2/Pd/C COOBn pep n COOH A fehérjék szerkezete A fehérjék primer (elsődleges) szerkezete

az aminosav-sorrendjük. A DNS a primer szerkezetet kódolja, és az aminosav-sorrend megszabja a fehérje további szerkezeti tulajdonságait is. A primer szerkezet meghatározása hagyományosan a peptid teljes hidrolízisével történhet. A leggyakrabban alkalmazott módszer az itt részletesen nem ismertetett Edman-lebontás. Ennek során az N-terminális aminosav felől egyesével lehasítjuk és azonosítjuk az aminosavakat (maximum 50 aminosav-egységig alkalmazható). Az ennél több aminosavból felépülő fehérjéket először rövidebb peptidekre kell bontani, ehhez az egyes peptidkötéseket szelektíven kell elhasítani kémiai, vagy enzimatikus módszerekkel. Az egyes aminosavak azonosítására hatékonyan használható fel a HPLC-MS analitika. Újabban bioinformatikai módszerekkel, a kódoló génszakaszok bázissorrendjéből határozzák meg a fehérjék aminosav-szekvenciáit. A fehérjék szekunder (másodlagos) szerkezetén a fehérjemolekula peptidgerincének,

a peptidkötések között létrejövő hidrogénkötések által stabilizált, lokális konformációját értjük. A legfontosabb szekunder szerkezeti elemek a periodikus szerkezetű hélix, és redő, illetve az aperiodikus kanyar és hurok. Az α-hélix egy 18 egységenként ismétlődő jobb- (αR) vagy ritkábban balmenetes (αL) spirál alakú szerkezeti rész. A szerkezetet a spirálban egymás felett helyet foglaló peptidkötések közt kialakuló intramolekuláris H-hidak stabilizálják. Ugyancsak helikális, de eltérő menetemelkedésű szerkezet a π-hélix. 16 A β-redő két, vagy több egymással párhuzamosan futó (azonos, vagy különböző peptidmolekulához tartozó) peptidlánc részvételével létrejövő redőzött lemezszerű szerkezet, amelyet ugyancsak a peptidkötések között létrejövő intra- vagy intermolekuláris H-hidak stabilizálnak. β-paralell szerkezet esetén a peptidláncok azonos, míg a β-antiparalell szerkezet esetén ellentétes

irányúak. A másodlagos szerkezetet a sík szerkezetű (a karbonil szénatom és az amid nitrogénatom is sp2-es hibridállapotú) peptidkötések egymáshoz képesti elfordulásával jellemezhetjük. Hat-hat atom van egy síkban, mely síkok az sp3-as hibridállapotú α-szénatom (Cα) kötései körül elfordulhatnak. A rotáció mindkét irányban megengedett, ellenben a rotációt az oldalláncok korlátozzák. Emiatt minél hosszabb a peptidlánc, annál inkább rögzítettebb a jellemző konformáció. A Cα atom körüli rotációkat a ψ (karbonil C-atom felé) és ϕ (amid N-atom felé) torziós szögekkel jellemezhetjük. A fehérjékben jellemzően előforduló torziós szögek ábrázolására alkalmas a Ramachandram-diagram. Az alábbi ábrán jól látszik, hogy számos konformáció nem előnyös, így a diagramon üres tartományok is találhatóak. Az előzőekben ismertetett periodikus szerkezetek jellemző torziós szögtartományai:  αR-hélix: ϕ < 0°,

–60° < ψ < 0°  αL-hélix: ϕ > 0°, 60° > ψ > 0°  π-hélix: ϕ < 0°, ψ ~ –60°  β-redő: ϕ < 0°, ψ > 60° A tercier (harmadlagos) szerkezet a fehérjemolekula oldalláncok helyzetét is tartalmazó tényleges térbeli elrendeződése, melyet az oldalláncok közötti diszulfid- és Hhidak, van der Waals kölcsönhatások és Coulomb erők tartanak össze. Megkülönböztetünk globuláris, illetve fibrilláris fehérjéket. A globuláris tercier struktúrájú fehérje (pl: enzimek) minden irányban kb. azonos kiterjedésűek A fibrilláris fehérjék (pl: α-keratin) a tér egyik irányában nagyobb kiterjedésűek, mint a másik kettő irányban. 17 A kvaterner (negyedleges) szerkezeten több protein és esetleg nem peptidtípusú alkotórész (prosztetikus csoport, koenzim) részvételével kialakuló diszulfid- és H-hidak, van der Waals kölcsönhatások és Coulomb erők által összetartott komplex szerkezeteket értjük. A

hemoglobin pl. négy proteinből és négy hem prosztetikus csoportból létrejövő fehérje A fehérjék biológiai funkciói, csoportosítása A fehérjék a 20 féle fehérjealkotó α-L-aminosavból felépülő makromolekulák. A fehérjék csoportosítása többek közt történhet funkciójuk szerint, vízoldhatóságuk szerint (pl: az albumin vízoldható), stb. Összetétel szerint megkülönböztetünk proteineket (csak aminosavból épül fel), valamint proteideket (aminosavakon kívül egyéb szerkezeti elemeket is tartalmaz). Számos létfontosságú sejtfunkció köthető fehérjékhez, ezek közül néhányat alább sorolunk fel.        Biokatalizátorok: az enzimek szerepe a sejtekben lejátszódó folyamatok aktiválási energiájának csökkentése. Szűk pH és hőmérséklettartományban működnek. Szubsztrát-, kemo-, regio- és sztereoszelektivitás jellemző rájuk Vázanyagok: pl. a miozin az izmokban fordul elő; a kollagén a bőr és a

csontok mátrixa; az α-keratin a haj és a gyapjú jellemző fehérjéje. Az immunrendszer működésében vesznek részt: az immunoglobulinok antigének (idegen fehérjék) megjelenésekor termelődnek. Jellegzetes Y alakjuk van. A rövidebb szál felel a felismerésért, a hosszabb szál a makrofágokhoz (nagy falósejt) kapcsolódik, amelyek az idegentestek (vírusok, baktériumok, rákos sejtek, stb.) lebontását végzik Információ átvitelben vesznek részt: pl: a rodopszin a látás során. A szabályozásban vesznek részt: pl. az agyalapi mirigyben termelt hormonok Tápanyagforrások: pl. a növényi magvak és a tojások fehérjéi Anyagtranszportban vesznek részt: pl. a hemoglobin az O2/CO2 transzport fehérjéje. A hemoglobinban helyet foglaló négy porfinvázas prosztetikus csoport egy-egy O2/CO2 molekula szállítására képes. A porfinvázas hem szerkezete 18