Kémia | Biokémia » Molekuláris biológia, tételek

BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 1. Az RNS és a DNS felépítésében résztvevő nukleotidok szerkezete, nevezéktana. Nukleotid analógok, ritka bázisok.  Az RNS és a DNS felépítésében résztvevő nukleotidok szerkezete               A nukleinsavak az élő szervezet funkciójában a genetikai információ tárolásának és továbbításának molekulái. Minden sejt fontos alkotóelemei, a sejtek szárazanyagtartalmának 5-15%-át teszik ki. A nukleinsavak nukleotid egységekből épülnek föl, hasonló elv alapján, mint a fehérjék az aminosavakból. Minden nukleotid három részből áll:  N-tartalmú heterociklusos bázisból, amely purin- vagy pirimidinszármazék;  egy pentóz egységből, ami ribóz vagy dezoxiribóz;  foszforsavból. A DNS-ben négy dezoxiribonukleotid fordul elő, amely heterociklusos

bázisban különböznek egymástól, hasonlóan az RNS-t négy ribonukleotid építi föl. A purinbázisok mindkét nukleinsavban az adenin és a guanin. A pirimidinbázisok a DNS-ben a citozin és az timin, míg az RNS-ban a citozin és az uracil. A két nukleinsav (DNS és RNS) között a legfőbb különbség a cukor komponensben van. A DNS-ben 2’-dezoxi-D-ribóz, az RNS-ben D-ribóz fordul elő A pentózok a heterociklusos bázisokhoz β-N-glikozidos kötéssel kapcsolódnak, mely a cukor 1’-szénatomja és a puringyűrű 9-es N atomja, illetve a pirimidingyűrű 1-es N atomja között alakul ki. A nukleinsavak nukleotidjaiban a foszfátcsoport a pentóz 5’-C-atomjához kapcsolódik észterkötéssel. A szervezetben uralkodó pH mellett a foszfát észterek anion formában vannak jelen. A purinváz egy pirimidin- és egy imidazolgyűrű kondenzációjával jön létre. Mivel mindkét gyűrű külön-külön is aromás, így a purin is az. A pirimidingyűrű planáris

szerkezetű molekula, a puringyűrű is csak kissé tér el a planáris szerkezettől. A bázisok planáris szerkezete és a hidrogénkötést kialakító képessége a biológiai funkció szempontjából rendkívül fontos. A nukleotidokban két planáris gyűrű található, az egyik a ribofuranóz, a másik a bázis gyűrűje. A két gyűrű az egyik lehetséges konformációban a ribofuranóz-gyűrű 2’-hidrogén vagy karboxil csoportja közel kerül a purin 3-as N atomjához, illetve a pirimidinnek 2-es O atomjához. Ezt nevezzük „syn-komfomáció”-nak, az ettől 180o-al elfordított állapotot pedig „anti-konformáció”-nak. Az utóbbi esetben (anti) a bázis és a cukor az N-glikozidos kötés ellentétes oldalán van, egymástól távol. Az N-glikozidos kötés mentén a két gyűrű viszonya BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA megváltozhaz nemcsak a nukleotidban,

hanem a makromolekulában is, másszóval az N-glikozidos kötés mentén a két gyűrű elfordulhat.  Az RNS és a DNS felépítésében résztvevő nukleotidok nevezéktana      A DNS-t felépítő egységeket dezoxitibonukleotidoknak. az RNS-t felépítő egységeket pedig ribonukleotidoknak nevezzük. A bázis-szénhidrát egységet nukleozidnak, míg a nukleozid-foszfátot nukleotidnak, vagy attól függően, hogy hány molekula foszfát épül be, nukleozidmono-, -di-, vagy -trifoszfátnak nevezzük. A di- és trifoszfátokban a foszfátok savanhidridkötéssel (makro-erg) kapcsolódnak egymáshoz. A több foszfátot tartalmazó nukleotidokban a cukorkomponenshez (5’-OH csoportjához) kapcsolódó foszfátot α, a következőt β, míg az esetleges harmadikat γ betűkkel jelöljük. A kapcsolódó pentóz szénatomjainak a számozását a mellé írt vesszővel különböztetjük meg a bázis atomjainak számozásától.  Nukleotid analógok   

  A természetes bázisokkal, nukleozidokkal nagyfokú szerkezeti hasonlóságot mutató vegyületek tartoznak ebbe a csoportba. Jelentőségük, hogy a hasonlóság miatt az élő szervezetben, a sejtekben helyettesíthetik a természetes nukleozidokat, ez a helyettesítés azonban nem tökéletes, emiatt gátolják a nukleotid anyagcserét vagy a polinukleotidok szintézisét. Felhasználhatók ezek az anyagok a humán kemoterápiában azzal a céllal, hogy a daganatos sejtek nukleinsav-szintézisét, osztódását gátolják. A nukleotid anyagcserét gátló nukeozidanalógokat antimetabolitoknak is szokás nevezni. Vannak olyan analógok, amelyek beépülhetnek a nukleinsavakba is, ám az ilyen nukleinsav kémiai szerkezetváltozások miatt nem tudja betölteni funkcióját, ilyen módon vezet a sejtosztódás gátlásához. A legtöbb citosztatikus és vírusellenes gyógyszer ilyen módszerrel működik.  Aza- és azidszármazékok: ezekben a purin- vagy

pirimidingyűrűben egy szénatom helyett, nitrogénatom található.  Allopurinol (4-hidroxi-piramizo-pirimidin) köszvényellenes gyógyszer, a purinanyagcsere végtermékének, a húgysavnak a felhalmozódását gátolja  AZT (azido-timidin) a leghatásosabb gyógyszere az AIDS-nek, a HIV vírus szaporodását gátolja a vírus reverz transzkriptáz enzim gátlásával, miután a sejtben trifoszfáttá alakult.  Tiolszármazékok: a természetes nuklo-bázis OH-csoportja helyett –SH csoport van. Az ilyen származékokat citosztatikumként, illetve immunszupresszív gyógyszerként használják.  Halogénszármazékok: a pirimidinek körében a leggyakoribbak, a halogénatom általában a pirimidingyűrű 5-ös C-atomjához kapcsolódik, ahová a metilcsoport a BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA timinben. A DNS-szintézisét gátolják, illetve beépülhetnek a

DNS-be, ezzel mutációt okozva. Vírusos kötőhártyagyulladás esetén szemcseppben használatos ilyen vegyület.  Cukorszármazékok: a ribóz- vagy dezoxiribóz helyett egy másik szénhidrát van, vagy a ribózgyűrűt módosítják. Felhasználhatók citosztatikumként, vírusellenes terápiban. A napjainkban leghatásosabb vírusellenes gyógyszer is cukorszármazék, a ribóz helyett a bázishoz egy hidroxi-etoxi-metil csoport kapcsolódik. Ilyen pl a Zovirax, a herpes-vírusok specifikus gátlószere, amely azért jelentős, mert nem toxikus egyéb sejtekre, mivel csak a vírus tudja aktív metabolittá alakítani az analógot, ami gátolja a vírus DNS-szintézisét.  Ritka bázisok     A fentebb említett négy bázison kívül kis mennyiségben előfordulnak a nukleinsavakban un. minor vagy ritka bázisok Ilyen pl. a 5-metil-citozin, 5-hidroxi-metil citozin, 6-N-metiladenin, 2-N-metilguanin, pseudo-uridin stb A ritka bázisok elsősorban a tRNS-ben

fordulnak elő, azok bázistartalmának kb. 10%-át teszik ki. A ritka bázisok a nukleinsav másodlagos módosításával jönnek létre és fontos szerepük van egyes szakaszok információtartalmának megváltoztatásában. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 2. Nukleotid tartalmú, biológiailag aktív molekulák és szerkezetük.      A nukleotidok legfonotsabb szerepe, hogy prekurzorai a DNS- és RNSszintézisnek. A nukleinsav szintézis során az NTP-k a molekula végén lévő pirofoszfát hidrolízise után monofoszfát egységenként polimerizálódnak makromolekulává. Valamennyi funkciójukban a nukleotidok β- és γ.foszfát-savanhidrid kötés kémiai energiája használódik fel új kovalens kötések kialakításához. A nukleotidok a sejtekben kis részben monofoszfátok, nagyobbrészt difoszfátok és trifoszfátok formájában fordulnak elő,

rövidítésük: NMP-dNMP; NDP-dNDP; NTP-dNTP. A nukleotid di- és trifoszfátok kétértékű kationokkal komplexet képeznek, a sejtekben Mg2+ komplexek formájában fordulnak elő.   A sejtben szabadon előforduló nukleotidok különböző funkcióval rendelkeznek. Az ATP a kémiai energia tárolásának és transzportjának fontos anyaga. A sejtlégzés során ADP-ből ATP keletkezik, és ebbe a formában tárolódik a tápanyagok elégetése során keletkezett energia.  A nukleotidoknak egy másik fontos szerepe, hogy egyes anyagcsere-folyamatokban „aktiválnak”, magasabb energiájú formába juttatnak molekulákat. Az uridin-trifoszfát (UTP) a poliszacharidok bioszintézisében tölt be ilyen szerepet, az UDP-hlukóz a szintézis kiindulási anyaga. Hasonló szerepet tölt be a citidin-trifoszfát (CTP) a membránok foszfolipid bioszintézisében. Egyik ilyen intermedier a citidin-difoszfát-kolin (CDP-kolin) és a citidin-difoszfát-diacil-glicerol (CDP-DAG).

   A nukleotidok, így az ADP számos koenzimnek is alkotórésze (NAD, FAD).  Az anyagcsere-folyamatok szabályozásában is részt vesznek nukleotidszármazékok, amelyek rendkívül kis koncentrációban fordulnak elő a sejtekben. Számos hormon úgy fejti ki a hatását, hogy kötődve a célsejthez, kiváltja a ciklikus-adenozin monofoszfát (cAMP) szintézisét ATP-ből. A cAMP további szabályozási folyamatsort indít el a sejtekben, fokozva egyes fehérjefoszforiláló enzimek működését. Másik két a szabályozásban kitüntetett nukleotid a guanozin-3’,5’-ciklikus monofoszfát (cGMP) és a guanozin-tertrafoszfát. Az előbbi számos extracellularis hatást, az utóbbi a baktériumok géntranszkripcióját szabályozza.   BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA     Anyagcserefolyamatokban is számos nukleotid fordul elő. A purin-

és pirimidinnukleotidokat minden sejt képes maga előállítani a szénhidrát és aminosav anyagcsere köztitermékeiből, ezeket az anyagcserefolyamatokat „de novo” bioszintetikus útnak nevezzük. A purin bioszintézis egyik fontos kötziterméke az inozin, illetve az inozinmonofoszfát (IMP). A purinnukleotidok szintézisének és lebontásának köztitermékei a hipoxantin (6hidroxi-purin), és a xantin (2,6-dihiroxi-purin) valamint a húgysav (2,6,8-trihidroxipurin) szintén purin származék. Növényekből izolálható számos olyan anyag (alkaloid), amelyik élettani hatását annak köszönheti, hogy purinszármazék. A legismertebb a kakaóból származó teobromin (3,7-dimetil-xantin), a tealevélből származó teofillin (1,3-dimetilxantin) és a kávéban előforduló koffein (1,3,7-trimetil-xantin). BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 3. A DNS szerveződése. A pro

és eukarióta genom jellemzőinek összehasonlítása.  A DNS szerveződése               A biológiai információt az egyik generációtól a másikra örökítő DNS szerkezete lehetővé teszi az információ majdnem tökéletesen stabil formában történő tárolását, pontos megkettőződését és átadását. Az információ nem csak a fehérjék szerkezetére vonatkozik, hanem módot nyújt azok szintézisének mennyiségi és időbeli szabályozására is, így végső soron a sejtek csaknem valamennyi funkciója a DNS ellenőrzése alatt áll. A fehérjék szerkezetére vonatkozó információt hárombetűs genetikai kód formájában tárolódik és adódik át. A szerkezet változó része az egymást követő nukleotidok bázisainak sorrendje, ez a bázissorend hordozza az információt. A polinukleotidlánc nem szimmetrikus szerkezet, végei különböznek egymástól. A lánc egyik végét képező nukleotid

cukorkomponensének 5’OH-ja többnyire foszfáttal észteresített formában van, ez az ún. 5’-vége a DNS-nek A másik végét képező nukleotid cukorkomponensének 3’OH-ja többnyire szabad, ez a 3’-vége a molekulának. Konvencionálisan a bázisok sorrendjét 5’  3’ irányban írjuk és jelöljük. Neutrális pH-n, viszonylag magas sókoncentráció mellett az egyedülálló polinukleotidlánc helikális szerkezetet alkot, a DNS azonban kevés kivételtől eltekintve nem egy, hanem két antiparalell állású polinukleotid láncból álló kettős hélix. A két lánc egy képzeletbeli tengely körül van feltekeredve, a tekeredés a leggyakrabban előforduló B-DNS-ben jobbmenetes (fiziológiás DNS-forma; Watson – Crick-modell). A foszfát-egységekkel összekötött dezoxi-ribóz-egységekből álló váz a kettős hélix spirál külső részén, míg a purin (adenin, guanin) és pirimidin- (timin, citozin) bázisok belül találhatók. A bázisok síkja

merőleges a spirál tengelyére, a cukoregységek síkja majdnem derékszöget zár be a bázisok síkjával. A spirál átmérője 2,0 nm, az egymást követő bázisok távolsága a tengely mentén 0,34 nm és (átlagosan) 36o-kal vannak elfordulva egymáshoz képest. A helikális szerkezetben egy teljes fordulat 10 nukleotidot tartalmaz, a helikális szerkezet mindkét láncon 3,4 nm-nyi távolságonként ismétlődik (menetemelkedés). A két láncot egymáshoz a komplementer bázispárok (A-T, G-C) között kialakuló H-hidak rögzítik. A komplementaritás oka, hogy csak az egymással szemben beilleszkedő A és T ill. G és C megfelelő csoportjai kerülnek abba a helyzetbe, hogy egymással H-hidakat tudjanak kialakítani. A DNS.ben az egyébként szabad állapotban oxo-enol tautomériát mutató bázisok oxoformában fordulnak elő. A véletlenszerűen és nagyon ritkán előforduló enolforma beépülése a DNS-be lehetőséget nyújt az evolúcióban fontos spontán

BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA               szerkezetváltozásra. Az oxocsoportok ugyanis H-akceptorként, míg a bázisok NH 2 oldalláncai hidrogéndonorként szerepelnek. A T pirimidingyűrűjének N3-ja és a G purinvázának N1-atonja H-donorként (eredetileg NH-csoportok), míg az A purinvázának N1-atonja és a C pirimidinvázának N3-ja H-akceptorként viselkedik. A T-A bázispárt három, a G-C bázispárt kettő H-híd rögzíti. Az egymással szemben lévő nukleotidok glikozidos kötései közötti távolság szigorúan meghatározott (1,085 nm), csak egy purin- és egy pirimidingyűrű tud egymással szembe helyezkedni. A natív DNS szerkezetét melegítéssel denaturálni lehet. A hőmérséklet emelkedése megbontja a rögzítő H-hidakat és a DNS bázisösszetételére jellemző hőmérsékleten a két lánc elválik

egymástól. Azt a hőmérsékletet, ahol a H-hidak 50%-a megbomlik, a DNS olvadási pontjának nevezzük. Megfelelő körülmények között a megfelelő bázispárok a komplementaritás elve alapján újra összekapcsolódhatnak, olyan nagy közöttük az affinitás. A B-DNS-ben a kettős hélix külső részét képező dezox-iribóz-foszfát váz csavarulatai között két, ugyancsak helikális árok helyezkedik el, a szélesebb nagy árok és a keskenyebb kis árok. Ez abból adódik, hogy a glikozidok kötések a párokat alkotó bázisok között nem pontosan egymással szemben helyezkednek el, az egyik oldalon 180o-nál kisebb szöget nagyobb ( nagy árok), a másik oldalon 180o-nál kisebb ( kis árok) szöget zárnak be egymással. A DNS-hez közvetlenül kapcsolódni tudó fehérjék többsége meghatározott bázisszekvenciát képes felismerni, és a kötődés a nagyárok területén történik meg. További finomszerkezet-változások jöhetnek létre, amelyeket a

cukor konformációja határoz meg. A ribo-furanóz gyűrűben három szénatom egy síkban van, a negyedik kiemelkedik ebből a síkból, amit borítékkonformációnak neveznek. A C2’-endo konformáció esetén a C2’ atom, a C3’-endo konformáció esetén pedig a C3’ atom emelkedik ki a gyűrű síkjából. A B-DNS-ben C2’-endo pentóz egységek vannak, azaz a ribóz C2’ atomja a gyűrű síkja fölé emelkedik. Ha a d-ribóz C3’-endo konformációt vesz fel, a kettős hélix szerkezete megváltozik, a bázispárok a hélix tengelyére többé nem merőlegesek, 19o-al eltérnek ettől a helyzettől, így a hélix szélesebb, zömökebb lesz, a kis árok eltűnik, kialakul az A-DNS. Alacsony sókoncentráció és nedvességtartalom hatására a B-forma átalakulhat Aformává, ahol 10 helyett 11 nukleotid alkot egy csavarulatot, és a hélix megrövidül. A C-DNS hasonlít a B-hez, 9 bázispár alkot egy csavarulatot A Z-DNS-ben („zig-zag”) a polinukleotid-vázat

alkotó szerkezet cikk-cakkokat alkot. A Z-formában a hélix balmenetes, a molekula hosszabb és vékonyabb, 12 bázispár alkot egy csavarulatot és csak egyetlen árok figyelhető meg rajta. A nagy árok kipúposodik, és konvex szerkezetet alkot. A Z-forma kialakulásának kedvez, ha purin és pirimidin nukleotidok egymást váltva fordulnak elő a DNS egy rövidebb szakaszán. A Z-forma egy-két tucat bázispárnyi hosszon fordul elő a DNS egy szakaszán. A Z-formát stabilizáló tényező a G és C bázisok posztszintetikus metileződése. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA       A hajlékony DNS előfordulhat lineáris és cirkuláris formában. A prokarióta DNS cirkuláris (és a mDNS), míg az eukarióta DNS linearis. A zárt, cirkuláris DNS topolódógiai izomérekek képez, melyek úgy jöhetnek létre, hogy a zárt kettősgyűrű a térben saját

tengelye körül feltekeredik és szuperhélixet alkot. Topológiai izoméreknek nevezzük azokat a DNS molekulákat, amelyek csak a szuperhélix szerkezetében, mértékében vagy hiányában különböznek egymástól. Pozitív szuperhélixről beszélünk, ha a tekercselődés iránya megegyezik az alaphélix menetirányával. Ellenkező esetben negatív szuperhélixnek nevezzük Azokat a molekulákat, amelyeken ilyen szuperhélix nem található, relaxált DNSnek nevezzük. A pozitív szuperhélix feszíti, stabilabbá teszi a szerkezetet, míg a negatív lazítja azt.  A pro és eukarióta genom jellemzőinek összehasonlítása               A genom az a genetikai információmennyiség, amelyet az adott sejt a DNS-ben (vírusoknál RNS) bázisszekvenciák által kódolt formában tartalmaz. Alapvető különbség, hogy a prokarióták nem rendelkeznek elkülönült sejtmaggal, a genom a citoplazmában helyezkedik el, míg az

eukariótákban a sejtmagban található, kromatinszerkezetbe rendeződve. Watson és Crick megállapítása szerint a DNS normális körülmények között mind eukariótákban, mind prokariótákban kettős spirál formájában található meg, mely két hélix egymással a komplementaritás elve alapján kapcsolódik. Az eukarióta DNS purinbázisai adenin és guanin, pirimidinbázisai citozin és timin, míg baktériumokban még más bázis is előfordulhat. Prokarióta élőlényre példa, a molekuláris biológiában sokat vizsgált E. coli baktérium, melyben egyetlen cirkuláris dsDNS-molekula van, amely négymillió bp hosszú, molekulatömege 2,6 × 106 kD. Mivel az E. coli DNS-e hosszabb, mint a sejt átmérője, natív állapotban a dsDNS kompakt szupertekercsként összecsomagolva fér csak el a sejtben. Az eukarióta genomban a DNS kromoszómákba rendeződve fordul elő, míg a prokariótákra a circularis DNS is jellemző. A vírusoknál a nyugalmi állapotban a DNS

általában lineáris, a replikáció során a gazdasejtben azonban cirkuláris molekulává záródik. A kromoszómákban a DNS egyetlen, el nem ágazó, lineáris polinukleotid lánc. Az eukarióta sejtben a DNS nem egyetlen molekula, hanem annyi, ahány kromoszómát tartalmaz a mag. Interfázisos sejtmag egyetlen kromoszómamolekulát (kromatin) tartalmaz. Eukariótákban a sejtmagban a DNS nerm önmagában fordul elő, hanem számos fehérjével alkot komplexet (hisztonok, nonhisztonok, transzkripciós szereppel bíró fehérjék, stb.) Az eukarióta genomra jellemző az ún. satellita DNS-szakasz, melynek reverzibilis denaturáció után a legnagyobb a reasszociációs sebessége. Ez a DNS-szakasz a kromoszómák centromer régiójából származik. Az eukarióta DNS jellemzője, hogy sokkal több azonos nukleotid szekvencia fordul elő benne, mint a prokarióta DNS-ben, mely szakaszokat repetitív szekvenciáknak nevezzük. Az ismétlődések gyakorisága alapján az eukarióta

nukleotid szekvenciák három csoportba sorolhatók: BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA   Nagyon gyakran ismétlődő (milliószor), rövid, 300 bp hosszú szakaszok. Ilyen pl. a satellita DNS, az ALU-szekvencia Minden emlős-DNS 10%-át teszi ki.  Közepesen gyakran ismétlődő nukleotidszekvenciák a genom 20-30%-át képviselik. Ilyen szekvenciákban vannak kódolva a riboszóma RNS gének, a hiszton gének.  Ismétlés nélküli, egyedi nukleotid szekvenciák. Az eukarióta DNS több bázipárt tartalmaz (3 milliárd), mint a prokariótáké, kb. ezerszer annyit, mégis az aktív gének száma csak kb. ötvenszer több BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 4. Az eukarióta kromoszóma felépítése. Centromer, telomer, mitochondrialis DNS.  Az eukarióta kromoszóma

felépítése              Az eukarióta sejt kb. 1000× annyi DNS-t tartalmaz, mint az E coli sejt Az eukarióta DNS nem egy molekula, hanem annyi, ahány kromoszóma van a sejtben. Interfázisos sejtben minden kromoszóma egy molekula lineáris DNS-nek felel meg. Az eukarióta DNS a sejtmagban nem önállóan fordul elő, hanem fehérjékkel képez komplexet és többszörösen feltekeredve igen kompakt szerkezetet ölt. A kromoszóma szerkezete változik a sejtciklus során. A mitózis alatt a legkompaktabb, itt igazi kromoszómaforma van jelen, míg interfázisban lazább, kromatinállományt alkot, de ebben az állapotban is feltekeredett a DNS. A feltekeredés kettős célt szolgál. Egyrészt mintegy „összecsomagolja” a terjedelmes molekulát, így kisebb helyet foglal el. Ugyanakkor a lazább és tömörebb formák váltakozásának meghatározó szerepe van a génaktivitás szabályozásában. A DNS-hez kapcsolódó fehérjék

kétfélék: hisztonok, és a nagyobb változatosságot mutató nonhisztonok. A nonhiszton fehérjék heterogén, különböző funkcióval bíró fehérjepopulációt alkotnak. Ide tartoznak a DNS és RNS szintézisben részt vevő fehérjék, és azok is, amelyek a génkifejeződés szabályozásában játszanak szerepet. A hisztonok bázikus fehérjék, amelyekben az AS-szekvencia igen hasonló egymástól távoli fajokban is mutatva, hogy valamilyen alapvető feladatot töltenek be. Négyféle hiszton molekula tartozik az ún. core-hisztonok közé (H2a, H2b, H3, H4), melyek molekulatömege 10 és 20 kDa között van. A H2a és H2b hisztonok lizinben gazdagok, míg a H3 és H4 arginint tartalmaz jelentős mennyiségben. A hisztonok terminális végei igen bázikus karakterűek, középső szakaszuk kevésbé poláros jellegű. Ez lehetőséget ad a mind egymáshoz, mind a DNS-hez, mid pedig más fehérjékhez való kapcsolódásra. A kromoszóma szerkezetének alapja a

nukleoszóma, ami a DNS-en kb. 200 bponként ismétlődik A négy core-hiszton két-két molekulája összekapcsolódba képez egy oktamert, amit hisztonkorongnak nevezünk. Erre kb 150 bp hosszúságban tekeredik fel a DNS, mely komplexet együtt nevezzük nukleoszómának. A nukleoszóma szerkezet a molekula teljes hosszán kialakul, gyöngyfüzérhez hasonlító struktúrát kialakítva, melynek átmérője 11 nm. Az ötödik féle hiszton, a H1-hiszton, részben a DNS-hez, részben a hisztonkorongoz kapcsolódva (linker régió) közel húzza egymáshoz, és bonyolultabb szerkezetbe rendezi a nukleoszómákat. A H1-hiszton kb. 21 kDa molekulatömegű, kevésbé mutat konzervativitást, lizinben igen gazdag. A H1-hiszton Ser, illetve Tre oldalláncai foszforilálódhatnak különböző proteinkinázok hatására, mely eseménynek regulációs szerepe van abban, hogy a BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

    H1-hiszton mennyire kompakt szerkezetet rögzít, pl. mitózisban a H1-hisztonok erősen foszforilált állapotban vannak. A nukleoszómális szerkezet még kompaktabbá válik azáltal, hogy egymás mellett elhelyezkedő hurkokat képez, melyek 300 nm átmérőjűek, azonban még mindig az extendált kromoszómának felelnek meg (kromatin vagy szolenoid). Az extendált kromoszóma további hurokképződéssel kondenzált szerkezetet alakít ki. Mitóziskor ez a szerkezet tovább kondenzálódik A mitózis metafázisából ismert 1400 nm átmérőjű tipikus kromoszóma két molekula DNS-t tartalmaz (kromatidok). Az interfázis során a molekula kondnzáltsági foka nem homogén a teljes hosszában. Ennek oka az egyes hisztonmolekulák kovalens módosítása (aciteliáció, foszforiláció, ADP-riboziláció), az ubikvitin nevű fehérje kötődése, a és különböző nonhiszton fehérjék jelenléte.  Centromer        

A centromer a kromoszóma karjai (telomerjei) között elhelyezkedő középrész. A kromoszómákat a centromer elhelyezkedése alapján különböztetjük meg. Ha a centromer a kar végén található, akkor telocentrikus. Ha az egyik véghez közel, akkor akrocentrikus. Ha nem egészen középen, hanem attól kissé távolabb, akkor submetacentrikus. Ha középen helyezkedik el, akkor a kromoszóma metacentrikus. A centromerben helyezkedik el a kromoszóma elsődleges befűződése. A centromer a kromoszóma legjellegzetesebb képlete, és a kromoszóma mozgási organizátorának tekinthető, ezért a kinetochor nevet is viseli. A centromer finomvizsgálatánál kiderül, hogy egyrészt mindkét kromatidának megfelelően található centromer, másrészt a centromer két tükörképszerűen elhelyezkedő elektrondenz állományt tartalmaz, közöttük egy világosabb területtel. A centromer terölet DNS-szekvenciája meglehetősen konzervatív, az interfázisban is

heterokromatikus (kondenzált). Az erre a területre kapcsolódó centromer fehérje a két kromatida összetartásában játszik szerepet. A pro- és metafázis alatt ezen a területen jön létre a kinetokor régió, amihez a kinetokor mikrotubulusok kapcsolódni fognak. A kinetokor régió legalább háromféle motorproteint tartalmaz.  Telomer     A hosszú, lineáris DNS-t tartalmazó eukarióta kromoszóma végeit (karjait) telomereknek nevezzük. A telomerekben a DNS 3’-végének megfelelő szál „túlnyúlik”, a túlnyúló egyes lánc rövid, G nukleotidban gazdag, kétszer ismétlődő szekvenciákat (telomer szekvencia) tartalmaz. A replikációk közötti időszakban a túlnyúló lánchoz egy telomervégi fehérje kötődik. A teloméreknek a kromoszóma végeinek védelmében van szerepük, nélkülük a kromoszóma a replikáció során egyre rövidülne. (Lásd: replikáció) BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

 Mitochondrialis DNS         Az eukarióta sejtekben található DNS a magon kívül is a mitochondriumokban (illetve a növények kloroplasztiszában). A mtDNS a prokarióta DNS-re emlékeztető cirkuláris forma, amely 16.569 nukleotidpárból áll és a mitochondrium fehérjéinek mintegy 5%-át kódolja. Ezenkívül a mitochondriumokban önállóan folyó fehérjeszintézishez szükséges riboszóma RNS-ek és tRNS-ek szerkezetéhez szükséges információt is tartalmazza. A mtDNS a sejtciklustól függetlenül replikálódik és a petesejt citoplazmájából kiindulva anyai úton öröklődik A mtDNS komplementer láncai összetételükben jelentősek különböznek. Az ún nehéz lánc igen sok G-t tartalmaz, míg a komplementer könnyű lánc C-ban gazdag. A nehéz lánc a templátja a két rRNS-nek, 12 mitokondriálisan kódolt fehérjének és 14 tRNS-nek. A könnyű lánc egy

fehérjeláncot kódol és 8 tRNS-t. A mtDNS nem tartalmaz intronokat. Ellentétben a nukleáris DNS-el a mtDNS molekulák száma egy sejtben több száz is lehet. Replikációja két helyről indul, az RNS szintézise mindkét láncról megtörténik és tartalmazza az egész genomot BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 5. A DNS primer és secunder szerkezete és annak vizsgálata.  A DNS primer szerkezete         A DNS polinukeotidokból felépülő polinukleotidlánc. Az egyes nukleotidok cukorból, foszforsavból és purin vagy pirimidinbázisokból épülnek fel. A DNS cukoralkotó része a dezoxiribóz, purinbázisai adenin és guanin, pirimidinbázisai citozin és timin. A polinukleotidlánc gerincét dezoxiribóz-foszfát egységet ismétlődése képezi. A pentóz gyűrűnek a 5’-OH csoportja foszfát-észter kötéssel kapcsolódik a szomszédos

dezoxiribóz gyűrű 3’-OH csoportjához. A polinukleotidláncban a gerincet tehát 5’-3’ diészter kötések tartják össze. A nitrogéntartalmú bázisok kilógnak a gerincből. A polinukleotid láncnak az utolsó nukleotidja a lánc egyik végén szabad 5’ foszfátcsoporttal, a másik végén szabad 3’-hidroxilcsoporttal végződik. A lánc bázisszekvenciáját 5’  3’ irányban írjuk föl. A nukleinsav molekulának az elején szabad 5’-P, a végén pedig szabad 3’-OH csoport van, ezt nevezzük a molekula polaritásának. Ha aDNS-láncot építőelemeire bontjuk, nukleozid-monofoszfátokat kapunk. A DNS-láncban elhelyezkedő nukleotidok sorrendje, az ún. bázisszekvencia agja a DNS primer szerkezetét.  A DNS secunder szerkezete       Watson és Crick megállapítása szerint a DNS normális körülmények között mind eukariótákban, mind prokariótákban kettős spirál formájában található meg. A két DNS lánc egymással

komplementer, ami azt jelenti, hogy az egyes bázisok a másik láncban csak a megfelelő bázisokkal kapcsolódnak (AT; GC). A kettős hélixben a báziskapcsolódás mindig úgy történik, hogy egy purinbázishoz egy pirimidinbázis (és fordítva) kapcsolódik. A DNS-ben a két polinukleotidlánc iránya ellentétes, antiparalell, azaz az egyik lánc 5’  3’, a másik lánc 3’  5’ irányban halad. A láncokat H-hidak és hidrofób kölcsönhatások tartják össze, amelyek önmagukban gyengék, de sokaságuk azonban erős kötést jelent. Az adenin két H-kötéssel kapcsolódik a timinhez, a guanint három H-kötés kapcsolja a citozinhoz. A kettős hélix a komplementaritásnak köszönhetően ugyanazt az információt hordozza. A specifikus bázispárok kialakulásában a bázis-tautomerizációnak nagyon nagy jelentősége van. Az elektron és protonvándorlás az –OH-csoport és a gyűrű N-atom között minden bázis számára két tautomer a laktim

(enol) és laktám (oxo)- formát tesz lehetővé. A kettős hélixben a bázisok oxo-formában vannak jelen BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA         Az egymás fölött elhelyezkedő planáris bázispárokat apoláros és hidrofób kölcsönhatások tartják össze, amelyek jelentősen hozzájárulnak a kettős hélix stabilitásához a H-hidakon kívül. A bázisok hidrofób tulajdonsága, az aromás gyűrűk elektronszerkezete az egyik legfőbb motiváló erő a helikális szerkezet kialakításában. Az egymás fölött elhelyezkedő lapos gyűrűk minden poláros molekulát kizárnak a környezetükből, felvéve a legstabilabb, helikális szerkezetet. A helikális szerkezetben a foszfátok töltéséhez kationok, a sejtben Mg2+ ionok kapcsolódnak. A helikális molekula külső felszínén helyezkednek el a foszfát cukor egységek, amelyektől negatív

töltése van a DNS-felületének. Mivel a bázispárok glikozidos kötései nem pontosan egymással szemben helyezkednek el, kialakul egy kis árok és egy nagy árok. Két polinukleotid lánc elvben jobb vagy balmenetes hélixet alkothat, azonban a fiziológiás B-DNS jobbmenetes. A DNS kettős spirálját nevezzük a DNS szekunder struktúrájának. A secunder szerkezetben kialakulhat A-, B-, C- és Z-DNS molekula (lásd: 3. tétel)  A DNS primer szerkezetének vizsgálata           A DNS nukleotidszekvenciájának analízisére felhasználhatók az ún. restrikciós endonukleázok. Kiválasztunk egy endonukleázt, melynek hasítási helye pontosan ismert. Ha ez az enzim képes elhasítani a DNS-t, akkor a hasítási hely szekvenciája ismertté válik. Mennél hosszabb egy restrikciós enzim által felismert szekvencia, annál kisebb a valószínűsége, hogy egy adott DNS-szakaszon ez a szekvencia előfordul, vagy többször is előfordul.

Több restrikciós endonukleáz egymást követő alkalmazásával restrikciós térképet lehet készíteni a DNS-ről. A keletkezett fragmentumokat agaróz-gélektroforézissel méret szerint szétválasztjuk, és az egyes fragmentumok pozícióját (méretét) detektáljuk (pl. fluoreszcens jelölés, radioaktív foszfát jelzés az 5’ végre  autoradiográfia). Az emésztési idő kellő beállításával el lehet érni, hogy a restrikciós helyek közül csak az egyiken (random) vagy az összesen megtörténjen-e a hasítás. A műveletet több, különböző restrikciós enzimmel megismételve az ismert szekvenciák előfordulásának helyéről részletes és a DNS-szakaszra jellemző képet lehet kapni. A restrikciós enzimekkel elhasított DNS kisebb fragmentumainak bázisszekvenciájának meghatározására kétféle módszert alkalmazunk: a specifikus kémiai hasítás módszerét (Maxam-Gilbert), és a didezoxi-módszert, a megszakított enzimatikus szintézis

segítségével kapott fragmentumok analízisét (Sangermódszer). A specifikus kémiai hasítás segítségével történő analízishez a két különböző specificitású endonukleázzal kihasított, vizsgálni kívánt DNS darab egyik vagy másik láncának 3’ végét szelektíven megjelöljük egy 32P-vel jelzett foszfátot tartalmazó dezoxi-ribonukleotiddal. Egy-egy kísérletsorozatban csak azt a láncot analizáljuk, amelynek vége a radioaktív jelzést kapta, a két lánc hődenaturációval szétválasztható. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA               A kémiai hasításhoz jelzett preparátumot négy részre osztjuk. A specifikus kémiai hasítás során az egyik vagy a másik bázist hasítjuk le az N-glikozidos kötésnél és a sérült nukleotid az alkalmazott feltételek mellett a láncból kihasad. A négy

elkülönített mintában végbemenő specifikus reakciók eredményeként egyegy minta mindig az egyik fajta bázis hasításával kapott eredményt mutatja. (Az egyik mintában mindkét purinbázis hasad, a másikban preferenciálisan a guanin, a harmadikban mindkét pirimidin, a negyedikben preferenciálisan a citozin. Az első és második minta különbségeiből az adeninre, a harmadik és negyedik minta különbségeiből a timinre vonatkozó adatokat lehet leolvasni.) A hasítást olyan kémiai feltételek mellett engedjük végbemenni, hogy csak részleges hasítás történjen, vagyis a lehetséges több hasítási hely közül egy molekulában mindig csak kevés helyen történjen meg a reakció. Az egy-egy minta különböző pozícióiban lévő nukleotidjai kihasítása révén keletkező, különböző számú nukleotidegységeket tartalmazó egyszálú láncdarabokat poliakrilamid-gélelektroforézis segítségével a hosszúság alapján szétválasztjuk. A radioaktív

jelzés lehetővé teszi, hogy a 3’-végtől számított különböző számú nukleotidegységnyi távolságban végbemenő hasítások révén kapott, különböző hosszúságú fragmensek pozícióját a gélen autoradiográfia segítségével kimutassuk. (A láncvéget és így radioaktív jelzést nem tartalmazó fragmensek nem látszanak.) A négy mintában a négy különböző nukleotid kihasításával létrehozott fragmentumok hosszúságából a szekvencia leolvasható. A kérdéses bázis előfordulásának helye a szekvenciában a kihasítással képződő fragmentumok nukleotidegységeinek száma +1. A megszakított enzimatikus szintézis segítségével történő analízis során az egyszálú, vagy hődenaturációval egyszálúvá tett DNS-szálak szekvenciájának meghatározása a komplementer szál szekvenciájának a meghatározásán alapul. A komplementer láncot primer jelenlétében, a DNS-polimeráz I enzim segítségével szintetitálják. A szintézis

megszakításához didezoxi-ribonukleotidokat használnak, mely nukleotidokban a ribóznak nemcsak a 2’-, hanem a 3’-szénatonján is hiányzik az OH-csoport, ezért ha a DNS-polimeráz beépíti a nukleotidláncba, a lánc további szintézise megszakad, mert a következő nukleotiddal a foszfodiészter kötés nem tud kialakulni. A szintetizálódó új lánc 5’ végét jelöljük, mint az előbb, majd az elkészített preparátumot négy részre osztjuk. Mind a négy mintához hozzáadjuk a szintézishez szükséges összes alapanyagot (enzim, bázisok), és minden mintához egy-egy különböző bázist tartalmazó didezoxi-ribonukleotidot, melyeket a DNS-polimeráz beépít a láncba. A beépülő didezoxi-ribonukleotid megszakítja a szintézist, és a radioaktívan jelölt 5’-véget tartalmazó fragmentum utolsó, 3’-nukleotidja lesz. Gélelktroforézis alkalmazásával meg lehet állapítani a négy mintából, hogy egy-egy bizonyos bázist tartalmazó

didezoxi-ribonukleotid hány nukleotidegységből álló fragmentumokat eredményezett. A fragmentumok nukleotidjainak száma jelzi a kérdéses bázis helyét a komplementer lánc bázisszekvenciájában. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  A DNS secunder szerkezetének vizsgálata     A secunder szerkezet vizsgálata röntgendiffrakciós eljárással történik. Ha röntgensugárzás esik atomokra, ezek elektronjain a sugárzás szóródást szenved, és az atomok minden irányban változatlan frekvenciájú röntgenfényt sugároznak. Ha az átsugárzott anyagban az atomok szabályos elrendeződésben vannak és az atomtávolságok a röntgensugárzás hullámhosszának nagyságrendjébe esnek, akkor az egyes atomokon szórt sugarak hulláminterferencia folytán bizonyos irányokban erősíthetik, másokban kiolthatják egymást. A röntgensugár hullámhosszának

ismeretében az interferenciafoltok elhelyezkedéséből következtethetünk az atomok elhelyezkedésére, és meghatározhatjuk a közöttük lévő távolságokat. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 6. A szemikonzervatív replikáció kísérletes bizonyítása  A szemikonzervatív replikáció     Minthogy a DNS két lánca egymással komplementer bázisszekvenciával rendelkezik, a replikáció szempontjából mindkettő tartalmazza ugyanazt az információt. A DNS replikációjának a lényege, hogy a kettős spirál láncai egymástól szétválnak, és külön-külön mindkettőről, mint templátról megszintetizálódik egy komplementer bázisszekvenciájú, antiparalell lefutású új lánc, tehát az eredeti kettős láncú DNS-sel teljesen azonos két új molekula keletkezik. A két új DNS-molekula egyik-egyik lánca a mintául szolgáló és teljes

egészében megőrzött szülői lánc és csak a másik szintetizálódik újonnan, mindig egy-egy nukleotidegységgel hosszabbodva. Ezért a replikációt szemikonzervatívnak nevezik.  A szemikonzervatív jelleg kísérletes bizonyítása     A bizonyítás Meselson és Stahl nevéhez fűződik, akik kísérleteikben colibaktériumokat 15N-izotópot tartalmazó táptalajban sok generáción keresztül tenyésztettek. Miután az összes baktérium minden N-je az izotóp formára cserélődött le, a baktériumokat olyan táptalajba helyezték, amelyben 14N volt a nitrogénforrás. Osztódás után vizsgálva a baktériumokat, megállapították, hogy az újonnan szintetizálódott DNS 50%-ban 14N-t tartalmaz. Ez azt bizonyította, hogy minden új baktériumsejtbe a DNS kettős spirál egyik szálának megfelelő komplementer minta került át (ez azonban nem jelenti azt, hogy a két szál nem egyenértékű az információ megőrzése szempontjából), és az új

sejtben kiegészül a megfelelő DNS-szállal. Ezáltal itt is létrejön a kettős spirál BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 7. Prokarióta DNS függő DNS polimerázok és szerepük  Prokarióta DNS polimerázok               A prokarióta replikációban a mintául szolgáló DNS-lánccal komplementer, új DNSlánc szintézisét a DNS-dependens DNS-polimeráz nevű enzimek végzik. A bakteriális DNS-polimerázok közül a DNS-polimeráz III felelős a replikációért. Az elsőként felfedezett DNS-polimeráz I a repair-ben játszik elsősorban szerepet, bár a replikáció egyik segédenzimeként is működik. A DNS-polimeráz I háromféle katalitikus aktivitással rendelkezik: egyrészt DNSszintetikus aktivitása van, másrészt ezzel ellentétes, polinukleotidokat hidrolítikusan hasító, nukleáz aktivitása. Ez utóbbi

kétféle aszerint, hogy a DNSlánc 5’ – vagy 3’-végéről hasít le nukleotidot (korrekciós 3’ – 5’ exonukleáz és hibajavító 5’ – 3’ exonukleáz aktivitás). Az enzim egyetlen polipeptidlánból áll, mindhárom aktivitásért ugyanaz a lánc a felelős. A polipeptidláncot megfelelő helyen történő hasítással olyan mesterséges fragmenssé alakítható, amely elvesztette 5’  3’ exonukleáz aktivitását. Ezt a laboratóriumi géntechnikában gyakran használt fragmentumot nevezik Klenowfragmentnek. A DNS-polimeráz III kétféle katalítikus aktivitással rendelkezik: szintetikus, és 3’ – 5’ exonukleáz aktivitással. 5’ – 3’ irányban nem hasít le nukleotidot A replikációban a DNS-szintézisért felelős enzim több, részben azonos, részben különböző aszimmetrikus molekula (4-4 alegység azonos, a többi különbözik). A DNS-polimerázok működéséhez szükséges mind a négy különböző dezokiribonukleozid (dATP, dGTP,

dTTP, dCTP), továbbá magnéziumionok és a templát DNS egyidejű jelenléte, de ez még nem elég. A DNS-polimerázok nem képesek megszintetizálni a DNS-lánc első néhány bázisa közti foszfodiészterkötéseket, hanem indítóláncot (primer) igényelnek. A primer lehet a templáttal komplementer DNS vagy RNS, amelynek utolsó nukleotidja szabad 3’-OH.val rendelkezik Ehhez kapcsolódik a szintézis során az első dezoxi-ribonukleotid 5’-OH-csoportját észteresítő foszfát, pirofoszfát lehasadása mellett. A mintául szolgáló DNS-szál és a képződő új szál antiparalell lefutású, a szintézis 5’  3’ irányú, a leolvasás 3’  5’ irányú. A DNS-polimerázok korrekciós 3’ – 5’ exonukleáz aktivitását lásd a 9. tételben! A DNS-polimerázok nukleotidokat csak úgy tudnak összekötni, hogy egy szabad nukleozid 5’-trifoszfát α-helyzetű foszfátját kötik hozzá a polinukleotid láncvégi 3’OH-jához, az α- és β-foszfátok

közti pirofoszfátkőtés hidrolízise és a (β, γhelyzetű) pirofoszfát lehasadása közben. Nem képesek azonban összekötni a 3’OHegy olyan nukleotid 5’-foszfátját, amely nukleotid már egy DNS-lánc első tagja BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA           (azaz 5’ vége). Ezt a reakciót, amely csupán egyetlen foszfodiészter kötés kialakulását jelenti, viszont ezzel két DNS-láncot köt össze (vagy egyet kör alakúvá tesz) a DNS-ligáz nevű enzim végzi. A DNS-polimeráz III tehát az új DNS-t 5’  3’ irányban szintetizálja, a komplementer templátot csak 3’  5’ irányban képes olvasni. A DNS-polimeráz III a vezetőszálon a primázhoz kapcsolódva folyamatosan tudja szintetizálni az új DNS-szálat, de az elmaradó szálon ellentétes irányban halad, 1000 – 1500 bázis hosszúságú Okazaki fragmentumok

formájában. A katalizált szintézis érdekessége, hogy a kétirányú szintézist egyetlen DNS polimeráz III molekula végzi. Az enzim több alegységből álló, két aszimmetrikus karral rendelkező molekula. Egyik karja a vezető láncot, másik karja pedig az ezzel ellentétes irányban növekvő elmaradó láncot szintetizálja. Ez úgy lehetséges, hogy az Okazaki fragmentum templátja átmenetileg hurokszerűen visszahajlik, mely hurok mentén a DNS-polimeráz III a replikációs villa haladásának irányában haladhat a késlekedő szálon, míg a tényleges szintézis iránya ezzel ellentétes. Az Okazaki fragmentumok folyamatos nukleinsavvá történő átalakítása és a primerek kivágása az 5’  3’ exonukleáz aktivitással rendelkező DNS polimeráz I feladata. A második fragmentum addig szintetizálódik, amíg a 3’OH vége el nem éri az első fragmentum primerének 5’ végét. A második fragmentum szintézisének befejezésekor a DNS-polimeráz I

5’  3’ irányú repair exonukleáz aktivitása segítségével egyenként lehasítja a ribonukleotid egységeket az első fragmentumról, és helyüket a komplementer dezoxi-ribonukleotid egységekkel pótolja. Ez azért lehetséges, mert ehhez a művelethez most már a primert a második fragmentum láncvégi szabad 3’OH-ja szolgáltatja. Így meghosszabbodik a második fragmentum az előző fragmentum első dezoxi-ribonukleotid egységéig. Ekkor már minden nukleotid a helyén van, csupán egyetlen foszfodiészterkötés hiányzik, amit a DNS.polimerázok nem tudnak létrehozni A primer helyére utolsóként beépített egység 3’OH-ját a következő nukleotid 5’foszfátjával a DNS-ligáz köti össze a foszfodiészterkötéssel. A fenti folyamat minden Okazaki fragmentumnál ismétlődik. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 8. A prokarióta replikon, a replikáció

iniciációja és terminációja. Okazaki fragmensek. A ligáz szerepe  A prokarióta replikon       Mivel a DNS két lánca egymással komplementer bázisszekvenciával rendelkezik, a replikáció szempontjából mindkettő tartalmazza ugyanazt az információz. A DNS replikáció lényege, hogy a DNS-sprál két lánca szétválik egymástól, és mindkét szál külön-külön templátként szolgál a szemikonzervatív replikációban. A prokarióta replikációban a mintául szolgáló DNS-lánccal komplementer, új DNSlánc szintézisét a DNS-dependens DNS-polimeráz nevű enzimek végzik. A bakteriális DNS-polimerázok közül a DNS-polimeráz III felelős a replikációért. Az elsőként felfedezett DNS-polimeráz I a repair-ben játszik elsősorban szerepet, bár a replikáció egyik segédenzimeként is működik. A nukleinsavak szintézise mindig az 5’-végükről kezdődik a 3’ vég irányába. A DNS-polimerázok működéséhez szükséges mind

a négy különböző dezokiribonukleozid (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), továbbá magnéziumionok és a templát DNS egyidejű jelenléte, de ez még nem elég.  A replikáció iniciációja          A prokarióta genom zárt, cirkuláris DNS-molekula, amelyen a replikáció startpontja pontosan meghatározott helyen van. A replikáció a cirkuláris DNS-en a startponttól kiindulva halad előre a kör mentén mindkét irányban, és végződik a kör startponttal szembeni részén. A DNS-polimerázok felismerik a startpontot, és ehhez kötődbe megkezdődik a replikáció. A DNS-polimeráz nem képes megindítani a replikációt, mivel nem tudja megszintetizálni a DNS-lánc első néhány bázisa közti foszfodiészterkötéseket. Így ún. indító láncot (primer) igényel, amelynek szabad 3’OH-csoportja van A primer 4-10 bázishosszúságú, a mintával komplementer RNS-lánc, amit egy primáz nevű RNS-polimeráz szintetizál. Az startponton (origo)

lévő meghatározott bázisszekvenciájú DNS-szakaszhoz (oriC) több molekula dnaA nevű fehérje kötődik, mely kötődéshez negatív szupertekercs szükséges. A dnaA indítja el a replikációhoz szükséges fehérjék által alkotott repliszóma kialakulását, és elősegíti a DNS lokális felnyílását, egy néhány száz nukleotidot érintő szakaszon, amelyen egy „iniciációs buborék” képződik. A komplexhez dnaB segítségével dnaC kötődik, mely fehérjének helikáz aktivitása van. A replikációt a DNS-giráz (II. típusú topoizomeráz) nevű enzim segíti, amely ATPből nyert energia felhasználásával negatív szupertekercsek kialakulását katalizálja BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA      Az iniciációs buborékben a széttekeredett szülő DNS két szálát egyszálú formában stabilizálni kell, ezt az egyes láncú DNS-hez

kötődő speciális fehérjemolekulák végzik (hélix destabilizáló HD vagy SSB). Az iniciációs buborék megjelenése után kezdődhet az első priemr szintézise, a replikációs villa mindkét szálán. A dnaB-dnaC komplexhez négy másik fehérje (N-fehérjék) kötődik, majd ezekhez csatlakozik a primer szintézisét végző primáz. Így kialakul a primoszóma. A primoszóma megkezdi az RNS primer szintézisét a vezető szálon, csatlakozik hozzá a DNS-polimeráz III és a rep fehérjék, mely utóbbiaknak helikáz aktivitásuk van, és a DNS további széttekeréséért felelősek. Ez az operatív fehérjekomplex a repliszóma, mindkét replikációs villában egy-egy repliszóma működik.  A replikáció terminációja  Okazaki fragmensek          A mintául szolgáló DNS-szál és a képződő új szál antiparalell lefutású, a szintézis 5’  3’ irányú, a leolvasás 3’  5’ irányú. A DNS-polimeráz III az új

DNS-t 5’  3’ irányban szintetizálja, a komplementer templátot csak 3’  5’ irányban képes olvasni. A DNS-polimeráz III a vezetőszálon ezért a primázhoz kapcsolódva folyamatosan tudja szintetizálni az új DNS-szálat, de az antiparalell lefutású elmaradó szálon ellentétes irányban halad, 1000 – 1500 bázis hosszúságú Okazaki fragmentumok formájában. A vezetőszál szintéziséhez elég egyetlen primer a startpontnál, míg a késlekedő szál minden darabjának szintézise egy primer szintézisével kezdődik. A primáz a dnaB-dnaC komplex segítségével az origotól kb. 1000 bázisnyi távolságra a késlekedő szál templátjáho kötődik, és visszafelé, a replikációs villa haladásával ellentétes irányban megszintetizálja az első Okazaki-fragmentum rövid primer RNS-ét. Ennek 3’OH-jához kapcsolódva a primoszóma DNS-polimeráz III komponense hasonló irányban megszintetizálja az Okazaki-fragmentumot. A primeáz eközben

továbbcsúszik a templáton a villa haladásának irányában újabb 1000-1500 bázistávolságra, és újabb primer RNS-t szintetizál, amit ismét a DNSpolimeráz III folytat. Az Okazaki fragmentumok folyamatos nukleinsavvá történő átalakítása és a primerek kivágása az 5’  3’ exonukleáz aktivitással rendelkező DNS polimeráz I feladata. A második fragmentum addig szintetizálódik, amíg a 3’OH vége el nem éri az első fragmentum primerének 5’ végét. A második fragmentum szintézisének befejezésekor a DNS-polimeráz I 5’  3’ irányú repair exonukleáz aktivitása segítségével egyenként lehasítja a ribonukleotid egységeket az első fragmentumról, és helyüket a komplementer dezoxi-ribonukleotid egységekkel pótolja. Ez azért lehetséges, mert ehhez a művelethez most már a primert a második fragmentum láncvégi szabad 3’OH-ja szolgáltatja. Így meghosszabbodik a második fragmentum az előző fragmentum első

dezoxi-ribonukleotid egységéig. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  Ekkor már minden nukleotid a helyén van, csupán egyetlen foszfodiészterkötés hiányzik, amit a DNS.polimerázok nem tudnak létrehozni  A ligáz szerepe      A DNS-polimerázok nem tudják nem tudják összekötni az RNS-primer utolsó helyére beépült nukleotid 3’OH-ját a következő egység 5’-foszfátjával. Ezt a reakciót katalizálja a DNS-ligáz. A reakció energiaigényes, prokariótákban NAD+ hidrolízisének terhére megy végbe. A DNS-ligáz tevékenységére nemcsak a replikációban, hanem a repair és rekombináció mechanizmusában is szükség van. A két replikációs villában szintetizálódott láncok egyesítését az origonak megfelelően, illetve a replikációs villák találkozásakor ugyancsak a DNS-ligáz végzi. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS

BIOLÓGIA 9. A replikáció pontosságának megvalósítása. Az új DNS szál időszakos megkülönböztetése.  A replikáció pontosságának megvalósítása      A DNS replikációjának nagyon pontosnak kell lennie, a másolás közben bekövetkező esetleges hibákat ki kell javítani, a nem komplementer bázisok beépülését meg kell akadályozni. Baktériumokban ezt maga a DNS-polimeráz végzi el, „korrekciós” 3’  5’ exonukleáz aktivitása segítségével, amely az esetleg beépülő nem komplementer nukleotidot hasítja le. A szintézis során beéépített utolsú nukleotid bázisa és a minta komplementer bázisa közti H-hidakat érzékeli a polimeráz enzim, és a szintézist csak akkor folytatja, ha a komplementer bázisok között a stabilizáló H-kötések kialakultak. Ha a H-kötések nem alakulnak ki, ez azt jelenti, hogy az utolsónak

beépített nukleotid hibás, bázisa nem komplementere a templát bázisnak. Ilyen esetben a polimeráz enzim az utolsóként létrehozott foszfodiészterkötést hidrolítikusan elhasítja, a hibás nukleotidot eltávolítja és csak ezután folytatja a szintézist ugyanezen a helyen. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 10. Restrikciós endonukleázok és metilázok  Restrikciós endonukleázok és metilázok             A restrikciós endonukleázok a DNS-t specifikus nukleotidszekvenciáknál hasító enzimek, amelyek felfedezése fontos szerepet játszott a laboratóriumi géntechnika megindításában. A restrikciós endonuklázok a természetben a baktérium fágok elleni védekezés eszközei. Bizonyos baktériumokban bizonyos fágok nem tudnak szaporodni. Ezt a jelenséget nevezik restrikciónak. A restrikcióért specifikus

endonukleáz-metiláz enzimpárok felelősek, amelyek a DNS-en azonos nukleotidszekvenciát ismernek fel. A restrikciót az endonukláz komponens biztosítja: ha megtalálja az idegen DNS-en a számára specifikus szekvenciát, akkor ott elhasítja a DNS-t, mindkét szálon. A metiláz feladata a baktérium saját DNS-ének megóvása az endonukleáztól. A metiláz ugyanazt a szekvenciát ismeri fel a DNS-en, mint az endonukleáz párja, és a replikáció után azonnal metilálja a felismert szekvencia bizonyos nukleotidjait. Ez megakadályozza az endonukleáz aktivitását az adott szekvencián. A metilezéshez S-adenozil-metionin adja a metilcsoportot. Az a fág, amelynek DNS-e tartalmazza az adott baktérium endonukleáza számára specifikus szekvenciát, abban a baktériumban nem szaporodhat. Az azonos DNS-szekvenciát felismerő restrikciós endonukleáz-metiláz pároknak több fajtája ismert (I., II és III csoport), de ezek közül csak a II típusba tartozókat használjuk

a DNS specifikus nukleotidszekvenciánál történő hasításához a laboratóriumi gyakorlatban. Az ebbe a csoportba tartozó enzimpárok önálló aktivitással rendelkező enzimek. E csoport tagjai a DNS-en szimmetrikus szerkezetű, általában 4 – 10 nukleotidegységből álló palindrom szekvenciákat ismernek fel és az endonukleázok a két DNS-láncon egymással szemben ellentétes irányban elhelyezkedő két azonos szekvencia azonos nukleotidja mellett hasítanak. Különböző baktériumok különböző szekvenciákat felismerő restrikciós enzimpárokat tartalmaznak. Ha egy restrikciós enzimmel hasított DNS-en a hasítási helyek éppen egymással szemben helyezkednek el, tompa végek képződnek. Előfordul azonban, hogy a két szálon a két metszéspont egymástól néhány bázisnyi távolságra van. Ekkor a metszett végen néhány bázis hosszúságú egyszálú végek alakulnak ki, melyek komplementer szakaszát a másik DNS-darab tartalmazza. Minthogy a

komplementer DNS-szekvenciák egymással nagy affinitást mutatnak, ezeket a végeket „ragadós végek”-nek nevezzük. Laboratóriumi körülmények között, ha két különböző DNS molekula (pl. egy prokarióta plazmid és egy eukarióta kromoszóma-DNS) hasítható egy bizonyos endonukleázzal, jelezve, hogy a specifikus szekvenciát mindkét DNS tartalmazza, akkor mindkét DNS-molekulán kialakulhatnak olyan „ragadós végek”, melyek egymással komplementerek. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA      A komplementer egyszálú végek spontán is képesek egymással összeilleszkedni, mely összeilleszkedő végeken a DNS-ligáz segítségével kialakulnak a hiányzó foszfodiészter kötések (mindkét láncon egy-egy). Ezzel a módszerrel előállítható a két különböző molekulából származó DNS darabokból az új, rekombináns DNS. A különböző

baktériumok által termelt, különböző specifikus szekvenciákat felismerő restrikciós enzimekből ma már száznál több ismert, és tisztított formában kereskedelmi forgalomban kaphatók. Rekombináns DNS-molekulák készítésén kívül a DNS nukleotidszekvenciájának analízisére is felhasználják ezeket az enzimeket. (Lásd 5 tétel) Ismert helyen, ismert restrikciós szekvencia eltűnése, vagy új megjelenése mutációt bizonyít. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 11. Az eukarióta replikáció  Eukarióta replikáció                Az eukarióta DNS megkettőződésének menete elviekben hasonlít a prokariótáknál megfigyelt folyamatokhoz, néhány lényeges különbség azonban mutatkozik. Az eukarióta DNS nem circularis, hanem linearis, és sokkal hosszabb, mint a prokarióta genom. A replikáció a hosszú

DNS molekulán egyszerre sok start-ponton indul meg, mindenütt két irányban, „replikációs buborékok” keletkezése közben. A vezető szál és a késlekedő szál szintézisét nem ugyanaz, hanem két különböző enzim végzi: az α-DNS-polimeráz a késlekedő szál, míg a δ-polimeráz a vezető szál szintézisét katalizálja. A β-polimeráz a repair-mechanizmusban vesz részt, a γ-polimeráz pedig az extranukleáris DNS szintézisét végzi. Az eukarióta DNS-polimerázoknak nincsen saját exonukleáz aktivitásuk, a 3’  5’ hibajavítást és az indító RNS-darabok kimetszését önálló nukleáz enzimek végzik, amelyek azonban a DNS-polimerázzal komplexet képeznek. Az eukarióta DNS-ligáz nem NAD+, hanem ATP hidrolízise közben működik. A nukleoszómális szerkezet kialakításához szükséges hisztonok a fehérjék többségétől eltérően a S-fázisban szintetizálódnak, szigorúan koordináltan a DNSreplikációval. Zömmel az összes régi

hiszton arra a DNS-re kerül, amely a vezető láncot tartalmazza, és az összes újonnan szintetizált hiszton a késlekedő szálat tartalmazó DNS-szakaszon foglal helyet. A lineáris DNS-t tartalmazó eukarióta kromoszóma végeit teloméreknek nevezzük. Ezeken a helyeken a DNS 3’-végének megfelelő szál „túlnyúlik”, rövid, G-ban kazdak, kétszer ismétlődő szekvenciákat tartalmaz (telomer szekvencia). Interfázisban a túlnyúló részhez egy telomervégi fehérje kötödik. A telomérek nélkül a kromoszóma a replikációk során egyre rövidülne. A lineáris DNS replikációja a késlekedő szál 5’-végén ugyanis speciális problémát vet fel. A láncvégi RNS-indító kimetszése után nem pótlódik a helye DNS-sel, így a késlekedő DNS rövidebb lesz, mint a templát. Hogy emiatt információt horduzó bázisszekvencia ne vesszen el, egy sajátságosan működő telomeráz enzim meghosszabítja a késlekedő szál templátjául szolgáló lánc

3’-végét. A késlekedő szálon az ennek megfelelő komplementer szekvenciára nincs szükség, ezért nem károsodik a DNS, ha a késlekedő szál 5’-vége a szintézis során rövidebb lesz. A telomeráz enzim „prosztetikus csoportként” egy RNS-darabot tartalmaz, és ennek az RNS-nek megfelelő komplementer DNS-sel hosszabbítja meg a DNS 3’ végét. A telomeráz enzim működése az egyik példa arra, hogy DNS szintetizálódhat RNSminta alapján. Felnőtt szomatikus sejtekben a telomeráz enzim expressziója csökken, megfigyelhető a telomer rövidülése, ami egyelőre hipotetikusan oka lehet az öregedésnek, illetve a malignus sejtekké való transzformálódásnak. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 12. A DNS mutációi. Kémiai mutagének Ames teszt  A DNS mutációi            Akkor beszélünk a DNS mutációjáról, ha

annak károsodását a repair enzimek nem javítják ki a replikáció előtt, vagy ha a hiba a replikáció közben történik. Ilyenkor megváltozik a DNS mindkét láncának bázisszekvenciála. Pontmutációnak nevezzük egyetlen bázispár változását. Ha az eredeti bp helyére másik bp kerül, szubsztitúcióról van szó. Ha az egyik pirimidinbázis helyéz másik pirimidinbázis, vagy egyik purinbázis helyét másik purinbázis foglalja el, akkor a szubsztitúció tranzíció. A bázisok dezaminálása tranzíciót idéz elő, de kialakulhat spontán, károsító tényező nélkül is. A spontán tranzíció nagyon ritka, 109 bázispárból álló DNS-ben 10 replikációra jut egy tranzíció. A spontán tranzíció oka a bázisok enol-oxo tautomériája. A DNS-ben az oxoforma van jelen, aminek az oxo-csoportja H-akceptorként működik a komplementer bázissal történő H-kötés kialakításában. Az enolos OH-csoport hidrogéndonorként működik, így az enol-formában

lévő bázisnak más a komplementaritása. Az enolforma megjelenésének valószínűségét az ionizációs sugárzások fokozzák. A transzverziós szubsztitúció, amikor pirimidinbázis helyére purinbázis (vagy fordítva) épül be, a DNS-polimeráz hibás működéséből ered. A szubsztitúciós mutációk mellett léteznek olyan pontmutációk is, melyeket egyegy nukleotid kiesése (deléció) vagy többlete (inzerció) okoz. Ha a változás a DNS fehérjéket kódoló szakaszain történik, kereteltolódással járó (frame-shift) mutációkról beszélünk. Mivel a fehérjét kódoló szakaszokban a bázisok egymásután hármasával (kodon) kódolnak egy-egy aminosavat, és a kodonok sora vesszőmentes, ezért deléció vagy inzerció eredményeként a mutációtól disztálisan az összes kodon-határ eltolódik, így az összes aminosav-kód sérül. Deléciót idézhet elő a depurinizáció, mert az ilyen sérülést tartalmazó mintáról történő szintéziskor a

depurinizáció helyén a DNS-polimeráz egy nulkeotidot nem épít be az új szálba. Inzerciót okozhatnak bizonyos aromás gyűrűs molekulák, (pl. akridin festékek) Ezek beékelődnek a DNS szomszédos bázispárjai közé (interkaláció) és megzavarják a DNS-polimeráz működését, amely ezeken a helyeken egy számfeletti nukleotidot épít be az új láncba.  Kémiai mutagének BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  Amest teszt         A mutagén hatás kimutatásának az egyik legegyszerűbb módja. A próba az ún szupresszor mutáció jelenségén alapul. Szupresszor mutációnak nevezzük azt a második mutációt, amelyik az első mutáció által okozott genetikai változás megnyilvánulását megszünteti. Ennek mechanizmusa sokféle lehet, történhet az első mutációval érintett génben, vagy azon kívül. Az Ames-tesztben

használt laboratóriumi baktériumtörzs (Salmonellák közé tartozók) egy genetikailag pontosan feltérképezett mutáció következtében elveszítette azt a képességét, hogy hisztidint tudjon előállítani. Ez a baktérium csak akkor növekszik, ha táptalajában hisztidin van. A baktériumok repair-rendszere szándékosan tönkre van téve, hogy ne javítódjék a hiba spontán, ezenkívül a baktérium felszínéről hiányzik a lipopoliszacharid réteg, hogy a vizsgált anyag könnyebben bejusson a baktériumba. Mutagén anyag hatására igen sok, és sokféle mutáció alakul ki, ezek között lehet olyan szupresszor mutáció is, aminek eredményeként a baktérium újra tud hisztidint előállítani. Az Ames-próba lényege annak vizsgálata, hogy 109 hisztidinhiányos baktériumból hány alakul át hisztidint termelni képes baktériummá, azaz hány lesz képes szaporodni kívülről bevitt hisztidin nélkül. Mivel a szervezetünkbe bejutott anyagok közül sok nem

mutagén önmagában, hanem a máj biotranszformációs enzimeinek hatására alakul át mutagénné, ezért a negatív Ames próbát ilyen jellegű teszt követi. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 14. Az RNS fajtái és szerkezete  Az RNS fajtái         Prokariótákban és eukariótákban a genetikai információt hordozó anyag (genom) DNS. A DNS egyik száláról, a komplementaritás elve alapján átíródó, majd a szintézis alatt még módosuló molekula a ribonukleinsav (RNS). Az RNS-nek több fajtája van. A fehérjékre vonatkozó információt a DNS-ről a szintetizáló apparátusra, a riboszómákra a mRNS szállítja. A riboszómák szerkezetének részét képező RNS-eket rRNS-nek nevezzük. A hárombetűs genetikai kódot a megfelelő aminosavszekvenciára átfordító, adapter molekulák a tRNS-ek. Az eukarióta sejtmagban található

hnRNS (heteronukleáris) egy része az érett mRNS-molekulák előanyagának tekinthetők. Az snRNS-molekulák (small nuclear) az eukarióta mRNS szintézisben játszanak fontos szerepet, az scRNS (small citoplasmatic) a szekretálódó fehérjéket szintetizáló riboszómákat irányítják az endoplazmatikus retikulumhoz. Az állati sejtek mitokondriumaiban a mtDNS a nukleáristól eltérő rRNS-eket és tRNS-eket kódol, amely az organellumon belül lejátszódó fehérjeszintézis komponensei.  Az RNS szerkezete          Az RNS purin és pirimidin ribonukleotid monofoszfát (NMP) egységekből épül fel, amelyet 3’- 5’-foszfodiészterkötések kapcsolnak össze. Az RNS-ben mindig ribózhoz kapcsolódnak a bázisok, szemben a DNS 2’dezoxiribózával. Az RNS-ek purin bázis tartalma azonos, míg pirimidin bázis tartalma eltérő a DNStől. Az RNS nem tartalmaz timint, helyette uracil található benne Az RNS-ek egyes típusai (főleg a tRNS

és az rRNS) az A-, G-, C- és U-bázissal rendelkező ribonukleotidokon kívül más, módosított nukleotidokat is tartalmaznak. Különösen sok ritka bázis található a tRNS-ekben, míg az rRNS-ben gyakori a ribóz egységek metileződése a 2’OH-csoporton. A nukleotidok módosítása poszt-transzkripciósan történik, tehát az RNSszintéziskor a nem módosított nukleotidok épülnek be a molekulába. A pro- és eukarióta RNS-ek eddig ismert formái egyszálú, lineáris molekulák. Elsődleges szerkezetüket a foszfodiészter kötésekkel összekapcsolt, meghatárpzptt bázisszekvenciával rendelkező polinukleotidlánc jelenti. Ezentúl másodlagos, bizonyos esetekben (pl. tRNS) harmadlagos szerkezettel is rendelkeznek Mivel az RNS leggyakrabban egyszálú, a bázispárokra jellemző arány, ami a DNSben kimutatható, az RNS-re nem jellemző. A bázisok közötti intramolekuláris kölcsönhatások helikális szakaszokat, vagy hajtűkanyarokat hoznak létre. A

hajtűkanyarok ott jönnek létre, ahol a molekulán BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA   belül komplementer szekvenciák találhatók, melyek egymással H-hidakat képeznek, hosszabb-rövidebb kettős hélixeket alkotnak, melyek egyik végén a nem komplementer bázisokat tartalmazó szekvenciák gyakran hurkot alkotnak (lásd: tRNS három hurka). A nem komplementer szakaszokon kialakuló helikális szerkezet az A-, G- és Cbázisok közötti, nem H-hdakból álló kölcsönhatások hozzák létre. Savban hidrolizálva mind a DNS, mind az RNS mononukleotidokra esik szét. Lúgban azonban csak az RNS hidrolizálható, mert a DNS-ben a ribóz 2’OH csoportja hiányzik, és nem tud a 2,3’-ciklikus diészter mononukleotid kialakulni a lúgos közegben.  mRNS   Az 5’ vége minden esetben 7-metil-guanozin trifoszfát. A metil-GTP foszfát végéhez kapcsolódik a

szomszédos 2-0-metil-ribonukleotid az 5’-OH csoportján keresztül. Ezt nevezik sapkának vagy „mRNS-cap”-nek, melynek szerepe a molekula 5’-végének védelme, valamint a fehérjeszintetizáló rendszer a molekulának ezt a végét ismeri fel. A mRNS másik vége, a 3’OH-vég 20-250 nukleotid tagból álló homopolimer, poliadenilsavból áll, poliA-faroknak nevezünk. A transzkripció végeztévek egy külön enzim, a poli-adenilát szintetáz készíti el a molekulának ezt a részét, ami feltehetőleg stabilizálja a mRNS-t. (Mivel a komplementeritás elve alapján kötődik ez a vég az oligoT-cellulózhoz, ezért az affinitás-kromatográfiai módszert alkalmazzák a mRNS-ek tisztítására a molekuláris genetikában.)  tRNS         Átlagosan 75 nukleotidból áll, és molekulatömege 25 kDa. Minden sejtben legalább 20 féle tRNS molekula van, de gyakran egy-egy AS szállításához több tRNS is rendelkezésre áll. Legjellemzőbb

közös tulajdonságuk a másodlagos szerkezetük. A síkra vetített tRNS formát „lóhere” formának nevezik, melyben négy fő szakasz található. Az akceptor-karon egy szakasz kétszálú bázispárokat hoz létre, és mindig CCA szekvenciával végződik. Ennek a karnak az adenozin 3’OH-csoportjához kapcsolódik majd a szállítandó AS karboxilcsoportja észterkötéssel. Ez a kar nem hurokban végződik. Ez a kar 7 bp-t tartalmaz Az antikodon-kar ismeri fel a mRNS-en a bázistripletet, a kodont. Ez a kar hurokban végződik, a vetített képen az alsó hurok. Ez a kar 5 bp-t tartalmaz A D-kar a nevét egy ritka bázistól, a dihidrouridin-től kapta, az aminoacil-tRNS szintetáz enzim felismerésében van fontos szerepe. Ez a kar hurokban végződik, a vetített képen a baloldali hurok. Ez a kar 3-4 bp-t tartalmaz A TΨC-karban is vannak ritka bázisok, szokás ezt pszeudouridin karnak is nevezni, amely az amino-acil-tRNS-t a riboszómákhoz rögzíti. Ez a kar hurokban

végződik, a vetített képen a jobb oldalon. Ez a kar 5 bp-t tartalmaz Az extra-kar nagyon változatos nukleotid-szekvenciát mutat. A legtöbb tRNS-ben ez a kar 3-5 bp hosszúságú, de van 13-21 bp hosszúságú extrakar is. Minden tRNS-ben az antikodon-tripleten kívül még legalább két nukleotid van, ami szerepet játszik a mRNS-kodon felismerésében. Az antikodon-kodon kapcsolódás a BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA              komplementaritás alapján jön létre. Ez a kapcsolat nem tökéletes, ha az antikodon harmadik nukleotidja nem tökéletes párja a kodon harmadik nukleotidjának. Ez a jelenség a „wooble”, vagy lötyögés. A genetikai kód leolvasásában csak az antikodon-hurok játszik szerepet, az akceptor-karon lévő AS közömbös ebben a funkcióban. A nukleotidsorrend aminosavsorrendé történő

átfordításához szükséges a tRNS molekula, amely pontosan ismeri fel a kodont, és a kodonnak megfelelő aminosavat a megfelelő helyre illeszti. A tRNS másodlagos szerkezetében síkra kivetítve három nagyobb, jellegzetes hurok található, míg egy kisebb hurok szerkezete variábilis. A tRNS 5’ vége foszforilált, 3’OH-végén minden tRNS CCA nukleotidsorrenddel, ez a transzkripció utáni módosulásként rakódik a molekulára. Az L-alakú molekula 5’ és 3’ vége egymáshoz közel kerül, és a komplementer bázisok révén H-hidakat alkot egymással. A 3’ CCA vég nem vesz részt a H-kötések kialakításában, az adenilsav szabad 3’OH-jához vagy 2’OH-jához kötődik a meghatározott aminosav. A CCA végtől a legtávolabb elhelyezkedő hurok az antikodon hurok, mely felimeri a szállítani kívánt aminosav kódját a mRNS kodonján, amit három nukleotid alkot, majd azzal antiparalell módon összeilleszkedik. Az antikodon 5’ végén mindig egy

pirimidin bázist tartalmazó nukleotid, 3’ oldalán általában egy módosított purint tartalmazó nukleotid helyezkedik el. A molekulában az 5’ végtől indulva az I. hurokban mindig megtalálható egy dihidrouracil tartalmú nukleotid, míg a IV. hurok jellegzetessége a timinpszeudouridin-citidin szekvencia, melyet egy purin tartalmú nukleotid követ A tRNS-ek szerkezete lehetővé teszi az aminoacil-tRNS kapcsolat kialakulását katalizáló, az adott tRNS-re és a hozzátartozó aminosavra egyaránt specifikus aminoacil-tRNS-szintetázhoz történő kötődést és a fehérjeszintézisben részt vevő riboszómákkal való kapcsolatot is. Az aminosavakat jelentő kodonok száma nagyobb, mint a sejtben előforduló különböző tRNS-ek száma. Minden AS-nak más-más tRNS felel meg, de nem minden kodonhoz tartozik egy másik tRNS. Az azonos AS-at kódoló különböző kodonokat, ha azok csak a 3. nukleotidban különböznek egymásól, gyakran ugyanaz a tRNS ismeri fel.

Ez a wooble vagy lötyögés A kodon-antikodon egymással antiparalell párosodása nem olyan szigorú, mint a DNS-ben. Itt a kodon 3 helyén lévő nukleotid és az antikodon 1 helyén lévő nukleotid között olyan bázispárosodások is létrejöhetnek, amelyek DNS-ben soha nem figyelhetők meg. Egy azonos tRNS által felismert különböző kodonok ugyanazt az aminosavat jelentik. Azoknak az aminosavaknak, amelyeknek kodonjai nem csak a 3 nukleotidban különböznek egymástól, több tRNS-ük is van.  rRNS    A riboszómák épülnek fel rRNS-ekből és egyéb fehérjékből, hozzájuk kötődik az mRNS és tRNS is a peptidkötés kialakítása során. Az emlős riboszóma két fő nukleoprotein alegységből áll: a nagy alegységből (60S) és a kis alegységből (40S). A nagy alegység 50 specifikus fehérjéből és három rRNS-molekulából épül fel (5 S rRNS; 5,8 rRNS; 28 S rRNS). BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

  A kis alegység 30 specifikus fehérjéből és egyetlen RNS-molekulából épül fel, ami a 18 S rRNS. Valamennyi rRNS, az 5 S rRNS kivételével egy közör prekurzorból keletkezik az eukarióta magvacskában.  Snurp-ok  A három fő RNS-féleségen kívül a sejtmag és a ctpl. tartalmaz még nagyszámú, kis molekulatömegű, labilis RNS-eket, melyek leggyakrabban fehérjékkel együtt fejtik ki hatásukat a génexpresszió szabályozásában. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 15. A prokarióta DNS függő RNS polimeráz  A prokarióta DNS függő RNS polimeráz             A DNS-dependens RNS-polimerázok a DNS-minta jelenlétében, azzal komplementer, antiparalell RNS-láncot szintetizálnak a négyféle ribonukleozidtrifoszfátból (ATP, GTP, CTP, UTP). A

reakcióhoz Mg2+-ionok is szükségesek Az RNS-polimeráz hatására egy ribonukleotid-egység szabad 3’OH-csoportja és a belépő új egység 5’-foszfátja között foszfodiészterkötés alakul ki, miközben egy pirofoszfát lehasad. Az RNS-polimeráz nem igényel primert, mint a DNS-polimeráz. Nincs nukleáz aktivitásuk, így a szintézis közben bekeletkezett esetleges hibákat nem tudják kijavítani. A prokarióta DNS-függő RNS-polimeráz a legjobban az E. coli baktériumból ismert. Több alegységből épül fel. Az ún „core” enzim négy alegységből áll, α 2 ββ’ szerkezetű, a β’ a DNS-hez való kötődésben, a β a nukleozid-trifoszfátok kötésében játszik szerepet. A core enzimet egy szigma-alegységnek nevezett fehérje egészíti ki holoenzimmé. Feladata a transzkripció specifikus iniciációs helyének (promoter régió) felismerése a DNS-en. Ez az alegység felelős azért, hogy a transzkripció a megfelelő szálon, megfelelő helyen és

megfelelő irányban kezdődjék el. A prokarióta genom minden transzkripcióra kerülő egysége promoterrel kezdődik, ami az egység 5’ végén található. A promoter nem kódol fehérjét, a DNSdependens RNS-polimeráz bekötődésének helyét tartalmazza, ezenkívül elhelyezkedhetnek rajta ún. transzkripviós faktorok A promotert követik a genomon a struktúr gének. Az egy-egy polipeptidlánc szintéziséért felelős DNS-szakaszok szerkezete a prokarióta genomban folytonos, ezeket szokás cisztronoknak is nevezni. Prokariótákban előfordul, hogy egyetlen promoterről kiindulva egymásután több polipeptidlánc kódja is átíródik a mRNS-re (policisztronos mRNS). Eukariótákra ez nem jellemző. A különböző promotereken az RNS-polimeráz bekötődésére szolgáló szekvenciák hasonlítanak egymásra (hasonlítanak az ún. consensus szekvenciához), de nem teljesen azonosak egymással. Azokat a promotereket, melyek szekvenciája megegyezik a consensus

szekvenciával, erős promoternek nevezzük, az ettől kisebb-nagyobb mértékben eltérőket gyengébb promoternek. Az erős promoterek iránt az RNS-polimeráz szigma-alegysége nagyobb affinitást mutat, mint a gyenge promoterek iránt, gyakrabban kötődik be ide az enzim, így időegység alatt több mRNS szintetizálódik az erős promoterekkel rendelkező transzkripciós alegységekről. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  Ha kizárólag a promoter erőssége befolyásolja az RNS-polimeráz bekötődését és az átírás sebességét, akkor konstitutív mRNS szintézisről beszélünk, ami azt jelenti, hogy a prokarióta sejt életciklusa alatt az illető mRNS (fehérje) egyenletes sebességgel szintetizálódik. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 16. Eukarióta DNS függő

RNS polimerázok  Eukarióta DNS függő RNS polimerázok          A DNS-dependens RNS-polimerázok a DNS-minta jelenlétében, azzal komplementer, antiparalell RNS-láncot szintetizálnak a négyféle ribonukleozidtrifoszfátból (ATP, GTP, CTP, UTP). A reakcióhoz Mg2+-ionok is szükségesek Az RNS-polimeráz hatására egy ribonukleotid-egység szabad 3’OH-csoportja és a belépő új egység 5’-foszfátja között foszfodiészterkötés alakul ki, miközben egy pirofoszfát lehasad. Az RNS-polimeráz nem igényel primert, mint a DNS-polimeráz. Nincs nukleáz aktivitásuk, így a szintézis közben bekeletkezett esetleges hibákat nem tudják kijavítani. Eukarióta sejtek sejtmagjában a transzkripciót három különböző DNS-dependens RNS-polimeráz végzi. Az RNS-polimeráz I a magvacskában működik és az rRNS-ek közül a kis alegység 18S és a nagy alegység 5,8S és 28S rRNS-einek szintézisét végzi. Az RNS-polimeráz II a

fehérjéket kódoló gének transzkripcióját végzi. Az RNS-polimeráz III a tRNS-ek és az 5S rRNS szintézisében játszik szerepet. Az RNS-polimerázok jellegzetessége, hogy a gyilkos galóca toxinja, az α-amanitin az RNS-polimeráz II aktivitását már kis koncentrációban erősen gátolja, a III-as enzimet csak kis mértékben, a polimeráz I pedig egyáltalán nem érzékeny e toxinra. A mitokondriumban a nukleáris enzimektől különböző, speciális RNS-polimeráz működik, a mtDNS-ről folyó transzkripcióért felelős. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 17. Az eukarióta mRNS szintézise. Splicing  Az eukarióta mRNS szintézise                A szintézis az iniciációval kezdődik, amikor is a monocisztronos promoterhez a DNS-dependens RNS-polimeráz II a transzkripciós faktorok közreműködésével kötődik.

Az iniciáció befejeződik, amint az első nukleotid 3’OH-vége és a második nukleotid 5’OH-ját észteresítő foszfát közti foszfodiészterkötés kialakul. Az elongációt az RNS-polimeráz II enzim már egyedül is képes végezni, majd a terminációval a szintézisnek a transzkripciós része lezárul. Az eukarióta gén transzkripciójakor keletkező RNS még nem a mRNS, hanem az elsődleges transzkriptum (hnRNS). A hnRNS a teljes átiratot tartalmazza, tehát nem csak a fehérjéket kódoló exonokat, hanem a fehérjék szerkezetét nem kódoló intron-szekvenciákat is. A hnRNS-nek egy érési folyamaton kell ahhoz átesnie, hogy a fehérje szintézisét irányítani tudó mRNS-sé alakuljon. Az érési folyamatok közé tartozik az RNS 5’-végének módosulása, azaz a Capképződés, a 3’-vég módosulása, azaz a poliA-farok kialakulása, és a splicing. A hnRNS 5’ vége eredetileg egy purin-nukleozid-trifoszfát (pppA vagy pppG). A Cap-képződés után nem

lesz szabad 5’-vége az RNS-nek, mert egy GTP-ből származó, módosult nukleotid kerül a lánc végére 3’  5’ pozícióban. Az új láncvégi nukleotid egy olyan metileződött (7-metil-guanin-tartalmú) guanin nukleotid, melynek 5’-foszfátja pirofoszfátkötéssel kapcsolódik az eredeti láncvégi nukleozid β-helyzetű foszfátjához. Az eredeti szekvencia első és második ribóza ugyancsak metileződik. A Cap védi a mRNS-t a lebomlástól és szükséges a transzláció iniciációjához. A Cap-képződés előbb megtörténik, mint ahogy a transzkripció terminálódik. A poli-A-farok a transzkripció terminációja után alakul ki. A terminációhoz szükséges jelnek át kell íródnia az RNS-re, ez az AAUAAA szekvencia és poli-Ahelynek nevezik. Ezt egy specifikus endonukleáz enzim az RNS-en ismeri fel A szekvenciát egy kb. 20 nukleotidból álló szakasz követi (terminátor régió), ennek átíródása után az endonukleáz elvágja az elsődleges

transzkriptumot és a transzkripció befejeződik. Ezután a poli-A-polimeráz nevű enzim egyenként, ATP-ből egy kb. 250 nukleotidból álló láncot szintetizál az RNS 3’ végére. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  Splicing              Az intronoknak megfelelő RNS-szakaszok kivágásának és az exonoknak megfelelő RNS-szakaszok összeillesztésének rendkívül pontosnak kell lennie, hiszen egyetlen nukleotidnyi elcsúszás kereteltolódáshoz, más polipeptidláncot kódoló RNS kialakulásához vezethet. Az intronok pontos kimetszésében három kitüntetett nukleotidszekvencia játszik szerepet. Az 5’-splice hely (intron 5’ végén), a 3’-splice hely (intron 3’ végén) és az elágazódási hely (20-50 nukleotidnyira 5’-irányban az intron 3’ végétől). A splicing csak akkor történhet, ha az elsődleges

transzkripzumon mind a három szekvencia megtalálható (intrononként egyszer-egyszer). Az összes eukarióta intronjának kitűntetett szekvenciája megegyezik abban, hogy az intron 5’-végén GU, 3’-végén AG található. Az intron hossza (50 – 10.000 nukleotid) és szekvenciája a splicing szempontjából érdektelen. A mechanizmust az indítja el, hogy az elágazódási helyen lévő adenin nukleotid 2’OH-ja megtámadja az intron 5’ végén lévő nukleotidot és foszfodiészterkötést létesít annak 5’-foszfátjával. Az intron hurokszerű képződmény alkot, míg az intron 5’-végén levő exon (1. exon) 3’-végi nukleotidjának 3’OH-ja átmenetileg szabaddá válik. Az 1. exon szabad 3’ OH-ja ezután megtámadja az intron és a 2 exon közötti foszfodiészterkötést. Az intron lehasad és kialakul a foszfodiészterkötés az 1 exon 3’OH-ja és a 2. exon 5’-foszfátja között A mechanizmusban az snRNS-ek játszanak szerepet, melyek fehérjékkel

komplexet képezve snRNP-t (small nuclear ribonukleoprotein) alkotnak. Ezeket U-RNS-nek is nevezik magas U tartalmuk miatt. Az snRNS-fehérje komplex másik neve a splisosoma. Ezek közül egyik az 5’-splice helyet, a másik a 3’-splice helyet, a harmadik az elágazódási helyet ismeri fel, de a splicing mechanizmusában még további néhány snRNS (snRNP) is szerepet játszik. Alternatív splicing jelensége is ismert, ami azt jelenti, hogy az egyik polipeptidlánc szempontjából intronként viselkedő DNS-szakasz egy másik fehérje számára kódoló szekvenciát jelent, és benne marad annak érett mRNS-ében. Ez a lehetőség magyarázatot ad arra a tényre, hogy eukariótákban egy adott DNSszakasz nem minden esetben kódol kizárólag egyetlen polipeptidláncot. Ez persze nem egymástól teljesen különböző fehérjéket jelent, csupán annyit, hogy két fehérje egyik vagy másik része (pl. C-terminális AS-szekvenciája) különbözik egymástól. BIOKÉMIA I.

– MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 18. Az eukarióta transzkripciós faktorok és csoportosításuk. A DNS-sel való kölcsönhatásuk molekuláris magyarázata.  Az eukarióta transzkripciós faktorok             Az eukarióta gén vagy géncsoport transzkripciójához szükséges feltétel, hogy a gén környezetében lévő kromatin szerkezete lazább legyen, mint a transzkripciósan inaktív heterokromatin. Az ilyen aktív kromatint eukromatinnak nevezzük Egyrészt a promoterek bizonyos szakaszai egyáltalán nem rendeződnek nukleoszómába, más részt a transzkripcióra kerülő rész nukleoszómába rendezett azakaszán a nukleoszómák nem alkotnak olyan szoros struktúrát. A kromatin lokális elrendeződését speciálsi, az illető sejt differenciáltságának megfelelő fehérjék irányítják. A DNS metilációjának ugyancsak van szerepe a

génexpresszió szabályozásában. Vannak az ún. obligát transzkripciós faktorok, melyek az RNS-polimeráz bekötődését segítik elő, és a promoterek speciális szekvenciáihoz (TATA-box, GC-box, CAAT-box) kötődnek. A specifikus transzkripciós faktorok egyes géncsoportokra jellemzőek. A gén vagy géncsoport transzkripciójának specifikus szabályozását elősegítő specifikus cisz-elem (reszponzív elem) a gém promoterén vagy a géntől távolabb elhelyezkedő enhanceren található. Ezekhez a cisz-elemekhez kötődnek a speciális transzkripciós faktorok. Egy adott transzkripciós egység átírásáért több transzkripciós faktor kölcsönhatása a felelős. Reszponzív elemnek azokat a consensus DNS-szekvenciákat nevezik, amelyeket egy-egy specifikus kémiai jelre adott sejtválaszban érintett gének promoterén vagy enhancerén találtak. Ilyen pl a cAMP-szint emelkedés hatására indukálódó génekre jellemző CRE (cAMP-reszponzív elem) vagy a

steroidok által regulált gének SRE-i, a növekedési faktorok által regulált génekre jellemző regulációs elemek (szérum reszponzív elem). A nukleotidszekvenciát a megfelelő reszponzív elemekhez kötődő specifikus transzkripciós elemek ismerik fel. Ezek rendszerint a DNS nagy árkában elhelyezkedve képesek ionos kötéssel, van der Waals-kötéssel vagy H-hidakkal kapcsolatot létesíteni a megfelelő nukleotidokkal. A speciális transzkripciós faktorok szerkezetét és működését a kémiai jelek különféle módon szabályozhatják. Bizonyos esetekben a kémiai jel közvetlenül, allosztérikus ligandként fejti ki hatását (pl. steroidok), más esetekben egy szignáltovábbító mechanizmus eredményeként fehérje foszforiláció-defoszforiláció útján (pl. cAMP-szintet emelő jelek) A transzkripciós faktorok nagyon gyakran dimérként fejtik ki a hatásukat, kialakulhatnak egyetlen transzkripciós faktor két molekulájából álló homodimérek,

BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA    de gyakori jelenség, hogy két különböző transzkripciós faktorból alakul ki egy heterodimér. Egy kémiai jellel szabályozott transzkripciós faktor regulálhatja egy másik transzkripciós faktor génjét is, ilyen módon regulációs kaszkádok alakulhatnak ki. A transzkripciós faktorok között olyanok is vannak, amelyek nem serkentik at általuk regulált gének expresszióját, hanem gátolják. Végül is megállapíthatjuk, hogy a transzkripciós faktorok fehérjék, melyek a DNShez kötődnek.  A DNS-hez kötődő fehérjék csoportosítása  Ezek a fehérjék szerkezeti motívumaik alapján többféle csoportba oszthatók.  A hélix-kanyar-hélix szerkezetű fehérjére jellemző egy rövid α-helikális rész, amely a DNS nagy árkába illeszkedik, ahol a nukleotidokkal másodlagos kémiai kölcsönhatásba

lép, majd egy második rövid α-helikális rész csupán részben fekszik bele a nagy árokba. Ezek a fehérjék többnyire dimérként kötődnek a DNS-hez, megfelelő motívumaikkal egymással szomszédos nagy árkokban helyezkednek el.            A cinkujjal rendelkező fehérjékre jellemző ismétlődő szerkezetben található négy, speciálisan elrendezett Zn2+-iont kötő AS-oldallánc, a négy oldallánc lehet 2 his és 2 cys, vagy 4 cys. Két-két Zn2+.iont kötő egymáshoz közelim oldalláncot kb 12 AS-oldallánc választ el a továbbiaktól. Az ilyen módon kialakuló motívumnak van egy α-helikális szegmentje, amely képes kapcsolatot kialakítani a DNS nagy árkában található nukleotidokkal. A leucincippzár-szerkezet nem DNS-hez történő kötődésben játszik szerepet, hanem a fehérjemolekulák dimerizációjában (ami gyakori jelenség). A szerkezet úgy alakul ki, hogy a fehérje α-helikális szakaszán legalább négy

leu helyezkedik el, amelyeket egymástól hat-hat más AS választ el. Így az α-hélix minden második csavarulatánál egy leu kerül a hélix ugyanazon oldalára. Ha két ilyen szerkezettel rendelkező fehérje kerül egymás mell megfelelő pozícióban, akkor a leucin oldalláncok egymás közé ékelődve összetartják a két fehérjemolekulát. A cippzár-motívum közelében bázikus oldalláncú aminosavak vannak, amelyeknek a DNS-hez történő kötődésében van szerepük. A liganddal regulált transzkripciós faktorok csoportjába a sejten belül elhelyezkedő hormonreceptorok tartoznak. Ligandjaik nélkül inaktív állapotban vannak, egyesek a citoszólban, mások a sejtmagban helyezkednek el. A megfelelő ligand kötődése aktiválja a receptort, amely azután a DNS-en a specifikus reszponzív elemhez kötődve befolyásolja (serkent vagy gátol) bizonyos gének transzkripcióját. Ebbe a csoportba tartoznak a steroidok receptorai, a thyreoidahormon receptora, a

D-vitamin receptor, a reténsav receptorai (A-vitamin származék) és az aril szénhidrogén receptor. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA     A foszforiláció-defoszforiláció segítségével szabályozott transzkripciós faktorok közé tartozik pl. a cAMP-dependens protein-kináz által foszforilált transzkripciós faktor. A fos és jun fehérjék szintén transzkripciós faktorok, a sejtproliferációt serkentő extracelluláris kémiai jelek hatására meginduló bonyolult folyamat eredményeként foszforilálódnak, és a sejtproliferációban részt vevő gének működését szabályozzák. A p53 nevű fehérje többek között egy sejtproliferációt gátló fehérje (p21) génjének transzkripciós faktora. A p53 szerkezetét kódoló gén tumorszupresszor gén, vagyis olyan gén, amelynek deléciója vagy károsodása tumor kialakulásának egyik fontos

molekuláris komponense. Az Rb-fehérje nem saját maga transzkripciós faktor, mégis van transzkripciót szabályozó hatása. Komplexet képez olyan transzkripciós faktorral, amelynek feladata G1-fázisból az S-fázisba történő átmenetet segítő fehérjék génjeinek aktiválása. Az Rb-fehérje inaktív komplexben tartja ezt a transzkripciós faktort, így a G1/S-átmenetet is. Ezért aztán ez is tumor-szupresszor BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 19. A genetikus kód  A genetikus kód          A transzkripció, illetve eukariótákban az elsődleges transzkriptum érése után a fehérjék szerkezetére vonatkozó genetikai információ a mRNS nukleotidsorrendjében jelenik meg. Egyes AS-akat a mRNS 5’-vége felől a 3’-vég irányában egymást folyamatosan követő nukleotidhármasok határozzák meg. Az egy-egy aminosavat kódoló

nukleotidtripletet nevezzük kodonnak. A mRNS 4 különböző bázisának mindegyike kodonban 3 lehetséges helyen fordulhat elő, ami alapján összesen 64 különböző kodon jöhet létre, viszont a fehérjékbe csak húsz aminosav épül be. A 64 lehetséges kodon közül három nem jelent aminosavat (UGA, UAG, UAA). Ezek az ún. nonsense kodonok, stopkodonok Az AUG-kodon metioninnak felel meg, de kitüntetett szerepe még az, hogy a mRNS-en a fehérje szintézisének startpontját jelzi. Tehát a fehérjék N-terminális végén az aminosav mindig metionin (prokariótákban formilmetionin). A startkodontól a stopkodonig tart a fehérjére vonatkozó olvasási keret. A többi 60 kodon oszlik meg 19 aminosav között, ami azt jelenti, hogy egyes aminosavakat egynél több kodon képes meghatározni (a genetikai kód degenerált), egy-egy kodon azonban mindig csak egy AS-at kódol. A metioninon és triptofánon kívül minden aminosavnak egynél több kodonja van. A genetikai

univerzális, néhány kivételtől eltekintve minden élőlényre ugyanaz a kódszótár érvényes. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 20. A pro és eukarióta fehérjeszintézis iniciációjának összehasonlítása  A fehérjeszintézis alapja       A pro-és eukarióta genomról folyó transzkripció során csak a kettősszálú DNS bizonyos, meghatározott szakaszainak egyik száláról történik a másolás. Ez a szál szolgál templátként. Az RNS szintézis iránya 5’  3’, a leolvasás iránya 3’  5’. A komplementer RNS polaritása és szekvenciája megegyező lesz a mintául szolgáló DNS-szállal komplementer másik szállal, azzal a különbséggel, hogy az RNS-ben T helyén U lesz. A két szál közül pozitív, kódoló szálnak nevezzük azt a szálat, amely megegyezik a szintetizálódó RNS-sel, és negatív szálnak azt, amelyik

a mintaként szolgált. Míg a DNS bizonyos szakaszán elhelyezkedő transzkripciós egység számára az egyik szál a pozitív, addig egy másik helyen lévő egység számára lehet a másik a pozitív. A cirkuláris prokarióta genomon az óramutató járásával megegyező irányú a transzkripció a genom egyik szakaszán, míg egy másik szakaszon, ahol a másik DNS-lánc jelenti a pozitív szálat, a transzkripció az ellentétes irányban folyik.  A prokarióta fehérjeszintézis iniciációja       A transzkripció a transzkripciós egység 5’-végén, az RNS-polimeráz promoteren történő bekötődésével és a transzkripció iniciációjával kezdődik, az elongációval folytatódik, s a transzkripciós egység átírása után a 3’-végen terminálódik. Az iniciáció első lépése, az RNS-polimeráz holoenzim bekötődése a promoterhez, egy zárt promoter komplexet eredményez. Ezután a komplex átalakul, és létrejön a nyitott

promoter komplex, tehát a DNS kettőslánc széttekeredik egy rövid szakaszon. A templátról szintetizálódó mRNS-be beépülő első nukleotid általában purin bázist tartalmaz, az RNS 5’-végi nukleotidja vagy pppA vagy pppG. Az iniciáció befejezését az első, láncégi nukleozid-trifoszfát 3’OH-ja és a belépő második nukleotid 5’OH-ját észeteresítő foszfát közti foszfodiészterkötés kialakulása jelenti. Ezután a polimeráz szigma-faktora disszociál a komplexről, s a transzkripció elongációját az RNS-polimeráz „core” enzim folytatja. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  Az eukarióta fehérjeszintézis iniciációja         A folyamat az eukariótákban sokkal bonyolultabb, mint a prokariótákban. Az RNS-polimeráz II önmagában nem tud a promoterhez kötődni. Bekötődéséhez szükséges a promoteren lévő

specifikus DNS-szakaszokhoz (cisz-elemek) kötődő transzkripciós faktorok jelenléte. A regulált gén 5’ végén elhelyezkedő promoter régión kívül másféle specifikus bázisszekvenciával rendelkező elem, az „erősítő DNS-szakasz” (enhancer) is közreműködik a transzkripció elősegítésében. Az enhancer a regulált géntől több száz, vagy akár több ezer nukleotidnyi távolságban, a gén 5’ vagy 3’ végének irányában, vagy esetleg a gén közepén lévő, polipeptidet nem kódoló intronban is elhelyezkedhet, és ugyancsak a transzkripciós faktorok kötődését szolgálja. A promoteren elhelyezkedő cisz-regulációs elemekkel ellentétben, amelyek csak 3’-irányban hatnak, az enhancer elemek 5’ és 3’-irányban is kifejthetik hatásukat. Megfigyeltek „csendesítő” (silencer) cisz-regulációs elemeket is, melyekhez egyes gének transzkripcióját specifikusan gátló fehérjék kötődhetnek. Az eukarióta gének promoterén

leggyakrabban megtalálható, az obligát transzkripciós faktorok kötődésére szolgáló consensus szekveneciák a TATA-box (start nukleotidtól kb. 25 nukleotidnyira felfelé található), és az ettől felfelé, különböző promotereken különböző távolságban lévő, nem minden gén promoterében elhelyezkedő GC-box és CAAT-box. Az iniciációt elősegítő fehérjék nemcsak a DNS-hez, hanem egymáshoz és az RNSpolimeráz II-höz is kötődnek. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 21. Az aminosavak aktiválása  A tRNS szerepe             A nukleotidsorrend aminosavsorrendé történő átfordításához szükséges a tRNS molekula, amely pontosan ismeri fel a kodont, és a kodonnak megfelelő aminosavat a megfelelő helyre illeszti. A tRNS másodlagos szerkezetében síkra kivetítve három nagyobb, jellegzetes hurok

található, míg egy kisebb hurok szerkezete variábilis. A tRNS 5’ vége foszforilált, 3’OH-végén minden tRNS CCA nukleotidsorrenddel, ez a transzkripció utáni módosulásként rakódik a molekulára. Az L-alakú molekula 5’ és 3’ vége egymáshoz közel kerül, és a komplementer bázisok révén H-hidakat alkot egymással. A 3’ CCA vég nem vesz részt a H-kötések kialakításában, az adenilsav szabad 3’OH-jához vagy 2’OH-jához kötődik a meghatározott aminosav. A CCA végtől a legtávolabb elhelyezkedő hurok az antikodon hurok, mely felimeri a szállítani kívánt aminosav kódját a mRNS kodonján, amit három nukleotid alkot, majd azzal antiparalell módon összeilleszkedik. Az antikodon 5’ végén mindig egy pirimidin bázist tartalmazó nukleotid, 3’ oldalán általában egy módosított purint tartalmazó nukleotid helyezkedik el. A molekulában az 5’ végtől indulva az I. hurokban mindig megtalálható egy dihidrouracil tartalmú

nukleotid, míg a IV. hurok jellegzetessége a timinpszeudouridin-citidin szekvencia, melyet egy purin tartalmú nukleotid követ A tRNS-ek szerkezete lehetővé teszi az aminoacil-tRNS kapcsolat kialakulását katalizáló, az adott tRNS-re és a hozzátartozó aminosavra egyaránt specifikus aminoacil-tRNS-szintetázhoz történő kötődést és a fehérjeszintézisben részt vevő riboszómákkal való kapcsolatot is. Az aminosavakat jelentő kodonok száma nagyobb, mint a sejtben előforduló különböző tRNS-ek száma. Minden AS-nak más-más tRNS felel meg, de nem minden kodonhoz tartozik egy másik tRNS. Az azonos AS-at kódoló különböző kodonokat, ha azok csak a 3. nukleotidban különböznek egymásól, gyakran ugyanaz a tRNS ismeri fel. Ez a wooble vagy lötyögés A kodon-antikodon egymással antiparalell párosodása nem olyan szigorú, mint a DNS-ben. Itt a kodon 3 helyén lévő nukleotid és az antikodon 1 helyén lévő nukleotid között olyan

bázispárosodások is létrejöhetnek, amelyek DNS-ben soha nem figyelhetők meg. Egy azonos tRNS által felismert különböző kodonok ugyanazt az aminosavat jelentik. Azoknak az aminosavaknak, amelyeknek kodonjai nem csak a 3 nukleotidban különböznek egymástól, több tRNS-ük is van. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  Az aminoacil-tRNS kialakulása         A tRNS csak az antikodonnak megfelelő kodont ismeri fel és beilleszti a mRNS által meghatározott helyre az általa szállított aminosavat. Egy bizonyos tRNS-molekula és az antikodonjának megfelelő AS közti kapcsolat kialakulásának specificitásáért az aminoacil-tRNS-szintetázok felelősek. Az aminoacil-tRNS kialakulása két lépésben végbemenő folyamat, a köztitermék azonban nem disszociál le a reakciót katalizáló szintetázról. Az első lépés az aminosav aktiválása

ATP segítségével, e reakció eredményeként aminoacil-AMP keletkezik, és pirofoszfát (PP i ) hasad le az AMP-ről. Az aminoacilAMP-ben az aminosavnak a karboxilcsoportja és az AMP foszfátcsoportja savanhidridkötést alkot egymással A második lépés az aktivált aminosav átvitele a specifikus tRNS-re, az AMP lehasadása közben. Az aminosav karboxilcsoportja ekkor a tRNS 3’CCA végén lévő adenilsav ribózának 2’ vagy 3’ OH-jára kötődik észterkötéssel. Ez a kötés –eltérően a többi észterkötéstől– makroerg, az e kötésben konzervált energia a polipeptidlánc szintézisekor használódik fel. Az aminoacil-tRNS-szintetáz által katalizált reakció nettó egyenlete a következő: ATP + aminosav + tRNS  aminoacil-tRNS + AMP + PP i Minden aminosavat saját, csak rá specifikus aminoacil-tRNS-szintetáz kö a megfelelő tRNS-hez, a fehérjeszintézis genetikai kódhoz való hűségét kizárólag az aminoacil-tRNS-szintetázok nagyfokú

specificitása biztosítja. Az aminoacil-tRNS-szintetázok a sejt legspecifikusabb enzimei. Ez az enzim ismeri fel egyszerre az aminosavat és a neki megfelelő tRNS-t. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 22. A fehérjeszintézis elongációja  Iniciáció           A mRNS-en kódolt információ a mRNS 5’-vége felől a 3’-vég irányában fordítódik le, a polipeptidlánc pedig az NH 2 -végétől a COOH-vége felé növekszik. A szintézisben megkülönböztetünk iniciációs, elongációs és terminációs lépéseket. A szintézis az iniciációs komplex kialakulásával kezdődik. A mRNS a riboszóma kis alegységéhez kötődik, a startjelet alkotó AUG kodonhoz az iniciátor-tRNS antikodonja illeszkedik. Az így kialakuló szerkezetet nevezik 30S iniciációs komplexnek. Az iniciátor tRNS metionint szállít. A komplex kialakulásához

GTP, és ún. iniciációs faktorok szükségesek Prokariótákban három iniciációs faktor ismert (IF1, IF2, IF3). Az IF3 megakadályozza, hogy az üres 30S és 50S riboszóma alegységek egymáshoz kötődjenek. Az IF2 GTP-kötő fehérje és segíti a mRNS és az iniciátor-tRNS kötődését a kis alegységhez. A mRNS és az iniciátor-tRNS bekötődése után az 50S riboszóma is bekapcsolódik a kis alegységhez, közben a GTP hidrolizál és az iniciációs faktorok ledisszociálnak. A most már teljes riboszómát tartalmazó 70S iniciációs komplexen két kötőhely alakul ki, a P-hely (peptidil), illetve az A-hely (aminoacil). Az AUG kodon és a hozzá illeszkedő iniciátor-tRNS a P-helyre kerül. Az A-helynek megfelelően helyezkedik el a polipeptidlánc második aminosavának kodonja.  A fehérjeszintézis elongációja  A poliopeptidlánc szintézisének elongációja ciklikusan ismétlődő három lépésből áll, és a ciklus annyiszor ismétlődik, ahány

peptidkötés van a fehérjében.  Első lépésként először a polipeptid második aminosavát hordozó aminoacil-tRNS kötődik be az A-kötőhelyre (aminoacil), a második kodonnak megfelelő pozícióba illeszkedve. Az aminoacil-tRNS bekötődése GTP-t igényel, a bekötődésnél az EF-Tu nevű elongációs faktor segítkezik. Az EF-Tu egy GTP-kötő fehérje, a bekötődés folyamán a GTP-t hidrolizálja és a GDP kötve marad rajta. Az EF-Tu GDP-vel alkotott komplexe inaktív, és így nem tud részt venni a következő aminoacil-tRNS bekötődésének folyamatában. Egy másik elongációs faktor, az EF-Ts szükséges ahhoz, hogy az EF-Tu-ról a GDP disszociáljon és az EF-Tu ismét GTP-t tudjon kötni. Az EF-Tu GTP-GDP kötő ciklusa nagyon fontos komponense a transzláció hűségének, ugyanis ez a ciklus bizonyos időt igényel, ami idő szükséges ahhoz, hogy az A-helyen elhelyezkedő kodonhoz a megfelelő antikodon illeszkedjék. Ha a kodonhoz olyan antikodon

illeszkedett átmenetileg, amelyiknek csak két betűje komplementer, még van idő a disszociációra, mielőtt ténylegesen bekötődne a hibás tRNS.     BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA          Az elongáció második lépéseként a P-helyen lévő iniciátor-tRNS és az A-helyen bekötött aminoacil-tRNS által hordozott aminosavak között létrejön a peptidkötés. Ahogy kialakul az első AS COOH-ja és a második AS NH 2 -je között a peptidkötés, megszűnik a kapcsolat a lánckezdő metionin (formilmetionin) és az iniciátor-tRNS CCA-végén lévő OH-ja között. A peptidkötés kialakulását a riboszóma nagy alegységének saját fehérjéi közé tartozó peptidil-transzferáz katalizálja. A peptidkötés kialakulása után a második AS tRNS-éhez kötve helyezkedik el a kéttagú peptid a riboszóma A-kötőhelyén. A

harmadik lépés a transzlokáció, amelynek során a riboszóma elgördül a mRNShez képest. Az AUG kodon és az üres iniciátor tRNS legördül a P-helyről, a P-helyre a második aminosavnak megfelelő kodon és kéttagú peptidet hordozó tRNS kerül. Az A-helyen megjelenik a lánc harmadik aminosavát meghatározó kodon. A transzlokáció szintén egy molekula GTP hidrolízisét igényli és a harmadik prokarióta elongációs faktor, az EF-G (transzlokáz) segédkezik a folyamatban. A transzlokáció után az elongációs ciklus mindhárom lépése ismétlődik minden újabb aminosavnál mindaddig, amíg a polipeptidlánc utolsó aminosavát hordozó tRNS és ehhez kötve a teljes polipeptidlánc nem kerül a P-helyre. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 23. A fehérjeszintézis terminációja. A fehérjeszintézis pontosságának szabályozása.  A fehérjeszintézis

terminációja         A transzlokáció (elongáció harmadik lépése) után az elongációs ciklus mindhárom lépése ismétlődik minden újabb aminosavnál mindaddig, amíg a polipeptidlánc utolsó aminosavát hordozó tRNS és ehhez kötve a teljes polipeptidlánc nem kerül a P-helyre. Ekkor következik be a polipeptidlánc szintézisének terminációja. Amikor az utolsó AS-nak megfelelő kodon az utolsó tRNS-sel együtt a P-helyre jut, az A-helyen megjelenik a stopkodon (vagy UAG, vagy UGA, vagy UAA). Ennek megfelelően nem kötődik újabb tRNS a riboszómához az A-helyre. Ehelyett a terminációs (release) faktorok kötődnek (vagy RF1, vagy RF2, vagy UAA esetén bármelyik). Ennek hatására a peptidil-traszferáz lehasítja a polipeptidláncot az utolsó (P-helyen lévő) tRNS-ről. A fehérje felszabadul, a riboszóma szétesik alegységeire, ami aztán elkezdheti egy újabb polipeptidlánc szintézisét. Egy riboszóma kb. 80 nukleotidnyi

helyet foglal el a mRNS-en Amint az első riboszóma a mRNS leolvasása közben elhagyja az első, kb. 80 nukleotidnyi szakaszt, egy másik riboszóma is megkezdheti a mRNS leolvasását, illetve a polipeptidlánc szintézisét. Ezután egy harmadik, negyedik, ötödik, stb. riboszóma kapcsolódásávak kialakul a poliszóma szerkezet, ami egy mRNS-ről sok egyforma fehérje szintézisét végzi egy azon időben, csak fázisokkal eltolva. Fehérjeszintézis közben mindig poliszóma alakul ki. Ez a szerkezet stabilizálja a mRNS-t.  A fehérjeszintézis pontosságának szabályozása    Minden aminosavat saját, csak rá specifikus aminoacil-tRNS-szintetáz köt a megfelelő tRNS-hez. A fehérjeszintézis genetikai kódhoz való hűségét egyrészt az aminoacil-tRNS-szintetázok nagyfokú specificitása biztosítja. A tRNS azt az aminosavat segíti beépíteni a polipeptidláncba az antikodonja által felismert kodonnak megfelelő pozícióba, amelyiket a szintetáz

hozzákötötte, csak a specifikus aminoacil-tRNS-szintetáz ismeri fel egyszerre az adott aminosavat és a neki megfelelő tRNS-t. Az aminoacil-tRNS-szintetázok a sejt legnagyobb specificitású enzimei közé tartoznak. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA        A megfelelő tRNS felismerése könnyű feladat, mert a különböző aminosavakat szállító tRNS-ek bázisszekvenciája különbözik egymástól. Nehezebb felismerni az egyes aminosavakat, mert bizonyos aminosavak szerkezete nagyon hasonló (pl. valin és izoleucin) Az aminoacil-tRNS-szintetázok kettős szűrővel rendelkeznek. Az esetleges elkövetett hibák korrigálására egy második szubsztrátfelismerő helyet is tartalmaznak. Ha véletlenül téves aminosavat aktiválnak, a specifikus tRNS kötődésekor hidrolizálják a hibás kötést. A genetikai kódhoz hű transzláció másik

komponense az elongáció alatt működő EF-Tu elongációs faktor GTP-GDP kötő ciklusa. Ez a ciklus ugyanis bizonyos időt vesz igénybe és ez az időmennyiség szükséges ahhoz, hogy az A-kötőhelyen lévő kodonhoz a megfelelő antikodon illeszkedjék. Ha a kofonhoz véletlenül egy olyan antiokodon illeszkedik átmenetileg, amelyiknek csak két betűje komplementer, még van idő a disszociációra mielőtt ténylegesen bekötődne a hibás tRNS. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 24. A DNS hasítása, elektroforézise. Southern, Northern hibridizációs eljárások, RFLP.  A DNS hasítása, elektroforézise              A restrikciós endonukleázok a DNS-t specifikus nukleotidszekvenciáknál hasító enzimek, amelyek felfedezése fontos szerepet játszott a laboratóriumi géntechnika megindításában. A restrikciós

endonuklázok a természetben a baktérium fágok elleni védekezésének eszközei. Az a fág, amelynek DNS-e tartalmazza az adott baktérium endonukleáza számára specifikus szekvenciát, abban a baktériumban nem szaporodhat. Ha az endonukláz megtalálja a DNS-en a számára specifikus szekvenciát, akkor ott elhasítja a DNS-t, mindkét szálon. A DNS specifikus nukleotidszekvenciánál történő hasításához a laboratóriumi gyakorlatban a II-es csoportba tartozó endonukleázokat használjuk (lásd 10. tétel) Az ebbe a csoportba tartozó enzimek a DNS-en szimmetrikus szerkezetű, általában 4 – 10 nukleotidegységből álló palindrom szekvenciákat ismernek fel és az endonukleázok a két DNS-láncon egymással szemben ellentétes irányban elhelyezkedő két azonos szekvencia azonos nukleotidja mellett hasítanak. Különböző baktériumok különböző szekvenciákat felismerő endonuklázokat tartalmaznak. Ha egy restrikciós enzimmel hasított DNS-en a hasítási

helyek éppen egymással szemben helyezkednek el, tompa végek képződnek. Előfordul azonban, hogy a két szálon a két metszéspont egymástól néhány bázisnyi távolságra van. Ekkor a metszett végen néhány bázis hosszúságú egyszálú végek alakulnak ki, melyek komplementer szakaszát a másik DNS-darab tartalmazza. Minthogy a komplementer DNS-szekvenciák egymással nagy affinitást mutatnak, ezeket a végeket „ragadós végek”-nek nevezzük. Laboratóriumi körülmények között, ha két különböző DNS molekula (pl. egy prokarióta plazmid és egy eukarióta kromoszóma-DNS) hasítható egy bizonyos endonukleázzal, jelezve, hogy a specifikus szekvenciát mindkét DNS tartalmazza, akkor mindkét DNS-molekulán kialakulhatnak olyan „ragadós végek”, melyek egymással komplementerek. A komplementer egyszálú végek spontán is képesek egymással összeilleszkedni, mely összeilleszkedő végeken a DNS-ligáz segítségével kialakulnak a hiányzó

foszfodiészter kötések (mindkét láncon egy-egy). Ezzel a módszerrel előállítható a két különböző molekulából származó DNS darabokból az új, rekombináns DNS. A különböző baktériumok által termelt, különböző specifikus szekvenciákat felismerő restrikciós enzimekből ma már száznál több ismert, és tisztított formában kereskedelmi forgalomban kaphatók. Rekombináns DNS-molekulák készítésén kívül a DNS nukleotidszekvenciájának analízisére is felhasználják ezeket az enzimeket. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA        Kiválasztanak egy endonuklázt, amelynek hasítási szekvenciája ismert. Ha az enzim képes elhasítani egy ismeretlen nukleotidszekvenciájú DNS-t, jelzi, hogy a DNS a hasítás helyén milyen szekvenciát tartalmaz. Több endonukleáz egymást követő alkalmazásával restrikciós térképet

lehet készíteni a DNS-ről. A kérdéses DNS-szakaszt egy endonuklázzal emésztik, majd a képződő fragmentumokat agaróz-gélelktroforézis segítségével méret szerint szétválasztják és az egyes fragmentumok pozícióját (hosszát) detektálják. Ezt el lehet végezni etidium-bromid festéssel fluoreszcencia alapján, de megkönnyíti a térképezést, ha a DNS 5’-végét radioaktív foszfát segítségével megjelölik, mert így a gélelektroforézissel szétválasztott fragmentumok autoradiográfiája alapján könnyű kimutatni azokat a fragmentumokat, amelyek az 5’ véget tartalmazzák. Az emésztési idő változtatásával el lehet érni, hogy a lehetséges hasítási helyek közül csak az egyiken (random) vagy mindegyiken megtörténjen a hasítás. A különböző módon végzett hasításokban kapott fragmentumok hossza és száma alapján a kirakós játékhoz hasonlóan lehet egymás mögé rendelni a DNS darabjait és meghatározni a restrikciós

szekvencia pozícióját. A műveletet több, különböző enzimmel megismételve az ismert szekvenciák előfordulásának helyéről részletes és a DNS-szakaszra jellemző képet lehet nyerni.  Southern, Northern hibridizációs eljárások          Specifikus DNS- vagy RNS-szekvenciák jelenlétének a jelzésére, azonosítására vagy mennyiségük meghatározására radioaktívan jelzett nukleinsav vagy oligonukleotid próbákat használnak. Az egymással komplementer nukleinsavszálak erősen vonzzák egymást és megfelelő körülmények között stabil kettős láncot alakítanak ki egymással. DNS-sel egy kívülről hozzáadott oligonukleotid csak akkor tud összeilleszkedni, ha a DNS-t először denaturáljuk. Ezután hozzáadva a próbaként használt nukleotidláncot a denaturált DNS-hez, megfelelő körülményeket létrehozva, ha a használt próbánkkal komplementer bázisszekvencia található a DNS-ben, a próba

hozzáilleszkedik. A mesterségesen létrehozott komplementer kapcsolat a hibridizáció. Ha a mint radioaktívan jelzett, csak ott alakul radioaktív jel, ahol a hibridizáció megtörtént, tehát a próbával komplementer szekvencia található. Különböző hosszúságú restrikciós DNS-fragmentumok közül egy bizonyos, vizsgálni kívánt DNS-darab kiválasztására, illetve azonosítására szolgál a Southern-blot technika. A blottolás a denaturált, egyszálú, a gélelektroforézissel hosszuk szerint szétválasztott DNS-darabok átvitele egy nitrocellulózmembránra, amelyen a nukleinsav erősen kötődik, és az ilyen módon rögzített molekula további analízisre alkalmassá válik. Az elektroforézissel szétválasztott, hosszúságuk szerint különböző pozícióban elhelyezkedő DNS-darabokat tartalmazó géllapot szűrőpapírra helyezik, közvetlenül a gél tetjére egy nitrocellulózmembránt tesznek, majd e fölé ismét szűrőpapírt. BIOKÉMIA I. –

MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA          Az alsó szűrőpapírt koncentrált sóoldattal nedvesítik, ami a kapillárishatás érvényesülése miatt átvándorol a közbülső rétegeken a felső szűrőpapírba. Eközben a DNS-t a gélből mintegy átmossa a nitrocellulózmembránra, ahol az erősen kötődik, minden DNS-darab pontosan abban a pozícióban, ahogyan a gélen elhelyezkedett, ezért nukleotidjainak száma meghatározható. A nitocellulózon fixált DNS-darabok közül hibridizáció segítségével kiválasztható a kérdéses DNS-fragmentum. Hasonló eljárás segítségével lehet kiválasztani és kimutatni egy bizonyos RNSmolekulát is például egy sejtkivonat összes RNS-ei közül. Az RNS analízisére szolgáló módszert Northern-blot eljárásnak nevezik. Ez a módszer megkönnyíti a génexpresszió vizsgálatát. Hibridizáció segítségével meg

lehet határozni egy kérdéses DNS-szekvencia helyét a kromoszómán, a sejten belül. Ezt az eljárást in situ hibridizációnak nevezik. A sejtet nagyon rövid ideig magas pH-jú oldattal kezelik, így a DNS denaturálódik, majd a próbát hibridizálják a komplementer DNS-szakasszal. Ebben a módszerben a próba nem radioaktívan jelölt, hanem olyan nukleotidot is tartalmaz, amelynek módosított oldallánca van. Az ilyen oldalláncot egy specifikus immunglobulin felismeri, és a Western-blot eljárásnál is használt módszer segítségével a hibridizáció helyét láthatóvá lehet tenni.  RFLP         Restrikciós térképek segítségével könnyen kimutathatók két vizsgálandó DNSdarab szekvenciájában megjelenő hasonlóságok, de méginkább a biztos eltérések. Ezzel a módszerrel vizsgálták pl. a mtDNS-ek evolúcióját és megállapították, hogy a pontmutációk valószínűsége az evolúció során tízszer nagyobb volt,

mint a genomiális DNS-é. Ha egy mutáció egy restrikciós helyet érint, az endonukleáz azon a helyen nem hasít.Másrészt mutáció létre is hozhat új hasítási helyeket Bármelyik eset következik be, megváltozik a restrikciós enzimekkel kapott fragmentumok száma és hossza. Ezen a jelenségen alapul az RFLP-térkép (restriction fragment lenght polymorphism), amely két egyed DNS-e közötti különbségeket mutat ki. A genomiális DNS-ben körülbelül minden 300. nukleotidban különbségek találhatók az egyes egyedek között. Ez a jelenség a polimorfizmus, melynek a legtöbb esetben nincs fenotípusos következménye. Ugyanakkor ha egy restrikciós endonukleázzal emésztünk két különböző emberből származó genomiális DNS-t, más és más hosszúságú restrikciós fragmentumokat kapunk. Az RFLP így alkalmazható személy azonosításra, amit az igazságügyi gyakorlatban lehet alkalmazni. Az eljárás alapja a Southern-blot technika. Egy személy

restrikciós fragmentum hosszai állandók és öröklődésükre a Mendel szabályok vonatkoznak. Ez tehát azt jelenti, hogy egy diploid szervezet esetében a szülőktől kapott RFLP kombinálódik BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  a gyerekben. Ezt a módszert apasági vizsgálatokban vagy gyanúsítottak azonosítására használják. Az RFLP géntérképezésre is alkalmazható, mert a restrikciós hasító hely előfordulása markerként nyomonkövethető pl. egy családon belül BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 25. Vektorok (plazmid, fág, vírusvektorok). Expressziós vektorok.  Vektorok  A rekombináns DNS sokszorosítható, elkülöníthető, azonosítható, a belőle kihasított darabok tisztíthatók, szekvenciájuk meghatározható. Rekombináns DNS

készítésének többféle célja lehet, az első feladat egy kiválasztott DNS-darab sokszorosítása.  Vektoroknak nevezzük, az olyan hordozókat, átvivőket, mely maga is DNS. A belőle illetve a vizsgálni kívánt DNS-ből készített rekombináns DNS bejuttatható egy baktériumba.  A vektornak az a lényege, hogy a baktériumban gyorsan replikálódni képes.  A vektor szerepét betöltheti egy plazmid-DNS. A plazmid a baktérium nagy cirkuláris DNS-én kívül megtalálható apró, kicsiny, szintén cirkuláris DNS a baktériumsejtben.  A plazmidok a nagy DNS-től függetlenül is replikálódhatnak, így egy-egy baktériumsejt            tartalmazhat akár száznál több másolatot is egy adott plazmidból. A plazmidok három típusát különböztetik meg: F- vagy szexfaktort, az R- vagy rezisztenciafaktort és a kolicinogén faktort. Az F-faktornak a baktérium konjugációjában van szerepe. Az F-plazmidot tartalmazó

baktérium (F+) hímnemű, az ilyet nem tartalmazó (F-) baktérium nőnemű. Az F+ baktérium kis nyúlványon át kapcsolatot létesít az F- baktériummal, ezen keresztül átjuttatja az F-plazmid egy szálát, amihez aztán az F- baktériumban megszintetizálódik a komplementer szál, és az is F+ baktériummá válik. Az R-faktor olyan géneket hordoz, amelyek különböző antibiotikumok elleni rezisztencia kialakulásához szükségez fehérjéket kódolnak. A kolicinogén faktor a kolicin nevű toxin produkciójához szükséges néhány génből áll. A plazmidok csak 5-10.000 bázisnál nem hosszabb DNS-darabok esetén jó vektorok, ennél nagyobb DNS-szakaszok esetén más vektorral, pl. fág-DNS-sel kell dolgozni. Gyakran használt vektor az E coli baktérium λ-fágja A leggyakrabban használt vektorok közé tartoznak az R-faktor plazmidok, amelyek a fehérjeszintézist gátló antibiotikumok jelenlétében is képesek replikálódni. A vektorba épített DNS-t egy

transzformációnak nevezett művelet segítségével juttatják a baktériumba. Hosszabb DNS-darabok klónozásához fág-vektor-DNS segítségével készítenek megfelelő rekonbinánst. A fág DNS-ből a végein levő bizonyos szakaszok (cos) kerülnek bele a konstrukcióba, ezek közé a karok közé 25-50.000 bázishosszúságú DNS-darabok is beilleszthetők. Így alakulnak ki a cosmidnak nevezett szerkezetek A cosmid mindig tartalmazza a bakteriális replikációs origót is. A cosmid szerkezet biztosítja a baktériumsejtben a replikáció lehetőségét. Az eukarióta expressziós vektorok (lásd később) között gyakoriak az eukarióta sejteket fertőző DNS-vírusok és retrovírusok genomjából készült konstrukciók. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA    Ezekből származnak azok a regulációs elemek, amelyek az expressziót bizosítják, e regulációs

elemeket általában valamilyen antibiotikum elleni rezisztenciáért felelős gént is hordozó plazmidvektorba ültetik. Az eukarióta sejtek transzfekciója során bekerült idegen DNS integrálódhat a saját genomba. Ekkor stabil, a sejtosztódás során expressziós képességét megőrző rendszer képződik. Ha a DNS nem integrálódik, hanem különálló DNS-ként (episzóma) viselkedik, az expresszió csak átmeneti, a transzfektált sejt az idegen DNS-t nem tudja utódaiba átörökíteni.  Expressziós vektorok    A rekombináns-DNS készítésének gyakori célja egy gén működésének a tanulmányozása vagy egy kívánt fehérje termeltetése. Ezekben az esetekben olyan vektorokat kell alkalmazni, amelyek nemcsak bejuttatják a kívánt DNS-szakaszt egy sejtbe, ahol az replikálódni képes, hanem lehetővé teszik a gén vagy génszakasz expresszióját, a mRNS illetve a DNS által kódolt fehérje termelődését is. Expressziós rendszerként

eukarióta gének esetében előnyösebbek az eukarióta rendszerek, mert azok tartalmazzák az RNS illetve fehérjék posztszintetikus módosításához szükséges komponenseket. Bizonyos vírusokkal fertőzött rovarsejteket gyakran szolgálnak fehérjetermeléshez expressziós rendszerül. BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 26. PCR és felhasználási területei  PCR (polimeráz láncreakció)         Egy kívánt DNS-szakasz homogén formában történő szaporítása klónozás útján hosszú és munkaigényes feladat. Az elmúlt évtizedben a DNS-polimeráz I segítségével egy olyan módszert dolgoztak ki, amely nagyon gyorsan, automatizálva is képes egy kívánt DNS-szakasz akár milliószoros mennyiségre történő sokszorosítására, feltéve, ha annak szekvenciája vagy legalább az elején és a végén lévő szekvencia ismert. A

szekvencia ismeretében DNS-szintetizátorban két olyan 20-25 tagú egyszálú oligonukleotidot készítenek, amelyek komplementerek a kérdéses DNS-darab egyik, illetve másik láncának 3’-végével, ezek töltik be a primer szerepét. A reakcióelegy tartalmazza a sokszorosítani kívánt DNS-mintát, a nagy moláris feleslegben lévő primereket, a négy dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátot, és egy olyan DNS-polimerázt, amely igen magas hőmérsékletű hőforrásokban élő baktériumokból származik (Taq polimeráz), és ezért nagy a hőtűrése. Aktiválását megőrzi olyan hőmérsékleten is, amelyen a DNS denaturálódik. A reakcióelegyet kb. 95 oC-ra emelve a DNS denaturálódik, két lánca elválik egymástól. Az elegyet alacsonyabb hőfokra hűtve a nagy moláris feleslegben lévő szintetikus primer molekulák hibridizálnak a megfelelő lánccal. A reakcióelegyet a polimeráz aktivitásának megfelelő hőmérsékleten tartva az enzim megszintetizálja a

primerek folytatását képező láncokat és így az eredeti DNS megkétszereződik. Egy újabb ciklus elindítható a reakcióelegy ismételt felmelegítésével. Ekkor az újonnan szintetizált DNS-molekulák ismét denaturálódnak és így az eredetinél már kétszer több templátot szolgáltatnak a reakcióhoz. Hűtés után a nagy feleslegben jelen lévő primer ismét hibridizál a megfelelő láncokkal és a polimeráz reakció végbemegy, ennek végén a DNS mennyisége ismét megkétszereződik. A ciklus 20-25-ször ismételhető, a folyamat végén a DNS mennyisége 2n-szeresére növekszik, ahol n a ciklusok számát jelöli.  A PCR felhasználási területei   A PCR-t ma már rutinszerűen használják a diagnosztikában és az igazságügyi orvosi gyakorlatban, ahol nagyon kis mennyiségű anyagból (pl. egy hajszálból vagy egy csepp beszáradt vérből) kell kiindulni. Fontos szerepe van az evolúciós vizsgálatokban, és gyakran alkalmazzák az

irányított mutagenezis stratégiájában is. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 27. A klónozás fogalma. cDNS és genomikus könyvtárak Klóntárak szűrése a keresett génre/fehérjére.  A klónozás fogalma  A klasszikus értelemben vett klónozás azt a folyamatot jelenti, amikor Rekombináns DNS-t készítünk egy kiválasztott DNS-darabból vektor felhasználásával, majd ezt a rekombináns genomot baktériumba transzformálva sokszorosítjuk.  Rekombináns DNS készítése  a klónozás első lépése    A vizsgálni kívánt DNS-t olyan plazmiddal rekombináltatjuk, ami az ampicillin elleni rezisztenciáért felelős gént tartalmazza és egy hasítási helyet a használt restrikciós endonukleáz számára. A ragadós végüknél összeilleszkedő DNS-darabokból a DNS-ligáz folymatos láncokat hoz létre. A képződő rekombináns plazmid

egyedei különböző genomiális DNS darabokat tartalmaznak.  Génkönyvtár létrehozása  a klónozás második lépése     Egy alkalmas, ampicillinre érzékeny baktériumtenyészetet transzformálunk a rekombináns plazmid preparátummal. Az egyik baktériumba az egyik fragmentumot hordozó plazmid, a másikba a másikat, stb. kerül be A baktériumokat ampicillint tartalmazó táptalajra oltva, csak a transzformált baktériumok növekednek. Az ilyen módon sokasított transzformált baktériumtenyészet alkotja a génkönyvtárat. Mivel a „könyvtárnak” annyi „lapja” van, ahány féle DNS-fragmentumot tartalmazó plazmidot transzformáltunk a baktériumokba, ezért ezeket –80 oC-fokra hűtve, fagyasztva tárolva a kívánt és keresett DNS-fragmentum bármikor kikereshető.  Klóntárak szűrése a keresett génre  a klónozás harmadik lépése  A baktériumtenyészet egy kis részét megfelelő hígításban szilárd táptalajra

oltják. Minden egyes baktériumból osztódása során egy elkülönülő telep jön létre. BIOKÉMIA I. – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA    Az agargélen elkülönülő telepekből pontosan ugyanabban a pozícióban, ahogy a táptalajon elhelyezkednek, másolatot készítenek egy nitrocellulózmembránra, amelyen a DNS hibridizációs próbája elvégezhető. A kiválasztani kívánt DNS komplementer oligonukleotidja a próba. A nem hibridizálódó felesleges próbát eltávolítják, majd a membránról autoradiográfiás felvételt készítenek. Ha a kívánt DNS-szekvencia jelenvolt valamelyik mintában, akkor az a gélen azonosítható, onnan izolálható és tovább szaporítható.  cDNS   A cDNS előállítása úgy történik, hogy érett mRNS-ről reverz transkriptáz enzimmel a megfelelő nukleotidok hozzáadása mellett szintetizáljuk a komplementer szálat,

ami tulajdonképpen a mRNS-nek megfelelő templátul szolgált eredeti DNS-fragmentum lesz. Különbséget a jelent az eredeti nukleáris DNS-sel, hogy mivel az érett mRNS-ről készült a nukleotidszál, ezért a mRNS már esett a splicing-on, tehát a cDNS intronokat már nem tartalmaz. BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 1. A DNS primer szerkezet meghatározásának elvi alapjai.  A DNS primer szerkezete         A DNS polinukeotidokból felépülő polinukleotidlánc. Az egyes nukleotidok cukorból, foszforsavból és purin vagy pirimidinbázisokból épülnek fel. A DNS cukoralkotó része a dezoxiribóz, purinbázisai adenin és guanin, pirimidinbázisai citozin és timin. A polinukleotidlánc gerincét dezoxiribóz-foszfát egységet ismétlődése képezi. A pentóz gyűrűnek a 5’-OH csoportja foszfát-észter kötéssel kapcsolódik a szomszédos

dezoxiribóz gyűrű 3’-OH csoportjához. A polinukleotidláncban a gerincet tehát 5’-3’ diészter kötések tartják össze. A nitrogéntartalmú bázisok kilógnak a gerincből. A polinukleotid láncnak az utolsó nukleotidja a lánc egyik végén szabad 5’ foszfátcsoporttal, a másik végén szabad 3’-hidroxilcsoporttal végződik. A lánc bázisszekvenciáját 5’  3’ irányban írjuk föl. A nukleinsav molekulának az elején szabad 5’-P, a végén pedig szabad 3’-OH csoport van, ezt nevezzük a molekula polaritásának. Ha aDNS-láncot építőelemeire bontjuk, nukleozid-monofoszfátokat kapunk. A DNS-láncban elhelyezkedő nukleotidok sorrendje, az ún. bázisszekvencia agja a DNS primer szerkezetét.  A DNS primer szerkezetének vizsgálata         A DNS nukleotidszekvenciájának analízisére felhasználhatók az ún. restrikciós endonukleázok. Kiválasztunk egy endonukleázt, melynek hasítási helye pontosan ismert. Ha ez

az enzim képes elhasítani a DNS-t, akkor a hasítási hely szekvenciája ismertté válik. Mennél hosszabb egy restrikciós enzim által felismert szekvencia, annál kisebb a valószínűsége, hogy egy adott DNS-szakaszon ez a szekvencia előfordul, vagy többször is előfordul. Több restrikciós endonukleáz egymást követő alkalmazásával restrikciós térképet lehet készíteni a DNS-ről. A keletkezett fragmentumokat agaróz-gélektroforézissel méret szerint szétválasztjuk, és az egyes fragmentumok pozícióját (méretét) detektáljuk (pl. fluoreszcens jelölés, radioaktív foszfát jelzés az 5’ végre  autoradiográfia). Az emésztési idő kellő beállításával el lehet érni, hogy a restrikciós helyek közül csak az egyiken (random) vagy az összesen megtörténjen-e a hasítás. A műveletet több, különböző restrikciós enzimmel megismételve az ismert szekvenciák előfordulásának helyéről részletes és a DNS-szakaszra jellemző képet

lehet kapni. A restrikciós enzimekkel elhasított DNS kisebb fragmentumainak bázisszekvenciájának meghatározására kétféle módszert alkalmazunk: a specifikus BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA               kémiai hasítás módszerét (Maxam-Gilbert), és a didezoxi-módszert, a megszakított enzimatikus szintézis segítségével kapott fragmentumok analízisét (Sangermódszer). A specifikus kémiai hasítás segítségével történő analízishez a két különböző specificitású endonukleázzal kihasított, vizsgálni kívánt DNS darab egyik vagy másik láncának 3’ végét szelektíven megjelöljük egy 32P-vel jelzett foszfátot tartalmazó dezoxi-ribonukleotiddal. Egy-egy kísérletsorozatban csak azt a láncot analizáljuk, amelynek vége a radioaktív jelzést kapta, a két lánc hődenaturációval

szétválasztható. A kémiai hasításhoz jelzett preparátumot négy részre osztjuk. A specifikus kémiai hasítás során az egyik vagy a másik bázist hasítjuk le az N-glikozidos kötésnél és a sérült nukleotid az alkalmazott feltételek mellett a láncból kihasad. A négy elkülönített mintában végbemenő specifikus reakciók eredményeként egyegy minta mindig az egyik fajta bázis hasításával kapott eredményt mutatja. (Az egyik mintában mindkét purinbázis hasad, a másikban preferenciálisan a guanin, a harmadikban mindkét pirimidin, a negyedikben preferenciálisan a citozin. Az első és második minta különbségeiből az adeninre, a harmadik és negyedik minta különbségeiből a timinre vonatkozó adatokat lehet leolvasni.) A hasítást olyan kémiai feltételek mellett engedjük végbemenni, hogy csak részleges hasítás történjen, vagyis a lehetséges több hasítási hely közül egy molekulában mindig csak kevés helyen történjen meg a

reakció. Az egy-egy minta különböző pozícióiban lévő nukleotidjai kihasítása révén keletkező, különböző számú nukleotidegységeket tartalmazó egyszálú láncdarabokat poliakrilamid-gélelektroforézis segítségével a hosszúság alapján szétválasztjuk. A radioaktív jelzés lehetővé teszi, hogy a 3’-végtől számított különböző számú nukleotidegységnyi távolságban végbemenő hasítások révén kapott, különböző hosszúságú fragmensek pozícióját a gélen autoradiográfia segítségével kimutassuk. (A láncvéget és így radioaktív jelzést nem tartalmazó fragmensek nem látszanak.) A négy mintában a négy különböző nukleotid kihasításával létrehozott fragmentumok hosszúságából a szekvencia leolvasható. A kérdéses bázis előfordulásának helye a szekvenciában a kihasítással képződő fragmentumok nukleotidegységeinek száma +1. A megszakított enzimatikus szintézis segítségével történő analízis

során az egyszálú, vagy hődenaturációval egyszálúvá tett DNS-szálak szekvenciájának meghatározása a komplementer szál szekvenciájának a meghatározásán alapul. A komplementer láncot primer jelenlétében, a DNS-polimeráz I enzim segítségével szintetitálják. A szintézis megszakításához didezoxi-ribonukleotidokat használnak, mely nukleotidokban a ribóznak nemcsak a 2’-, hanem a 3’-szénatonján is hiányzik az OH-csoport, ezért ha a DNS-polimeráz beépíti a nukleotidláncba, a lánc további szintézise megszakad, mert a következő nukleotiddal a foszfodiészter kötés nem tud kialakulni. A szintetizálódó új lánc 5’ végét jelöljük, mint az előbb, majd az elkészített preparátumot négy részre osztjuk. Mind a négy mintához hozzáadjuk a szintézishez szükséges összes alapanyagot (enzim, bázisok), és minden mintához egy-egy különböző bázist tartalmazó didezoxi-ribonukleotidot, melyeket a DNS-polimeráz beépít a

láncba. BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA   A beépülő didezoxi-ribonukleotid megszakítja a szintézist, és a radioaktívan jelölt 5’-véget tartalmazó fragmentum utolsó, 3’-nukleotidja lesz. Gélelktroforézis alkalmazásával meg lehet állapítani a négy mintából, hogy egy-egy bizonyos bázist tartalmazó didezoxi-ribonukleotid hány nukleotidegységből álló fragmentumokat eredményezett. A fragmentumok nukleotidjainak száma jelzi a kérdéses bázis helyét a komplementer lánc bázisszekvenciájában. BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 2. A DNS másodlagos szerkezete  A DNS secunder szerkezete               Watson és Crick megállapítása szerint a DNS normális körülmények között mind eukariótákban,

mind prokariótákban kettős spirál formájában található meg. A két DNS lánc egymással komplementer, ami azt jelenti, hogy az egyes bázisok a másik láncban csak a megfelelő bázisokkal kapcsolódnak (AT; GC). A kettős hélixben a báziskapcsolódás mindig úgy történik, hogy egy purinbázishoz egy pirimidinbázis (és fordítva) kapcsolódik. A DNS-ben a két polinukleotidlánc iránya ellentétes, antiparalell, azaz az egyik lánc 5’  3’, a másik lánc 3’  5’ irányban halad. A láncokat H-hidak és hidrofób kölcsönhatások tartják össze, amelyek önmagukban gyengék, de sokaságuk azonban erős kötést jelent. Az adenin két H-kötéssel kapcsolódik a timinhez, a guanint három H-kötés kapcsolja a citozinhoz. A kettős hélix a komplementaritásnak köszönhetően ugyanazt az információt hordozza. A specifikus bázispárok kialakulásában a bázis-tautomerizációnak nagyon nagy jelentősége van. Az elektron és protonvándorlás az

–OH-csoport és a gyűrű N-atom között minden bázis számára két tautomer a laktim (enol) és laktám (oxo)- formát tesz lehetővé. A kettős hélixben a bázisok oxo-formában vannak jelen Az egymás fölött elhelyezkedő planáris bázispárokat apoláros és hidrofób kölcsönhatások tartják össze, amelyek jelentősen hozzájárulnak a kettős hélix stabilitásához a H-hidakon kívül. A bázisok hidrofób tulajdonsága, az aromás gyűrűk elektronszerkezete az egyik legfőbb motiváló erő a helikális szerkezet kialakításában. Az egymás fölött elhelyezkedő lapos gyűrűk minden poláros molekulát kizárnak a környezetükből, felvéve a legstabilabb, helikális szerkezetet. A helikális szerkezetben a foszfátok töltéséhez kationok, a sejtben Mg2+ ionok kapcsolódnak. A helikális molekula külső felszínén helyezkednek el a foszfát cukor egységek, amelyektől negatív töltése van a DNS-felületének. Mivel a bázispárok glikozidos kötései

nem pontosan egymással szemben helyezkednek el, kialakul egy kis árok és egy nagy árok. Két polinukleotid lánc elvben jobb vagy balmenetes hélixet alkothat, azonban a fiziológiás B-DNS jobbmenetes. A DNS kettős spirálját nevezzük a DNS szekunder struktúrájának. A secunder szerkezetben kialakulhat A-, B-, C- és Z-DNS molekula (lásd: 3. tétel) BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA  A DNS secunder szerkezetének vizsgálata     A secunder szerkezet vizsgálata röntgendiffrakciós eljárással történik. Ha röntgensugárzás esik atomokra, ezek elektronjain a sugárzás szóródást szenved, és az atomok minden irányban változatlan frekvenciájú röntgenfényt sugároznak. Ha az átsugárzott anyagban az atomok szabályos elrendeződésben vannak és az atomtávolságok a röntgensugárzás hullámhosszának nagyságrendjébe esnek, akkor az egyes

atomokon szórt sugarak hulláminterferencia folytán bizonyos irányokban erősíthetik, másokban kiolthatják egymást. A röntgensugár hullámhosszának ismeretében az interferenciafoltok elhelyezkedéséből következtethetünk az atomok elhelyezkedésére, és meghatározhatjuk a közöttük lévő távolságokat. BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 3. A genetikai kód tulajdonságai  A genetikus kód          A transzkripció, illetve eukariótákban az elsődleges transzkriptum érése után a fehérjék szerkezetére vonatkozó genetikai információ a mRNS nukleotidsorrendjében jelenik meg. Egyes AS-akat a mRNS 5’-vége felől a 3’-vég irányában egymást folyamatosan követő nukleotidhármasok határozzák meg. Az egy-egy aminosavat kódoló nukleotidtripletet nevezzük kodonnak. A mRNS 4 különböző bázisának mindegyike kodonban 3

lehetséges helyen fordulhat elő, ami alapján összesen 64 különböző kodon jöhet létre, viszont a fehérjékbe csak húsz aminosav épül be. A 64 lehetséges kodon közül három nem jelent aminosavat (UGA, UAG, UAA). Ezek az ún. nonsense kodonok, stopkodonok Az AUG-kodon metioninnak felel meg, de kitüntetett szerepe még az, hogy a mRNS-en a fehérje szintézisének startpontját jelzi. Tehát a fehérjék N-terminális végén az aminosav mindig metionin (prokariótákban formilmetionin). A startkodontól a stopkodonig tart a fehérjére vonatkozó olvasási keret. A többi 60 kodon oszlik meg 19 aminosav között, ami azt jelenti, hogy egyes aminosavakat egynél több kodon képes meghatározni (a genetikai kód degenerált), egy-egy kodon azonban mindig csak egy AS-at kódol. A metioninon és triptofánon kívül minden aminosavnak egynél több kodonja van. A genetikai univerzális, néhány kivételtől eltekintve minden élőlényre ugyanaz a kódszótár érvényes.

BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 4. A szemikonzervatív replikáció bizonyítása  A szemikonzervatív replikáció     Minthogy a DNS két lánca egymással komplementer bázisszekvenciával rendelkezik, a replikáció szempontjából mindkettő tartalmazza ugyanazt az információt. A DNS replikációjának a lényege, hogy a kettős spirál láncai egymástól szétválnak, és külön-külön mindkettőről, mint templátról megszintetizálódik egy komplementer bázisszekvenciájú, antiparalell lefutású új lánc, tehát az eredeti kettős láncú DNS-sel teljesen azonos két új molekula keletkezik. A két új DNS-molekula egyik-egyik lánca a mintául szolgáló és teljes egészében megőrzött szülői lánc és csak a másik szintetizálódik újonnan, mindig egy-egy nukleotidegységgel hosszabbodva. Ezért a replikációt szemikonzervatívnak nevezik.

 A szemikonzervatív jelleg kísérletes bizonyítása     A bizonyítás Meselson és Stahl nevéhez fűződik, akik kísérleteikben colibaktériumokat 15N-izotópot tartalmazó táptalajban sok generáción keresztül tenyésztettek. Miután az összes baktérium minden N-je az izotóp formára cserélődött le, a baktériumokat olyan táptalajba helyezték, amelyben 14N volt a nitrogénforrás. Osztódás után vizsgálva a baktériumokat, megállapították, hogy az újonnan szintetizálódott DNS 50%-ban 14N-t tartalmaz. Ez azt bizonyította, hogy minden új baktériumsejtbe a DNS kettős spirál egyik szálának megfelelő komplementer minta került át (ez azonban nem jelenti azt, hogy a két szál nem egyenértékű az információ megőrzése szempontjából), és az új sejtben kiegészül a megfelelő DNS-szállal. Ezáltal itt is létrejön a kettős spirál BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

5. Prokarióta DNS függő DNS polimerázok és szerepük  Prokarióta DNS polimerázok               A prokarióta replikációban a mintául szolgáló DNS-lánccal komplementer, új DNSlánc szintézisét a DNS-dependens DNS-polimeráz nevű enzimek végzik. A bakteriális DNS-polimerázok közül a DNS-polimeráz III felelős a replikációért. Az elsőként felfedezett DNS-polimeráz I a repair-ben játszik elsősorban szerepet, bár a replikáció egyik segédenzimeként is működik. A DNS-polimeráz I háromféle katalitikus aktivitással rendelkezik: egyrészt DNSszintetikus aktivitása van, másrészt ezzel ellentétes, polinukleotidokat hidrolítikusan hasító, nukleáz aktivitása. Ez utóbbi kétféle aszerint, hogy a DNSlánc 5’ – vagy 3’-végéről hasít le nukleotidot (korrekciós 3’ – 5’ exonukleáz és hibajavító 5’ – 3’ exonukleáz aktivitás). Az enzim egyetlen

polipeptidlánból áll, mindhárom aktivitásért ugyanaz a lánc a felelős. A polipeptidláncot megfelelő helyen történő hasítással olyan mesterséges fragmenssé alakítható, amely elvesztette 5’  3’ exonukleáz aktivitását. Ezt a laboratóriumi géntechnikában gyakran használt fragmentumot nevezik Klenowfragmentnek. A DNS-polimeráz III kétféle katalítikus aktivitással rendelkezik: szintetikus, és 3’ – 5’ exonukleáz aktivitással. 5’ – 3’ irányban nem hasít le nukleotidot A replikációban a DNS-szintézisért felelős enzim több, részben azonos, részben különböző aszimmetrikus molekula (4-4 alegység azonos, a többi különbözik). A DNS-polimerázok működéséhez szükséges mind a négy különböző dezokiribonukleozid (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), továbbá magnéziumionok és a templát DNS egyidejű jelenléte, de ez még nem elég. A DNS-polimerázok nem képesek megszintetizálni a DNS-lánc első néhány bázisa közti

foszfodiészterkötéseket, hanem indítóláncot (primer) igényelnek. A primer lehet a templáttal komplementer DNS vagy RNS, amelynek utolsó nukleotidja szabad 3’-OH.val rendelkezik Ehhez kapcsolódik a szintézis során az első dezoxi-ribonukleotid 5’-OH-csoportját észteresítő foszfát, pirofoszfát lehasadása mellett. A mintául szolgáló DNS-szál és a képződő új szál antiparalell lefutású, a szintézis 5’  3’ irányú, a leolvasás 3’  5’ irányú. A DNS-polimerázok korrekciós 3’ – 5’ exonukleáz aktivitását lásd a 9. tételben! A DNS-polimerázok nukleotidokat csak úgy tudnak összekötni, hogy egy szabad nukleozid 5’-trifoszfát α-helyzetű foszfátját kötik hozzá a polinukleotid láncvégi 3’OH-jához, az α- és β-foszfátok közti pirofoszfátkőtés hidrolízise és a (β, γhelyzetű) pirofoszfát lehasadása közben. Nem képesek azonban összekötni a 3’OHegy olyan nukleotid 5’-foszfátját, amely nukleotid már

egy DNS-lánc első tagja BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA           (azaz 5’ vége). Ezt a reakciót, amely csupán egyetlen foszfodiészter kötés kialakulását jelenti, viszont ezzel két DNS-láncot köt össze (vagy egyet kör alakúvá tesz) a DNS-ligáz nevű enzim végzi. A DNS-polimeráz III tehát az új DNS-t 5’  3’ irányban szintetizálja, a komplementer templátot csak 3’  5’ irányban képes olvasni. A DNS-polimeráz III a vezetőszálon a primázhoz kapcsolódva folyamatosan tudja szintetizálni az új DNS-szálat, de az elmaradó szálon ellentétes irányban halad, 1000 – 1500 bázis hosszúságú Okazaki fragmentumok formájában. A katalizált szintézis érdekessége, hogy a kétirányú szintézist egyetlen DNS polimeráz III molekula végzi. Az enzim több alegységből álló, két aszimmetrikus karral

rendelkező molekula. Egyik karja a vezető láncot, másik karja pedig az ezzel ellentétes irányban növekvő elmaradó láncot szintetizálja. Ez úgy lehetséges, hogy az Okazaki fragmentum templátja átmenetileg hurokszerűen visszahajlik, mely hurok mentén a DNS-polimeráz III a replikációs villa haladásának irányában haladhat a késlekedő szálon, míg a tényleges szintézis iránya ezzel ellentétes. Az Okazaki fragmentumok folyamatos nukleinsavvá történő átalakítása és a primerek kivágása az 5’  3’ exonukleáz aktivitással rendelkező DNS polimeráz I feladata. A második fragmentum addig szintetizálódik, amíg a 3’OH vége el nem éri az első fragmentum primerének 5’ végét. A második fragmentum szintézisének befejezésekor a DNS-polimeráz I 5’  3’ irányú repair exonukleáz aktivitása segítségével egyenként lehasítja a ribonukleotid egységeket az első fragmentumról, és helyüket a komplementer dezoxi-ribonukleotid

egységekkel pótolja. Ez azért lehetséges, mert ehhez a művelethez most már a primert a második fragmentum láncvégi szabad 3’OH-ja szolgáltatja. Így meghosszabbodik a második fragmentum az előző fragmentum első dezoxi-ribonukleotid egységéig. Ekkor már minden nukleotid a helyén van, csupán egyetlen foszfodiészterkötés hiányzik, amit a DNS.polimerázok nem tudnak létrehozni A primer helyére utolsóként beépített egység 3’OH-ját a következő nukleotid 5’foszfátjával a DNS-ligáz köti össze a foszfodiészterkötéssel. A fenti folyamat minden Okazaki fragmentumnál ismétlődik. BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 6. Prokarióta DNS polimerázok exonukleáz aktivitásának szerepe a replikáció pontosságának ellenőrzésében.  A replikáció pontosságának megvalósítása      A DNS replikációjának nagyon pontosnak kell

lennie, a másolás közben bekövetkező esetleges hibákat ki kell javítani, a nem komplementer bázisok beépülését meg kell akadályozni. Baktériumokban ezt maga a DNS-polimeráz végzi el, „korrekciós” 3’  5’ exonukleáz aktivitása segítségével, amely az esetleg beépülő nem komplementer nukleotidot hasítja le. A szintézis során beépített utolsó nukleotid bázisa és a minta komplementer bázisa közti H-hidakat érzékeli a polimeráz enzim, és a szintézist csak akkor folytatja, ha a komplementer bázisok között a stabilizáló H-kötések kialakultak. Ha a H-kötések nem alakulnak ki, ez azt jelenti, hogy az utolsónak beépített nukleotid hibás, bázisa nem komplementere a templát bázisnak. Ilyen esetben a polimeráz enzim az utolsóként létrehozott foszfodiészterkötést hidrolítikusan elhasítja, a hibás nukleotidot eltávolítja és csak ezután folytatja a szintézist ugyanezen a helyen. BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

7. Az Okazaki-fragmentek és a ligáz szerepe a DNS replikációjában.  Okazaki fragmensek           A mintául szolgáló DNS-szál és a képződő új szál antiparalell lefutású, a szintézis 5’  3’ irányú, a leolvasás 3’  5’ irányú. A DNS-polimeráz III az új DNS-t 5’  3’ irányban szintetizálja, a komplementer templátot csak 3’  5’ irányban képes olvasni. A DNS-polimeráz III a vezetőszálon ezért a primázhoz kapcsolódva folyamatosan tudja szintetizálni az új DNS-szálat, de az antiparalell lefutású elmaradó szálon ellentétes irányban halad, 1000 – 1500 bázis hosszúságú Okazaki fragmentumok formájában. A vezetőszál szintéziséhez elég egyetlen primer a startpontnál, míg a késlekedő szál minden darabjának szintézise egy primer szintézisével kezdődik. A primáz a dnaB-dnaC komplex

segítségével az origotól kb. 1000 bázisnyi távolságra a késlekedő szál templátjáho kötődik, és visszafelé, a replikációs villa haladásával ellentétes irányban megszintetizálja az első Okazaki-fragmentum rövid primer RNS-ét. Ennek 3’OH-jához kapcsolódva a primoszóma DNS-polimeráz III komponense hasonló irányban megszintetizálja az Okazaki-fragmentumot. A primeáz eközben továbbcsúszik a templáton a villa haladásának irányában újabb 1000-1500 bázistávolságra, és újabb primer RNS-t szintetizál, amit ismét a DNSpolimeráz III folytat. Az Okazaki fragmentumok folyamatos nukleinsavvá történő átalakítása és a primerek kivágása az 5’  3’ exonukleáz aktivitással rendelkező DNS polimeráz I feladata. A második fragmentum addig szintetizálódik, amíg a 3’OH vége el nem éri az első fragmentum primerének 5’ végét. A második fragmentum szintézisének befejezésekor a DNS-polimeráz I 5’  3’ irányú repair

exonukleáz aktivitása segítségével egyenként lehasítja a ribonukleotid egységeket az első fragmentumról, és helyüket a komplementer dezoxi-ribonukleotid egységekkel pótolja. Ez azért lehetséges, mert ehhez a művelethez most már a primert a második fragmentum láncvégi szabad 3’OH-ja szolgáltatja. Így meghosszabbodik a második fragmentum az előző fragmentum első dezoxi-ribonukleotid egységéig. Ekkor már minden nukleotid a helyén van, csupán egyetlen foszfodiészterkötés hiányzik, amit a DNS.polimerázok nem tudnak létrehozni  A ligáz szerepe    A DNS-polimerázok nem tudják nem tudják összekötni az RNS-primer utolsó helyére beépült nukleotid 3’OH-ját a következő egység 5’-foszfátjával. Ezt a reakciót katalizálja a DNS-ligáz. A reakció energiaigényes, prokariótákban NAD+ hidrolízisének terhére megy végbe. BIOKÉMIA – MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

  A DNS-ligáz tevékenységére nemcsak a replikációban, hanem a repair és rekombináció mechanizmusában is szükség van. A két replikációs villában szintetizálódott láncok egyesítését az origonak megfelelően, illetve a replikációs villák találkozásakor ugyancsak a DNS-ligáz végzi