Kémia | Biokémia » Ureáz enzim vizsgálata

Ureáz enzim vizsgálata  Alapfogalmak  Enzimek: leggyakrabban fehérjék, de egyes RNS-ekről is kimutatták a katalítikus tulajdonságot. Működésük lényege az E a csökkentése Az enzimek legtöbbje igen specifikus, ami csak adott szubsztrát megkötését, és csak adott kémiai reakció katalízisét jelenti.  Inkubálás: az az időszak, amíg az enzim reakció folyamata tart. Ehhez biztosítani kell a megfelelő körülményeket (pH  puffer; hőmérséklet  T max alatt legyen és a vizsgált időintervallum alatt állandó; ionerősség  szükséges ionok a kellő koncentrációban legyenek jelen; kiindulási szubsztrátkoncentráció  legalább tíz nagyságrenddel nagyobb mennyiségben, mint az enzim).  Szénsav amidjai: ha a szénsav egyik –OH csoportját helyettesítjük -NH 2 csoporttal, akkor a karbaminsavhoz jutunk, ha mindkettőt, akkor az ureához, és ha az =O-t is =NH-val, akkor a guanidinhez, ami a szénsav imidje.  Urea: a

vizeletben található, AS-ak –NH 2 csoportjának bomlásterméke.  Ureáz: egy hidroláz típusú enzim, ami az ureát (karbamidot) lebontó enzim. Működése hidrolízissel történik. SH-enzim, ami azt jelenti, hogy sok olyan tiol csoportja van, amely nem vesz részt diszulfid híd kialakításában, ezenkívül a katalitikus hely kialakításában is fontos szerepük van. A reakció: urea + H 2 O ↔ 2NH 3 + CO 2 .  DTNB: más néven Elmann-reagens, irreverzibilis reakcióban az ureáz aktivitásához elengedhetetlen tiol csoportot, tehát az enzim reakciót leállítja.  PCMB: para-kloro-merkuri-benzoát. Az enzim tiol csoportjaival reverzibilis reakcióba lép: a beonzát (benzolgyűrűn az 1-es helyen egy COO- csoport) para helyzetű HgCl-járól a Cl leválva HCl-ot képez míg az SH-csoport H-jével, míg a S a para helyzetű Hg-hoz kapcsolódik.  Merkaptoetanol: HS-CH 2 -CH 2 OH; tiol, tehát SH-csoporttal rendelkezik. A PCMB enzimmérgező hatását

felfüggeszteni képe úgy, hogy saját SH-csoportjaival megköti azokat.  Guanidin: az ureáz enzim szubsztrátanalógja, az enzim aktivitását gátolja, és ezt a gátlást az ureakoncentráció emelésével vissza lehet szorítani. (Kompetitív gátlásra jellemző sajátosság.)  Bertheloth-reakció és fotometrálás  Kivitelezéséhez két oldatot használunk: „A”-oldat: 10 g fenol és 50 mg nátriumnitroprusszid 1000 ml vízben oldva „B”-oldat: 67,3 g Na 2 HPO 4 × 2 H 2 O, 10 g NaOH és 10 ml NaOCl („Hypo”) 1000 ml vízben feloldva  A színreagens a két oldat hozzáadásával jön létre a kémcsőben. Az 1 ml inkubált elegyhez 4 ml „A”-oldatot és 4 ml „B”-oldatot adunk, majd alapos rázás és 30 perc várakozás után 625 nm hullámhosszon fotometráljuk az oldatot. A kék elegy optikai denzitása arányos az ammónia (produktum) koncentrációval.  Enzimaktivitás időfüggése két szubsztrát illetve enzimkoncentrációnál

 Oldatsorozat: A 1,2 1,0 ml 50 l 100 l 7,5 perc 1% EDTA (pH 6,5) 10 mM urea 1 mM urea ureáz 1:50 inkubálási idő  Vakminta: 1) 1% EDTA (pH 6,5) 2) ureáz 1:50 3) 5 mM PCMB 4) 10 mM urea 5) „A”-reagens 6) „B”-reagens  1,0 ml 100 l 100 l 50 l 4 ml 4 ml 1.) Indítás (enzimoldat hozzáadása)  A 1  30”  A 2  1’  A 3  1’30”  A 4  2’  B 1  2’30”  B 2  3’  B 3  3’30”  B 4  4’ A 3,4 1,0 ml 50 l 100 l 7,5 perc B 1,2 1,0 ml 50 l 100 l 15 perc B 3,4 1,0 ml 50 l 100 l 15 perc  2.) Leállítás (5 mM PCMB 100 l hozzáadása)  A 1  8’  A 2  8’30”  A 3  9’  A 4  9’30”  B 1  17’30”  B 2  18’  B 3  18’30”  B 4  19’  3.) Színreagensek hozzáadása (4 ml „A”-, és 4 ml „B”-oldat bürettából, a leállítás után 3 perccel)  A 1  11’  A 2  11’30”  A 3 

12’  A 4  12’30”  B 1  20’30”  B 2  21’  B 3  21’30”  B 4  22’  4.) 30 perc várakozás után 625 nm-en fotometria a vakmintával szemben  5.) Az extinkció értékeket az inkubációs idő függvényében ábrázoljuk milliméterpapíron.  Szubsztrátkoncentráció hatása az enzimaktivitásra  1.) Ureáz telítési görbéjének meghatározásához hígítási sorozatot készítünk: vak 1,1 2,2 3,3 4,4 5,5 6,6 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 1% EDTA ml ml ml ml ml ml ml (pH 6,5) 5,0 mM urea 50 l 7,5 mM urea 50 l 10,0 mM urea 50 l 15,0 mM urea 50 l 20,0 mM urea 50 l 30,0 mM urea 50 l ureázkivonat (1:100) 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l urea0,25 0,375 0,5 0,75 1,0 1,5 végkoncentrációk 0,0 (mM) 15 15 15 15 15 15 15 inkubálási idő perc perc perc perc perc perc perc  2.) Leállítás (5 mM PCMB 100 l hozzáadása)  3.) Színreakció (4 ml „A”-

és 4 ml „B”-oldat hozzáadása bürettából)  4.) 30 perc várakozás után fotometria 625 nm-en a vakmintával szemben  5.) Subsztráttelítési görbe megszerkeztése  6.) Kettős reciprok ábrázolás után grafikus K M és V max meghatározás, az 1 1  O.D v egyenlet felhasználásával.  Ureáz enzimaktivitás gátlása szubsztrátanalógokkal és SH-reagenssel.  1.) Hígítási sorozat 1% EDTA (pH 6,5) 10 mM urea 20 mM urea 200 mM guanidin 0,1 mM PCMB 4 mM merkaptoetanol ureázkivonat (1:50) inkubálási idő vak 1,1 2,2 3,3 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 100 l 100 l 100 l 100 l 15 perc 15 perc 15 perc 15 perc 4,4 1,0 ml 50 l 100 l 100 l 15 perc 5,5 1,0 ml 50 l 100 l 50 l 100 l 15 perc  2.) Leállítás (5 mM PCMB 100 l hozzáadása) majd 3 perc várakozás  3.) Színreagensek hozzáadása (4 ml „A”- és 4 ml „B”-oldat bürettából) majd 30 perc

várakozás  4.) Szabad szemmel megfigyelés (az ureáz színreakció intenzitásából):  enzimgátlás  kompetitív inhibítor hatását  SH-csoporttal reagáló PCMB hatását  guanidin hatását az urea felfüggeszti  PCMB hatását a merkaptoetanol felfüggeszti