Kémia | Biokémia » Piruvát-kináz izoenzimek vizsgálata

BIOKÉMIA II – GYAKORLAT Piruvát-kináz izoenzimek vizsgálata  Piruvát-kináz     A glikolízis és a glukoneogenezis reakciói között a részfolyamatok többsége reverzibilis, irányuk és sebességük a mindenkori szubsztrátok és termékek koncentrációjától függ. A glikolízisben és a glukoneogenezisben három olyan irreverzibilis reakció van, ami meghatározza az átalakulás irányát, s ezen reakciók enzimei különböznek a glikolízis és glukoneogenezis között. Az egyik ilyen irreverzibilis reakció a glikolízisben a PEP  piruvát átalakulás, ami egyben szubsztrátszintű foszforiláció is, ADP foszforilálódik ATP-vé. Ezt a reakciót a piruvát-kináz katalizálja. A reakcióhoz Mg2+ szükséges: PEP + Mg2+ + ADP  piruvát + Mg2+ + ATP   A piruvát-kináz L, M és R típusú izoenzimeit ismerjük. Az L- a májban, az M- az izomban,

az R-izoforma pedig a vörösvértestben található meg. A piruvát-kináz működése allosztérikus szabályozás alatt áll: az ATP és az alanin gátolja, a fruktóz-1,6-biszfoszfát pedig serkenti.  Mérés    Az enzim által katalizált reakcióban keletkezett piruvát a LDH által tovább alakítható laktáttá. Eközben NADH oxidálódik NAD-dá A NADH 340 nm-en abszorpciós maximumot ad, így ezen a hullámhosszon fotometrálva az extinkció csökkenése a NADH csökkenését mutatja, ami közvetett módon a piruvát keletkezését jelzi. A megfelelő módon csatlakoztatott rekorder az extinkció változását grafikusan megjeleníti.  Kivitelezés   Az ATP és a FDP szabályozó hatásának vizsgálata  vakminta: médium + PEP + NADH  behelyezzük a fotométerbe, és beindítjuk a rekordert  LDH  PK-L  2 perc felvétellel felvesszük az alapvonalat  ADP  2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul)  ATP  2 percig

mérünk változást (a reakció lassul)  FDP  2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul, amíg el nem fogy a NADH) Az alanin és FDP szabályozó hatása  az összeállítás ugyanaz, mint az előbb BIOKÉMIA II – GYAKORLAT       ADP  2 percig mérünk változást (a reakció gyorsul) alanin  3 perc inkubálás alanin ismét  2 percig mérünk, a reakció le is állhat FDP  aktiválja az enzimet, a reakció újra indul A fentieket megismételjük az M-izoformára is. A reakcióelegy térfogatának, az extinkcióváltozásnak és az koefficiensnek az ismeretében meghatározhatjuk a reakciósebességet. extinkciós