Biológia | Tanulmányok, esszék » Boldogkői Zsolt - A molekuláris biológia frontvonalai

1. Riporter gének A Molekuláris Biológia Frontvonalai Tartalom: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Riporter gének Ideghálózatok Feltételes transzgénikus rendszerek A genetikai kód néma helyei Minimális élet Szintetikus élet Metagenomika Nanomedicina Riporter gének DIA 1 A riporter gének olyan fehérjéket (riporter proteineket) kódolnak, amelyek könnyen detektálhatók oldatban, élő sejtben, ill. élő szervezetben A legkorábban alkalmazott riporter gén az E coli lac operonjának egyik strukturális génje, a lacZ gén. Ígéretes riporter génnek indult a szentjánosbogárból származó luciferáz gén, de a különböző fluoreszcens fehérjék, kedvezőbb sajátságaik révén,- mára háttérbe szorították. A riporter gének felhasználása széleskörű: használhatók génexpressziós vizsgálatokra, szelekciós markerként, sejtstruktúrák megjelölésére, idegi hálózatok jelölésére, fúziós formában sejtfehérjék mozgásának a vizsgálatára, stb. DIA

2, 3 1a. LacZ gén az E coli lac operonjának egyik strukturális génje, mely a -galaktozidáz enzimet kódolja. A lacZ gént a molekuláris klónozásban máig markerként alkalmazzák az ún kék-fehér szelekciós rendszerekben a nem-rekombináns plazmidot tartalmazó baktérium kolóniák kiszűrésére. A lacZ gént használhatjuk eukarióta rendszerekben is. Itt már nincs szükségünk a represszorra és az azt gátló induktorokra, mert a bakteriális promótert kicseréljük valamilyen eukarióta promóter/enhanszer szabályozó szekvenciára. A lacZ gén két fontos alkalmazási területét említjük meg (1) Eukarióta promóterek erősségének és/vagy sejt-specifitásának vizsgálata oldatban. Ebben a rendszerben a lacZ gént a vizsgálandó szabályozó elem kontrollja alá helyezzük, majd az expressziós kazettát tenyésztett sejtekbe transzfektáljuk. Egy bizonyos idő eltelte után a sejteket összegyűjtjük, feloldjuk, s ONPG nevű kromogén szubsztrátot

adunk hozzá. A kezdetben színtelen szubsztrát a sejtekben keletkezett –galaktozidáz hatására sárga terméket produkál, a sárgulás mértéke (amit fotométerrel mérünk) az enzim mennyiségétől függ. Ezzel a módszerrel tehát összehasonlíthatjuk egymással különféle szabályozó elemek erősségét, ill. egy szabályozó elem aktivitását különböző sejttípusokban. (2) A lacZ gén másik fontos alkalmazási területe sejtek, szövetek, ill. az egész szervezetek megjelölése Ezzel a rendszerrel vizsgálható pl egy szabályzó elem sejtspecifikus kifejeződése egy élőlényben Ehhez a vizsgálathoz olyan transzgénikus élőlényeket állítunk elő, amelyekben a lacZ gént a vizsgálandó szabályozó elem „hajtja meg”. Az élőlényt el kell pusztítani a vizsgálathoz, mert a szöveteit fixálni kell a kromogén szubsztráttal (X-gal, színtelenből kékszínűvé válik galaktozidáz hatására) való reakcióhoz. Ezt a technikát főként az

agykutatásban alkalmazzák, mert ebben a szervben található messze a legtöbbféle sejttípus (egérben több száz féle idegsejt található), s ezek rendszerint megjelölés nélkül nem különíthetőek el egymástól. DIA 4 1b. Luciferáz gént eredetileg a szentjános bogárból izolálták, de léteznek bakteriális luciferázok is A luciferáz fehérje lumineszcenciára képes, ami azt jelenti, hogy valamilyen energia (nem hő) hatására fényt bocsát ki. A kemilumineszcencia bizonyos kémiai kölcsönhatások eredményeként keletkezik; a biolumineszcencia pedig élőlényekben végbemenő kemilumineszcencia. A luciferáz esetében a lumineszcenciát az enzim szubsztrátjának (luciferin) oxidációja okozza A luciferáz rendszer alkalmazható oldatokban az enzim aktivitásának mérésére (ún. luminométer műszer segítségével), azaz pl különféle genetikai szabályozó elemek erősségének ill. sejt-specifitásának a vizsgálatára Az első luciferázt

kifejező élőlény egy transzgénikus dohány volt (ld. dia), amely akkor lumineszkált, ha a növény a szubsztrátot a gyökerein keresztül felvette a talajból. A luciferáz sikerét a rendszer szubsztrát-függősége határolta be A luciferin ugyanis egy nagyon drága szubsztrát, amelyet ráadásul körülményes bejuttatatni a szervezetbe. Oldatokban végbemenő reakciók vizsgálatára még mindig használják ALAPKÖVETELMÉNY 28. Előadás Boldogkői Zsolt 1 1. Riporter gének 1c. Fluoreszcens proteinek szintén lumineszkálnak, de ez nem kemilumineszcencia, hanem fluoreszcencia, mivel nem kémiai reakció, hanem gerjesztő fény hatására bocsátanak ki fényt (a foszforeszkálással szemben, a fluoreszcencia csak addig tart, amíg a gerjesztő fényt alkalmazzuk). A fluoreszcens proteinek óriási előnye, hogy szubsztrát nélkül is láthatóvá tehetők. DIA 5-10 A zöld fluoreszcens protein (GFP; green fluorescent protein) felfedezését és a vele való

munka technikai hátterének kidolgozását 2008-ban Kémiai Nobel Díjjal jutalmazták, melyet három kutató vehetett át. A GFP-t az Aquorea victorea nevű medúzából izolálták Ez a fehérje a medúzában a következőképpen működik. Mechanikai hatásra bizonyos sejtekben kinyílnak a Ca2+-csatornák, s ennek következtében a Ca2+ beáramlik a citoplazmába. A Ca2+ hozzákapcsolódik a két komponensből álló aequorin [apoaequorin fehérjéből és egy luciferin prosztetikus (nem protein) csoportból áll] fehérje komponenséhez, ami ezáltal aktiválódván, oxidálja a luciferint. Az aktivált luciferin alapállapotba visszakerülvén kék színű fényt (469 nm) bocsát ki (kemilumineszcencia). A kék fény gerjeszti a GFP-t (FRET, fluoreszcencia energia transzfer), amely ezt követően alacsonyabb hullámhosszú (zöld) fényt emittál. A rendszer eredeti funkciója a kis halak odacsalogatása lehet. Az izolált GFP gén működését függetleníteni tudjuk az

aequorin-tól, azáltal, hogy a kék gerjesztő fényt mi biztosítjuk, pl. egy fluoreszcens mikroszkóp által A 8-as dián a GFP molekulák medúzában való elhelyezkedése látható. A GFP-ből előállíthatóak génexpressziós kazetták, úgy hogy a riporter gént ellátjuk különböző szabályozó elemekkel: promóter/enhanszer, transzkripciós terminációs hely, polyA szignál, stb. Az ilyen expressziós kazettákat sejtekbe tudjuk bejuttatni, ahol stabil vagy átmeneti kifejeződést érhetünk el, attól függően, hogy a GFP-kazetta beépül-e a gazda DNS-ébe, vagy sem. DIA 11 A GFP genetikai módosítása (1) A medúzából nyert GFP nem olvasódik le megfelelő mennyiségben az emlős sejtekben, s ezért nem produkál erős fluoreszcenciát. Az alacsonyszintű transzláció oka a nem-optimális kodonhasználatban keresendő. Magyarázatként: A genetikai kód redundáns, ami annyit jelent, hogy egy aminosavat több (3 betűs) kodon is meghatároz(hat). A

különböző tripleteket (antikodonokat) hordozó tRNS gének eltérő kópiaszámban fordulnak elő a genomban, s ez a szám fajra jellemző. A tRNS gének DNS-ben való kópiaszáma és egy aminosav kodonhasználata harmonizálódott az evolúció folyamán, ami azt jelenti, hogy ha egy adott tripletet hordozó tRNS gén nagyobb számban található a DNS-ben, mint az ugyanazt az aminosavat kódoló másik tripletet hordozó tRNS gén, akkor a gének nagyszámú tRNS géneknek megfelelő szinonim kódokat fogják gyakrabban használni, és vice versa. Egy példával megvilágítva a problémát: ha egy faj génjeiben jóval több glicin aminosavat kódoló GGC tripletet találunk, mint a szintén glicint meghatározó GGA tripletet, akkor számíthatunk arra, hogy a GCC antikodonnal rendelkező tRNS gének nagyobb kópiaszámban lesznek jelen az adott faj genomjában, mint a TCC tripleteket hordozó tRNS gének. Rokon fajok körében a kodonhasználat nagyon hasonló, pl az emlős

fajok között nincs sok különbség. Az evolúciósan távoli fajok (pl medúza és egér) kodonhasználata azonban jelentősen eltérhet egymástól Ezért, ha egy medúza gént akarunk egér sejtekben kifejeztetni, akkor a transzláció lassú lesz, mivel a szükséges tRNS-ek nincsenek megfelelő számban jelen a sejtben. Tehát, a GFP gén kodon-használatát át kell alakítani emlősszerűvé Ezt meg is tették a molekuláris biológusok, jelentősen növelve ezzel a GFP sejten belüli mennyiségét, s ezáltal a fényerejét. (2) Egy másik feladat az volt, hogy az emittált zöld fény hullámhosszát adaptálják a mikroszkópiában elterjedt szűrőkhöz. Az immunhisztokémiában az ún. FITC fluoreszcens festéket használják antitestekhez való konjugációhoz (hozzákapcsolás), s ennek a festéknek 488 nm-nél maximális a fény emissziója. A GFP kromofór (fénykibocsátásért felelős) régióját úgy módosították (aminosav cserékkel), hogy a fehérje molekula

is ezen a hullámhosszon emittáljon maximális intenzitással. (3) Továbbá, a kromofór régiót úgy is átalakították, hogy más színeket bocsásson ki gerjesztés hatására; így jöttek létre a sárga, narancs, kék, stb. színek (4) A különböző sejtszervecskékhez való kötődés végett genetikai úton a membránba való beépüléshez szükséges rövid peptid szakaszokat fuzionáltak a fehérje N-terminális végéhez. (5) Vörös spektrumban kibocsátó fluoreszcens protein gént nem tudták a GFP gén genetikai módosításával előállítani, ezért egy másik gént (DsRed) kellett izolálni egy másik csalánozó (korall) fajból (Discosoma sp.) A DsRed fehérjét is módosították genetikailag: optimális kodonhasználat, érési idő meggyorsítása, a kedvezőtlen tetramer szerkezet helyett monomer szerkezetűvé alakítása, és különféle vörös színárnyalatokat előállítása. A későbbiek folyamán más fajok fluoreszcens protein génjeit is

izolálták, ami még több színárnyalatot, s különféle egyéb sajátsággal (fluoreszcencia intenzitás, stabilitás, színváltoztatás képessége, stb.) rendelkező molekulákat eredményezett ALAPKÖVETELMÉNY 28. Előadás Boldogkői Zsolt 2 1. Riporter gének A FLUORESZCENS PROTEINEK ALKALMAZÁSAI 3 A fluoreszcens protein géneket többféle feladatra alkalmazhatjuk, néhány példát illetően ld. alább DIA 12-16 Transzgénikus állatok Előállíthatunk olyan élőlényeket, amelyek minden sejtjükben kifejezik a riporter géneket. Ennek tudományos jelentősége eleinte abban rejlett, hogy bemutassák, a fluoreszcens proteinek nem toxikusak. Az ilyen élőlények nagyon látványosak Sokféle fluoreszcens gént kifejező állatot előállítottak már: elsőként a genetikai modellállatokat (C. elegans, muslica, egér), majd a háziállatok közül a nyulat, a sertést, a macskát és a kutyát módosították genetikailag. Kereskedelmi célra GFP-t

kifejező zebrahalat GloFish® márkanéven kezdték árusítani, de Kaliforniából és több Európai országból kitiltották őket. Olyan transzgénikus maláriaszúnyogot állítottak elő, ami megfertőződik ugyan a maláriát okozó Plasmodium fajokkal, de, egyrészt, nem terjeszti a kórt, másrészt, jobb a túlélési esélyük a vadtípusú szúnyoggal szemben a maláriával fertőzött vérrel való táplálkozást követően (tehát, várhatóan kiszorítani a vadtípusú szúnyogot). A transzgénikus állatokat a beépített GFP segítségével lehet megkülönböztetni a vadtípusú szúnyogtól. Sokan aggódnak azonban attól, hogy egy GMO szervezet kibocsátása a természetbe kiszámíthatatlan negatív következményekkel járhat, s ezért az engedélyezési procedúra minimum 10 évet fog igénybe venni, de a pozitív döntés egyáltalán nem garantált. Helyezzük be a mérleg másik serpenyőjébe a tényeket: évente 250 millió ember fertőződik meg és

egymillió ember (90%-ban 5 év alatti gyerek) hal meg maláriafertőzés következtében. A fluoreszcens protein géneket alkalmazhatjuk más transzgénekkel való együttes bevitelre különféle sejtek, vagy egyedek DNS-ébe, s ilyenkor, mint (szelekciós) marker, jelzi a transzgén integrálódását a genomba. DIA 17 Szövet- és sejt-specifikus génexpresszió Ezt a technológiát főként az agykutatásban alkalmazzák. A dia első ábráján egy olyan GFP-t kifejező egér embrió látható, amely minden idegsejt típusban kifejezi a riporter gént. Az idegrendszer azonban sokféle, különböző funkciót ellátó idegsejtből áll, ezért, ezek megkülönböztetésére célszerű olyan szabályozó szekvenciákkal ellátni a kifejezni kívánt riporter gént, amely csak bizonyos típusú neuronokban fejeződik ki (ld. BAC technológia) DIA 18 Sejt szervecskék megjelölése Fluoreszcens fehérjékkel megjelölhetik a sejtszervecskéket is úgy, hogy az adott szervecske

membránjának egyik fehérjéjével fuzionáljuk a GFP-t, vagy egyéb fluoreszcens fehérjét (kiméra fehérje keletkezik). DIA 19 Intracelluláris transzport Ezzel a technikával a fehérjék sejten belüli mozgását, transzportját követhetjük nyomon. A technika lényege az, hogy a GFP gént fuzionáljuk egy celluláris fehérje génjével, úgy hogy a fluoreszcens protein a celluláris fehérje C-terminálisán (ritkán N-terminálisán) helyezkedjen el. Ha a GFP nem zavarja a fehérjénk mozgását, akkor nyomon követhető a fehérjék természetes körülmények között való intracelluláris mozgása. ALAPKÖVETELMÉNY 28. Előadás Boldogkői Zsolt