Kémia | Felsőoktatás » Ilisz Péter - A kromatográfia elméleti alapjai

A kromatográfia elméleti alapjai Kromatográfiás elválasztás 1. A különbözı fizikai-kémiai tulajdonságú komponensek megoszlása az álló- és mozgófázis között eltérı (kvázi egyensúly) 2. A töltéssel rendelkezı részecskék töltésüknek, méretüknek megfelelıen, elektromos erıtérben, eltérı sebességgel mozognak (Elektroforézis) Felosztás alapja: 1. Mozgó- és állófázis minısége 2. Kényszeráramot létrehozó erı: nyomáskülönbség elektromos erıtér Kromatográfia felosztása Álló fázis Mozgó fázis Nyomáskülönbség Elektromos erıtér Kényszeráramlást okozó erı Szilárd Folyadék Gáz kromatográfia GC gáz GSC GLC Szuperkritikus kromatográfia SFC szuperkritikus fluid SFC SFC TLC IC GPC,SEC PC Normal phase (HPLC-NP) Reversed phase (HPLC-RP) Folyadék kromatográfia LC Folyadék kromatográfia LC folyadék folyadék CE GEL ELFO A kromatográfiás elválasztások • Frontális kromatográfia

• Kiszorításos kromatográfia • Elúciós kromatográfia Kölcsönhatások a kromatográfiában 1. Fizikai kölcsönhatások -szorpciós: adszorpciós abszorpciós (oldódás, megoszlás) kemiszorpció -hidrofil- kölcsönhatások -hidrofób- kölcsönhatások -méret szerinti kölcsönhatások 2. Kémiai kölcsönhatások -sav-bázis kölcsönhatás -komplex képzıdés -H-hidas kölcsönhatások 3. Biokémiai kölcsönhatások -biokémiai affinitás KROMATOGRÁFIÁS ALAPFOGALMAK A kromatográfiás folyamat Következmény: • A komponensek eltérı sebességgel vándorolnak (differenciális migráció) • A kromatográfiás folyamat elırehaladtával a sávok kiszélesednek (band broadening) Retenciós adatok Retenciós idı: tR Holt idı: tM (t0) Redukált retenciós tR’ = tR - tM idı: Retenciós térfogat: Redukált retenciós térfogat: Nettó retenciós térfogat: (GC) Fajlagos retenciós térfogat: (GC) VR = t R F ′ ′ VR = t R F =

(t R − t M ) F = VR − VM ′ VN = jVR = j (t R − t M ) F = jVR − jVM VN 273 m : Vg = L megosztófolyadék tömege mLT Retenciós faktor (k’) • A komponens az elválasztás során mennyi idıt tartózkodott az állófázison viszonyítva a mozgófázisban eltöltött idıhöz képest. k’: a kvázi egyensúly hányamegoszlási dosa, ha az anyagmennyiséget mólban adjuk meg k’ = nS/nM Retenciós faktor (k’): a kvázi egyensúly megoszlási hányadosa, ha az anyagmennyiséget mólban adjuk meg ns k′ = nM k′ : retenciós faktor n : x móljainak száma ns nM ns + nM k′ + 1 = + = nM nM nM nM 1 R= = ns + nM 1 + k ′ L tR = uX L ← uX = tR u tM tR = tM (1 + k ′) ux ux R= u tM = u ux = 1 + k′ L u L = u tM t R − tM k′ = tM t0 = t M VR = t R F F : cm3 / min VM = tM F VM = tM F Figyelembe véve: k′ = nS nM k′ = Vs k′ = K VM állófázis térfogatát VS mozgófázis térfogatát VS ns = xsVs xs : mol / dm3 nM = xM VM

xM : mol / dm3 xS K= xM xsVs xM VM = VM VR = t R = VM (1 + k ′) tM K β β= k′ = K VM Vs Vs VM ß: fázisarány k’ értékét a termodinamikai komponens megoszlására folyamat szabja jellemzı meg Több komponens elválasztása esetén a szelektivitási tényezı (elválasztási faktor) α az a paraméter, mely termodinamikai alapon megmutatja, hogy lehetséges-e az elválasztás k2 α= k1 A megfelelı szelektivitási tényezıhöz megfelelı kinetikai hatékonyságnak kell párosulni Az elúciós folyamat feltételei: 1. „Dugószerő” mintabevitel 2. A mozgófázis a kromatogram kifejlesztése alatt állandóan áramlik az állófázis felett 3. A mozgófázis szorpciója kisebb mértékő, mint a legkevésbé kötıdı minta komponensé A kromatográfiában arra törekszünk, hogy a megoszlási hányados független legyen a koncentrációtól és a csak a hımérséklettıl függjön. A megoszlási izotermák lineáris szakaszain dolgozunk Egy

mólnyi anyag mozgó fázisból az álló fázisba való kerülésére érvényes: ∆Gi = -RT ln Ki Az egyensúlyi elmélet alapján megadható: 1. A kromatográfia általános egyenlete, mellyel a retenció jellemezhetı 2. Kvalitatíve értelmezi a csúcstorzulásokat 3. Értelmezi a megoszlási hányadost 4. Értelmezi a két komponens elválasztásához szükséges termodinamikai kritériumot. Nem ad választ: • Milyen a koncentráció eloszlás a kolonnában való elırehaladás során • Milyen tényezık befolyásolják ezt • Milyen tényleges kölcsönhatások vezetnek az elválasztáshoz Az elúciós kromatográfiás folyamat Következmény: • A komponensek eltérı sebességgel vándorolnak (differenciális migráció) • A kromatográfiás folyamat elırehaladtával a sávok kiszélesednek (band broadening) A sávszélesedés szemléltetése ⇐⇐ mozgófázis haladásának iránya Sávszélesedés (Band broadening) magyarázata Tányérelmélet

A különbözı kromatográfiás rendszerek összevetéséhez relatív zónaszélesedést adunk meg amit elméleti tányérszámmal (N) fejezünk ki. Elméleti tányér a kolonna azon szakasza, ahol a kvázi-egyensúly létrejön.
 =  

= 
   L: kolonna hossz σt2: idıben kifejezett variancia négyzet σL2: hosszúságban kifejezett variancia négyzet A számolásoknál a variancia (σ σ) helyett a pontosabb, csúcsalapon mért 4σ σ értéket (w) használata 2 t  N = 16  R  = 5,54 w  tR    w  1/2  2 • A tányérelmélet feltételezései: • Az elméleti tányérokon pillanatszerően beáll az egyensúly • A megoszlási hányados független a koncentrációtól • A mozgófázis szakaszosan megy egyik tányérról a másikra • A kolonna hossztengelye irányában a diffúzió elhanyagolható • Ezek a feltételek nem mindig teljesíthetık Sebességi elmélet A sebességi elméletek

feltételezései: • Az állófázisból a mozgófázisba való anyagátmenet gátolt • A kolonnán az áramlási sebesség sugárirányban változik az eltérı keresztmetszető csatornák miatt (Eddy diffúzió) • Longitudinális (hosszirányú) diffúzió történik, melynek zónaszélesítı hatása annál nagyobb, minél tovább tartózkodik a komponens a kolonnán A sebességi elmélet szerint a csúcsszélesedés oka: 1. Áramlási - nem egyensúlyi- folyamatok 2. Diffúziós folyamatok 3. Anyagátadási folyamatok Gátolt anyagátmenet, Eddy – és longitudnális diffúzió Porózus töltet A sebességi elmélettel számolt csúcsszélesedési adatok akkor igazak, ha teljesülnek a gázokra és folyadékokra jellemzı fiz.-kém paraméterek paraméter gáz Diffúziós koefficiens (cm2 sec-1) folyadék 10-1 Szuperkrit. fluid 10-4 – 10-3 Sőrőség (g cm-3) 10-3 0,3 – 0,8 1 Viszkozitás (poise) 10-4 10-4 – 10-3 10-2 Reynolds szám 10 .

102 10-5 Sebességi elméletek (Van Deemter, Giddings, Knox) Zónaszélesedést kiváltó folyamatok H értékei additívek: • Örvénydiffuzió L H= N Ce d p • Anyagátadási gátlás a mozgófázisban 2 CM d p u DM • Anyagátadási gátlás a mozgófázis álló részében 2 CS M d p u DM •Anyagátadási gátlás az állófázisban 2 CS d f u Ds • Longitudinális diffúzió Cd DM u Az állófázis, mozgófázis és a komponens kölcsönhatása H additivitása H= 1 1 1 + Ce d p C M d p 2 u DM + Cd DM u 2 2 + CS M d p u DM Általában H kicsi, ha: 1. - kicsi a szemcseátmérı 2. - kicsi az áramlási sebesség 3. - kicsi az eluens viszkozitás 4. - nagy az elválasztás hımérséklete T 5. - kicsi az elválasztandó molekula DM és DS u
+ CS d f u Ds H függése a lineáris áramlási sebességtıl (u) (Van Deemter) gázkromatográfiás töltet esetén H függése a lineáris áramlási sebességtıl (u)

folyadékkromatográfiás töltet esetén H –u görbék különbözı szemcseátmérıjő (dp) töltetekre H u H függése a viszkozitástól (η) 7,4x10 −15 (ψ 2 M 2 )1/2 T DM = ηV 0.6 H függése a hımérséklettıl (T) 7,4x10 −15 (ψ 2 M 2 )1/2 T DM = ηV 0.6 A sebességi egyenlet különbözı alakjai h = Aν 1/3 B + + Cν ν A B h= + + Cν 1 + E/ν ν Knox Scott B A 1/2 Cν Dν h= + + + 1 + E/ν 1/2 ν Horváth A B 3/2 Cν Dν h= + + + 1 + E/ν 1/3 ν Giddings A kromatográfia kinetikus elmélete A van Deemter, Knox elmélet hátrányai: 1. Nem veszi figyelembe mekkora nyomásesés kell egy adott N eléréséhez 2. Különbözı morfológiájú töltetek összevetése nehéz: Szemcsés töltet: dp Monolit töltet: pórusátmérı, váz szélesség 3. Nem tartalmazza azt az ellenállást, melyet a nyomásesés (∆p) és a viszkozitás (η) változása okoz adott elméleti tányérszám elérésekor Ezt egy új paraméter, az

elválasztási ellenállás (E) adja meg Szabályos (gömb) és szabálytalan (irreguláris) töltetek Monolit töltet Szilikagél töltet. Karakterisztikus paraméter : pórúsátmérı és falvastagság összege Polimer töltet. Karakterisztikus paraméter : pórúsátmérı és falvastagság összege Az új összefüggés alapot teremt a kolonnák összehasonlítására ∆p t M E= 2 η N Az összehasonlításhoz rögziteni kell a ∆p/η értékét, mert DM az η függvénye és az η függ a mozgó fázis összetételétıl. Másrészrıl E a dp vagyis a szemcseátmérı illetve struktúra függvénye (monolit oszlop) A Knox összefüggés szemcsés és monolit kolonnákra H = Aν 0 , 33 + B ν + Cν 5 µm monolit 3 µm Az ábra nem mutatja mekkora az E értéke a három kolonnára Szemcsés és monolit töltető kolonnák összehasonlítása elválasztási ellenállás (E) alapján 5 µm monolit Áramlási ellenállás oldalról nézve: monolit

jobb mint a szemcsés Szemcsés és monolit töltető kolonnák összehasonlítása ∆p – F összefüggés alapján Nyomásesés (∆p) szempontjából a monolit elınyösebb, mint a szemcsés. De redukált elméleti tányérmagasság (h) szempontjából nem egyértelmő. A kinetikus görbe végleges transzformációja t0/N2 (tE) – N összefüggés Zónaszélesedés: minimumtól balra: a hosszirányú diffúzió szabja meg (B tag) minimumtól jobbra: anyagátadási ellenállás (C tag) Emin és Nopt szerepe monolit 5µm Kinetikus görbéknél Emin és Nopt együtt kell megadni Bonyolult elválasztások: monolit (nagy Nopt) Gyors elválasztások: szemcsés (nagy E0) Oszlopon kívüli sávszélesedés A komponens Vx térfogata Az oszlopon VB (VB=tBF) Összekötı vezetékekben Vi Detektorcellában Vj Egyéb csatlakozóelemekben Vk térfogatúra szélesedik Vi: térfogategységben kifejezett sávszélesedés Detektorban VB‘ sávszélesség ′2 VB

= VB + Vx + Vi + V j + K Cél: Ehhez: V B ≈ VB 2 2 2 2 ′ VX = 1/3(t w F) F= 2 ml / min (u = 0,03 ml / s) Vp= 20 x 0,03 = 600 µl Vx=1/3 x 600= 200 µl A felbontás A felbontás (RS) definiciója Rs = t R2 − t R1 1 (w1 + w2 ) 2 Ha az 1. csúcsra vonatkoztatunk: 1 k1 RS = N 1 (α − 1) 4 1 + k1 Ha a 2. csúcsra vonatkoztatunk: 1 RS = 4 α − 1 k 2 N2 α 1 + k 2 Két komponens felbontásának grafikus ábrázolása Csúcsarány: 1:1 Csúcsarány: 2:1 A felbontás növelésének lehetıségei 1 RS = 4 α − 1 k2 N2 α 1 + k2 A felbontás függése a retenciós faktortól 1 RS = 4 α − 1 k 2 N2 α 1 + k2 A felbontás függése a szelektivitástól 1 RS = 4 α − 1 k2 N2 α 1 + k2 A felbontás függése az elméleti tányérszámtól 1 RS = 4 α − 1 k2 N2 α 1 + k 2 Gázkromatográfia Kromatográfia felosztása Álló fázis Mozgó fázis Nyomáskülönbség Elektromos erıtér Kényszeráramlást okozó erı

Szilárd Folyadék Gáz kromatográfia GC gáz GSC GLC Szuperkritikus kromatográfia SFC szuperkritikus fluid SFC SFC TLC IC GPC,SEC PC Normal phase (HPLC-NP) Reversed phase (HPLC-RP) Folyadék kromatográfia LC Folyadék kromatográfia LC folyadék folyadék CE GEL ELFO Gázkromatográfia • Gas chromatography-GC – Gáz-folyadék (GLC) – Gáz-szilárd (GSC) • Gázkromatográfiával vizsgálható anyagok – Bomlás nélkül elpárologtatható (származékképzés) – Szilárd-folyadék-gáz – 600 móltömegig (közvetlenül 200-300) • Analitikai módszerek 50-70%-a kromatográfiás (20-30% ebbıl kb. a GC) Gázkromatográfia története • M. Tswett Folyadék-szilárd kromatográfia 1903 (fejlıdése a lassú anyagátmenet problémája miatt nem dinamikus) GC – dinamikus fejlıdés • E. Cremer gáz-szilárd kromatográfia 1951 • A. T James, A J P Martin gáz-folyadék kromatográfia 1952 • van Deemter sebességi elmélet 1956 • M.

Golay kapilláris kolonnák kifejlesztése • Schay Géza gázkromatográfiás könyv 1961 • Szepesy László gázkromatográfiás könyv magyar (1961) és angol (1971) nyelven Gázkromatográf (GC) injektor detektor tisztító patron PC oszlop termosztát nyomásmérı áramlás-szabályozók gázpalack Részei: 1. Eluensforrás, a gázáramlást biztosító és szabályozó rendszerrel, tisztítóval 2. Mintabeviteli rendszer 3. Kolonna a termosztáttal 4. Detektor 5. Detektorjel erısítésére szolgáló erısítı 6. Jelátviteli rendszer számítógéppel (jelrögzítés, tárolás, feldolgozás) Gázkromatográfiás készülékek Típusai: Rutin elemzést szolgáló készülékek (reporting) Kutató készülékek (analitikai) Hordozható (portable) készülékek Preparatív Folyamat (process) Analitikai készülékek: Töltött kolonnás Vegyes kolonnás Kapilláris GC Vivıgázáram elnevezés tiszta nagy tisztaságú ultra jelölés % ppm 2.5

99,5 5000 3.0 99,9 1000 3.5 99,95 500 4.0 99,99 100 4.5 99,995 50 5.0 99,999 10 6.0 99,9999 1 7.0 99,99999 0,1 Vivıgáz minıségét megszabja: -Kolonna: -töltetes: N2, Ar DM kicsi -kapilláris: He, H2 -Detektor: -TCD: H2, He -FID: He, Ar, N2 -ECD: N2, Ar+CH4 Acél, alumínium palackok, 100-150 bar nyomással, max. 0,15 m3 térfogattal Reduktor: nyomáscsökkentı (a gáz anyagi minıségének és a nyomásnak megfelelıt választani) 100-150 bar-t kell 1-5 bar-ra lecsökkenteni 2 lépésben 1 membránszelep nyomásmérı: 100-150 bar 2 tőszelep nyomásmérı: 1-5 bar Áramlási sebesség szabályozása Tőszelep áramlási sebesség finom szabályozása Membrános áramlásszabályozó T növekedés hatására az áramlási sebesség csökken Tőszelep: T növekedésébıl eredı áramláscsökkenést nem kompenzálja Membrános áramlásszabályozó, integrált áramkörös nyomásérzékelı fixen tartja az áramlást Mintabemérı (Injektor) A

mintabemérés kritikus pont – Pillanatszerő, kvantitatív és reprodukálható legyen – Minta gáz/gız halmazállapotba kerüljön (főthetı) – Eluenssel való elkeveredés – Oldószer fókuszálás viszonylag kicsiny térfogat 0,1 µl-1 ml folyadék elpárologtatva: 100-10000 X térfogatnövekedés Gáz halmazállapotú minták bemérése Gázmintabemérı csap - mintahurok 5-10-szeresét átengedve a mintából biztosítható, hogy a csap elfordításával valóban minta kerüljön a gázkromatográfba - különbözı térfogatú mérıhurkok (0,25 ; 0,5 ; 1 ml) - bemérıhurok főthetı is, de nem szükséges Gáz halmazállapotú minták bemérése Fluidisztor - nagysebességő gázkromatográfiában használatos - gyors mintabevitel - számítógépes vezérléssel mőködtethetı Mikromennyiségő gáz halmazállapotú minták bevitele teflon dugattyús mikrofecskendıkkel történik Folyadék halmazállapotú minták bemérése Mintabevitel két fı

eleme: - mikrofecskendı - gázkromatográf mintabemérı, elpárologtató része Mikrofecskendık Általában 5-50 µl térfogatúak Teflon végő rozsdamentes acél dugattyú, üvegtest, kalibrált térfogat Hamilton, SGE a leggyakoribb gyártmány Gázkromatográf mintabemérı része Flash elpárologtató - pillanatszerő elpárologtatás, ha injektor T = 50-70˚C + Fp - belsı rész üvegbetét korrózió ellen - injektor V kellıen nagy, hogy az elpárologtatás ne okozzon p növekedést, de ne túl nagy mert csökken a hatékonyság - fıleg kapilláris kolonnáknál használják, ahol nagyobb az injektált minta mennyisége Gázkromatográf mintabemérı része On-column injektor - adagolás közvetlenül a kolonna töltetére - kolonna elsı 5-10 cm-es része csak töltetet megosztófolyadékot nem tartalmaz - elpárolgással egyidejőleg az elválasztás is elkezdıdik - expanziós tér lecsökkenthetı - fıleg kapilláris kolonnáknál használják, ahol nagyobb

az injektált minta mennyisége Gázkromatográf mintabemérı része Mintaáram elosztó (splitter) - kis mintamennyiség (0,1-0,01 µl) bevitele kapilláris kolonnáknál alkalmazzák - az injektált mennyiség nagyobb (1-2 µl) de a splitter csak 1/101/100-ad részét engedi a kolonnára - expanziós tér szükséges - split és splitless üzemmód „Splittelés” hátrányai 1. A minta alkotói közötti diszkrimináció 2. A splitarány mérés közbeni ellenırizhetetlen megváltozása 3. A flash párologtatás okozta drasztikus termikus hatásra bekövetkezı esetleges termikus degradáció Gázkromatográf mintabemérı része Cold on-column - hideg injektor, hideg kolonna - illékony, kevésbé hıálló vegyületek injektálására - kolonna elsı része hideg (hőtés) majd fokozatosan melegszik - nincs lehetıség splittelésre Gázkromatográfiás kolonnák Kapilláriskolonnák csoportosítása • mikrokapillárisok: d < 150µm •

standard kapillárisok: 150µm < d < 500µm • makrokapillárisok: d < 0,5 mm Kapilláriskolonnák típusai PLOT, WCOT, SCOT kolonna Adszorpciós Abszorpciós Hordozók kívánalmak: a hordozó szemcsék egységes mérete a szemcsék geometriája a hordozó termikus és mechanikai stabilitása kémiai inertség típusai: diatómaföld alapúak üveg alapúak aktívszén alapúak Megosztófolyadék kívánalmak: hıstabilitás folyékony hallmazállapot jól definiált kémiai szerkezet kémiai inertség kellı nedvesítı képesség oldhatóság mérsékelt ár Megosztófolyadék típusai: szénhidrogén típusú megosztófolyadékok ftálok glikol-észterek poliglikolok (poliéterek) polietilén-glikol származékok nitrilek szilikon fázisok HETP függése a töltet szemcseméretétıl HETP függése a megosztófolyadék mennyiségétıl HETP függése a kolonna átmérıtıl HETP függése a nyomástól HETP függése az eluens

minıségétıl Gázkromatográfiás detektorok univerzális: minden molekulára ad jelet szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben a koncentráció változása detektorjel változást eredményez lineáris tartomány: T= mc (eltérés < 5 %) érzékenység: m (egységnyi koncentrációváltozás hatására bekövetkezı jelváltozás) kimutatási határ: az a koncentráció, melynek mérésénél a detektor válaszjele egyértelmően megkülönböztethetı a háttértıl (LOD) meghatározási határ: az a legkisebb koncentráció, amely megfelelı precizitással és pontossággal meghatározható (LOQ) Gázkromatográfiás detektorok • FID (flame ionization detector – lángionizációs detektor) • ECD (electron capture detector – elektron befogási detektor) • FPD (flame photometric detector – lángfotometriás detektor) • PID (photo-ionization

detector – foto-ionizációs detektor) • MS(D) ( loecule selective detector – tömegspektrometriás detektor) • TCD (thermal conductivity detector – hıvezetıképességi detektor) Hıvezetıképességi detektorok hıvezetés: idıegység alatt, 1 m hosszon, 1K hımérsékletkülönbség hatására átszármaztatott hımennyiség. Anyagi minıségtıl függ - állandó eluensáram állandó hıvezetés főtött szál ellenállása állandó - mintával „szennyezett” eluens változó hıvezetés főtött szál T változik változik az ellenállás detektorjel áramlás ingadozásából adódó hıelszármaztatás kivédése hídkapcsolással Hıvezetıképességi detektorok Hıvezetıképességi detektorok • konvencionális: 0,5-3 cm3 cellatérfogat (töltött kolonna) • félmikrocellás: 25-100 mm3 cellatérfogat (wide bore kolonna) • mikrocellás: 5-10 mm3 cellatérfogat • rétegcellás: 1-10 nl cellatérfogat (integrált mikoráramkörökhöz

hasonló, LOD = 10-10-10-9g) Ionizációs detektorok elektródok között akkor folyik áram, ha ionokat hozunk létre a mintából Ionizációs detektorok Az ionizációhoz használt energia tipusa: - termikus energia (FID) kinetikus energia (ECD, MS) fényenergia (PID) elektromos energia (kisülési ionizációs detektor –DID) Ionizációs detektorok Lángionizációs detektor Ionizációs detektorok Elektronbefogási detektor Minıségi analízis - Összehasonlítás elızıleg mért, ismert anyagok retenciós idejével - Relatív retenció alkalmazása - Addíció - Retenciós indexek - Tömegspektrométer KOVÁTS-féle retenciós index • Alapja: – Szénhidrogén származékok homológ sorában a retenciós idık a C-atom számmal exponenciálisan növekednek ⇓ – Lg tR’ ábrázolva – C-atom szám függvényében egyenest ad – N alkán homológok retenciójához viszonyít KOVÁTS-féle retenciós index I x = 200 * lgt R X − lgt Rn

lgt Rn+2 − lgt Rn + 100n Ix-ismeretlen komponens retenciós indexe tR’n+2 > tR’x (ismeretlen) > tR’n – n-páros szénatomszámú parafin szénatomszáma Jelentıssége: – Ismeretlen komponens azonosítása Mennyiségi analízis A detektor érzékeli az oszlopból kilépı gázáram valamilyen fizikai v. kémiai tulajdonságának megváltozását jelfeldolgozás Az elektromos jel – Függhet: • koncentrációtól (konc. érzékeny) • idıegység alatt a detektorba jutó minta mennyiségtıl (tömegáram érzékeny) – A jel és a konc. ill a tömegsebesség közötti függvénykapcsolat keressük a mennyiségi elemzés során Mennyiségi analízis - Csúcsterülethez (A) keressük az anyagmennyiséget (m) - Csúcsterület meghatározás integrálással (ma elektronikus integrátorokkal) Mennyiségi értékelés Módszerek: – Kalibrációs görbék felvétele – Belsı standardok – Addíciós módszer Kalibrációs módszer A3 Aism A2 A1

m1 m2 mism m3 Ismert koncentrációjú mintasorozat mérésével kalibrálva, azaz kalibrációs görbe felvétele után az ismertelen koncentrációja(tömege) a görbérıl visszaolvasva meghatározható Addíciós módszer Belsı standard módszer Relatív érzékenység f=Ai/As*ms/mi a vizsgálandó mintához olyan anyagot (belsı standardot) adunk, amelyet a minta nem tartalmaz, de jól elváló jelet ad, és ehhez viszonyítjuk a mintakomponensek által szolgáltatott jeleket. Elızetesen meg kell határozni a minta-komponensek belsı standardra vonatkozó relatív érzékenységét. Ipari oldószerek GC analízise Speciális feladatra tervezett állófázisokat is árulnak A folyadékktomatográf (HPLC) A folyadékkromatográfiás rendszerek felépítése I. A folyadékkromatográfiás rendszerek felépítése II. A folyadékkromatográf felépítése Eluens tárolók Üvegedény (vizes rendszereknél: ionok oldódnak ki) Mőanyag edény

(szerves eluensek lágyítókat, adalékokat oldanak ki) Eluensek gázmentesítése • • • • Forralás (differenciális párolgás) Vákuum alkalmazása (differenciális párolgás) Ultrahang alkalmazása He alkalmazása (leghatásosabb) Szivattyúk Szivattyúkkal szemben támasztott követelmények: 1. Nagy nyomáson szállítson akár kis, akár nagy térfogati áramlási sebességgel 2. Pulzálás csökkentés akár mechanikusan akár elektronikusan 3. Cserélhetı nagynyomású szivattyúfej (analitikai-preparativ; acél-titán-teflon: biológiai minták) 4. Automatikus kompresszibilitás kompenzáció 5. Kompatibilis kis forráspontú oldószerekkel 6. Kompatibilis pufferolt eluensekkel 7. Kompatibilis ionpár-képzı anyagokkal 8. Gyors eluens csere biztosított legyen 9. Kis „hold-up” térfogat 10.Számítógépes vezérlés (mozgófázis összetétel, gradiens vezérlés, áramlási sebesség, stb) Állandó nyomáson szállító szivattyúk 1. Pneumatikus

szivattyú Elıny: - olcsó - egyszerő - pulzálás mentes Hátrány: - térfogat és végnyomás korlátozott - térfogati sebesség a viszkozitás és permeabilitás függvénye 2. Pneumatikus erısítéső szivattyú (Haskel type) Elıny: - olcsó - oldószercsere egyszerő - nagy térfogati sebesség érhetı el - szállítási nyomás gyorsan beáll Hátrány: - térfogati sebesség a viszkozitás és permeabilitás függvénye Állandó áramlási sebességgel szállító szivattyúk 1. Fecskendı típusú szivattyú (Syringe-type) Elıny: - pulzálás mentes - térfogati sebesség független a viszkozitástól és a permeabilitástól - térfogati sebesség könnyen szabályozható - szállítási nyomás gyorsan beáll Hátrány: -drága - kapacitás korlátozott - oldószercsere bonyolult 2. Alternáló dugattyús szivattyú (Reciprocating piston pump) Alternáló dugattyús szivattyúk szállítóteljesítmény görbéi Alternáló dugattyús

szivattyúk Elıny: - térfogati sebesség független a viszkozitástól és a permeabilitástól - térfogati sebesség könnyen szabályozható - a belsı szivattyú térfogata kicsi Hátrány: - pulzáló folyadékszállítás - a szállított folyadékmennyiségi tartomány korlátozott - a szállítási nyomást lassan éri el A kompresszibilitás hatása a szállítóteljesítményre Szívóütem után: - folyadék térfogata: V = m / ρ (ρ ρ = g/cm3) - nyomás növelésével ρ változik - Darcy: K o ∆P u= η Lε - a térfogatcsökkenés a folyadékkromatográfiás körülmények függvénye - A kolonna bemenetnél a térfogati áramlási sebesség csökken - kompresszibilitás kompenzáció: -mechanikus -elektronikus 3. Membrán szivattyú (membrane piston pump) Elıny: az eluens nem érintkezik a tömítésekkel Pulzálás csökkentés: - több szivattyúfej alkalmazása - 500 1/min frekvencia alkalmazás -400 bar nyomás az acélmembránon 4. Egydugattyús

gyors feltöltéső szivattyú szállítás Feltöltés 200 ms ko m pr es sz ibi lit ás szállítás 5. Sorba kötött két dugattyúfejes szivattyú Csak a szívófejen van szívó és nyomószelep Pulzálás mentesítés: elektronikusan: egyik ágban állandó nyomás másik ágban állandó áramlási sebesség A nagynyomású szivattyúk mőködését befolyásoló tényezık 1. Szilárd részecskék hatása 2. Oldott gázok hatása 3. Korróziós hatás 1. Szilárd részecskék hatása a. eltömi az eluens szőrıt és a szelepek védı szőrıit b. rárakódik a szelepülésekre c. eltömi a nyomásmérı egységet d. eltömi a kapillárisokat e. Eltömi a mintaadagolót Következmény: - szállítóteljesítmény változása - pulzálás - nyomásnövekedés Kiküszöbölés: -eluens szőrése 0,4 – 0,5 µm pórusú szőrın -oldószer gyárilag szőrve: 0,2 – 0,4 µm pórusú szőrın Szilárd részecskék eredete: a. Eluensbıl válik ki -

kristálykiválás pufferekbıl eluensek elıre elkészítése izokratikus módban - algák, baktériumok elszaporodása: nagy víztartalmú eluensekben b. Szivattyú tömítések morzsolódása - dugattyúk mőködés közbeni mosása 2. Oldott gázok hatása 1. Oxigén oldódása vízben és szerves oldószerekben 2. Pulzálás: a szívóütem után nincs addig folyadékszállítás amíg a gázbuborék nyomása el nem éri a kolonna belépı nyomását 3. Oxigénbuborékok keletkezése víz-meteanol (exoterm), víz-acetonitril (endoterm) oldószer párok keverésekor. 4. Levegımentesítés (lásd: eluenstárolók) 3. Korróziós hatás HPLC technika: rozsdamentes acél (SS 316) használata Haloid ion (Cl-, Br-) korrózió Korróziós folyamatok víz-metanol, víz-acetonitril eluens rendszerekben: 0,1 ppm feletti Oxigén koncentráció jelenlétében az O2 redukálódik: O2 + 2 H2O + 4e- ⇔ 4 OHA vas anódos oxidációval oldódik: Fe Fe2+ + eKatódos és anódos

reakciótermék reagál: Fe2+ + 2 OH- Fe(OH)2 Oxigén jelenlétében: 4 Fe(OH)2 + O2 + H2O 4 Fe(OH)3 2 Fe2O3 + 6 H2O Megjelennek a vasoxid különbözı formái: zöld, vörös, barna Passziválás: foszfát puffer, idınként salétromsav használata Adagolók 1. Kézi adagolók 2. Automata adagolók Oszlopok Anyaga: -acél -PEEK (poliéter-éter keton) -üveg Mérete: Oszlophossz (cm) 20-50 10-20 10-15 5-10 2-5 Oszlop belsı átmérı (mm) 5-10 4-6 4-6 2-4 2-4 20-40 10-20 5-10 3-5 <2 Töltet szemcse átmérı (µm) Oszlop csatlakozók Oszlop- és összekötı csatlakozók Folyadékkromatográfiás detektorok Folyadékkromatográfiás detektorok felosztása és alkalmazásuk gyakorisága •UV-Vis (80%) •Fluoreszcens (5%) •Elektrokémiai (5%) •Törésmutató mérı (RI) (2-3%) •Vezetıképességi (2-3%) •Fényszórásos (ELSD) (2-3%) Folyadékkromatográfiás detektorok összehasonlításához használt

paraméterek •Detektor zaj •Dinamikus tartomány •Lineáris tartomány •Detektálás alsó határa •Cella térfogat és kialakítása •Idıállandó •Nyomásváltozás hatása a jel/zaj viszonyra •Áramlási sebesség hatása a jel/zaj viszonyra •Hımérséklet hatása a jel/zaj viszonyra Rövid távú zaj Statikus: 0.5-15x10-4 AU / perc Dinamikus: 0.5-10x10-4 AU / perc Hosszú távú zaj Statikus: 1.0-40x10-4 Dinamikus: 1.0-50x10-4 AU / 10 perc AU / 10 perc Alapvonal mászás (drift) Statikus: 5.0-100x10-4 Dinamikus: 2.0-60x10-4 AU / óra AU / óra A jel és zaj viszonyának (s/n) szemléltetése Folyadékkromatográfiás detektorok jelleggörbéje Dinamikus tartomány: a jel arányos az anyag mennyiséggel Lineáris tartomány: lineárisan arányos anyagmennyiséggel (5%) a jel az Detektálás alsó határa (DAH, LOD): a jel 3x nagyobb, mint a zajszint Mennyiségi mérés alsó határa (LOQ): a jel 10x nagyobb mint a zajszint Dinamikus

tartomány: a jel arányos az anyag mennyiséggel Magában foglalja a lineáris tartományt Lineáris tartomány: a jel lineárisan anyagmennyiséggel (5% eltérésig) s=ac arányos az ahol: s detektorjel a detektor érzékenysége c a minta koncentrációja Fowlis és Scott: s = a cr ahol: r válasz index (0.98 < r < 102) r függ a készülék felépítésétıl Lineáris tartomány: a legnagyobb koncentráció és a DAH közti szakasz A detektor érzékenysége a = ∆s / ∆c illetve a = ds / dc A detektor érzékenysége: az analitikai egyenes meredeksége illetve nem lineáris tartományban a jel koncentráció szerinti deriváltja Az érzékenység alapján nem lehetséges a detektorok összehasonlítása: Uv-Vis: AU / (mol dm-3) Elektrokémiai: nA / (moldm-3) Gyakorlatban: mV/ koncentráció Kimenı jel: vagy Detektálás alsó határa (DAH, LOD) A detektor érzékenység és a detektálás alsó határa Detektorra vonatkozó DAH: az adott anyagra

jellemzı koncentráció mely a detektor cellában áthaladva a zaj kétszeresének megfelelı jelet ad Kromatográfiás rendszerre vonatkozó DAH: az adott anyagra jellemzı koncentráció mely a kromatográfiás rendszerben (adagoló, kolonna, detektor cella) áthaladva a zaj kétszeresének megfelelı jelet ad A kromatográfiás rendszer detektor érzékenysége (XD) és a legkisebb kimutatható anyagmennyiség (m) függ: - Kolonnára jellemzı adatok a) geometriai méret (r, L) b) töltet jellemzık (ε, N, dp) - Visszatartásra jellemzı adatok (k, N, mozgófázis összetétel) - Detektorra jellemzı adatok Uv-látható (Uv-vis) detektorok Egyutas detektor Kétutas detektor A detektorok fényforrása Deutérium lámpa Xenon lámpa alap 500 óra Alkalmazható hullámhossz tartomány: 190 – 800 nm 210 - 550nm Állandó hullámhosszon mőködı lámpák Hg gız lámpa 253 nm (szőrı) Zn lámpa 213, 307 nm (szőrı) Cd lámpa 228.8 nm (szőrı) Szerves

oldószerek fényelnyelése Az oldószer fényáteresztı képessége (Uv cut-off): Az a legkisebb hullámhossz, ahol a transzmittancia 10%-ra csökken Oldószer Uv cut-off (nm) Acetonitril 190 Metanol 205 2-propanol 205 Dioxán 215 tetrahidrofurán 230 Fordított fázisú kromatográfiában használt oldószerek tisztaság vizsgálata gradiens elúcióval Elméleti görbe Gyakorlati görbe 100% 0% A detektor optikai felépítésének jellemzésére szolgáló paraméterek: 1. Hullámhossz beállítás torzítatlansága (accuracy) 2. Hullámhossz beállítás reprodukálhatósága (reproducibility) 3. Sávszélesség (bandwith) 1. és 2 Legtöbb készülék automatikusan végzi a hullámhossz kalibrációt 2. Sávszélesség hatással van az érzékenységre és a linearitásra -nagyobb sávszélességnél nagyobb lesz a fotodiódára jutó energia, jel/zaj viszony javul, kimutatási határ csökken. -De: nagy energia és sávszélesség hatására az

intenzításkülönbség csökken és ezzel az abszorbancia (A) kisebb lesz Minden olyan hatás, mely a zajt növeli, csökkenti a detektor érzékenységet és növeli a detektálás alsó határát. Ezért vizsgálni és optimalizálni kell: - Detektor cella kialakítását - Detektor kimeneten az elektronikus szőrı idıállandójának hatását (kromatográfiás csúcs torzulás) - Hımérséklet változás hatását - Áramlási sebesség hatását - Nyomás-ingadozás hatását A detektor cella térfogatának és geometriájának hatása Hagyományos cellák: - hengeres furat - úthossz: 4-10 mm - térfogat: 4-8 µL Úthossz csökkentésével az RI hatás csökkenthetı (Lambert-Beer törvény) „Taper beam” cella -RI hatás csökkentése -Jel/zaj viszony növelés: optikai úthossz növelés (határt szab a cellatérfogat növekedés, kolonnán kívüli zónaszélesedés) A detektor idıállandójának hatása a jelre Az idıállandó (τ) (a jel mennyi

idı alatt követi a detektorban bekövetkezı változást): τ növelése - csökkenti a jel/zaj viszonyt, de -torzítja a kromatográfiás csúcsot -változtatja a maximum helyét (minıségi analízis) -Általános szabály: az idıállandó nem lehet nagyobb, mint a hot idıhöz tartozó σt zónaszélesedés tized része Nagyhatékonyságú, pl. 3 cm kolonnánál, ha a holtidınél mért zónaszélesedés σt = 150 ms, a detektor idıállandója 15 ms kell legyen. Hımérséklet változás hatása a jel/zaj viszonyra Modern detektoroknál, ahol a zajszint 10-5 AU, a hımérséklet változás törésmutató változást okoz az eluensben (RI hatás; ld. detektor) Általában: 1˚C hımérséklet változás 10-4 AU változást okoz. Áramlási sebesség és a nyomás-ingadozás hatása a jel/zaj viszonyra Általában igaz, hogy a fényelnyelés független az áramlási paraméterektıl. Szők csıben az áramlási sebesség és nyomásesés változás nyíróerı változást

okoz az eluensben az egyes rétegek között. Ez hımérsékletváltozást okoz, ami együtt jár a törésmutató megváltozásával. Többcsatornás Uv-vis és diódasoros detektorok Többcsatornás detektorok: Különbözı hullámhosszakon egy idıben több kromatogramot képesek rögzíteni Maximum 8 hullámhosszon mőködnek (8 fotodióda) Az adatfeldolgozó szoftver kisebb kapacitású mint a diódasoros módban mőködı szoftveré Diódasoros detektor: helyesebben diódasoros detektálási mód (DAD, diode array detection) Többcsatornás detektorok, idı-, intenzítás- és hullámhossz adat együttest győjtenek, és az adatokat számítógépen tárolják (utólagos értékelés) Diódasoros detektor felépítése Mintát fehér fénnyel világítjuk meg, fényfelbontás a küvetta után történik. 190-800 nm között általában 128-1024 fotodióda. Felbontás 1-5 nm Diódák jele kombinálható, ekkor a felbontás csökken. A diódasor néhány msonként

letapogatja a spektrumot Gyors pásztázó és diódasoros detektorok összehasonlítása gyors pásztázó: egyetlen dióda, a rács mozog diódasoros: 128-1024 dióda, a rács helyzete állandó A diódasoros (gyorspásztázó) detektor adatszolgáltatásai A: háromdimenziós kép; B: spektrum; C: kromatogram; D: izoabszorpciós vonalak Diódasoros detektor nyújtotta szolgáltatások A t, λ, A mintavételezés sőrősége, mérés utáni korlátlan felhasználás lehetısége Változtatható paraméterek: •Mérési idı: akár több óra is lehet •Hullámhossz tartomány: (190-800 nm között) változtatható •Mintavételezési idı: fotodiódák kiolvasási ciklusideje (néhány ms, ha túl nagy torzítja a kromatogramot) •Optikai sávszélesség: alapvetıen befolyásolja a spektrumot •Integráló program: a mennyiségi kiértékeléshez •Spektrum feldolgozási lehetıségek: csúcstisztaság ellenırzés Csúcstisztaság ellenırzés ( )≡ ( ) (

) ( )       ≡   ( )≡ ( ) 
  Fontos: •Mekkora a legkisebb minta koncentráció, ahol a spektrum még értékelhetı •Jel/zaj viszony megfelelı •Matematikai eljárás (szoftver) alapján egyértelmő legyen a csúcs tisztaság Fluoreszcenciás detektálási mód Fluoreszcencia: besugárzás és az emisszió közti idı: 10-5 - 10-8 s Gerjesztı fény: fehér ⇒ rács (prizma) ⇒ λ1 Emittált fény: rács (prizma) ⇒ λ2 fekete test λ1 λ2 Foszforeszcencia: az emisszió késleltetett (intersystem crossing) Merck fluoreszcens detektor Törésmutató (RI) mérı detektor Elsı on-line detektor A komponens és a mozgófázis törésmutatója eltérı Univerzális detektor Feltétel: Állandó összetételő mozgófázis Állandó hımérséklet Hımérséklet hatás Hımérséklet változás ⇒ RI változás Ultra termosztálás: 0.001°C Kolonnáról lejövı mozgófázist felcsévelt 0.1-02 µm ámérıjő termosztált

kapillárison és detektoron vezetik át Szivattyú pulzálás hatása Pulzálás ⇒ nyomásváltozás ⇒hımérsékletváltozás ⇒RI változás RI detektorok differenciális mőködésőek: referencia ág ⇔ mérıág közti RI különbség mérése: váltakozva mérik a törésmutatót a két ágban Uv detektorhoz képest: DAH 3-4 nagyságrenddel nagyobb Fényelhajlás elvén mőködı RI detektor •Referencia ág: csak tiszta mozgófázis •Mérı ág: mozgó fázis + minta •Ha a két ágban azonos a mozgófázis összetétel, a tükörrıl visszavert fénynyaláb elhajlása ugyanolyan mértékő, de ellentéte irányú, a diódán a folt zeró jelet ad •Ha a mérıágban a mozgófázis összetétel megváltozik, a tükörrıl visszavert fénynyaláb elhajlik, a folt helyzete megváltozik a diódán, a jel zérótól eltérı (+ vagy – lehet) • Nagy lineáris tartomány Teljes visszaverıdés elvén mőködı RI detektor Fresnel elv: üveg és folyadék

határfelületrıl visszavert fény mennyisége függ: •fény beesési szögétıl •a két fázis törésmutatója közti különbségtıl •maximális érzékenység: üveg és folyadék határfelületre érkezı fény beesési szöge a kritikus szöghöz közeli Differenciális mőködés Referencia és mérıcella: teflon (3 µL), a prizma és a tükrözı hátlap közé fogva ⇒ mozgatható optikai padon ⇒ beesési szög változtatható Törésmutató tartomány: 1.33 – 163 RI detektor alkalmazása 1. Szénhidrátok elemzése 2. Méretkizárásos kromatográfia 3. Kıolajipar, alifás szénhidrogének 4. Zsiralkoholok elemzése (háztartási vegyipar) 5. Polimerek vizsgálata (polietilén, propilén Alapvetı hátrány: 1. Nagy LOD 2. Érzékeny a hımérséklet és áramlási sebesség változásra 3. Nem használható gradiens elúcióban Elpárologtatással egybekötött fényszórás elvén mőködı detektor ELSD: evaporative light-scattering detektor

Univerzális Mőködési elv: • Kolonnáról lejövı eluens porlasztása • Oldószer elpárologtatása (Főtés) • Nem illékony részecskék visszamaradnak • Részecskék megvilágítása (lézer, W lámpa) • A részecskéken szórt fény mérése Szemcsék mérete ( 0.2 – 30 µm) és száma függ: •Mozgófázis áramlási sebessége •Porlasztó gáz áramlási sebessége •Oldószerek felületi feszültsége •Viszkozitás •Sőrőség Független: a részecskék kémiai tulajdonságától Jel – koncentráció összefüggés: nem lineáris Elıny: Gradiens technika alkalmazható Nem alkalmas: Molekulák, nagy cseppek detektálására Reprodukálhatóság: állandó mőködési paraméterek Elektrokémiai detektálási mód Elektrokémiai detektálás: • Elektronátmenet az elektródokon ⇒ hımérséklet függı ⇒ termosztálás • Elektródfelületre jutó anyagmennyiség ⇒ áramlási sebesség függés ⇒ pulzálás függés re du kci ós á

r a m ox id ác ió s Oxidáció ⇔ redukció A, B, C anyag i - E görbéi Redukciós üzemmód •Hg-elektród •O2 mentes közeg (O2 is redukálódik) •Mozgófázis áramvezetı (normál fázisú kromatográfia: nem vezetı oldószerek) Oxidációs üzemmód • Kis felülető elektród: 8-10%-os áramkihasználás: amperometriás detektálás (glassy carbon elctrode; inert de áramvezetı) • Nagy felülető elektród: 100%-os áramkihasználás. Coulombmetriás detektálás (porous graphite electrode; az eluens az elektródokon átáramlik) Egyéb folyadékkromatográfiás detektorok Viszkozitás mérı detektor Vezetıképesség mérı detektor: ionkromatográfia Infravörös detektor Radioaktív detektor Transzport detektor Ionkromatográfia (IC: Ion Chromatography) Ionok elválasztása: eltérı sebességgel haladnak át egy megfelelıen megválasztott oszlopon Ioncserélı gyanták 1971: „forced flow chromatography”: N2 gáz +UV-Vis spektrofotometria:

Fe(III) elválasztása HPLC fejlıdése megteremtette a mőszeres hátteret az IC fejlesztéséhez hiányoztak a detektorok (klasszikus HPLC detektorok nem alkalmasak) 1975: vezetıképesség-mérésen alapuló detektálás: modern IC elválasztásért felelıs oszlop szulfonált polisztirol-DVB kicsiny ioncserekapacitás: 0,02 mmol/g „elnyomó” oszlop nagy ioncserekapacitás Ionkromatográf: Dionex Co. Kationokra: spektrofotometriás meghatározások léteztek korábban is Anionokra kicsiny koncentrációban (ppm) nem volt analitikai módszer Ionkromatográfia (IC: Ion Chromatography) elválasztás: álló- és mozgófázis közötti ioncsere-egyensúlyon alapul szervetlen és szerves ionok elválasztására Minta halmazállapota: folyadék
nagyhatékonyságú analitikai módszer
kvalitatív & kvantitatív információk
összetett minták analízise
a mintát alkotó komponensek szétválasztása Mozgófázisa: folyadék Állófázisa: ioncserélı technikai

kivitelezés: oszlop (kiszorításos), elúciós analízis Ionkromatográf felépítése: hasonló a HPLC-hez Elúciós analízis leggyakrabban alkalmazott technika jel integrális detektor 1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása 2. minta bevitele 3. elúció A detektort elérı mintakomponens(ek) B felgyülemlett mennyiségét méri. A Minta: A & B A: kevésbé kötıdik tA tB differenciális detektor Analitikai információ: minıségi: t (retenciós idı) mennyiségi: csúcs területe idı jel •az állófázisra juttatott minta mennyisége igen kicsiny „elhanyagolható” az eluenséhez képest •nincs szükség regenerálásra Pillanatnyi különbséget mérnek az áthaladó eluens összetételében. idı Állófázis: •térhálósított mőgyanta (pl: polisztirol-divinilbenzol kopolimer) vázon ioncserélı funkciós csoportok •módosított szilikagél Ioncserélık: •erıs •gyenge Ioncserélık: •kationcserélık

•anioncserélık erıs kation: -SO3H (szulfonsav) gyenge kation: -COOH erıs anion: kvaterner aminocsoport gyenge anion: primer aminocsoport Kationcserélı: n RSO3H + Mn+ (RSO3)nMn+ + n H+ anioncserélı: n RN(CH3)3OH + An- [RN(CH3)3]nA + n OH- Ionok megkötıdése függ:
méret
töltés
hımérséklet
ionerısség
pH Állófázis: pórusos gyanták: diffúzió: csúcs kiszélesedés hatékonyság növelése: felületi porózus réteg: éles csúcsok (kicsiny minta kapacitás) Mozgófázis: Kationok elválasztása: erıs sav híg (vizes) oldata Anionok elválasztása: erıs bázis híg (vizes) oldata Detektor: vezetıképesség mérés eluens: nagy a vezetıképessége: nagy háttérjel szupresszor oszlop: vezetıképesség „elnyomó” kompetíció a H+ (OH-) és a Mn+ (An-) között az ioncserélı helyeken Kationcserélı analitikai oszlop: nagykapacitású anioncserélı szupresszor Analízis: Kationcserélı: (KCl meghatározás acidi-alkalimetriásan) n

RSO3H + Mn+ (RSO3)nMn+ + n H+ Elnyomás: H+ semlegesítése (eluens + minta) n RN(CH3)3OH + An- + nH+ [RN(CH3)3]nA + n H2O An-: az eluens anionja az eluens anionja megkötıdik és vele ekvivalens mennyiségő hidroxidion kerül az oldatba lecserélıdik az analitikai oszlopon elválasztott kation ellenionja is: ekvivalens mennyiségő OH- jut az oldatba vezetıképesség mérés & kationok eluens tároló pumpa ionelnyomó kolonna adagoló detektor analitikai kolonna PC ionelnyomásos IC anionok elválasztása: kationcserélı szupresszor Szupresszor oszlop: regenerálást igényel csúcs kiszélesedét okoz – hatékonyság csökkenés Gyenge savak anionja nem meghatározhatók: savas forma kicsiny vezetıképesség-változást eredményez Kicsiny ioncserekapacitású oszlopok megjelenése: nem szupresszált rendszerek Anioncserélı: TÖLTET-E- + A- TÖLTET-A- + E- nem szupresszált rendszer (nincs szupresszor oszlop): kicsiny vezetıképességő mozgófázis

alkalmazása eluens tároló adagoló pumpa detektor Mozgófázis: •benzoesav •ftálsav •borkısav •citromsav PC analitikai kolonna egykolonnás (nem szupresszált) IC Detektor: •vezetıképesség mérés •UV-Vis 1980’ Töltetek fejlıdése: hatékonyság növekedés: folyamatosa növekvı számú alkalmazás töltettel szemben támasztott követelmények: •lehetı legnagyobb tányérszám •töltet/eluens rendszer: gyors egyensúly (kinetikus csúcs kiszélesedés minimalizálása) •retenciós idık: se túl nagy, se túl kicsi •töltet/eluens rendszer: detektorral kapcsolható legyen Oszlop anyaga: •saválló acél •PEEK (poli(éter-éter-keton)) Oszlop méretei: átmérı: 1-8 mm Töltet: hossz: 3-30 cm polisztirol-DVB kopolimer módosított szilikagél cellulóz alapú Az oszlop szerves polimer-alapú töltetek: kevésbé nyomástőrı (keresztkötések számával javítható) duzzadnak: szerves oldószer csak kisebb koncentrációban

alkalmazható pH stabilitás: 1< pH < 14 szilikagél: pH: 3-8 kicsiny (µm) szemcsék (HPLC) különbözı mérető pórusok: mikro & makro pellikuláris töltet: az állófázis porózus külsı héjat alkot egy áthatolhatatlan szemcse felületén Kationcserélı HO3S HO3S HO3S kicsiny ioncserekapacitás: felületi módosítás SO3H Anioncserélı CH2N+ R3 CH2N+ R3 R3+NCH2 kicsiny ioncserekapacitás: felületi módosítás CH2N+ R3 OH Módosított szilikagél OH SiO2 OH OH OH H = A + B/u + C * u H [mm] A van Deemter egyenlet általános ábrázolása C*u Hmin B/u A u szabálytalanabb töltet: nagyobb áramlási egyenlıtlenségek kisebb szemcseméret: kisebb egyenlıtlenségek u [cm/s] Mintaadagolás 1. a mintát pillanatszerően kell bejuttatni az eluensbe 2. keveredjen el az eluenssel (OLDHATÓSÁG) minta térfogata: 10-50 µl (nincs térfogatváltozás) mikroliterfecskendı: A bevitt minta térfogatát az adagolón

elhelyezett hurok („loop”) térfogata határozza meg. hatutas bemérı szelep alternáló mozgást végzı, kis dugattyú-térfogatú pumpa (reciprocating pump) pulzálás: jelentısen csökkenthetı: ikerfej alkalmazása (fáziseltolás) V térfogat: 10-100 µl továbbított folyadék mennyisége: korlátlan áramlási sebesség változtatása: •löket hossz •dugattyú sebessége idı DETEKTOROK Az eluenst alkotó ionok jelenlétében képesnek kell lennie, a minta ionjainak mérésére. •csak a mintát alkotó komponensekre ad válaszjelet •csak az eluenst alkotó komponensekre ad válaszjelet (indirekt detektálás) Eluens megválasztása: minél kisebb detektorjel Detektorok Kolonna: idıben (térben) elválasztja az egyes alkotókat Az adott komponens az eluenssel (vivıgázzal) együtt beáramlik a detektorba. mennyiségi analízis: a detektor által elıállított jel arányos az anyag koncentrációjával vagy idıegység alatt bejutott

mennyiségével univerzális: minden molekulára ad jelet szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet destruktív nem destruktív dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben a koncentráció változása detektorjel változást eredményez lineáris tartomány: T= mc (eltérés < 5 %) érzékenység: m (egységnyi koncentrációváltozás hatására bekövetkezı jelváltozás) kimutatási határ: az a koncentráció, melynek mérésénél a detektor válaszjele egyértelmően megkülönböztethetı a háttértıl (LOD) meghatározási határ: az a legkisebb koncentráció, amely megfelelı precizitással és pontossággal meghatározható (LOQ) UV-Vis spektrofotométer Alkalmazható: UV-Vis tartományban elnyel az adott komponens Lambeert-Beer: Aλ = ελ c l mérı ág „fényosztó” (splitter) rés fényforrás cella (küvetta) I0 I I0 I0 referencia ág monokromátor Fényforrás: UV:

deutérium lámpa Vis: volfrám lámpa Detektor: fotodióda D E T E K T O R A = lg I0/I Cella: kvarc küvetta l=5-10 mm Diódasoros detektor DAD (Dioda Array Detector) polikromátor fényforrás lencse cella (küvetta) diódasor Elıny: különbözı hullámhosszúságon mért elnyelések egyidejő mérése spektrum felvétele: minıségi információ Fluoreszcencia mérésen alapuló detektor fluoreszkáló anyagok detektálása monokromátor rés cella (küvetta) fényforrás monokromátor Detektor: a kibocsátott fényt méri pl. festékanyagok Vezetıképesség mérésen alapuló detektor Vezetıképesség: G [Siemens] 1/R Ha egy elektrolit oldatba két azonos mérető, sík felülető, párhuzamos elektródlap (pl. Ptlap) merül, amelyek felületének nagysága A, a köztük levı távolság pedig l, akkor az így kapott vezetıképességi cellára igaz, hogy K=A/l: cellaállandó (geometria) κ: fajlagos (specifikus) vezetıképesség: megadja a két,

egységnyi (1 cm2) felülető, egymástól egységnyi távolságra (1 cm-re) levı elektród között levı elektrolitoldat vezetıképességét oldatok vezetıképessége: additív tulajdonság Függ:
ionok minıségétıl (mozgékonyság)
ionok számától (koncentráció) Semleges molekulák: nem detektálhatók Elv: 2 elektród (acél) elhelyezve az áramlási cellában megfelelı feszültség: áram folyik Áramerısség: töltés, méret, koncentráció, oldószer, hımérséklet Egyenfeszültség: elektrolízis veszélye Váltakozó feszültség: 100-10 kHz, U= 20 V „Érintkezés mentes” cella Egyéb detektorok: •potenciometria •amperometria •atomabszorpció •ICP •tömegspektrometria Termosztát: oszlop: ioncsere: hımérséklet függés eltérés a HPLC-tıl: •Ionokat mérünk (HPLC is) •Ioncserélı oszlopokat használ (HPLC is) ALKALMAZÁSOK: Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari Környezetvédelmi Kapilláris elektroforézis

elektroforézis: valamely vezetı közegben (általában víz) elektromos erıtér hatására a töltéssel rendelkezı részecskék elmozdulnak elektroforetikus elválasztás: az elválasztandó komponensek adott elektromos tér hatására kialakuló eltérı migrációs sebességén alapul elektroozmotikus áramlás: (electroosmotic flow, EOF) a folyadék elektromos tér hatására valamely töltéssel bíró felület mentén kialakuló elmozdulása κ=GK Λm = κ: fajlagos vezetıképesség [S cm-1] G: vezetıképesség [S] K: cellaállandó [cm-1] κ c moláris fajlagos vezetıképességet (Λm) Kohlrausch elsı törvénye Λm = λ + λ + − λ+: a kation moláris fajlagos vezetıképessége [cm2Ω-1mol-1] λ-: az anion moláris fajlagos vezetıképessége [cm2Ω-1mol-1] az elektroforetikus mozgékonyság függ:
az ion töltésétıl (lehet pozitív ill. negatív töltésének elıjelétıl függıen)
sugarától
alakjától
szolvatáltságának mértékétıl
a

közeg viszkozitásától
pH-jától,
ionerısségtıl
hımérséklettıl üveg felület & víz: szilanol csoportok pH > 2,5: deprotonált forma: pozitív töltéseket vonzanak: negatív elektród (katód) felé mozognak: folyamatos áramlás (dugószerő áramlási profil) PC D E K E D P P „outlet” „inlet” V A kapilláris elektroforetikus készülék sematikus rajza E: elektród; K: kapilláris; D: detektor, P: puffertartó edény; PC: személyi számítógép; V: tápegység E L E K T R O F E R O G R A M kation semleges molekula anion µa: látszólagos mozgékonyság µe: effektív mozgékonyság µEOF: elektroozmotikus áramlás µa = µe + µEOF Alapeset: bemenet: + kimenet: kation: komigrál anion: kontramigrál D katód (-) anód (+) EOF vk va outlet V inlet A kapilláris követelmények: •kémiailag és elektromosan inert •hajlékony •kellıen szilárd •megfizethetı •ne nyeljen el az UV-Vis tartományban

kvarc kapilláris (poliimid bevonattal) 25 µm - 100 µm 10 – 100 cm bevonatos kapillárisok: polimerek, PVA, teflon Kondícionálás: üvegfelület helyreállítása (NaOH) A detektor
megfelelı érzékenység
kimutatási határ
kicsiny zajjal
nagy linearitási tartománnyal
gyors válaszidıvel Többféle mérési elv UV-Vis fluoreszcencia vezetıképesség MS UV-Vis: egyszerő, olcsó, széleskörben alkalmazható UV-Vis Lambert-Beer: A=εcl háttérelektrolit elnyelése fluoreszcencia A tápegység U=5-30 kV I=3-300 µA A feszültség változtatásának hatása: növelve a kapillárisra kapcsolt feszültséget: •nı a térerısség •nı az EOF célszerő nagyobb •csökkennek a migrációs idık feszültségen dolgozni •élesebb csúcsokat kapunk növelve a kapillárisra kapcsolt feszültséget: •nı az áramerısség •egyre több hı szabadul fel (Joule-hı) •kiszélesednek a csúcsok •csúsznak a migrációs idık célszerő kisebb

feszültségen dolgozni Mintabevitel hidrodinamikai injektálás: nyomás alkalmazása elektrokinetikus injektálás: feszültség alkalmazása elektroforetikus mozgékonyságtól függ Áramlási profil EOF lamináris áramlás áramlás hajtóereje a kapilláris belsejében mindenütt azonos lamináris áramlási profilból eredı zónakiszélesedés a kapilláris elektroforézisnél elhanyagolható Szelektivitás: •puffer minısége, koncentrációja •pH Elınyök •rövid analízis idı •nagy felbontóképesség (N: 105-106) •kicsiny oldószerfelhasználás •egyszerő mintaelıkészítés Hátrányok: •kisebb érzékenység •kevésbé robusztus (reprodukálhatósági problémák) ALKALMAZÁSOK: bármi, ami befér a kapillárisba Klinikai Gyógyszeripari Élelmiszeripari Környezetvédelmi Minıségi analízis Alapja: a retenciós idı a minta komponenseinek minıségétıl függ A legegyszerőbb módszer: a retenciós idık (pontosabban a

redukált retenciós idık) összehasonlítása ismert vegyületek retenciós idejével jel relatív retenció (rx,r): a kísérleti körülmények különbözıségébıl származó eltéréseket kompenzálja egy kiválasztott (r) anyagra vonatkoztatott redukált retenciós idı hányadosaként adnak meg: rx ,r idı tx t Rx = t Rr jel idı tr tx Mennyiségi értékelés a kromatogramon levı csúcsok területe (magassága) arányos a mintakomponensek mennyiségével, ill. koncentrációjával Detektor: a komponensek vagy az eluens fizikai vagy kémiai tulajdonságainak mérése 1. kalibrációs módszer 2. addíciós módszer 3. belsı standard módszer jel A kalibrációs módszer c1 T1 T = mc T: csúcs területe c: koncentráció (anyagmennyiség) m: arányossági tényezı (érzékenység) 1. független standard (kalibráló) oldatok T idı jel c2 T2 ismeretlen oldat: Tx T3 Tx T2 idı jel T1 c3 T3 m c1 c2 cx c3 c idı jel Standard

addíció cx Tx T1,x= Tx+T1 T1=T1,x-Tx idı T2,x= Tx+T2 T2=T2,x-Tx jel cx+ c1 T T1,x T2 idı T1 jel Tx cx c1 c2 c2 + cx T2,x c idı Belsı standard: relatív terület meghatározása a mintán belüli referencia
rögzített (meghatározott és állandó) koncentrációban (mennyiségben) a mintához hozzáadjuk a referencia anyagot
a referencia anyag csúcsára vonatkoztatjuk a meghatározni kívánt csúcsok területét Elınyök: az analízis során fellépı hibák egy részét küszöböli ki: adagolás érzékenység változása Analitikai információ: minıségi: retenciós (migrációs) idı retenciós (migrációs) idı függ: alkalmazott körülmények: •mozgófázis •anyagi minıség •áramlási sebesség •állófázis t Rx rx ,r = •minıség t Rr •hossz •hımérséklet •pH, ionerısség •stb minıségi információ: UV-Vis: spektrum Növekvı igények: új detektorok alkalmazása, fejlesztése Tömegspektrométer

Tömegspektrometria (MS) Nobel-díj: 1922, 1989, 2002 Alapelve: a gázállapotú ionizált molekulákat, ezek töredékeit (un. fragmenseit) vagy bizonyos esetekben az atomokból képzıdött ionokat tömegük alapján szétválasztja, majd mennyiségileg meghatározza 1. mintabevitel és a minta gázállapotba hozása 2. ionizáció és bizonyos esetekben fragmentáció 3. a keletkezett ionok töltésegységre jutó tömegük szerinti elválasztása 4. a szétválasztott, különbözı tömegő ionok mennyiségének meghatározása A készülék felépítése: vezérlı- és adatfeldolgozó rendszer mintabevitel ionforrás analizátor vákuumrendszer detektor A vákuumrendszer 1. az ionforrásban megfelelı hatékonysággal elı állíthatók legyenek az ionok 2. megfelelı hosszúságú szabad úthosszat kell biztosítani: az ionforrásban képzıdött ionok ütközés nélkül eljuthassanak a detektorba kb. 10-3 Pa kétlépcsıs nyomáscsökkentés: 1. elıvákuum:

néhány torr 2. nagyvákuum: 10-3 Pa vákuumszivattyú: 1. atmoszférikus nyomásról képes közvetlenül gázt elszívni (rotációs szivattyúk) 2. mőködéséhez un elıvákuum megteremtése szükséges (diffúziós szivattyúk) elınye: kicsiny háttérzaj Elıny: Kicsiny molekula tömegő eluens (pl. H2) is hatékonyan eltávolítható Ionizációs módszerek lehetıvé teszik a különféle halmazállapotú, igen eltérı tulajdonságokkal bíró anyagféleségek ionizációját Elektronionizáció (electron impact ionization, EI) legáltalánosabban alkalmazott ionizációs technika EI 1: mintabevezetı nyílás; 2: ionvisszaverı lemez (repeller); 3: izzószál; 4: elektronbevezetı nyílás; 5 és 6: iongyorsító rés; 7: belépı nyílás; 8: ionképzıdés helye; 9: anód ∆U=5-100 V EI oC T≈ 200 p ≈ 10-8-10-9 atm elektronok U energia molekula gerjesztett molekula elektron emisszió molekulaion fragmens ionok fragmentáció: elektronok

energiája (gyorsító feszültség: 70 eV) minıségi azonosítás (ujjlenyomat) általában : egyszeres pozitív ionok képzıdnek negatív ionok: nagy elektronegativitású atomok vannak jelen a molekulában Kémiai ionizáció (CI) a mintát az elektronforrásba történı belépése elıtt un. „reagens” gázzal hígítják nem a vizsgálandó minta lép közvetlen kölcsönhatásba az elektronokkal, hanem a hígító gáz molekulái mintát alkotó komponensek: szekunder ionizáció RH e RH+ + M RH+ MH+ + R primer-ion képzıdés CH4 + e– = CH4+ + 2e– (CH3+) szekunder-ion képzıdés CH4+ + CH4 = CH5+ + CH3 (CH3+ + CH4 = C2H5+ + H2) protontranszfer a) proton transzfer CH5+ + MH = CH4 + MH2+ b) hidrogén absztrakció CH3+ + MH = CH4 + M+ (C2H5+ + MH = C2H6 + M+) c) töltésátvitel CH4+ + MH = CH4 + MH+ Kémiai ionizáció (CI) Reagens gáz: •metán •i-bután •ammónia Ionizáció: a hígító gáz minıségétıl függıen [M+H]+, [M-H]-, [M+NH4]+

Elınyök: •egyszerősíti a tömegspektrumot •molekulaion tömegét adja meg Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák (atmoszférikus nyomáson mőködnek) minta T elpárologtatás ionizálás kapcsolt technikák: HPLC-MS •termikus ionizáció •elektromos tér okozta ionizáció •ionütközés okozta ionizáció •gyors atom ütközési Analizátorok az ionok tömeg/töltés szerinti elválasztása Jellemzése: 1. maximális tömegszám: amelynek vizsgálatára még alkalmas az adott analizátor 2. transzmisszió: a detektort elérı és az ionforrásban keletkezett ionok hányadosa 3. felbontás: az analizátor mekkora tömegkülönbséggel tud elválasztani két iont •szektor típusú •kvadrupól •ioncsapdás •repülési idı analizátor Szektor típusú analizátorok Ionok elválasztása: Mágneses tér vagy a gyorsító feszültség változtatása mágnes ionnyaláb Fc = mv2/r ½ mv2 = zeU v= ionforrás Lorentz-erı FL = zevB E=

qU=zeU Ekin= ½ mv2 2 zeU m detektor FL= Fc mv2/r= zevB mv 2 r= zevB r = mv/(zeB) = (m/z) (v/eB) Elektrosztatikus analizátor egyszeres fókuszálás: felbontása korlátozott kétszeres fókuszálás: mágneses + elektromos fókuszálás: jobb felbontás Kvadrupólus analizátorok olcsó, egyszerően kezelhetı, stabilis, reprodukálható tömegspektrumot eredményezı analizátor 1: ionizáló elektronsugár; 2: az analizátor által kiszőrt ionok útja 3: az analizátor által átengedett ionok útja; 4: detektor egymással szemben elhelyezkedı rudakat elektromosan összekötve azokra egyenés váltóáramot kapcsolva kvadrupoláris változó elektromos tér alakul ki az ionok oszcilláló mozgást végezve haladnak át oszcilláció amplitúdója függ: •ion töltése •ion tömege •alkalmazott feszültségek Ioncsapdás analizátor: (IonTrap) módosított kvadrupólus analizátor „tárolni tudja az ionokat” Repülési idı analizátorok azonos

kinetikus energiájú ionok sebessége vákuumban, külsı elektromos vagy mágneses teret nem tartalmazó közegben, tömegük négyzetgyökével fordítva arányos ionforrás U Ionok (egyenlı mozgási energia) Kisebb tömegő ion: nagyobb sebesség repülési csı (tér mentes) v= 2 zeU m Detektorok az analizátor által elválasztott, adott idı alatt becsapódott ionok számát határozza meg pontdetektor: az ionok egymást követıen érik el a detektor ugyanazon pontját Csak olyan analizátorral alkalmazható együtt, amely képes az ionokat idıben elválasztani egymástól: pl. kvadrupólus Elektronsokszorozó: 1. a fókuszált ionnyaláb egy un konverziós dinódába ütközve onnan elektronokat lök ki 2. kilökıdött elektronokat megfelelı feszültséggel gyorsítjuk 3. újabb és újabb felülettel ütköztetve megsokszorozott elektronáramot kapunk fotokonverziós detektorok: a becsapódó ionok hatására kilökıdött elektronokat szcintillátor

segítségével fotonokká alakítjuk, majd a kibocsátott fotonokat fotoelektronsokszorozóval elektromos jellé alakítjuk jobb hatásfok, hosszabb élettartam és kisebb karbantartási igény Sordetektor: egymástól térben elválasztott ionok egyidıben érik el a kilépırésnél elhelyezett detektor sort drága: magasabb árfekvéső készülékekben alkalmazzák (TOF, szektor) Kapcsolt technikák valós minták: komplex, sokkomponenső rendszerek A pontos és megbízható minıségi és mennyiségi analízis elképzelhetetlen a mintát alkotó komponensek elválasztása nélkül. elválasztástechnikai eljárás alkalmazása szükséges A hagyományos kromatográfiás technikák azonban még tökéletes szeparáció esetén sem kínálnak abszolút biztonságos minıségi azonosítást. minıségi információ: csak az adott komponens retenciós viselkedése a manapság megkövetelt megbízható és reprodukálható meghatározások indokolják a tömegspektrometria és

az elválasztástechnikai módszerek kombinálását A következı feltételeknek kell teljesülnie ahhoz, hogy a két, meglehetısen eltérı körülmények között mőködı módszert kapcsolni tudjuk egymáshoz: •A kombináció ne vezessen kromatográfiás hatékonyság csökkenéshez. •A kromatográfból a tömegspektrométerbe történı bevezetés során a minta alkotóiban nem kontrollált kémiai átalakulás ne menjen végbe. •A minta megfelelı mennyisége bejusson és ionizálódjon a tömegspektrométerben. •A kromatográfot és az MS-t összekapcsoló un. interfész ne növelje számottevıen a háttérzajt. •Az interfész legyen egyszerő felépítéső, könnyen használható, tisztítható és karbantartható valamint lehetıség szerint olcsó. •Az interfész legyen kompatibilis valamennyi kromatográfiás körülménnyel (pl. vivıgázok, oldószerek, áramlási sebesség, pH, hımérséklet, stb.) •Az interfész ne korlátozza az MS nyújtotta

lehetıségeket (pl. ionizáció, vákuum, felbontóképesség, stb.) •Az interfész alkalmazásával nyert eredmények reprodukálhatók legyenek. HPLCMS Atmoszférikus nyomású ionizációs technikák ESI (ElectroSpray Ionization) Nobel-díj ESI az oldatbeli ionok gázfázisba juttatása COULOMB FISSION ION EVAPORATION APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) nem szükséges ionok jelenléte az oldatban elektromos kisülés: szekunder ionizáció CEMS Interface: •jet-szeparátor •membrán alkalmazása GCMS kicsiny átmérıjő (d ≤ 0,25 mm) kapilláris oszlopok elterjedése: interface nélküli, közvetlen csatlakoztatás EI 1. anyamolekula gerjesztıdik 2. ionizálódik 3. fragmentáció fragmentáció: •kötéshasadás •a molekulát alkotó atomok átrendezıdése tömegspektrum: m/z függvényében ábrázolt beütésszám molcsúcs: molekulaion csúcsa báziscsúcs: legintenzívebb vonal leányion: molekulaionból képzıdı ion

unokaion: leányionokból képzıdı ion