Biológia | Tanulmányok, esszék » Gyulai-Bittsánszky-Malone - Transzgénikus nyárfák alkalmazása a fitoremediációban

Zöld Biotechnológia (ed. Dudits D) 8/3-4:9-13 & 8/5-6:9-14 (2012) Transzgénikus nyárfák (35S-gshI-11ggs és 35S-rbcS-gshI-6lgl) alkalmazása a fitoremediációban Gyulai Gábor1, Bittsánszky András2, Malone P. Renee3, Gullner Gábor2, Kőmíves Tamás2 1SZIE MKK GBI Gödöllő; 2MTA ATK NÖVI Budapest, 3DIT Dublin e-mail: gyulai.gabor@mkksziehu; bittsanszkyandras@agrarmtahu; reneemalone@DITie; gullnergabor@agrarmtahu; komives.tamas@agrarmtahu 1. Összefoglalás A transzgénikus növénynemesítésnek kiemelt szerepe van a fák mindkét nagy csoportjában, a tűlevelű nyitvatermőkben és a zárvatermő lombos fákban (ez utóbbin belül az erdei és gyümölcsfákban). Az erdei nyitva- és zárvatermő fákban elsősorban a fa mennyiségi és minőségi javítására, a gyors növekedésre és ellenállóságra való nemesítés a cél. A gyümölcsfák esetében az (a)biotikus stresszt tűrő képesség és a termés mennyiségének, minőségének és beltartalmi

értékeinek a növelése, valamint az évekkel előrehozott virágzás indukciója a fő cél. A fák hosszú életideje megnehezíti ezeknek a céloknak az elérését, de a gyors növekedésű fákban (pl. a nyárfák) sok előrehaladás történt Írásunk bevezető részében áttekintjük a fás növények nemesítésének evolúciós lehetőségeit, főbb csoportjait és tulajdonságait, majd összefoglaljuk a legfontosabb transzgénikus nyárfa kísérleteket, és beszámolunk a 35S-gshI transzgénikus szürke nyárban (Populus x canescens) elért eredményeinkről. 2. Bevezetés A virágos növények evolúciójában nem az ’egyszerűbb’ lágyszárú, egy/kétéves növények jelentek meg először, hanem a hosszú életidejű, évelő, ’bonyolultabb’ fás növények: a fák. Ezért nem a lágyszárú, hanem a fás életforma az ősibb (’fejletlenebb’), de ’sikeresebb’, az életidő (ld. több ezer évig élő fenyők) és a nagyság (ld. mamutfenyő)

értelmében Mind a három ’leg’-növény nyitvatermő fa É-amerikai géncentrummal: a Föld legnagyobb tömegű növénye az óriás mamutfenyő (Sequoiadendron giganteum), a legmagasabb növénye a tengerparti mamutfenyő (Sequoia sempervirens) és a legtovább élő növénye a szálkásfenyő (Pinus longaeva) (a legöregebb élő példánya ma 4789 éves) (1. ábra) A nyitvatermőknek (pl fenyők) minden faja fa (nincs ’lágyszárú, egynyári nyitvatermő’). A fás növényeken belül a nyitvatermő ’tűlevelű’ fák (nem minden nyitvatermőnek tű alakú a levele) ősibbek a zárvatermő lombos fáknál. A nyitvatermők fák fajszámban (Gingko 1 faj, Gnetumok 66 faj, Szágópálmák 185 faj, Fenyők - Coniferales 556 faj; összesen cca. 750 faj) elmaradnak a 250000-es fajszámú zárvatermőktől. Fajdiverzitásban a nyitvatermők talán ’nem használták ki’ a megjelenésük óta eltelt 350 millió évet, szemben a zárvatermők 150 millió éves

fejlődésével. Igaz, a legkorábban megjelent podokarpuszok 169 faja és az 50 millió évvel később (200 millió évvel ezelőtt) megjelent fenyők (Pinaceae) 191 faja igen diverz fajkialakulást jelez. 1 (A) (B) (C) 1. ábra A három ősi mamutfenyő törzse, levélzete és toboza. (A) az óriás mamutfenyő (Sequoiadendron giganteum) egy példánya, és 40 éves telepítése a gödöllői Arborétumban (fotó: Krassay L. 2011); (B) az elágazásra hajlamos tengerparti mamutfenyő (Sequoia sempervirens); és (C) az ősi kínai mamutfenyő (Metasequoia glyptrostroboides) (fotó: Gyulai Zs. G, Freiburg, 2010) Genetikai értelemben a nyitvatermők további két „leg”-tulajdonságban is közel állnak az elsőséghez. A Pinusok hatalmas genomméretét (20 x 109 DNS bp) csak néhány liliom múlja felül (40 x 109 DNS bp), összehasonlítva a búza (16 x 109 DNS bp; 2n=6x=42), az ember (3,6 x 109 DNS bp; 2n=2x=46) és a nyárfa igen kis (0,55x109 bp; 2n=4x=38)

genomméretével (2. ábra) 9 A genomok mérete (x10 DNS bp) és kromoszómaszámuk (2n) 9 x 10 bp 25 46 20 20 42 40 38 42 15 16 24 11 20 14 zs (6 x) 8 ro pa ár ád rn cu ko be r 3,2 em ric a k 2,7 ku ko ar s as zm yp o ch riz d. di um pe ro O 0,5 14 5 3,6 Br a (P op fa tiu ul us ) ) us (P in ny ár ők m 0 Fe ny 0,4 0,3 uh 0,2 0,8 ci ro 10 ol 0,5 bú za 5 (6 x) 20 18 b 20 za 24 10 2n = 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 2. ábra A genom mérete és kromoszómaszáma. Nyitvatermő (Pinus) és zárvatermő (Populus) fák összehasonlítása a zárvatermő egy- és kétszikűekkel, valamint az emberi genommal. Sejtszervek (kloroplasztisz és mitokondrium) A teljes kloroplasztisz genom (cpDNS) méretében is az egyik nyitvatermő cikászpálma (Cycas taitungensis) felülmúlja (163.403 bp; #NC009618) a zárvatermő fákat (3 ábra) Igaz, a Cathaya argyrophylla fenyő (csak 1955- 2 ben írták le) kloroplasztisza az

egyik legkisebb méretű (107.122 bp; #NC014589), amelyet már csak az élősködő növények (pl. aranka) génvesztett kloroplasztisz méretei múlnak alul (Cuscuta obtusiflora) (85286 bp; NC009949) 11 4,91 4 1 09 ,5 18 1 1 6,1 0 4 1 1 7,7 2 6 11 6 ,47 0 1 19 ,7 26 11 9,29 9 12 1 ,02 0 1 21 ,0 24 13 4 ,49 6 1 33 ,3 09 13 4 ,52 5 1 3 6,4 6 2 13 4 ,54 5 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 7 0,0 2 8 8 5,2 8 6 100000 7 3,3 4 5 1 07 ,1 22 8 1 5 6,5 0 5 7 15 4 ,47 8 6 1 57 ,7 90 5 15 7 ,03 3 4 15 9,88 6 3 15 8 ,48 4 2 1 6 0,8 6 6 1 6 0,9 2 8 1 1 59 ,9 30 1 61 ,7 91 125000 1 63 ,4 03 cp D N S (b p ) 150000 16 2 ,68 6 14 3 ,17 1 175000 1 40 ,3 84 200000 75000 50000 0 3. ábra A kloroplasztisz genom (cpDNS) méretei. A nyitvatermő (Pinus) és zárvatermő (Populus) fák összehasonlítása a zárvatermő egyés kétszikűekkel (1) Cycas taitungensis NC009618 (2) Amborella trichopoda NC005086 (3) Platanus

occidentalis NC 008335 (4) Vitis vinifera NC007957. (5) Nuphar advena NC008788 (6) Nymphaea alba NC006050 (7) Liriodendron tulipifera NC008326 (8) Morus indica NC008359. (9) Prunus persica NC014697 (10) Populus trichocarpa NC009143 (11) Populus alba NC008235 (12) Arabidopsis thaliana NC000932. (13) Euglena gracilis NC001603 (14) Zea mays NC001666 (15) Hordeum vulgare NC008590 (16) Triticum aestivum NC002762. (17) Oryza sativa Japonica NC001320 (18) Oryza sativa Indica NC008155 (19) Equisetum arvense NC014699 (20) Marchantia polymorpha NC001319. (21) Lathyrus sativus NC014063 (22) Welwitschia mirabilis NC010654 (23) Cedrus deodara NC014575. (24) Pinus longaeva NC011157 (25) Durinskia baltica NC014287 (26) Pinus monophylla NC011158 (27) Gnetum parvifolium NC011942. (28) Ephedra equisetina NC011954 (29) Cathaya argyrophylla NC014589 (1955) (30) Cuscuta obtusiflora NC009949. (31) Euglena longa NC002652 (32) Epifagus virginiana NC001568 Cucumis melo: 156017 bp cpDNA (NC015983) A cpDNS

méretében a Floydiella terrestris zöldmoszat hatalmas kloroplasztisz-DNS-e a máig legnagyobb szekvenált cpDNS-minta (521.168 bp; #GU1962681) A mitokondrium genom méretére néhány adat: az apró genomú emberi (Homo s.) mtDNS 16569 bp hosszú (#NC012920), összehasonlítva a növényi mtDNS méreteivel: pl. a lúdfű (Arabidopsis th; 366924 bp; #NC001284), szágópálma (Cycas taitungensis, 414.904 bp; #NC010303), szőlő (Vitis v, 773279 bp; NC012119) és a sárgadinnye (Cucumis melo) eddig legnagyobb, óriásméretű mtDNS-ével (2.900000 bp) A fák evolúciója Az első és legősibb zárvatermő lombos fa (Amborella trichopoda) közel 140 millió ével ezelőtt jelent meg és ma is él az Új Kaledóniai szigeteken. Alacsony kétlaki kisméretű fa, amely egyivarú virágainak felépítésében már zárvatermő, de a fatörzs szerkezetében még nyitvatermő, mert fatestében csak vízszállító fasejtek (tracheidák) vannak, mint minden nyitvatermő (fenyőféle) fában.

A kétlakiság is ősi bélyegnek tekinthető, mert a nyitvatermők között az ősi Ginkgo és a Cikászok is kétlakiak. A Gnetumok és a fenyők ’már’ egylakiak (igaz a legősibb nyitvatermő, a fenyők közé tartozó Podokarpuszok egylakiak). A nyitvatermőkben nem alakult ’még’ ki kétivarú virág Az evolúcióban ’fejlettebb’ zárvatermő lombos fa törzsében, az egymás fölötti fasejtek (tracheida) egybenyílásából kialakultak a facsövek (tracheák) (130 - 140 millió évvel ezelőtt) és jelen vannak minden zárvatermő lombos fában. Ha figyelembe vesszük a három fenti nyitvatermő ’leg’-fafajt, a fatestnek ez a ’fejlődése’ nem lett ’sikeresebb’ (viszont ez tehette lehetővé a gyümölcsfák gyümölcsének megjelenését a tobozok helyett). A lombosfák evolúciós kirajzása az alig száz ősi kétszikű ’ANITA’ faj (basal dicots) megjelenésével kezdődött: ezek a fás Amborella (Új Kaledónia, 1 faj) mellett a lágyszárú

Nymphaea (tündérózsa, vizitök, stb; Euramerika; 50 faj); a 3 fás, örökzöld Illicium (pl. csillagánizs; Ázsia, Amerika; 42 fafaj), a fás Trimenia (Ausztrália, 8 faj) és a szintén fás, kúszó lián Austrobaileya (Ausztrália, 2 faj) fajai. Az ősi kétszikűeket követték a valódi kétszikűek (eudicots), közöttük a legtöbb fafajt (250) magába foglaló pillangós családot (Fabaceae), és a Rosaceae család legjelentősebb gyümölcsfáit (alma, körte, barack, szilva stb.) A pillangósok családja (Fabaceae) azért is nevezetes, mert az Astragalus (Csüdfüvek) nemzetsége a legnagyobb fajszámú (2.500 faj) növénynemzetség Csak két növényrendben (Gunnerales, Geraniales) nem alakult (még) ki fa. Vízfelvétel, gyors növekedés, aquaporin gének A növények gyors növekedése, ezzel fitoremediációs kapacitása, attól függ, hogy milyen intenzíven és hatékonyan tudják felvenni a vizet és a benne oldott tápelemeket. A vízfelvétel genetikai

szabályozása elsősorban az aquaporin (aqp) gének által kódolt AQUAPORIN (AQP) sejthártyafehérjék aktivitásának a függvénye (Agre P, kémiai Nobel díj, 2003). Az AQP fehérjék a MIP (major intrinsic protein) csoportba tartoznak, és aminosav-összetételükre az igen magas alanin-, glicin- és treonintartalom jellemző (4. ábra) 45 NIP5-1.Arabidopsis t BOR1.Arabidopsis t K+ ion channel A.t Myosin (Homo s.) Dragline silk (Nephila sp) 40 35 aa (%) 30 25 42 30 27 26 26 20 22 22 22 15 10 31 21 14 7 5 5 8 3 0 Ala 10 10 9 Arg 7 5 4 1 Asn 4 0 Asp 6 5 1 0 Cys 2 3 Gln 4 0 Glu 5 6 4 Gly 2 2 0 His 11 12 5 5 1 Ile 0 Leu Lys 6 2 2 0 Met 3 0 Phe 5 5 5 5 5 2 0 Pro 8 1 Ser Thr 1 0 Trp 2 3 2 3 Tyr 5 6 2 Val 4. ábra Két aquaporin fehérje (NIP5-1, BOR1) aminosav-összetétele (aa %) összehasonlítva a növényi Kálium-ion csatorna, az emberi miozin, és a pókfonál (dragline silk) aa-összetételével. A MIP

aquaporinok (26-30 kD) működése megegyezik az állatokban, ahol 13 típusuk van, és a növényekben, ahol 5 csoport ismert: PIP, TIP, NIP, SIP és XIP (PIP - plasma membrane intrinsic proteins, TIP - tonoplast intrinsic proteins, NIP - NOD26-like intrinsic proteins of symbiosome membranes, a SIP - small basic intrinsic proteins, és a be nem sorolt XIP intrinsic proteinek). Az aminosav-szekvenciákból szerkesztett filogenetikai hasonlósági dendrogram három fő csoportba osztja az AQP fehérjéket, köztük az igen intenzív vízfelvevő tökféléket és a leggyorsabban növekvő nyárfákat (Populus) és a nyitvatermőket (Pinus, Picea) (5. ábra) A fák hosszú élete és nagy tömege is a vízfelvétel függvénye. Növekedési erélyben is úgy tűnik, hogy a nyitvatermők a leghatékonyabbak. A gödöllői Arborétum kísérleti telepén látható olyan 40 éves mamutfenyőtelepítés, amely kétszer akkora fatömeget hozott, mint a 80-éves telepítésű feketefenyő (1

ábra), és többszörösét, mint a lombos fák. A lágyszárú zárvatermők között a Cucurbitaceae fajai (pl. tök, uborka, dinnye) a legintenzívebb növekedésűek (ld a világ legnagyobb termését adó takarmánytököt). 4 AQLP.AAL05942Pinus taeda 5 NIP6-1.XP 003604209Medicago truncatula NOD.26XP 003546049Glycine max 28 1 NOD, AQP AQP.ADN34021Cucumis melo 99 AQP.ABN11916Cucumis sativus AQP Pinus NIP1-2.NP 193626Arabidopsis thaliana 99 6 NIP1-3.XP 003568755Brachypodium distachyon AQP.NP 001046375Oryza sativa Japonica 15 NOD-26.CAD67694Cucurbita pepo 99 99 Si-TRP, NOD, AQP Si-TRP.BAK09175Cucurbita moschata 0 NOD-20.ADK56129Fragaria chiloensis 99 NOD-26.CAB45652Pisum sativum 54 NIP1-2.XP 003593786Medicago truncatula 39 99 NIP-1.ABS72446Vigna unguiculata NIP-11.DAA33874Gossypium hirsutum 24 NIP3-1.NP 174472Arabidopsis thaliana Picea - Populus NIP1-1.XP 003571857Brachypodium distachyon 99 7 99 NIP4-2.NP 198598Arabidopsis thaliana NIP.XP

002302955Populus trichocarpa NIP1-1.NP 001105721Zea mays 99 83 AQP.ABK27103Picea sitchensis NIP.XP 002314811Populus trichocarpa 1 NIP1-1.XP 003634831Vitis vinifera 15 AQP.ABN11917Cucurbita ficifolia 99 NIP-12.ADE34292Gossypium hirsutum NIP-13.ADE34293Gossypium hirsutum 26 AQP.XP 002317387Populus trichocarpa 5 Populus NIP-26.XP 002526017Ricinus communis 45 BAJ96213.AQPHordeum vulgare 0 NIP-61.ABY19374Lotus japonicus 10 AQP.XP 002973832Selaginella moellendorffii 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 5. ábra Az aquaporin fehérjék (AQP, NIP, NOD and Si-TRP) filogenetikai kapcsolatai. A nyitvatermő (Pinus, Picea) és zárvatermő (lágyszárú és fás) fajok, valamint a ’külső csoport’ Selaginella csipkeharaszt kiemelésével. A fehérjeszekvenciák (NCBI) letöltése, blast-elemzése és illesztése után a dendrogram szerkesztése Mega4 (Tamura et al. 2004) programmal történt a génbanki (NCBI) számok, a relatív genetikai távolság (mérce) és a bootstrap

(x1000) értékek feltüntetésével. 3. Fitoremediáció A fitoremediáció ma már egy technológia, amelyben növényekkel történik a talajszennyeződések eltávolítása: a szennyezett talaj megtisztítása, remediálása. Összehasonlítva a fizikai (pl talajelhordás), kémiai (pl Na2EDTA kelát-kezelés) és biológiai (pl. baktériumok alkalmazása) remediációs módszerekkel, a növények használata költséghatékony és kevésbé káros a környezetre. A mérgezés felszámolása történhet lebontással, talajból történő kivonással (fitoextrakció), vagy a szennyezőanyagok megkötésével, immobilizációjával. A fitoextrakció során, a növények tápanyagfelvevő mechanizmusát használjuk fel a szennyezőanyagok talajszint feletti szövetekben történő akkumulációjához. Néhány évi növekedés után a föld fölötti biomasszát begyűjtve a szennyezés eltávolítható a területről. A növényanyag elégetéséből (bioenergia) visszamaradt

hamuban tovább koncentrálódnak a szennyezőanyagok, amelyeket újrahasznosíthatunk, vagy lezárt hulladéktárolókba helyezhetünk. Fitoextrakcióra azok a növények alkalmasak, amelyek képesek a szennyezőanyagok gyors felvételére, és a föld fölötti szöveteikben történő akkumulációjára/tűrésére/lebontására, amelyre a Populus fajok kiemelten alkalmasak. Ültetésük egyszerű, jól gyökeresednek, vegetatív úton könnyen szaporíthatók, növekedésük gyors (4-5 méter/év). A Populus fajokra, a fás növények közül a legjobban tanulmányozott fajokra, számos módszert dolgoztak ki erdészeti, vegetatív szaporítási, szövettenyésztési, géntranszformációs nemesítési és betakarítási eljárásokra. A nyárfajoknak magas a transpirációs rátájuk, hosszú gyökérzetük révén elérik a talaj mélyebb vízrétegeit, könnyen 5 adszorbeálják, lebontják és/vagy detoxifikálják a szennyezőanyagokat, miközben gátolják a

talajeróziót is. Fajai világszerte elterjedtek főként az ártéri területeken, így nagy valószínűséggel található a potenciális fitoremediációs területekre megfelelő Populus faj. A nyár nem része az emberi tápláléknak, habár számos állatfaj hasznosítja táplálékként (pl. rovarok) és lakhelyként (pl madarak) Mindezek alapján a Populus fajok ideális jelöltek a fitoremediációra történő nemesítésre (1. táblázat) A legtöbb nyárfával végzett fitoremediációs feladatot az Egyesült Államokban dolgozták ki, ahol már több erre szakosodott gazdasági társulás alakult. Ezek között is a legfontosabbak a glutation (GSH) alapú fitoremediációra génnemesített 35S-gshI transzgénikus nyárfák. A GSH (glutation) és szerepe a stressz elleni védekezésben Rey-Pailhade 1888-ban izolált élesztőből egy olyan vegyületet, amely elemi kénnel reagálva spontán reakcióban hidrogén-szulfidot termelt. A vegyületet két görög szó

felhasználásával filotionnak ("kenet szerető") nevezte el (Meister, l988). 1921-ben Hopkins vizsgálta újra ezt a vegyületet, és először (tévesen) glutamátból és ciszteinből álló dipeptidként jellemezte. A két aminosav kapcsolódására utalva Hopkins nevezte el a vegyületet glutationnak (GSH) (glutaminsav+filotion+pepton). amely elnevezés egyben az eredeti filotion névhez és az egyszerű peptideket jelző pepton végződéshez is kapcsolódott. Hopkins később megismételte vizsgálatait, és 1929-ben helyesen ismerte fel a GSH tripeptid voltát. A redukált GSH (-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin) oxidált formája a GSSG, melyben két GSH molekula kén-hídon keresztül kapcsolódik össze. A GSSG visszaalakulását GSH-vá a glutation reduktáz enzim (GR) katalizálja és a reakcióhoz a fotoszintetikus elektrontranszport-láncban termelődött NADPH-t használja fel. A GSH a növényi antioxidáns rendszer fontos eleme. Szintézisének két utolsó

lépésében két ATP-t igénylő lépés van. Az elsőben a γ-glutamil-cisztein (γ-EC) jön létre a glutaminsav és a cisztein között, amelyben nem a szokásos peptidkötés alakul, ki hanem egy speciális peptidkötés, amelyben a glutaminsav nem az α-, hanem a γkarboxilcsoportjával kapcsolódik a ciszteinhez, aminek következtében a glutationt a proteolitikus enzimek nehezen tudják lebontani. 6. ábra A glutation bioszintézisének két utolsó enzimatikus lépése és a reakciókat katalizáló enzimek. A második lépésben a glicin kapcsolódik a C-terminális helyzetű ciszteinhez, így alakítva ki a glutation tripeptidet. Az első lépést a γ-glutamilcisztein szintáz enzim (γ-ECS) (kódoló génje a gsh1), a másodikat a glutation szintáz enzim (GS) (kódoló génje a gsh2) katalizálja. A reakció végbemegy a citoszolban és a kloroplasztban is (6 ábra) 6 A GSH a stressz elleni védelemben több ponton is hat, melyek közül a reaktív oxigéngyökök

elleni védelem (különösen a membránlipidek és -proteinek védelme), a H2O2 elleni védelem (az aszkorbinsav regenerációján keresztül), és a fitoremediációs kapacitást biztosító nehézfémkötő fehérjék (HMBP – heavy metal binding proteins) (pl. fitokelatinok) prekurzoraként a teljes növényi nehézfémtűrésben tölt be központi szerepet A fitokelatinok kiinduló molekulája a GSH, melyek bioszintézisét a fitokelatin szintáz enzim katalizálja: (γGluCys)nGly + (γGluCys)nGly  (γGluCys)n+1Gly (n = 1,2,3). A Cu, Cd, Pb és a Zn különösen jól kötődnek a Cys (cisztein) tiol (SH) csoportjához, oldható fémkelátot hozva létre. A GSH, hasonlóan a többi kéntartalmú peptidhez, a xenobiotikumok (kémiai szennyeződések) nagy csoportjával képes reakcióba lépni (pl. GSH-herbicid komplex), amelyeket az ABC transzporterek (ATP binding casette) szállítanak a vakuólum ’depóba’. A fák biotechnológiai modellnövénye a nyárfa A nyárfa az

erdészeti biotechnológiai kutatások modellnövénye. Ezt annak köszönheti, hogy rendelkezik számos olyan, a többi fás növényben együtt nem jelentkező tulajdonsággal, amelyek megkönnyítik a biotechnológiai és molekuláris biológiai kutatásokat. Ezek a következők:  Kisméretű a nukleáris genom (2. ábra), a haploid genom mérete 0,485±10 x 109 bp, hasonló a rizsgenom méretéhez, és csak 4  nagyobb az Arabidopsisénál, de 40  kisebb, mint a fenyő genomja;  Ismert a Populus trichocarpa teljes genomszekvenciája (Tuskan et al. 2006);  Könnyű a vegetatív szaporíthatóság, amellyel a genetikai állomány változatlanul fenntartható;  Gyors a növekedése és a termőre fordulása, a kísérletek viszonylag gyorsan (8-10 év) elvégezhetők;  Könnyű transzformálhatóság, könnyű transzgénikus fák előállítása. 4. Génbevitel nyárfába A nyár genomszekvencia-adatai szabadon hozzáférhetők (http://www.jgidoegov/poplar/)

Mindezen jó tulajdonságok alapján nem meglepő, hogy az első transzgénikus fa szintén a nyár volt, amelyet 1987-ben állítottak elő, a bevitt tulajdonság a glifozát-rezisztencia volt (1. táblázat) A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus szürke nyárfák jellemzői A vizsgálatainkhoz a szürkenyárhibrid (Populus tremula × Populus alba = Populus × canescens) két transzformáns klónját alkalmaztuk (INRA No.717-1-B4): a 11ggs és a 6lgl klónokat, összehasonlítva a nem transzformált szürkenyárral (WT). A növények az Escherichia coli baktériumból származó γ-glutamil-cisztein szintáz (γ-ECS) enzimet kódoló gént (gsh1) hordozták. A gén eredeti start-kodonját (TTG) PCR technikával ATG szekvenciára módosították. Magát a kódoló szekvenciát (1,7 kb) tartalmazó HindIII/SmaI fragmentumot a pLBR19 plazmidba klónozták. A promóter a karfiolmozaik-vírus (CaMV) konstitutív 35S promótere volt, dupla felerősítő (enhancer)

szekvenciával (p70) és a CaMV poli-A szekvenciájával. Ezt a CaMV-35S promóter – gshI – poli-A gén-kazettát a pBIN19 bináris vektorba klónozták egy SstI/XbaI inszertben. Az így elkészített vektort építették be az Agrobacterium tumefaciens C58 (pMP90) törzsébe, és végezték el a szürkenyárhibrid (P. × canescens) genetikai transzformációját Kétféle gshI-génnel transzformált nyárfa klóntípust állítottak elő. A 11ggs klónban (35S-gshI-11ggs) a transzgén fehérjeterméke a citoszolban expresszálódik. A 6lgl klónban (35S-rbcS-gshI-6lgl) a CaMV-35S promóter és a gshI gén közé beépítették a borsó RUBISCO gén kis alegységének tranzit peptidjét (borsó rbcS), aminek következtében a gshI gén terméke beszállítódik a kloroplasztiszba (7. ábra) A transzgénikus klónokban a GSH-tartalom 2-4-szer nagyobb lett, mint a kontroll klónokban. A szürkenyárklónok (11ggs, 6lgl, kontroll) steril hajtásai Németországból

(Albert-Ludwigs-Universität, Institut für Forstbotanik und Baumphysiologie, Freiburg, Prof H Rennenberg) érkeztek. 7 1. táblázat: A fontosabb genetikailag módosított nyárfák (A) HERBICIDREZISZTENCIA Faj/Hibrid Transzgén* Rezisztencia tulajdonság Irodalom P. alba  P grandidentata P. tremula  P alba P. trichocarpa  P deltoides P. tremula  P alba P. tremula  P alba P. tremula  P alba P. tremula  P alba P. alba  P grandidentata aroA bar bar bar crs1-1 crs1-1 bar aroA Glifozát rezisztencia Foszfinotricin rezisztencia Foszfinotricin rezisztencia Foszfinotricin rezisztencia Klórszulfuron rezistzencia Klórszulfuron rezistzencia Foszfinotricin rezisztencia Glifozát rezisztencia (Fillatti et al. 1987) (de Block 1990) (de Block 1990) (Devillard 1992) (Brasileiro et al. 1992) (Chupeau et al. 1994) (Chupeau et al. 1994) (Donahue et al. 1994) P. alba  P grandidentata P. nigra cryIA(a) cryIA(c) (MCCown et al. 1991) (Wang et al. 1996) P.

tremula  P tremuloides P. tremula  P tremuloides P. alba  P grandidentata P. tremula  P grandidentata [P. alba  (P davidiana + P simonii)]  P tomentosa cryIIIA ocI pinII pinII cryIA(cI (Cornu et al. 1996) (Leple et al. 1995) (Heuchelin et al. 1997) (Klopfenstein et al. 1997) (Yang et al. 2003) [(P. tomentosa  P bolleana)  P tomentosa] CpTI Malacosoma disstria Lymantria dispar Apochemia cinerarius Chrysomela tremulae Chrysomela tremulae Lymantria dispar Plagiodera versicolora Lymantria dispar Clostera anachoreta Lymantria dispar Malacosoma disstria Stilpnotia candida resveratrol 3-glükozid Citokinin-tartalom Citokinin-tartalom Hormon anyagcsere Hormon anyagcsere Hormon anyagcsere Hormon anyagcsere Hormon anyagcsere Módosult gyökérzet Hormon anyagcsere Rendellenes fejlődés Glutation anyagcsere Glutation anyagcsere Glutation anyagcsere Nitrogén hasznosítás Lignin anyagcsere Lignin anyagcsere chalkon szintáz stressztűrés sóstressz (Giorcelli et

al. 2004) (Schwartzenberg et al. 1994) (Ebinuma et al. 1997) (Eriksson et al. 2000) (Tuominen et al. 1995) (Tuominen et al. 2000) (Nilsson et al. 1996) (Ahuja és Fladung 1996) (Tzfira et al. 1998) (Olsen et al. 1997) (Mohri et al. 1999) (Foyer et al. 1995) (Foyer et al. 1995) (Arisi et al. 1997) (Gallardo et al. 1999) (Van Doorsselaere et al. 1995) (Baucher et al. 1996) (Nicolescu et al. 1996) (Arisi et al. 1998) (Hu et al. 2005) (B) ROVARREZISZTENCA (Zhang et al. 2005) (C) ANYAGCSERE-MÓDOSÍTÁS P. alba P. tremula  P alba P. sieboldii  P grandidentata P. tremula  P tremuloides P. tremula  P tremuloides P. tremula  P tremuloides P. tremula  P tremuloides P. tremula  P tremuloides P. tremula P. tremula  P tremuloides P. nigra P. tremula  P alba P. tremula  P alba P. tremula  P alba P. tremula  P alb P. tremula  P alba P. tremula  P alba P. tremula  P alba P. tremula  P alba P. tomentosa StSy ipt ipt GA-20-oxidáz iaaM, iaaH iaaM rolC

rolC rolB+rolC phyA Homeobox OSH1 gor gshII gshI GS AS comt AS cad chs FeSOD mtlD (D) VIRÁGZÁSMÓDOSÍTÁS P. tremuloides leafy Korai virágzás (Weigel és Nilsson 1995) P. tremula  P alba, P. tremula  P tremuloides P. trichocarpa  P deltoides P. tremula  P alba, P. tremula  P tremuloides P. trichocarpa  P deltoides P. trichocarpa  P deltoides leafy Korai virágzás (Rottmann et al. 2000) ptlf Korai virágzás (Rottmann et al. 2000) leafy Korai virágzás (Skinner et al. 2003) (E) PROMÓTERMÓDOSÍTÁS pcad/gus Xilém specifikus expresszió (Feuillet et al. 1995) P. tremula  P alba prolC/gus Évszak specifikus expresszió (Nilsson et al. 1996) P. tremula  P tremuloides p-SAM/gus Szövet specifikus expresszió (Mijnsbrugge et al. 1996) P. tremula  P alba p35S/gus Konstitutív expresszió (Nilsson et al. 1996) P. tremula  P tremuloides *Jelmagyarázat: aroA: mutáns EPSP szintáz, AS: antiszensz; bar: foszfinotricin acetyl transzferáz;

cad: cinnamil alkohol dehidrogenáz; cat: kloramfenikol acetil transzferáz; comt: kávésav O-metil transzferáz; CpTI: tripszin inhibitor; crs1-1: mutáns acetolaktát szintáz; cryIA(c), cryIA(a), cryIIIA: Bacillus thuringiensis δ-endotoxin gének; FeSOD: vas szuperoxid dizmutáz; GS: glutamin szintáz gshI: γ-glutamilcisztein szintáz gshII: glutation szintáz gor: glutation reduktáz gus: β-glükuronidáz; ipt: izopentenil transzferáz; iaaH: indol-3-acetamid hidroláz; iaaM: triptofán-2-mono-oxigenáz; luxF2: luciferáz; mtlD: mannitol-1-foszfát dehidrogenáz; ocI: rizs cisztein proteináz inhibitor; p: promóter; phyA: fitokróm A; pinII: burgonya proteáz inhibitor II; StSy: stilbén szintáz. 8 7. ábra A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgén-kazetta felépítése. (A) A citoszolban expresszálódó 35S-gshI-11ggs transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció. LB: bal oldali határoló régió; P-p70: karfiolmozaik-vírus 35S promótere

dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával; gsh1: a γ-ECS enzimet kódoló gén szekvenciája; T-35S: karfiolmozaikvírus poli(A) szekvenciája; T-nos: nopalin szintáz promótere; nptII: neomycin foszfotranszferázt kódoló gén szekvenciája; Pnos nopalin szintáz terminátor szekvenciája; RB: jobb oldali határoló régió. (B) Az rbcS tranzitpeptiddel a kloroplasztiszba szállított 35S-rbcS-gshI-6lgl transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció a γ-ECS kloroplasztiszban való túltermeltetéséhez. rbcS: borsó RUBISCO enzim kis alegységének tranzitpeptidjét kódoló része A 35S-gshI transzgénikus szürke nyár mikroszaporítása in vitro A növények mikroszaporítása nodális hajtástenyészetben in vitro történt WPM táptalajon (8. ábra) 8. ábra A transzgénikus 35S-gshI transzgénikus szürkenyár (P. x canescens) mikroszaporítása in vitro (1) a kiinduló gyökeres hajtástenyészetből vágott, (2) nodális szárdarabokon megindul, (3) az

alvórügyek kihajtása, (4) és teljes kifejlődése, majd (5) gyökereztetése, a (6) a nagy mennyiségű klón előállításában. 9 A 35S-gshI és a 35S-rbcS-gshI transzgén beépülő kópiaszámának és expressziójának meghatározása (qPCR) A 35S-gshI transzgén beépülési kópiaszámának meghatározása, a konstitutívan expresszálódó actin gén kontrolljában végeztük, tervezett primerekkel (Primer3’, NCBI), qPCR elemzésben (25 µl) (Corbett Gene 6000), DyNAmo HS SybrGreen I qPCR Kit (# F-410L, Finnzymes, Finland – Izinta) felhasználásával, a 2−ΔΔCt módszer kiértékelésével (9. ábra) Az RT-qPCR eredmények szerint, a 35S-gshI transzgén a 35S-gshI-11ggs klónban magasabb (1,6) beépülési kópiaszámot mutatott, mint a 35S-rbcS-gshI-6lgl klónban (1,0), amelyben azonban a transzgén expressziója 13,5szöröse volt a folyamatos kloroplasztiszba történő géntermék (GSH) szállításának eredményeként (9. ábra) 3 12 10 13,5 2n 8 2n

2n 2 1,6n 6 1n 4 2 0 1 3,2 1,3 1,0 1,0 Pop.gsh1 Ecoli.35S-gshI WT TR(ggs11) Pop.gsh1 Ecoli.35S-rbcS-gshI - Gén kópiaszám (relatív) - - gshI-mRNS szint (rel. génexpresszió) - 14 0 Pop.gsh1 TR(lgl6) 9. ábra A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus-, valamint a kontrol (WT) szürke nyár (2n=4x=38) klónok (P. x canescens) transz/gén beépülésének és saját Popgsh1 génjének kópiaszáma és relatív génexpressziója A relatív génexpressziót a génekről átírt mRNS-ek mennyiségének mérésével határoztuk meg a totál RNS (0,05 g levélszövetből kivonva, és NanoDrop ND-1000 UV-Vis spectrofotométerrel ellenőrizve) mintákból szintetizált cDNS-ből. A nyárfa saját gshI génjének (Popgsh1mRNS), valamint a két transzgén konstrukciónak (35S-gshI-11ggs-mRNS és a 35S-rbcS-gshI-6lgl-mRNS) az mRNS mennyiségét az a-tubulin (a-tubulin-mRNS) és az aktin (actin-mRNS) mRNS-ének mennyiségéhez (1,0) viszonyítottuk

(Absolutely RNA Miniprep Kit (# 400800, Stratagene, USA - Biomedica, Magyarország) követve a protokollt. cDNA szintézis: Az mRNS-ek reverz transzkripciójához (cDNS szintézis) RT-t (reverse transcriptase, Moloney Murine Leukemia Virus: M-MuLV), oligo(dT)18 (0,5 µg) és 3’-primert alkalmaztunk (# K1622; Fermentas – Biocenter, Szeged, Hungary). Génexpresszió mérése: Az egyszálas cDNA-mintákat (2,5 μl) közvetlenül vittük qRT-PCRbe (25 µl) a megtervezett primerekkel (400 nM) (‘Primer3’ NCBI) DyNAmo HS SybrGreen I qPCR kitben A qRT-PCR ciklusai: 10 perc elődenaturációt (95 °C) követő 35 amplifikációs ciklus (95 °C/20 sec, 60 °C/20 sec, 72 °C/20 sec) 4°C-os véghűtéssel (Rotor Gene 6000, Corbett Research, Australia). Az adatok kiértékelése A kalibrációhoz és a qvantáláshoz 10-szeres cDNS koncentrációsorban történt (1x, 10x, 102x, 103x cDNA) (10. ábra), NTC (non DNA-template control) és ddH2O kontrollal A számítás (Ct, ΔC, ΔΔCt

meghatározása) 2−ΔΔCt módszerrel történt: Ct-szint (threshold cycle): A küszöbértékének meghatározása a felszaporodó cDNS-fragmentum küszöbérték feletti fluoreszcencia értékéből (dR) történt kézi illesztéssel. A standard görbe, amely a Ct-érték és a felszaporodó cDNS-fragmentum fluoreszcenciája közötti korrelációt mutatta magas R2-értékű volt (0,987). ΔC: ΔCt értéke a CtEcolgshI – Cta-tubulin és a CtPopgsh1–Cta-tubulin különbségét mutatja. ΔΔCt values: A ΔΔCt érték Ctkezeletlen átlaga – Ctkezelt átlag különbségének a 2−ΔΔCt értéke 10 10. ábra A gshI transzgén kimutatása RT-qPCR-el a 35S-gshI-11ggs (--) és a 35S-rbcS-gshI-6lgl (-■-) transzgénikus szürkenyárklónokban. A PCR ciklusok száma (Cycles) és a DNS-be kötődő SybrGreen festék fluoreszcenciája (dR) közötti korrelációs görbe. A reakció kalibrációja és kvantálása 10-szeres cDNS koncentrációval (1x, 10x, 102x, 103 mennyiségű

cDNS; az ábrán ’Standard 1,2,3,4’) és NTC (DNS nélküli kontroll; non DNA-template control) alkalmazásával történt. A transzgén működésének reaktivációja DHA-indukált DNS-demetilációval A TGS (transzkripcionális géncsendesítés) leghatékonyabb módja, az adott szervben szükségtelen gének működésének (expressziójának) elhallgattatása (gene silencing). Mindkét TGS, a fehérje szintű (az adott gén környezetében levő hiszton fehérjék de/acetilálása, a HDAC: hiszton deacetiláz katalízisében), és a DNS szintű (a gén citozin bázisainak metilálása 5metC-vé, a DNMT: DNS-metiltranszferáz katalízisében) indukálható kémiai kezeléssel. Vizsgálatainkban a humán rákterápiában alkalmazott, nem metilálható citozin-analógot a DHAC-t (dihidro-azacitidin) alkalmaztuk. A DHC képes beépülni az éppen osztódó sejt replikálódó DNS-ébe, ezzel az utódsejtekben az adott gén citozinjainak metilálhatatlanságával az adott gén

reaktiválódik. Megállapítottuk a két transzgén (a 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl) mellet a nyárfa saját gsh1 génjének nagyságrendi (10x) reaktiválódását a két transzformált nyárfában és nem transzformált (WT) klónban (11. ábra) - gsh-mRNS szint (relatív gén expresszió) - 26 23,7 24 22 19,8 20 18 16 13,9 13,5 14 12 10 8 6 3,1 4 2 1,0 1,0 0,5 35S-gshI11ggs 35S-gshI11ggs + DHAC 2,1 1,3 0 Pop.gsh1 Pop.gsh1 + DHAC WT Pop.gsh1 TR(ggs11) Pop.gsh1 + DHAC 35S-rbcSgshI-6lgl 35S-rbcSgshI-6lgl + DHAC Pop.gsh1 Pop.gsh1 + DHAC TR(lgl6) 11. ábra A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgének (E. coli), valamint a nyárfa (Populus x canescens) saját (WT) gsh1 génjének reaktiválása DHAC (4x10-7 M) kezeléssel (21 napig kezelt in vitro levélkorong-tenyészetben). 11 Funkcionális elemzések: a transzgén hatása a nyárfa egyéb génjeinek (gst) működésére Paraquat stressz alatt (4x10-7 M, 21 nap,

levélkorong-tenyészet) a transzgénikus klónokban megvizsgált saját GST-enzimaktivitás (glutation S-transzferáz) pozitív serkentést (co-expressziót) mutatott a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus klónban. Ez az eredmény igazolja, hogy a kloroplasztiszban, a fotoszintetikus elektrontranszport láncára ható paraquat elleni védekezéshez felhasználódik a kloroplasztiszba szállított transzgén által kódolt GSH is (12. ábra) 35S-gshI-11ggs -▲- 2,0% szacharóz fény -- 1,0% szacharóz, fény - ■- 0,2% szacharóz, fény -- 1,0% szacharóz sötét -- 2,0% szacharóz sötét 35S-rbcS-gshI6lgl Nem-transzgénikus 12. ábra A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgén hatása a nyárfa egyéb génaktivitására. A gst által kódolt GST enzim (glutation S-transzferáz) aktivitásának változása eltérő szénellátás (2% -▲-, - 1% --, - 0,2% -■- szacharóz) és fény (16 h fény/8 h sötét fotoperiódus és folyamatos sötét inkubációval

-▼-, -◄-), valamint paraquat stresszben (4x10-9 – 4x10-6 M) (az átlagértékek és a szórás jelölésével; n=3). A vizsgálati eredmények igazolják, hogy a transzgénikus 35S-gshI nyárfaklónok (Populus) közel 10-szer aktívabban képesek a talajszennyeződések felvételére, ezért alkalmazásukkal tizedére csökkenthető egy szennyezett (ld. napjaink vörösiszap-katasztrófái) terület remediálása. Köszönetnyilvánítás: A vizsgálatokat az OTKA-K77641 és az OTKA-PD75169 pályázat támogatta. Ajánlott irodalom Bittsánszky A, G Gyulai, G Gullner, J Kiss, Z Szabó, Gy Kátay, L Heszky, T Kőmíves (2009): In vitro breeding of grey poplar (Populus × canescens) for phytoremediation purposes. Journal of Chemical Technology & Biotechnology 84: 890–894 Gullner G, G Gyulai, A Bittsánszky, J Kiss, L Heszky, T Kömíves (2005) Enhanced Inducibility of Glutathione S-Transferase Activity by Paraquat in Poplar Leaf Discs in the Presence of Sucrose. Phyton 45:

39–44 Gyulai G, Z Tóth, A Bittsánszky, Z Szabó, G Gullner, J Kiss, T Kőmíves and L Heszky (2008a) Gene up-regulation by DNA demethylation in 35S-gshItransgenic poplars (Populus x canescens). in: Genetically Modified Plants: New Research Trends Eds T Wolf and J Koch, Nova Science Publisher, Inc USA, Chapter 8, pp. 173–191 ISBN 978-1-60456-696-3 Kőmíves T, Gullner G (2000) Phytoremediation. In: Plant-Environment Interactions (RE Wilkinson ed), Marcel Dekker Publ, New York, pp 437–452 Malone R, Dix PJ (1990) Mutagenesis and triazine herbicide effects in strawberry shoot cultures. J Exp Bot 41: 463–469 12