Kémia | Biokémia » A mitokondriális oxidáció vizsgálata polarográfiás módszerrel

BIOKÉMIA II – GYAKORLAT A mitokondriális oxidáció vizsgálata polarográfiás módszerrel  Mitokondriális oxidáció      A légzési szubsztrátok oxidációja, az ADP foszforilációja és a mitokondrium iontranszportja a kemiozmotikus hipotézis szerint az elektrontranszporthoz H+grádiens kialakulása révén kapcsolt. A légzési lánc redox-lépéseinek szabadenergiaváltozása terhére a komponensek H+okat juttatnak ki a mátrixból az intermembrán résbe, így a két tér között [H+]grádiens és elektromos potenciálkülönbszég alakul ki (kettő együtt az elektrokémiai potenciál). Az elektrokémiai potenciál terhére számos aktív-transzport történik a mitokondriumban, és nem utolsó sorrendben ATP-szintézis folyhat (oxidatív foszforiláció). Azok az anyagok, amelyek a [H+]-grádienst megszűntetik, szétkapcsolják az elektrontranszportot és

az oxidatív foszforilációt. Ilyen pl a 2,3-dinitro-fenol Ezeket az anyagokat szétkapcsoló szereknek nevezzük. Az oxidatív foszforiláció és az elektrontranszportlánc egyes sajátságait a mitokondrium-szuszpenzió oxigénfogyasztásának mérésével vizsgálhatjuk.  Respirációs kontroll és P/O hányados         Ép mitokondrium esetében megfelelő körülmények között a légzési szubsztrátok egyidejű ATP-szintézis mellett oxidálódnak, és az O 2 -fogyasztás oxigráffal mérhető. Az oxidáció sebessége telítési-[S], -[P i ] és -[O 2 ] jelenlétében csak a mitokondrium koncentrációjától és az ADP jelenlététől függ. Az ADP  ATP átalakulás a [H+]-grádiens megszűntetése révén stimulálja az O 2 fogyasztást. Ezt nevezzük az O 2 -fogyasztás akceptor-kontrolljának ADP hiányában a légzés lassú (nyugalmi), de ADP hozzáadásakor többszörösére nő (aktív). Az ADP jelenlétében és elfogyása után

mért sebességének aránya az oxidaáció és foszforiláció kapcsoltságára jellemző, és respirációs kontroll-hányadosnak nevezzük. ADP-hozzáadás mellett az O 2 -felvétellel sztöchiometrikus arányban képződik ATP; a sztüchiometriai együttható az ún. P/O-hányados Intakt mitokondriumban értéke attól függ, hogy a légzési láncba az oxidálódó szubsztrát melyik ponton lép be. Szétkapcsoló szerek jelenlétében a P/O-hányados értéke csökken, mivel foszforiláció nem történik, ugyanakkor az O 2 -fogyasztás (légzés) nem változik, mert a szétkapcsoló szer csökkentve a [H+]-grádienst a légzést stimulálja. Vannak olyan szerek, amelyek az egész mitokondriális légzést gátolják, így az oxidatív foszforilációt is. BIOKÉMIA II – GYAKORLAT        Oligomicin: az ATP-szintézisét gátolja közvetlenül, de mivel a

[H+]-grádiens nem használódik fel, a légzés is gátlódik. Atraktilozid, karboxiatraktilozid: az F 0 F 1 csatornát gátolja. Mivel a légzési lánc elektrontranszportja érintetlen, a protongrádiens kiépül, csak nem használódik fel, hasonlóan az oligomicin esetéhez. Ilyenkor szétkapcsolószerekkel a lassú légzést meg lehet gyorsítani. CN-, CO: a citokróm a 3 -at gátolják, így az utolsó lépés nem valósul meg, a légzés leáll, ATP-szintézis nincsen. Antimycin-A: a III-komplexben a cit. b és c 1 közötti elektronátmenetet gátolja Rotenon: NADH-dehidrogenázt gátolja, ami az I. komplex Malonát: a szukcinát-dehidrogenázt kompetitív módon gátolja, ami a II. komplex A protongrádiens terhére nem csak ATP-szintézis, hanem különböző kationok transzportja is megvalósulhat. azokat az anyagokat, amelyek kationokat juttatnak be a mátrixba, ionoforoknak nevezzük. Így ha a 2,3-DNP-lal szétkapcsoltuk a légzést és a foszforilációt, ionoforokkal a

légzés stimulálható, mivel a protongrádiens terhére kationtranszport valósul meg.  Műszaki háttér     Az oldott oxigén mennyiségét polarográfiás oxigénelektróddal mérjük. Az elektródra a polarizátor 0.6 V feszültséget ad, ami mellett az oldott O 2 elektrolítikusan redukálódik. Ezen a feszültségen az elektródon átfolyó áram erőssége megfelelő, egyenletes keverés mellett, arányos az oldott oxigén pillanatnyi koncentrációjával, mely érték megfelelő átalakító segítségével egy rekorderen megjeleníthető. A fentiek miatt a reakció ideje alatt a mérőedényt el kell zárni a levegőtől, hogy a keveredés közben a légkörből ne tudjon O 2 beleelegyedni. Az adott hőmérsékleten mérhető oldott oxigén koncentrációját 100%-ra kalibráljuk a műszeren. 0%-nak a Na-ditionit hozzáadása mellett mért értéket kalibráljuk  Kivitelezés BIOKÉMIA II – GYAKORLAT

 A műszert az előzőek szerint kalibráljuk:  inkubáló oldatba helyezzük az elektródot és a rekorderen ekkor megjelenő adatot 100%-nak jelöljük  Na-ditionit hozzáadása mellett mért értéket 0%-nak jelöljük  P/O-hányadost határozunk meg:  inkubáló oldat  mitokondrium szuszpenzió  szubsztrát (pl. glutamát, malát, szukcinát)  nyugalmi légzést veszünk fel  ADP-hozzáadás (20l)  aktivált légzés felvétele, majd a lecsengés után a nyugalmi  a P/O-hányados a hozzáadott ADP mennyiség és az O 2 -fogyás alapján határozható meg.  ADP, oligomicin, 2,3-DNP és KCN hatása az oxigénfogyasztásra  inkubáló oldat  mitokondrium szuszpenzió  légzési szubsztrát  ADP  felvesszük az oxigénfogyást  nagyobb adag ADP  oligomicin  csaknem leáll az oxigénfogyasztás (telítődik a protongrádiens)  2,3-DNP-vel újraindítható (szétkapcsol) 

KCN-nel ismét leáll (citokróm méreg)  Szukcinát oxidáció gátlása malonáttal  minden ugyanaz, mint a fentiekben  a légzési szubsztrát szukcinát, ami a II. komplexen lép be (szukcinát-DH)  ezt kompetitív módón gátolja a hozzáadott malonát  az oxigénfogyasztás csökken, nagyobb adag malonát mellett leáll  Karboxiatraktilozid hatása  légzési szubsztrát a glutamát-malát  ADP  majd gátlószer (karboxiatrktilozid)  szétkapcsolószerrel (2,3-DNP) újraindítható