Kémia | Biokémia » Enzimek

1. Enzimek mérföldkövei - Évezredek borjú gyomor tejalvasztó enzim - SCHWAN: gyomorból izolálta a pepszint, fehérjebontó enzim elnevezés - 1876 KÜCHE enzim elnevezés - 1890 TAKAMINE takadiasztase enzimpreparátum (Aspergillus orizae) proteáz, amiláz - 1894 E. FISCHER: α - és β glikozidos kötéssel foglalkozott α -metil-Dglükózt bont a maltóz (élesztő) β -metil-D-glükózt bont emulzim(mandula) 2. - 1913 MICHAELIS -MENTEN: enzimkinetikai leírás - 1926 SUMNER ureáz tisztított enzim kristályos formában, babból fehérjét izoláltak - 1966 Lizozim térszerkezete - 1969 Enzimek és sejtek immobilizálása, de 1823 Franciao. Ecetsav generátor - 1969 TAKABE D, L MET reszolválása (enzim) japán - 1973 6-amino-penicillánsav enzimes előállítása(enzim) - 1974 NOVO HFCS enzimes előállításaÆClinton Corn Prac. CoUSA - 1977 Laktáz (enzim)ÆSnam-Progetti(Olaszország) - 1975 KLIBANOV enzimes reakció szerves fázisban,

átészterezési reakció - 1999 ENZYME DATA BANK 3705 db enzimet tartalmaz Enzim források 2.1 Állati szövetek: • tripszin • rennin • emésztőcsatorna emésztőenzimei • májból glutamát dehidrogenáz 2.2 Növényi eredetű: • papain • bromelin • α -, β -amiláz-Æcsírázó magvakból 1 2.3 Mikroorganizmusok: • Egyenértékű vagy jobb enzimet termelnek. • A géneket egy kedvezőbb tulajdonságú mikroorganizmusba teszik át • Pl: Pneumonieval senki nem fermentálna így a számunkra fontos gént belőle pl. B subtilisbe teszik át . 3. Enzimek piaci helyzete Enzyme preparation Sales(percent of Enzyme (tons/year) total) Bacillus protease 6200 45 Glucoamylases 4500 13 Bacillus amylases 4200 5 Glucose isomerases 1900 6 Rennin(microbial) 1500 10 Amylases(fungal) 800 4 Pectinases 100 3 Proteases(fungal) 100 2 Others - 12 Aunstrup et al.,1979 - 45% baktérium proteázok • mosószerekben • mgj:

a termelésben volt egy hanyatló rész de a problémát megoldották a porzás mentes készítményekkel - 13% glükoamiláz - Bacillus amiláz - Glükóz izomeráz - Rennin • keményítőipar • söriparÆmalátázásra segítenek rá • Tejsavalvasztást csinál • Tejiparban használják 2 • - Borjúgyomorból izolálták gomba eredetű amiláz • söripar • textilipar--->növényi ch-ének emésztése --->írtelenítés - - 4. pektinázok • gyümölcsökben található poliszacharidok • gélesítőanyag • lé tisztább és kezelhetőbb lesz pektináz adagolás hatására • galakturonsavak kötéseit bontja gomba proteázok Enzimek alkalmazása 4.1 Ipar ƒ élelmiszeripar ƒ detergens ipar ƒ textilipar ƒ bőripar ƒ papíripar 4.2 Analitika ƒ glükóz-oxidáz, ƒ alkohol dehidrogenáz, ƒ koleszterin oxidáz 4.3 Orvosi alkalmazás ƒ aszparagináz ƒ proteáz ƒ lipáz ƒ sztreptokináz 4.4

Kutatás ƒ RE 3 5. ƒ Reverz transzkiptáz ƒ DNS-ligáz ƒ DNS-polimeráz Ipari enzimek termelése 1837-ben az enzimtermelés 450 M USD 1995 kb.800 M USD illetve 1998 1600 M USD ipari enzim előállítás, és 23000 M USD terápiás enzim előállítás. 5.1 Ipari enzimek piaca Világtermelési érték (1998) 1600 M USD Terápiás enzimek(1996) ƒ Gastro intestinális betegségnél ƒ Reumás betegségeknél ƒ Anyagcsere betegségeknél ƒ Trombózisnál ƒ Ráknál 23000 M USD a.) Alkalmazásuk Élelmiszeripar 5% Keményítő 11% Detergens ipar 34% Textilipar 11% Bőripar 9% Papír 1,2% 60%-a rekombináns Er ƒ Chymosin (1993) 140M USD ƒ RE (1996) 100 M USD ƒ Taq polimeráz (1998) 80 M USD 4 ƒ Detergens enzimek (1997) 200 M USD A detergens enzimeket site dirested mutagenezissel állították elő, mégpedig úgy, hogy az aktív centrumtól távol eső 8 AS-at módosítottak így megnövekedett a mosóerő valamint

100°C-on a hőstabilitás 34-szeres lett. b.) Rekombinás ER ƒ AQUAZYM ULTRAR : Írtelenítésnél használják B.stearothermohilusÆBlicheniformis ƒ PENICILLIN ACILASER : Ecoli multikópiás plazmid 28X aktivitás ƒ MAXIRENR : Tejipar használja Chymosin borjúÆE.coli(Phizen USA) B.subtilis(Genencon USA) Kluyveromyces lactis (Gist Brocades) ƒ NATUPHOSR: Fitáz Asp.nigerÆAspniger(genomba) 25-30%-kal jobb ƒ PURADAXR: mosó celluláz Bac. BCE(lúg,°C)ÆBsubtilis ƒ CD-GLIKOZIL-TRANSZFERÁZR ciklodextrin Kl.pneumoniaeÆBsubtilis A teljes piac 90%-át 9 cég uralja, melyek az alábbiak: NOVO, GIST BROCEDES,IBIS, GENECORN INTERN,RHONE-POULENC, SOLVAY ENZYM INTERN., COLLECTIVE JAPINDPRODUC,MILES A termelés 40%-át USA adja, Európa 35%-át és Japán 24°%-át. 5.2 Tenyésztés: a) Felületi (mold bran): tálca, forgódob, takadiastase pektum b) Szubmerz Specifikum: ƒ Olcsó termék: Nagy produktivitás kell. Nagy térfogatú fermentor Folytonos: glükóz.izomeráz

(NOVO) Rátáplálásos:α-amiláz, proteáz, pen aciláz Törzsfejlesztés: egy enzim bevitel kell csak ƒ O2 limitben jó termelés: glükóz izomeráz, aspargináz, pen.aciláz 5 ƒ De: proteáznak jó OTR kell ƒ 8% CO2 a levegőben jó az α-amiláz termelés ( B. subtilis) ƒ Alk.proteáz (és mások is) 3 típusú fermentáció Lebontja az extracelluláris fehérjéker: izolálás egyszerű. Katabolit represszió Cél: ne nőjön hanem fehérjét építsen be a sejt Glükáz, fruktóz, sőt glu is (glüko-amiláznál), α amiláz, celluláz, proteáz, amilo-glükozidáz Kivédés: • más, lassan bomló szénhidrát:laktóz, keményítő, mannóz, (cellulóznál)glicerin (α-amiláznál) 1200-szoros aktivitás növekedés • Adagolás (glükóz) • Mutáns (adenil-cikláz regulációs mutáns) Nézzük meg a lac operon esetében a katabolit repressziót. Ha glükóz és laktóz egyidejűleg van jelen a táptalajban, akkor nincs erõs lac expresszió. Ezt a

jelenséget nevezik katabolit repressziónak A glükóz ugyanis jobb szén- és energiaforrás, ezért elõbb ezt használja fel a baktérium. Ekkor nincs szüksége a laktóz hasznosítási enzimekre. Ha a sejt "éhezik" kevés ATP és sok ciklikus AMP (cAMP) keletkezik. A keletkezõ cAMP a katabolit aktivátor proteinnel (CAP ) egy cAMP-CAP komplexet alkot. Ez a komplex pedig aktivátora más cukorhasznosítási géneknek, így a lac operonnak is. Ha a glükóz elegendõ, akkor a cAMP:ATP arány eltolódik az ATP javára és így nincs elég cAMP-CAP komplex, az egyéb cukorhasznosítási operonok (pl. lac, ara ) működése nem aktivált, azaz látszólag represszált. 1.ára Katabolit represszió 6 Indukció Konstitutív enzimek: állandóan termelnek Induktív enzimek:csak akkor termelnek ha kell Mit mivel indukáljunk? • Amilázokat Æ keményítővel • Invertáz Æ szacharózzal • β -galaktozidáz Æ laktózzal • Glükóz-izomeráz Æ

xilóz(xilán, korpa)zal 2.ábra A lac operon szerkezete és expressziója 5.3 Feldolgozás: Intracelluláris enzimek Extracelluláris enzimek (sejtfeltárás) Kicsapás: Na2SO4,(NH4)2 SO4,i-propanol.izoelektromos ponton csapunk ki Kromatográfia: Gél-, ioncserés-, adszorpciós-, biospecifikus-kromatográfia: S-analóg, antitest Membrán elválasztás: ultraszűrés (koncentrálás) Szárítás: • dob-,fluidágyas-,porlasztva szárító,liofilezés • Folyadékban szárítás: drága pl: α -amiláz (2%E+20%NaCl) és Glükoamiláz (5%E) • Por ill. granulálás: extrúderes granulálás (pormentes )pl:proteázok, a detergensben az enzim koncentráció 0,015- 0,025% 7 6. Ipari enzimek 6.1 Amilázok • α-amiláz • β -amiláz • γ -amiláz (pullulanáz, izo-amiláz) • Glülo-amiláz 3.ábra Amilázok fajtái 8 6.11 α-amiláz Jellemzői • extracelluláris enzim • katabolit represszió: glükóz-keményítő(induktor is egyben) •

Thermomonospora:opt °C enzim(53°C) amelyet magasabb hőfokon is lehet használni • B.subtilis: 27-30 °C az optimális hőmérséklete • Az extracelluláris enzim egy szignálpeptid segítségével jut ki a sejtből. 4.ábra Szignálpeptidek működése Minden olyan mikroba termeli amelyik keményítőt emészt: • Aspergillus oryzae • Bacillus licheniformis • Aspergillus niger • Bacillus amyloliquefaciens • Bacillus subtilis • Mucor nemzetség 9 Felhasználás • keményítő lebontás • söripar • írtelenítés Az írtelenítő enzim először a maláta volt.’917 BOIDIN EFFRONT baktérium amiláz melyet 1945 után kereskedelmileg termeltek. Majd 1950-ben NOVO-NORDISK Bsubtilis keerskedelmi enzimet termeltek írtelenítéshez. Ez egy olcsó, stabil, kemikáliákra nem érzékeny, nagy aktivitású enzimÆAQUAZYM. Ezt követően B.stearothermophilus egy nagy hőstabilitású és széles pH optimummal rendelkező kis mennyiségű

enzimet termel. Mivel kis mennyiségben termeli ezt az enzimet ezért B.licheniformisba klónozták(nem patogén, maga is amiláz és proteáz termelő, kicsi a kálcium igénye, nagy az aktivitása)ÆAQUAZYM ULTRAR 6.12 β-amiláz: Mikrobák, amik termelik • Bacillus polymyxa • Streptomyces • Ps.sp Jellemzője • nagyobb hőtolerancia Felhasználás • maltóz szirup előállítás • söripar • erjedési ipar 6.13 Pullulanáz Mikróbák • Pullularia pullulans • Aerobacter aerogenes Jellemzői • α -1,6 kötést bont,határdextrint • induktor: i-maltóz, pullulán <---ma konstitutív mutánssal termelik 10 Felhasználás: keményítő hidrolízis Glükóz előállítás (α -amiláz, pullulanáz, glüko-amiláz) Corn strach(40%w/v) Deionized water Ca2+(20ppm) α -amiláz Pullulanáz 5 min 105°C 60 min 95°C pH 4,5 60°C, filtration Dilution (10-20% dry weight) Glucoamylase 48h 60°C Glucose (98% yield) 11 5.ábra

Keményítő bontás Novo Industries, 1977 1 Æstrach 2Æ glükóz E1Æ α –amiláz (Bac. licheniformis, Asp niger) E2Æ glükoamiláz (Asp. niger) E3Æpullulanase (Pullularia pullulans, Aerobacter aerogenes, Ps.) 1) Áztatás:Kukorica+víz+SO2+ tejsavas baktérium 2) Nedves őrlés, ívszitákÆolaj, rost, fehérje 3) Elfolyósítás: pH: 6-6,5 T=115°C-95°C Termostabil amiláz: Ca aktivál és stabilizál 4) Elcukrosítás: pH:4,2 12 T=60°C Konverzió:98% Enzim:oldható de van immobilizált is Reaktor:Folyamatos kevert reaktor 5) Hidrolízis:48h, glükózzá alakul át, fontos, hogy higítsuk a rendszert mert ha az enzim nem talál vizet akkor transzglikoziláló enzimként működhet , mely képes a cukrokat is hidrolizálni. 6.14 Glüko-amiláz Mikróbák amik termelik • Aspergillus niger • Aspergillus awamori • Rhisopus nigrigans Jellemzői • nem redukáló végen bont • maltózt nem hidrolizálja • Katabolit represszor: glükóz. laktóz, glu

• Induktor: keményítő, dextrin 6.2 Glükóz-izomeráz(xilóz-izomeráz) Indukrora:xilán(fában,fűrészporban található) Konstitutív mutánsokat alkalmaznak Bacillus coagulans NOVO: Sweetzyme: glükóz katabolit represszió, cobalt és magnézium kell az enzimtermeléshez-mutáns: nem kell! Folytonos technológia: glükóz és oxigén limitben Felhasználás: Izoszörp előállítás Izoszörp előállítás (xilóz-izomeráz,glükóz izomeráz) Az izomerizálásra kerülő glükózszirupnak tisztának kell lennie: szűrés v. aktív szenes kezelés v.ioncserés tisztítás v mérgezik az enzimet Mikroorganizmus: • B.coagulans, katabolit represszió, induktív enzimet termel ( ma konstitutív mutáns) Fermentáció: 13 • Folytonos fermentáció, Co és Mg –ot kell adagolni a fermentációhoz, mivel az intracelluláris enzimek drágák ezért immobilizált enzimet alkalmaznak. • pH: 7,5-8 • T=50-60°C ez akadályozza a M. infekciót, de lassan

inaktiválja az enzimet • Fix ágyas párhuzamos reaktorokat alkalmaznak ( sejt rögzített) lsd. Ábra • 1000t HFCS/nap: 20 reaktor • t1/2=100 nap ( 12%-os aktivitásnál csere) • Konverzió: • glükóz (55%)-Æfruktóz(45%) • 50%-os fruktóz tartalmat a semleges pH miatt nem lehet elérni, de: ioncserével 55% is elérhető. Termelés kezdete: • 1967 Clinton Corn Proc.Co • 1974 Immobilizálás Felhasználás: • Élelmiszeripar • Édesítőipar • Sütőipar • Tejipar Magyarország • 1982 Szabadegyháza • 50000 t/év • Immobilizált enzim • Nettó hozam: 12M USD/év 14 6.ábra Izoszörp előállítás 6.3 Proteázok • 6200t tiszta enzim/év • Mosószeripar, tejipar, gyógyszeripar, bőripar, élelmiszeripar • Fehérje hidrolizátum: tápoldat, infúzió. Élelmiszer • Peptid kötéseket bont(létrehoz)(Hidrolízis-szintézis) • Aktiválás proteolízissel: pepszinogén, tripszinogén, proinzulin,

véralvadás • Fehérje lebontás: élelmiszer, tejalvadás, mosóenzimek, infúzió,vérrögoldás • Fehérje szintézis: aszpartám előállítás 6.31 Alkalikus proteázok Jellemzői • Szerin proteáz így hidrolízisben kulcsszerepe van • Mosószerproteáz • Jó detergens: nagy a hőstabilitása Jól bírja a lúgos közeget tehát nagy az alkálistabilitása 15 Nagy a kelát és perborát stabilitása Mikroorganizmusok, amik termelik • Streptomyces nemzetség • Aspergillus nemzetség • B. amyloliquefaciens : szubtilizint termel ami egy szerin proteáz és amely reverzibilis acilezésre képes Screening • pH=10-es fehérje agaron szálesztéssel Törzsjavítás • Célja: az adott törzs több enzimet termeljen • 1.)erős promótert teszünk az adott gén elé • 2.)multikópiás plazmid: az adott gén több példányban legyen jelen , de ezt a plazmidot nem kell más mikroorganizmusba átrakni. • Génsebészat és a Protein

enginiering feladata ez • Cégek akik a törzsjavítással foglalkoznak:NOVO, GIST-BROCADES, PROCTER-GAMBLE Fermentáció • Fed batch fermentáció • NH4 és aminosav koncentrációra figyelni kell, alacsonyan kell tartani az egész fermentáció alatt • Nagy oxigén bevitel kell:IVVM , 48-72 h • 1971-ben allergia krízis: mivel ezek por állagúak voltak allergiát okoztak így gyöngyszemcsezték őket ezzel elkerülve allergén hatásukat. • Stabilitásuk érdekében kutatások folytak melyek bebizonyították, hogy a Met 222 (mely a stbilitásért felelős)Ser-re cserélve jobb aktivitást tapasztaltak de stabilitása nem volt jobb. 6.32 Neutrális proteázok Jellemzői • Olyan fehérjebontó enzim amely semleges pH-n dolgozik • Érzékeny: hőre o Stabilizátorokra(CaCl2, NaCl o Alkalikus proteáz gyorsan lebontja 16 Mikroorganizmusok, melyek termelik • Bacillus subtilis • S.griseus • Aspergillus orizae Felhasználás •

Élelmiszeripar: kenyér, keksz gyártás • Bőripar: Szőrtelenítésre használják mivel a bőr is egy fehérje ezért ennek egy irányított folyamatnak kell ennek lennie Régen emberi fekáliákkal kezelték a bőröket--Æcserzés 6.33 Savas proteázok Jellemzői Cys proteáz Penészek melyek hasonlóak a pepszinhez (pH opt=2-4), ilyen papin, bromelin Felhasználás • Emésztést elősegítő • Szója szósz előállítás • Glutén hidrolizátum hasznosítása a sütőiparban Rennin Jellemzői: • Alkalikus proteáz a rennin. • Sajtgyártás legfontosabb enzime. • Ez egy alvasztó enzim, Asp van az aktív centrumban tehát aszpartáz proteáz • 3-4 hetes borjú gyomorban található pre-pro chymozin formában • Izoenzim: chymosin A Æ244. aminosav Asp, 40%, nagyobb az aktivitása chymosin B Æ244. aminosav Gly, 60%, A tehénban vagy A illetve vagy B van A megnövekedett igényt nem tudták fedezni( 64t sajt gyártása évente), ezért arra

törekedtek hogy valahogy megpróbálják pótolni a hiányzó mennyiséget. 17 Pótlással többféle képpen próbálkoztak: 1) állati pepszinek (csirke pepszinÆIzrael, Csehország) 2) savas penész proteázok • M.miehei • M.pusillus • Endothia parasiticaÆkereskedelmi készítmény 1937 (SUPRAREN USA, Franciaország) • Ez is egy savas proteáz (pH=4-5,5) • Hőstabilitása viszonylag nagy, ez nem jó tulajonság a Protein enginiering foglalkozik vele • Extracelluláris enzim, kicsapódhat 3.) Rekombináns DNS technika 1980 elején a borjú renin gént klónozták ÆR ENNET R szabadalmaztatták és engedélyeztették Gazdaszervezet: • E. coli: az enzim oldhatatlan „inclusin body” formába van, • a fehérje 15-20%-a rennet • probléma, hogy nem élelmiszeripari mikroba tehát toxint termel • B.subtilis: élelmiszeripari mikroba, de glikozilálja az enzimet • Kluyveromyces lactis • Élelmiszeripari SCP • 1950-60-ban savóból

izolálták • A tejiparban használatos béta – galaktozidázt ezzel termelte a Gist- Brocada • Aktív enzim szekrécióval rendelkezik • 1988-tól ezzel termeltették az enzimet (Franciaország: Gist- Brocada, Hollandia) • Rekombináns K. lactis előállítása 18 7.ábra Rekombináns Klactis előállítása Az ábrán jól látható, hogy a CDNS izolálását követően az elkészített expresszós vektorba a plazmidba inszertálódik a CDNS. Majd az így elkészített plazmidot vitték be a törzsbe. 19 8. ábra Plazmid A fenti ábrán látható ez a plazmid. Az expresszós vektorba beleraktak egy laktóz promóter régiót, laktóz terminátor régiót, pro-chymosin DNS-t , egy transzpozont és egy szignál peptid részt is. Az élesztő alfa faktor leadert, mint szignál szekvenciát használva a prochymosint extracellulárisan termeli. Mivel a törzs kevés extracelluláris fehérjét termel, könnyű a rennetet izolálni: ProchymosinÆ chymosin

MAXIRENR Scale up könnyű mert ezzel az enzimmel termelték a B galaktozidázt (bár az intracelluláris enzim volt. Élő sejtet nem tartalmazhat a termék, ezért azokat benzoesavval megölik, alacsony pH-n és szűrik közben a fenti reakció végbemegy. Terméktartósítását benzoesavval vagy NaCl-al végezik a lényeg az, hogy DNS-t nem tartalmazhat. Régebben plazmidos rekombináns élesztővel termeltették a prochymosint ma a prochymosin gén a kromoszómában van tehát be van épülve. MAXIRENR: • Tisztább, mint a borjú rennet, nincs kísérő enzim(pepszin+ egyéb) • A rennettel kémiailag és biológiailag teljesen azonos • Ez kereskedelmi termék az egész világon. • Termelése olcsó • Állandó tisztaságú, mentes állati szervmaradványoktól • Mennyisége korlátlan 20 • 1988-tól ipari termelés Seclinben Franciaországban, ez az üzem ISO 9002 Bizonyitvánnyal rendelkezik rekombináns tenyésztésére. Sőt Kóser engedéllyel is

rendelkezik, azaz „vegetáriánus” termékeknek minősítették termékeiket. Az engedélyeztetés nehéz volt sok mindent figyelembe vesznek: DNS stabilitást, patogenitást, mutagenitást, toxikusságot. Etetési tesztnek kell megfelelni Sajtgyártási teszteket csinálnak. Organoleptikus vizsgálatokat, valamint allergológiai vizsgálatokat is. Valamint az EC előírásokat be kell tartani, melyek a termelésre és a termékre vonatkozik. Chymosin (sajt) gyárásának technológiája Ez az első termék amelynél enzimet és mikrobát is használnak évek óta. A fontos tej fehérjék: Fehérje % Foszfát csoportok molekulánként Kazein alfa s1-kazein 32 8 Hőstabil P miatt alfa s2- kazein 8 10-13 kálcium kötő. béta-kazein 32 5 Micella képző gamma-kazein 8 1-2 80 Savó fehérjék béta-laktoglobulin 12 0 béta laktalbumin 4 0 Ezek ultraszűréssel immunglobulin 3 0 eltávolíthatók szérum albumin 1 0 20 21 0,1 kálcium

jelenlétében a kazein micellában van mely a következő ábrán látható: 9.ábra Kazein micellában Rennet hatás: 1.fázis: K-kazein hidrolízise 10.ábra K-kazein hidrolízise 22 11.ábra Aktív chymosin előállítása A rennin fenilalanin-metionon hasítást csinál, mely hatására keletkezik két fehérjedarab és ez a vágás destabilizálja az egész szerkezetet. 2.fázis : koaguláció, mely a hőmérséklettel és a kálcium ionokkal nő Sajtérlelés: Bizonyos sajtokat érlelni kell( 4 hét-2 év), az idővel fordított arányban változik a víztartalom. Valamint előfordulhatnak: kémiai, biokémiai, mikrobiológiai változások. • Ha tejcukor maradt a rendszerben és mikrobák beleesnek akkor rossz ízt produkálnak • Sok szabad zsírsav keserű ízt ad • A fehérje bomlás folyamatos 23 6.34 Fémproteázok Thermolizin az aszpartángyártás fontos enzime. Törzsizolálás:meleg helyekről • BOC:Benzil-oxi-karbonil-származék, mely

hidrogénezéssel eltávolítható • Vízmentes közeg • Egyébként:random dipeptidek és oligopeptidek képződnek Aszpartám gyártás Az aszpartán egy mesterséges élelmiszer, mi fenilalanin metil észterének és aszparaginsavnak a szintézisével keletkezik Thermolizin segítségével. Ahhoz, hogy a fenilalanin metil észter aminocsoportja reakcióba lépjen az aszparaginsav karboxil csoportjával a rajtuk lévő másik funkciós csoportokat blokkolni kell. A metil észter a karbonsavat alapból blokkolja az aszparaginsav aminocsoportját pedig egy benzoil-oxi-karbonil csoporttal blokkolják. Tehát ahhoz, hogy a szintézis végbemenjen kell nekünk: 1) L-aszparaginsav 2) FenilalaninÆ a fenilalanin nem baj , ha racém, mert az enzim amúgyis csak az L konformációkat kapcsolja össze , a D-alanin csapadékot képez az aszpartámmal, szűrhető. 3) Ebből a kettőböl a thermolizin enzim hatására keltkezik egy csapadék , a reakció közel semleges pH-n és

50°C-on megy. 4) Ezt a csapadékot elválasztják 5) És a keletkezett csapadékot visszaoldják. Enzimes kezelés oka: • D-aszpartán savanyú így annak képződését meg kell akadályozni. Jól szűrhető és kivihető. 24 • Sztereoszelektív a reakció Enzimes kezeklés előnyei: • Nincs β izomer képződés • Az enzim tökéletesen sztereoszelektív: racém Phe használható • Nincs racemizáció a szintézis alatt • A reakció vizes közegben végrehajtható 25 12.ábra Aszpartám előállítás • Oldott enzimet használnak • Vizes fázis • Fermentáció: o Szakaszos keverős reaktor o pH=7-7,5 o T=50°C 6.4 β–galaktozidáz (laktóz) Laktóz-Æ glükóz + galaktóz Mikroorganizmusok, amik termelik • Baktériumok, Élesztők, Penész • Kluyveromyces Lactis: pH=6-7, tejben laktóz hidrolízis • Asp. Niger: pHopt=4-5, savó hidrolízis Alkalmazás • Tej, tejpor: laktóz hidrolízis, növeli az édességet, laktóz

intoleráns betegeknek (laktóz 20%<galaktóz 58% <glükóz 70%) • Fermentációs termékeknél (joghurt, sajt stb.) a fermentáció sebességét növeli • Savó takarmányban • Savó élelmiszerekben: könnyebb felvétel, emészthetőség, édesség növelése, valamint megakadályozza a kristályosodást (fagylaltok, sütemények esetében) 26 Technológia 1) Szakaszos enzimes technológia • Tej+ enzim • T=35°C • t=4 h • 70-80%-os laktóz hidrolízis • UHT sterilezés • Aszeptikus csomagolás 2) Folytonos enzimes technológia • Immobilizált enzim • Tejnél nagy a fertőzési veszély • Savónál jobb, mivel kisebb a pH • SNAMPROGETTI ( Olaszország)Æ cellulóz triacetát szálon immobilizálás( szál reaktorok:Plug flow),konverzió:75-80%, kapacitás 8000l tej /nap(1977) Laktóz intolerancia, laktóz érzékenység • A leggyakoribb enzim hiánybetegség • Európa lakosságának: 5- 15%-a, Afrika 80%-a, Kína

90%-a szenved ilyen betegségben • Az anyatej 7,5%-a laktóz, a tehéntej 4,5%-a • A bél 3 éves korig sok enzimet termel(egészségeseknél)Æez bontja a tejcukrot, így asszimilálható lesz. Betegnél, a gén hiányzik, így nincs enzimtermelés A tejcukor bontatlanul a vastagbélbe kerül és megakadályozza a széklet vízleadását. A bélbaktériumok a laktózt erjesztikÆgázképződés, felfúvódás. 27 6.5 Pektinázok Pektin: Poligalakturonsav +annak észeteri béta1,4-es kötéssel kapcsolódnak össze. Ezeket a kötéseket bontják a poligalakturonázok, poligalakturonázról. 13.ábra Pektin 28 beszélhetünk exo- és endo 14.ábra A pektin hidrolízise Felhasználás • GyümölcsléiparÆa gyümölcsök húsát ezzel az enzimmel kezelve a lé mennyiségét megnövelhetik és a feldolgozhatóságot megkönnyítik • Olivaolaj gyártásÆolajos-vizes emulziók stabilitását javítja • BorászatÆpréselhetőséget elősegíti

Mikroorganizmusok amik termelik: • Aspergillus niger • Rhyzopus nemzetség • Botrytis cinerea 29 6.6 Lipáz A zsírok fizikai tulajdonságai a zsírsav komponensektől függ. Ezek a tulajdonságok változnak: • Frakcionált kristályosításkor:szilárd és folyadék frakció • Hidrogénezéssel: telítetlenÆtelített, o. p növekedés:margaringyártás • Átészterezés: kémiai: statisztikus folyamat Enzimes: irányítható régióspecifikusság Jellemzői • A lipázok a zsírok módosítását végzik az észter kötéseket szívesen hidrolizáljál A hidrolízis sebessége eltérő, függ: a hossztól, a telítetlen kötésektől valamint más sebességgel hidrolizálnak a szélső és a középső részeken. • De a növényolaj ipar, zsíripar számára nem fontos a lipáz hidrolízise, nekik céljuk, hogy megtartsák a trigliceridet így célszerű a lipázt messze tartani. • De az átészterezési reakcióban fontos szerepet játszanak, a

triglicerid és a zsírsav valamilyen statikus folyamatban kicserélődnek és egyensúly alakul ki. • Extracelluláris enzim • Induktora az olaj • Represszora a glükóz és a glicerin • Szubsztrát specifitás ƒ Zsírsav specifikusság: nem erős, de a specifikusság sebessége függ: a zsírsav hosszától és a telítetlen kötések helyétől és számától ƒ Glicerin specifikusság a) van olyan eset amikor nincs glicerin specifikusság, a kémiaihoz hasonlóan ez is egy statisztikus átészterezés vagy bontás.Candida nemzetség b) Regiospecifikusság: 1, 3-ra specifikus.Mucor- és Rhizopus nemzetség tagjai • Használják immobilizált enzimként vagy makropórusú hordozóhoz rögzítve(diatomaföld, akrilát, poli-propiléngyanta) 30 Mikroorganizmusok, amik termelik: • Aspergillus nemzetség • Mucok nemzetség • Rhyzopus nemzetség • Candida nemzetség Felhasználás • Emésztést elősegíti (pankreász lipáz pótló) •

Sajtérlelésben: ízjavító (P.raquefartii spóra) • Szappan ipar (Candida lipáz) • Átészterezés, észetrképzés Átészterezés folyamata: Ezekben a kétfázisú rendszerekben fontos szerepe van a víznek. Ha a víz koncentrációja nagy(vizes fázis) Æhidrolízis Ha a víz koncentrációja kicsi(szerves fázis)Æszintézis Zsírok átészterezése: a) Trigliceridek között b) Triglicerid és zsírsav között 31 A hozzáadott zsírsav beépül és „új zsír” képződik. Esettanulmány: Pálmaolaj (olcsó) Æ kakóvaj (drága) Enzimes termék Kakóvaj Triglicerid Pálmaolajban% % % StStSt 5 3 1 POP 58 16 16 POSt 13 39 41 StOSt 2 28,5 27 StLnSt 9 8 8 StOO 4 4 6 St = sztearát (18) P = Palmitát (16) O = Oleát (18) Ln = Linolát (18) A kakóvaj már testhőmérsékleten olvad: -élelmiszerek 32 - kúpok Aroma anyag előállítás Észter előállítása lipáz enzimmel (Candida antaretica) 15.ábra Észter

előállítása lipáz enzimmel 33 • i-propanol az oldószer • pH=7 • Immobilizált enzim • T= 60°C • Hozam:99% Probléma: A képződő víz eltávolítása, itt szintézisről van szó. a) azeotróp desztillációval, a propanolt folyamatosan táplálják a reaktorba b) pervaporáció i-propil és –mirisztát alkalmazása: szapan, kenőcs, bőrkrém előállítása Az eljárás alkalmas más észterek előállítására is. Gyártó:UNICHEM (Hollandia) 6.7 Penicillin aciláz • G peniccillinÆ 6-aminopenicillánsav+ fenilecetsav • Félszintetikus penicillin előáálítása a 6- aminopenicillánsavból történik. • Fermentáció • E.coli ATCC III05 mutáns • Fenil-ecetsav adagolás:induktív enzim • Glükóz katabolit represszió • Oxigénlimit szükséges a jó enzimtermeléshez • Intracelluláris enzim alkalmazása esetén a nyomásesést dezintegrátorral kell beállítani. Penicillin hidrolízis: a)sejttömeggelÆ

szakaszos hidrolízis • Penicillin+sejt pH=8,37°CÆhidrolízis • Szűrés, pH=2 6APA extrakció(metil-izobutil keton) • 6-APA kicsapás izoelektromos ponton, pH=4, 3 b)Immobilizált sejttel vagy enzimmel. Előny: ár, tisztaság 6.8 Fitáz • Fitinsav: mezoinozit-hexafoszfát • Fitin: a fitinsav Ca v. Mg sója • növényi sejtfal komponense 34 • Állattartás: nagy mennyiségű trágya N és P tartalma nagy probléma, mert eutrofizációt okoz • Növényi fitinÆP az állat ezt felhasználja. De a sertés és a csirke gyomra nem termel fitázt. Így vagy foszfort vagy fitázt kell a takarmányhoz adni Mikroorganizmusok, amik termelik: Asp. Niger kis mennyiségben termeli, gazdaságtalan A Gist-Brocades 1985 táján klónozta a gént glüko-amiláz promóter szekvenciához, és ezt a „kazettát” integrálták statisztikusan Asp. Niger genomjábaMinek az lett az eredménye, hogy a titer jelentősen megnőtt a termelés gazdaságossá vált.

Szűrés után koncentrálás: folyadék (ultraszűrés+ szorbit). Por:búzakorpa hordozó NATUPHOSR nem kell foszfort adni a takarmányba így a trágya foszfor tartalma 25-30%-kal csökken. 6.9 Cellulóz Sok gyapottermék tartalmaz cellulózt. A celluláz általános mosó additív: cellulózszál pelyheket (bolyhokat) eltávolítja, nem támadja meg a cellulóz rostokat, új bolyhok nem képződnek, színes, fényes marad a textil hosszú hordás és gyakori mosás után is. A celluláz pH optimuma savas, míg a mosás pH-ja lúgos. Így az lett a cél, hogy alkalikus cellulázokat kell keresni. Kelet Afrikában alkalikus tavak és hőforrások vannak (50-110 °C) (pH=8-12). Nagyon sok mikroorganizmus él bennükÆextermofilek: alkáli toleránsok, obligát alkalofilek és hőtoleráns fajok. Prokarióták. A tavak körülményei azonosak a mosáséval Ezek a baktériumok nehezen szaporíthatóak, így a cellulázt más mikroorganizmusba kell klónozni. A Bacillus BCE103 nehezen

szaporítható és kevés celluláz enzimet termel, ezért ezt az endocelluláz gént klónozták B. subtilisbe Ez jó gazdaszervezet mert: • Nem patogén • Sok más enzimet is kiválaszt • A cellulóz extracelluláris tehát izolálása egyszerű PURADAXRÆhő-; alkáli- és fehérítőtűrő enzim 35