Kémia | Tanulmányok, esszék » Faragó Eszter - A vér-agy gát szelektivitásának molekulaszerkezeti alapjai és nanotechnológiai hasznosításuk a permeabilitás elősegítésére

FARAGÓ ESZTER A vér-agy gát szelektivitásának molekulaszerkezeti alapjai és nanotechnológiai hasznosításuk a permeabilitás elősegítésére Diplomamunka Témavezetők: Dr. Kiss Éva és Prof. Dr Kálmán Mihály ELTE TTK Fizikai-Kémiai Tanszék 2011 Köszönetnyilvánítás Dolgozatomat az ELTE Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriumában, illetve a Semmelweis Egyetem Anatómiai és Fejlődéstudományi tanszékén készítettem. Köszönetet szeretnék mondani témavezetőimnek Dr. Kiss Évának és Prof Dr Kálmán Mihálynak, akik lehetővé tették, hogy diplomamunkámat az általuk vezetett csoportokban végezhessem. Ezenkívül köszönettel tartozom a munkám során nyújtott hasznos tanácsaikért, útmutatásukért, áldozatos munkájukért. Szeretném megköszönni Dr. Hórvölgyi Zoltánné Pető Idának, Őz Andreának és Deák Szilviának a munkám során nyújtott sok segítséget. Köszönöm továbbá Pénzes Csanád Botond PhD hallgatónak

az AFM mérések elvégzését, kiértékelését, Mahalek Judit és Sam Sadeghian orvostanhallgatóknak a műtétek elvégzése során nyújtott segítségét. Köszönettel tartozom Dr. Havancsák Károlynak és Dr Varga Gábornak a pásztázó elektronmikroszkópos mérések elvégzéséért, amelyek az ELTE Anyag- és Élettudományi Szerkezetkutató Centrumában készültek. Köszönöm Dr. Jalsovszky Istvánnak, Cserép Balázs Gergelynek és Enyedi Kata Nórának, hogy rendelkezésemre bocsátották a fluoreszceineket és a kumarinokat, illetve Dr. Hegedűs Imrének, MTA MÜKKI munkatársának a flureszceinnel jelölt kompozit anyagokat. Köszönöm továbbá az ELTE Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriumának összes dolgozójának, illetve a Semmelweis Egyetem Anatómiai- és Fejlődéstudományi tanszékén Prof. Dr Kálmán Mihály vezette csoport összes tagjának a támogatást és azt, hogy mindig jóindulatú segítőkészséggel álltak a

kéréseimhez, kérdéseimhez. Végül, de nem utolsósorban köszönettel tartozom családomnak, akik mindig mellettem álltak, és mindenben támogattak. 2 Tartalomjegyzék: Rövidítésjegyzék . 6 1. Bevezetés 7 2. Irodalmi összefoglaló 9 2.1 A vér-agy gát fogalma, biológiai szerepe 9 2.2 A vér-agy gát felépítésében résztvevő főbb sejtek 9 2.21 Agyi endothelsejtek 10 2.22 Asztrociták 12 2.23 Periciták 13 2.3 A vér-agy gát permeabilitása, transzport rendszerek 13 2.31 Paracelluláris transzport 14 2.32 Transzcelluláris transzport 15 2.321 Receptor mediált transzport (RMT) 15 2.322 Carrier mediált transzport 16 2.323 Adszorptív mediált transzcitozis (AMT) 16 2.324 Efflux transzporterek 17 2.3241 Multidrog rezisztens transzporterek 17 2.4 A vér-agy gát állapota a központi idegrendszert érintő betegségek esetén 17 2.41 Neurodegeneratív betegségek 18 2.411 Alzheimer-kór 18 2.412 Parkinson-kór 18 2.42 Cerebrovaszkuláris

betegségek 19 2.43 Gyulladásos betegségek 19 2.431 Fertőzés 19 2.432 Sclerosis Multiplex (SM) 20 2.433 Agytumor 20 2.5 Stratégiák gyógyszerek központi idegrendszerbe juttatására 21 2.51 Invazív technikák 21 2.52 Nem invazív technikák, kolloidális gyógyszerhordozók 22 2.521 Polimer micellák 22 2.522 Liposzómák 23 3 2.523 Nanorészecskék 24 3. Célkitűzések 29 4. Kísérleti rész 30 4.1 Felhasznált anyagok 30 4.2 Nanorészecskék előállítása 30 4.21 Nanoprecipitáció 30 4.22 Az eljárás kidolgozása 31 4.23 Fluoreszcens részecskék 32 4.3 A részecskék jellemzése 33 4.31 Dinamikus fényszóródásmérés 33 4.32 Pásztázó elektronmikroszkópos mérések 34 4.33 Atomi erő mikroszkópos mérések 36 4.34 Fluorimetriás mérések 36 4.35 Rediszpergálhatóság és stabilitás vizsgálata 38 4.36 A biológiai vizsgálatoknál használt metodikák 38 4.361 Kísérleti állatok és a műtét 39 4.362 Feldolgozás 39 4.363

Vér-agy gát vizsgálata 39 4.364 Nissl-festés 40 4.365 Immunhisztokémiai vizsgálat 40 5. Eredmények 41 5.1 A nanoprecipitációs eljárás során tapasztaltak 41 5.2 Méret meghatározás dinamikus fényszóródásméréssel 41 5.3 Fluoreszcens anyagok kapszulázása 45 5.4 Pásztázó elektronmikroszkópos mérések 47 5.5 Atomi erő mikroszkópia 49 5.6 Rediszpergálhatóság és stabilitás 50 5.7 Biológiai vizsgálatok 53 5.71 Vér-agy gát vizsgálata ép agyban rhodaminnal 53 5.72 Vér-agy gát vizsgálata ép agyban Evans-kékkel 53 5.73 Vér-agy gát vizsgálata ép agyban fluoreszcein-izotiocianáttal jelölt nanoméretű kompozitanyaggal . 53 4 5.74 Vér-agy gát vizsgálata ép agyban fluoreszceinnel, illetve rhodamin B base-zel jelöltnanorészecskékkel . 53 5.75 Vér-agy gát vizsgálata fagyasztásos léziót követően 57 6. Eredmények értelmezése 58 6.1 A nanorészecskék előállítása és jellemzése során tapasztaltak értelmezése 58

6.2 A biológiai vizsgálatok során tapasztaltak magyarázata 58 7. Összefoglalás és kitekintés 60 8. Summary . 63 9. Irodalomjegyzék 65 5 Rövidítésjegyzék ABC: ATP kötő kazetta (ATP-Binding Casette) AFM: atomi erő mikroszkóp AMT: adsorptive-mediated transcytosis AP: alkaline phosphatase ATP: adenozin triphosphate BBB: vér-agy gát (Blood Brain Barrier) DLS: dinamikus fényszóródásmérés (Dynamic Light Scattering) γ-GT: γ-glutamil transpeptidase GFAP: gliális savanyú fehéje (Glial Fibrillary Acidic Protein) GLUT 1: glükóz transzpoter 1 (glucose transporter 1) JAM: Junctional Adherens Molecule LDL: alacsony denzitású lipoprotein (Low Density Lipoprotein) MAb: monoklonális antitest (Monoclonal Antibody) MDR1: multidrog transzporter (Multidrug Resistance Protein 1) MRP: multidrog-rezisztens protein (Multidrug Resistance-associated Protein) OAP: ortogonálisan rendezett transzmembrán fehérjestruktúra () PLA: politejsav (PolyLactidAcid)

PLGA:poli(D,L-tejsav-glikolsav) (Poly(D,L-Lactid Acid-Glyclic Acid)) PEO: polietilén-oxid PPO: polipropilén-oxid RHS: retikulo hisztocita rendszer (Reticulo Histocita System) RMT: receptor-mediated transport SEM: pásztázó nelektron mikroszkóp (Scanning Electronmicroscope) 6 1. Bevezetés A XIX. század vége óta ismert, hogy a központi idegrendszert a szervezet egészétől egyfajta gát választja el (a felfedezés Paul Ehrlich anilinfestéses kísérletéhez köthető), jelentőségét azonban csak hosszú évtizedek kutatómunkája nyomán ismerték fel. Ez a gát csak olyan anyagok számára átjárható, amelyek feltétlenül szükségesek az agy tápanyagellátása és homeosztázisának fenntartása szempontjából. Nemcsak az idegen, agy számára toxikus anyagokat tartja távol, hanem a szervezet immunanyagait is. A hagyományos gyógyszerek esetén sok esetben azzal a problémával kell szembesülnünk, hogy nem a célszervben fejtik ki hatásukat. Bár az

irányított célba juttatás gondolata szintén Paul Ehrlich által már 1908-ban felmerült, sajnos ezt a gyakorlatba mind máig nem sikerült teljes mértékben átültetni, bár vannak biztató eredmények. Komoly problémát okoz ebből következően, hogy a szükségesnél nagyobb mennyiségben kell adagolni a gyógyszereket, így biztosítva az adott célszerv számára a megfelelő mennyiséget. Ez különösen a tumoros megbetegedések esetében okoz komoly gondot, ugyanis ilyen pácienseknél sok esetben erős citosztatikumokat alkalmaznak, így igen sok toxikus mellékhatás lép fel. Emellett számos más betegség kezelése során szintén számítanunk kell hasonló mellékhatásokra. A központi idegrendszert érintő kóros elváltozások esetében ezeken kívül meg kell birkóznunk egy másik feladattal is, miszerint át kell juttatni az adott hatóanyagot a szervezet egészét és az agyat elválasztó gáton, ugyanis az agy felé történő anyagáramlást a

vér-agy gát korlátozza. A központi idegrendszert érintő kóros elváltozások igen nagy százalékában kimutatható a vér-agy gát károsodása. A károsodás egyaránt lehet a kór kiváltója vagy a betegség következménye. Komoly problémát okoz, mert így a védelmi funkciók megszűnnek, ezáltal az idegszövetet elárasztják a számára toxikus anyagok. Ez azonban terápiás lehetőségeket is rejt magában, hiszen ebben az esetben a hatóanyag molekulák is átjuthatnak a vér-agy gáton. Ebben az esetben azonban egy másik probléma merül fel, miszerint a gyógyszermolekulák nemcsak az agy károsodott területeire jutnak el, hanem az egészséges részek sejtjeihez is, ami komoly problémát okoz. Egy lehetséges megoldást nyújt a nanotechnológia. Az anyagtudomány fejlődése révén több olyan anyagot elő tudtunk állítani, amelyek 7 biokompatibilisek, biodegradábilisek, így az irányított terápia kulcsfontosságú elemei lehetnek. A

nanotechnológiai eljárások révén pedig ezekből az anyagokból olyan méretű, és felületi tulajdonságú hordozórészecskéket állíthatunk elő, amelyek alkalmasak a gyógyszerek célba juttatására. Egyrészt, mert megakadályozzák az immunrendszer által történő kiürülést, másrészt anélkül lehet a hordozóegységet valamilyen carrier molekulával megjelölni, hogy a hatóanyagot bármilyen csekély mértékben is befolyásolnánk, harmadrészt nem kell a szervezetet feleslegesen terhelni a nagy dózisú gyógyszerekkel. Mindezek ismeretében azt mondhatjuk, hogy a gyógyszerkutatásban a nanoméretű, megfelelő felületi tulajdonságokkal rendelkező részecskék hordozóként való alkalmazása egy igen jelentős perspektíva lehet. 8 2. Irodalmi összefoglaló 2.1 A vér-agy gát fogalma, biológiai szerepe Az ún. vér-agy gátat (blood-brain barrier, BBB) a következőképp definiálhatjuk: Az azonos strukturális és funkcionális elemek

összessége, amelyek behatárolják az általános szövetközti tér és agy állománya közti anyagforgalmat. Szerepe kettős egyrészt elhatárolja az agyat a szervezet többi részétől, kizárja azokat az anyagokat, amelyek károsak lehetnek a központi idegrendszer számára, másrészt biztosítja bizonyos anyagok átjutását. Mivel a vér-agy gát jelentősége kiemelkedő a szervezet egészének normális működése során, tulajdonságainak feltérképezésére több in vitro modell született, amelyek segítségével több feltételezést sikerült bizonyítani. (pl Gliasejtek és endothelsejtek kapcsolata [1,7]) 2.2 A vér-agy gát felépítésében résztvevő főbb sejtek A vér-agy gát felépítését a „három sejt modell” segítségével szemléltethetjük [5]. Ennek tagjai: endothelsejtek, asztrociták és periciták [1,3,4,5]. (1ábra) Az alábbiakban ezen sejttípusok jellemzése következik. 1. ábra: A vér-agy gátat felépítő három sejtféleség:

endothelsejt, asztrocita és pericita elhelyezkedése 9 2.21 Agyi endothelsejtek Az endothelsejt az erek belső felületét borító rendkívül lapos sejtféleség. Kulcsfontosságú szerepet játszik érfal permeabilitásának szabályozásában [2]. A kapillárisok falát csak endothelium és annak lamina basalisa alkotja, amelynek támaszkodik mind az endothelsejt, mind pedig a gliasejt. Az agyi erek az agyállomány mélységében szinte kizárólag ilyen szerkezetűek. A különböző szerveket behálózó erek falát alkotó sejteket csupán néhány egyedi jellemzőjük különbözteti meg, elsősorban permeabilitásuk. Ez alapján három csoportra oszthatjuk a kapillárisokat: fenesztrált, diafragmával fenesztrált és nem fenesztrált kapilláris. Az utóbbi csoportba tartoznak az agyi erek endothelsejtjei, amelyek szabályozzák a véralvadást, receptoraik segítségével felveszik és lebontják az alacsony denzitású lipoproteineket (LDL) és a különböző

glikoproteineket [1]. Az agyi endothelsejteket a szervezet más részén elhelyezkedő endothelsejtektől több speciális tulajdonságuk különbözteti meg (pl.befolyásolják az agyi keringést), amelynek révén a vér-agy gát funkció kialakul. A vér-agy gát funkció lényegében három összetevőből áll. Az egyik (a) a sejtek közötti inter- vagy paracelluláris átjutás gátlása (tight junction-ök által). A másik (b) transzcelluláris transzport gátlása, a harmadik (c) ezt kiegészítendő a szükséges anyagok átjutásának biztosítása. a) Az agyi endothelsejteket szoros zárókapcsolatok (zonula occludensek), tight junction-ök kötik össze, amelyek általában a hámszövetre jellemzőek. (2ábra) 10 2.ábra: Az endothelsejtek közti szoros zárókapcsolat szerkezete A szoros zárókapcsolat által összekapcsolt endothelsejtek adják a vér-agy gát morfológiai alapját. Blokkolják a paracelluláris transzportot a vérből Ez adja a gát-funkció

kulcsát [1,3,4,6,7]. (2ábra) A szoros kapcsolat szerkezeti alapját speciális fehérjék (occludin, claudin, JAM (junctional adhesion molecules)) alkotják, amelyek mint a varrás öltései tartják össze a két sejt membránját. Egy-egy occludin molekula négyszer éri át a membránt és két hurkot hoz létre, amelyek homofil módon kötődnek egy másik plazmamembránon hasonlóképp létrejött hurkokhoz [6,7]. Ily módon olyan közel kerülnek az endothelsejtek egymáshoz, hogy a paracelluláris transzport lehetősége igen csak lecsökken. A tight junction felelős az agyi endothelsejtek polaritásáért is, amelynek az enzimek és transzportfehérjék aszimmetrikus elhelyezkedése köszönhető. Ez igen fontos tényező a vér-agy gát működésében. b) Az idegrendszeri működéshez nem szükséges, illetve az azt kifejezetten gátló anyagok kiszűrése, a szükséges anyagok mennyiségének szabályozása az efflux transzporter pumpák feladata. Ezek egyik családja

az ATP-kötő kazetta (ABC)-transzporterek, amelynek a vér-agy gát felépítése szempontjából fontos tagja a P-glikoprotein vagy más néven multidrog transzporter (MDR1).(Részletesebben ld 2325 fejezetben) Elsődleges ligandumjaik 11 xenobiotikumok, citosztatikumok, pl.:Vinca-alkaloidokstb [1,8] Az ABC-transzporterek közül ki kell még emelnünk a multidrog-rezisztencia proteineket (MRP), amelyek főként glutation-konjugált vegyületeket pumpálnak vissza a vérbe [1,8]. c) Mindezek ismeretében érthető, hogy az idegrendszer sejtjeinek funkcionalizálásához elengedhetetlen tápanyagok átjuttatása speciális transzport-rendszerek segítségével történik. Ezek között megtalálhatjuk a receptorhoz kötött transzcitózist, illetve szállítófehérjékhez kötött átjutást is. Az előbbire példa a LDL vagy inzulin agyba jutása, az utóbbira pedig a glükóz-transzporter 1 (GLUT 1) vagy A- és L-típusú aminosavtranszporterek [1,4,5]. 2.22

Asztrociták Az idegszövet idegsejtekből és gliasejtekből épül fel. A két alkotóelem egymástól elválaszthatatlan, szerves egységet képez. A glia felelős nagyrészt az agy a szervezettől való elhatárolásáért. Ennek megfelelően számos funkciót képvisel, amiket a szervezet többi részében más sejtféleségek látnak el. A gliasejtek feladata az idegsejtek speciális anyagcseréjének a lebonyolítása (pl. K+, Ca2+, NH3, NO, glikogénstb), illetve mielinhüvelyképző és támasztó funkció ellátása, ezenkívül a vér-agy gát funkciók kialakításában is döntő szerepük van [1,2,9]. Az idegsejtek és a gliasejtek közt különbséget tehetünk, miszerint az utóbbi esetében nem terjed tova az akciós potenciál, a gliasejt nem mutat hisztodinamikai aktivitást, és nincs főnyúlvány a nyúlványai közt. A gliát négy nagy csoportra osztjuk: asztrocitára, oligodendrogliára, mikrogliára és ependymára [9]. Az asztrocita sejtek közös

tulajdonsága, hogy tartalmaznak egy specifikus fehérjét, ún. glial fibrillary acidic protein-t (GFAP) [9]. Az asztrocita csillag alakú, sűrű elágazódású sejt Az idegszövet felszínén egységes réteget hoznak létre azáltal, hogy a gliatalpak mozaikszerűen összefekszenek, beborítják az ereket, hatással vannak az endothelsejtekre [2,3,7]. Az asztrociták hatására köztük erősebb a ’tight junction’, fokozódik zárókapcsolatok fehérjéinek expressziója. Ezzel együtt pinocytosis és a permeabilitás lecsökken, kialakul a sejtek polarizációja. Ennek hatására a BBB specifikus transzport-rendszerek, illetve enzimek működése is fokozódik, így például GLUT 1, illetve γ-glutamil-transzpeptidáz [7, 9]. Azonban nemcsak a gliasejtek befolyásolják az endothelsejtek tulajdonságait, hanem az endothelsejtek is hatással vannak a gliasejtekre. Kimutatták, hogy az agyi endothelsejtek 12 serkentik az asztrociták és periciták proliferációját,

befolyásolják azok működését, morfológiáját. A két irányú kommunikáció hipotézisét támasztja alá az az adat, miszerint a perivaszkuláris asztrocitákban az ortogonálisan rendezett transzmembrán fehérjestruktúra (OAP) (amelyet a víztranszportért felelős akvaporin csatornákkal azonosítanak [10]) és az endothelsejtek közötti ’tight junction’-ök párhuzamosan alakulnak ki. (Mindkét struktúra eltűnik, ha külön-külön tenyésztjük a két sejtet [7,9].) 2.23 Periciták A periciták az erek lamina basalisaban lévő sejtek, amelyek kontaktusban vannak az endothelsejtekkel [11,12]. Fontos szerepet játszanak az agyi angiogenesisben (in vitro modellben sikerült igazolni [14]), az endothelsejtek közti ’tight junction’-ök kialakításában, a vér-agy gát differenciálódásában. Az erek simaizomsejtjeivel közös sejtvonalhoz sorolják őket, azonban elhelyezkedésük, morfológiájuk, bizonyos mértékig marker expresszió alapján

megkülönböztethetjük őket, bár általánosan használható markert még nem sikerült találni [13]. Az eloszlásuk és az, hogy milyen mértékben borítják az endotheliumot, értípusonként változó. Számos fiziológiás és patológiás folyamatban szerepet játszanak Megfigyelhető például, hogy hypoxia vagy agyi trauma esetén távolabb kerülnek az agyi mikroerektől, ami pedig hozzájárulhat a vér-agy gát permeabilitásának növekedéséhez. Hiányuk endotheliális hiperpláziát, abnormális morfogenezist idézhet elő az agyi erekben [12]. Bár a periciták jelentősége nyilvánvaló, azonosításuk nehézkes, mivel biokémiai, morfológiai, fiziológiai szempontból heterogének, így szerepükről még igen keveset tudunk. 2.3 A vér-agy gát permeabilitása, transzport rendszerek Mint már említettem az endothelsejteknél (ld 2.21 fejezetben) kétféle transzport történhet: paracelluláris (vagy intracelluláris) és transzcelluláris (vagy

intercelluláris). Köztük az az alapvető különbség, hogy a transzcelluláris transzport esetében a sejteken keresztül míg a paracelluláris transzport esetében a sejtek között jutnak át a molekulák az apikális oldalról a bazolaterális oldalra. A 3 ábra érzékelteti a transzport rendszerek elhelyezkedését 13 3. ábra: A transzport rendszerek elhelyezkedésének és működési elvének a szemléltetése 2.31 Paracelluláris transzport Paracelluláris transzportról beszélünk, ha a molekulák átjutása a szomszédos sejtek érintkezésén keresztül történik. Míg a transzcelluláris útvonal mind aktív mind passzív transzporttal bejárható, addig a paracelluláris úton csak passzív transzport révén juthatnak be a molekulák. Az utóbbi elektrokémiai, ozmotikus gradiens kialakulásával jár A vér-agy gát esetében ez elvileg nem történhetne meg, hiszen az agyi erek endothelsejtjei közt szoros zárókapcsolatok vannak, azonban a tapasztalatok

azt mutatják, hogy vannak olyan molekulák, amelyek paracelluláris úton jutnak be az agyba. A paracelluláris útvonalak vezetőképessége jól definiált érték, amely egyúttal meghatározza azt is milyen méretű és töltésű molekulák juthatnak át ezen az úton. A vér-agy gát paracelluláris permeabilitását az endothel citoszkeletonok közti összehúzó erő és az endothelsejtek közti, valamint a sejt-mátrix adéziós erők közti egyensúly biztosítja. Alapvetően egy igen dinamikus rendszerről beszélünk, ami a tight junction-öket felépítő molekulák kölcsönhatásainak dinamikus változásai révén a „nyitott” és „zárt” állapotok folyamatos cseréje történik, szigorúan szabályozott körülmények közt. Azonban a vér-agy gáton való átjutás esetében azt mondhatjuk, hogy a paracelluláris transzport szerepe nem jelentős. 14 2.32 Transzcelluláris transzport A transzcelluláris transzport folyamatokat energiaigény szempontjából

két csoportra oszthatjuk: aktív és passzív transzportra. A passzív transzport, amelyet további két csoportra oszthatunk (facilitált és nem facilitált passzív transzport), fő jellemzője, hogy a koncentrációgradienssel egyező irányba történik az áramlás. Ide sorolhatók az ioncsatornák (pl Na+csatorna, Ca2+-csatorna) Ily módon jut be pl a víz, a vízben oldott anionok, a kationok egy része.stb A hidrofil, nagyméretű molekulák számára azonban passzív transzport gátolt Az ilyen tulajdonságú anyagok aktív transzporttal juthatnak be. Aktív transzport esetén az áramlás a koncentráció-gradienssel ellentétes irányba történik. A legtöbb ilyen transzport energiaigényét közvetlenül az ATP terminális foszfátjának hidrolízise fedezi. Ezek az ún elsődleges aktív transzportok Ilyen pl Na+K+- ATPáz Vannak olyan transzportfolyamatok, amelyek nem közvetlenül kapcsolódnak az ATP hidrolíziséhez. A folyamat energiaigényét az elektrokémiai

gradiensnek megfelelő irányba transzportáló anyag fedezi. Az ilyen transzportokat nevezzük másodlagos aktív transzportnak. Ilyen mechanizmussal történik pl. a glükóz és bizonyos aminosavak felszívódása a bélhámból Morfológiai szempontból szintén két részre oszthatjuk a transzport folyamatokat: carrier mediált és vezikuláris transzport. 2.321 Receptor mediált transzport (RMT) A receptor mediált transzport mechanizmusának lényegét röviden úgy foglalhatjuk össze, hogy a keringésbe bekerült ligand összekapcsolódik az apikális membránban lévő receptorával, ezáltal egyfajta szignált indít el, amely indukálja az endocitózist. Ennek köszönhetően a receptor-ligand komplex egy klatrin nevezetű fehérje által burkolt intracelluláris vezikulába kerül. A RMT során a vezikula a bazolaterális oldalra kerül, ahol összeolvad a membránnal, így a ligand felszabadul. A receptor mediált transzport elsősorban a makromolekulák vér-agy

gáton való átjuttatásában van nagy jelentősége. Ilyen módszerrel juthatnak be pl különféle toxinok (diftéria, kolera), vírusok (szarkóma, adenovírus), fehérjék (transzferrin,LDL), hormonok (luteinizáló hormon), antitestek (Immunglobulin- G, -E). Fontos szerepet játszik a központi idegrendszer betegségeinek kezelésében, hiszen ebben az esetben meghatározó tényező, hogy az adott gyógyszer átjut-e a vér-agy gáton. Ha ezt az utat 15 célozzuk meg, akkor keresnünk kell olyan molekulát, amelynek van az endothelsejteken receptora (Klasszikus példák: inzulin receptor, transferrin receptor, LDL transzporterei). Ez a carrier lehet természetes eredetű vagy szintetikusan előállított pl. antitest vagy peptid. Ehhez konjugáljuk a bejuttatni kívánt hatóanyagot, így a gyógyszer a carrier molekulával együtt receptor mediált transzport segítségével átjut a vér-agy gáton [12,15-17]. 2.322 „Carrier mediált” transzport A „carrier

mediált” transzport tulajdonképpen a RMT egyik fajtája. A folyamat során a sejtmembránban elhelyezkedő transzporter fehérjék segítségével történik a molekulák, ionok membránon való átjuttatása. A transzporter fehérjék jelen vannak mind az apikális mind a bazolaterális oldalon a BBB membránban, nagy sztereospecifitással rendelkeznek, így a molekulák szelektív transzportját könnyen meg tudják valósítani. Ilyen mechanizmussal jutnak el a központi idegrendszerhez a szükséges tápanyagok, például: aminosavak, glükóz, nukleozidok, szerves savak, vitaminok. A bejutás a koncentrációgradiensnek megfelelően (vérből agyba áramlás) facilitált diffúzióval történik [12,15-17]. 2.323 Adszorptív mediált transzcitózis (AMT) Az AMT alapja az elektrosztatikus kölcsönhatás a pozitívan töltött anyag és az agyi endothelsejtek felszínén lévő, negatívan töltött helyek között. A negatív töltés főként a savas glükoproteinek egyik

alkotójának, a sziálsavnak tulajdonítható, de úgy tűnik sok esetben a heparán-szulfát jelenléte is szükséges a folyamat lejátszódásához [14,17,18]. A kölcsönhatás létrejötte után a bejuttatni kívánt molekula az endocitózis folyamatához hasonlóan egy vezikulába kerül. A vezikula vagy közvetlenül exocitózison esik át vagy a vezikuláris transzport valamelyik útvonalán halad tovább. Ha nem kerül lizoszómába a molekula, akkor végül az endothelsejt valamelyik oldalán exocitózissal kijut. Ezzel a módszerre főként a peptidek, proteinek jutnak be az agyba, így a központi idegrendszer betegségeinek gyógyítása esetén az aminosav alapú terápiás szerekkel ezt az útvonalat célozzák meg. 16 2.324 Efflux transzporterek Ahogy már korábban is említettem az efflux transzporterek az esetlegesen bejutó, sejtmembránon áthatoló, lipofil anyagok kívül tartásáért, a központi idegrendszer anyagcseretermékeinek kijuttatásáért,

az agy homeosztázisának fenntartásáért felelősek. Alapvetően három csoportra oszthatjuk őket, amelyek a következőek: multidrog rezisztens transzporterek, monokarbonsav transzporterek, szerves ion transzporterek. [20] A legfontosabbak a multidrog-rezisztens transzporterek, így a következő részben ezeket mutatom be részletesebben. 2.3251 Multidrog rezisztens transzporterek A multidrog rezisztens transzporterek egyik vér-agy gát szempontjából fontos tagja a P-glikoprotein (ABC transzporter vagy multidrog rezisztencia protein 1 (MDR1)). Az emberi szervezetben az agyi membránok luminális és abluminális oldalán egyaránt expresszálódik, így megfigyelhetők a periciták, asztrociták és mikroglia esetében is. A P-glikoprotein egy 150 kDa-os fehérje, amely két homológ részből áll, közöttük a kapcsolatot egy flexibilis linker teremti meg. Az elektronmikroszkópos felvételeken jól látszik, hogy az MDR1 henger alakú membránfehérje, amely egy kb. 5

nm átmérőjű pórust alkot. [21] A P-glikoprotein működését nem ismerjük pontosan, több hipotézist találhatunk az irodalomban. A leginkább elfogadott az ún pumpa-modell, amely szerint az ATP energiáját felhasználva történik a gyógyszerek, káros anyagok transzportja. Sokféle, sejtek számára toxikus anyagot pumpál ki, amelyek eltérő szerkezetűek lehetnek, de egy közös jellemzőjük van, mindegyik hidrofób karakterű. A P-glikoprotein fiziológiás jelentősége abban rejlik, hogy védi a sejteket a táplálékban és a környezetben előforduló toxikus anyagokkal szemben. Fontos tulajdonsága, hogy gátolható 2.4 A vér-agy gát állapota a központi idegrendszert érintő betegségek esetén Mivel a gyógyszereket különböző megbetegedések esetén adjuk, ezért érdemes megvizsgálni, hogy a különböző kóros állapotok során milyen változások történnek a BBB integritásában, permeabilitásában. Általános tapasztalat, hogy a sérült

agyszövetben a vér-agy 17 gát károsodott. Ez a károsodás vagy a betegség oka vagy pont ez okozza a kóros elváltozást A jelenségnek nyilvánvaló negatív hatása mellett van egy nagy előnye: a gyógyszerek könnyen, szelektíven érik el a beteg területet. A következőkben áttekintem a központi idegrendszer fontosabb kórállapotait, és megvizsgálom, hogy ezzel párhuzamosan a vér-agy gát permeabilitása hogyan befolyásolja az adott állapot kialakulását, kezelését. 2.41 Neurodegeneratív betegségek 2.411 Alzheimer-kór Az Alzheimer-kór az időskori dementia egyik formája, a kognitív képességek és az emlékezet progresszív hanyatlását idézi elő. A homloklebeny, halántéklebeny és hippokampusz kolinerg neuronjainak degenerációját, az említett szervek sorvadását okozza. A megbetegedés kialakulásában a vér-agy gát károsodása, megnövekedett permeabilitása jelentős szerepet játszik. Megfigyelték, hogy a kóros területen amyloid

felszaporodás történik. A β-amyloid egy heterogén, 39-43 aminosavból álló peptid [22] A lerakódás oka ismeretlen, egyik elmélet szerint a β-amyloid eleve az agyban keletkezik. Egy másik elmélet szerint a β-amyloid a keringési rendszerből származik, és ha átjut a vér-agy gáton neurotoxikus hatást vált ki. Ahogy már említettem több peptid és proteinreceptor-mediált transzport (lásd 2.321) segítségével jut át a vér-agy gáton és kerül a központi idegrendszerbe [23]. A β-amyloid is ilyen mechanizmussal jut be az agyba. A betegség kezelése jelenleg kolin-észteráz gátlókkal történik 2.412 Parkinson-kór A Parkinson-kór az Alzheimer-kórhoz hasonlóan lassan előrehaladó, degeneratív betegség. A kór a középagy dopaminerg neuronjainak károsodását okozza, ennek következtében dopamin hiány alakul ki a striatumon. A betegséget kiváltó ok többnyire ismeretlen, idegrendszeri fertőzések, más degeneratív betegség, gyógyszerek,

pszichoszomatikumok egyaránt előidézhetik. A Parkinson-kór kialakulása mögött azonban az esetek nagy többségében a P-glikoproteinhez kötött transzport rendszer csökkent efflux-funkciója áll, ami azt jelzi, hogy a BBB nem tudja ellátni maradéktalanul a feladatát [25]. A kezelés az agy dopamin szintjének növelését célozza meg. 18 2.42 Cerebrovaszkuláris betegségek Cerebrovaszkuláris megbetegedésekről akkor beszélünk, ha bizonyos okból (pl. agyi trombózis, agyi embólia, agyvérzés) az agyban részben vagy egészben csökkent mértékű vagy teljesen leáll a keringés. A vér-agy gát integritása az agyi ereket érintő megbetegedésekben több okból kifolyólag változatos. Például hipoxiás állapot kialakulása esetén nő a BBB permeabilitása, ezzel együtt az agyi erekben véráram drasztikusan lecsökken, ami a citokinek (interleukin 1 és tumornekrosis faktor (TGF β1)) aktivitásához vezet. A citokinek megjelenése a sejtadhéziós

molekulák túlszabályozását eredményezi. A reperfúzió következménye, hogy a limfociták át a vér-agy gáton, és felszabadíthatnak az agyban proteázokat (metalloproteázokat), amelyek a vér-agy gát kinyílását indukálják [21]. A betegség kezelése a kiváltó októl függ. Általában azonban elmondható, hogy a plakkok kialakulásának gátlását célozzák meg a terápiás módszerek. 2.43 Gyulladásos betegségek 2.431 Fertőzés A központi idegrendszer fertőzés lehet bakteriális, virális, gombás vagy parazita eredetű. A mikrobák központi idegrendszerbe való bejutásának, vér-agy gáton át történő penetrációjának a mechanizmusa nem teljesen ismert. Alapvetően három lehetséges útról beszélhetünk. 1) Transzcelluláris penetráció: Ennek során a fertőző ágensek átjutnak a véragy gáton anélkül, hogy annak a permeabilitását megváltoztatnák. Így jut be az agyba a például az Escheria coli, a Streptococcus pneumonie,

a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). A mechanizmust tekintve történhet az átjutás vakuoláris transzporthoz hasonlóan vagy receptor-mediált endocitózissal. A HIV-1 vírust gp120 fehérje borítja, amely adszorptív mediált endocitózist indukál, és így jut be a HIV-1 vírus az agyszövetekbe. 2) Paracelluláris útvonalak: Egy agyi fertőző ágens nagyon gyakran a vér-agy gát permeabilitásának megváltoztatásával (növelésével) jut be a központi idegrendszerbe. Általában elmondhatjuk, hogy a fertőzésre adott immunválasz következtében különböző mediátorok (citokinek, kemokinek, sejtadhéziós molekulák, mátrix metalloproteázok) szabadulnak fel a fertőzés helyén. Ez a folyamat a központi idegrendszerben azzal jár, hogy megváltozik a vér-agy gát szerkezete, funkciója. A 19 citokinek és a mátrix metalloprotázok például hozzájárulnak a vér-agy gát kinyílásához. Mindez pedig például a Streptococcus pneumonie és

a HIV-1 vírus vér-agy gáton át történő penetrációját eredményezi [21]. 3) „Trójai ló” mechanizmus: Ennek során egy fertőzött makrofág aktiválja az agyi endothelsejteket és ezáltal a fertőzött makrofágot mint mikroglia sejtet fogják a központi idegrendszerbe bejuttatni. Az endothelsejtek és az immunsejtek a szükségesnél jóval nagyobb mennyiségben termelik az adhéziós molekulákat, amely azt eredményezi, hogy a keringésben lévő immunsejtek kötődnek az agyi erekhez, ami az immunsejtek vér-agy gáton keresztüli útjának az első lépése lehet. Így a virális részecskék igen könnyen bejutnak az agyba, a fertőzött immunsejteket mintegy „Trójai faló”-ként használva. Például a HIV-1 vírus ilyen módszerrel is átjuthat a vér-agy gáton 2.432 Sclerosis Multiplex (SM) A sclerosis multiplex az egyike a központi idegrendszert leggyakrabban érintő fertőző betegségeknek. A kór lefolyása során a beteget saját immunrendszere

„támadja” meg, az idegsejt nyúlványait, myelinhüvelyeit károsítja, roncsolja. Ennek következtében az ingerületvezetésben hiba lép fel, lassabban vagy egyáltalán nem működik. A szervezet megpróbálja kijavítani a rost burkolatán lévő hiányosságokat a rendelkezésre álló támasztószövettel, ennek következtében kemény gócok alakulnak ki. A vér-agy gát szerepe a betegség kialakulásában a következő. Bár nincsen egyértelmű magyarázata a betegség kialakulásának, mindegyik elméletben kulcsfontosságú elemnek tartja a Tsejtek BBB-n való átjutását, illetve elismeri a gliasejtek szerepét kór lefolyásában. A kezelés során elsősorban a gyulladás megszüntetését célozzák meg, különböző gyulladás csökkentő szerekkel. 2.433 Agytumor Emberben a gliomák a leggyakoribbak az elsődleges, központi idegrendszert érintő tumorok között. A különböző típusú gliomákat megkülönböztethetjük a szövettani tulajdonságokat

tükröző sejtvonalak alapján. Így beszélhetünk asztrocitomáról, oligodendrogliomarol, és oligoasztrocitomáról. A tumorok vérellátása alapvetően meghatározza a további fejlődésüket. Az agyi erek falának megvastagodás együtt jár az endothelsejtek hiperplaziájával, amely megnöveli a nem-szelektív 20 transzendotheliális transzport lehetőségét, vagyis a vér-agy gát nem tudja ellátni a feladatát. Gliomák esetében nyitott szoros zárókapcsolatok az egyik legfontosabb abnormalitás. Asztrocitómák esetén ez az abnormalitás az occludin expressziója során jelentkezik, ugyanis vagy megakadályozzák vagy olyan formában exprimálják, amely nem tudja ellátni a funkcióját. A gliomák kezelése nagyon nehézkes, ugyanis a kemoterápiára igen gyenge választ adnak, sok esetben rezisztensek a terápiás gyógyszerekre. (Utóbbi a rákos sejt módosult biokémiai folyamatainak köszönhető.) Ezt minél inkább elkerülendő az antitumor

hatású gyógyszerek igen toxikusak mind az egészséges, mind a rákos sejtek számára, ezért a kemoterápia az igen komoly mellékhatások miatt gyakran csak korlátozott mértékben alkalmazható. [15, 21] Ezek alapján nyilvánvaló, hogy a gyógyszerek központi idegrendszerhez való eljuttatása mind normál, mind patológiás állapotban korlátozott mértékben mehet végbe. Ahhoz, hogy sikeres lehessen a központi idegrendszert érintő betegségek kezelése, különböző, új stratégiákat kell bevetni a gyógyszerek célba juttatására. 2.5 Stratégiák gyógyszerek központi idegrendszerbe juttatására A gyógyszerek diffúziója a vérből az agyba elsősorban azon múlik, hogy az adott biológiailag aktív molekula képes-e átjutni a lipidmembránon. Az ehhez elengedhetetlen tulajdonságok a következők: hidrofób jelleg és kis méret. Számos gyógyszer azonban nem rendelkezik ezekkel a tulajdonságokkal, így különböző stratégiákat kell alkalmazni annak

érdekében, hogy eljussanak a célszervbe (jelen esetben az agyba). Alapvetően kétfajta technikát különböztetünk meg: invazív és nem invazív. A következőkben ezeket fogom jellemezni 2.51 Invazív technikák A vér-agy gát funkció kijátszására már 50 évvel ezelőtt is voltak technikák. Az első erre irányuló módszer Neuwelt nevéhez fűződik [26]. Az eljárás során mannitol oldatot fecskendeztek a páciensek nyaki artériáiba. A normálishoz képest igen magas cukormennyiség az agyi erekben azt eredményezte, hogy az endothelsejtekből kiáramlott a víz, így megnyíltak 21 a tight junction-ök. Ez a hatás 20-30 percig tart, ami alatt azok a gyógyszerek, amelyek normál esetben nem jutnának át a vér-agy gáton most szabadon beáramoltathatnak az agyba. Általában akkor alkalmazzák ezt a kezelési módot, ha a betegnek rosszindulatú gliomája, agyi limfómája van. Habár igen sok mellékhatással jár ez a technika (pl fizológiai stressz,

megnövekedett intracranialis nyomás, nem kívánt anyagok bejutása az agyba, a gyógyszerek normál szövetekbe való eljutása), ezen a kóros állapotok mérséklésére hatékonyan alkalmazható [22,26]. Egy másik lehetőség a vér-agy gát permeabilitásának növelésére vazoaktív molekulák (pl. bradykinin, leukotrien, cereport) alkalmazása [27] Ennek az az előnye, hogy csak az agy tumoros részén növeli meg a kapillárisok áteresztő képességét, az egészséges részen nem, így az antitumor hatású gyógyszerek csak a rákos szövetekhez juthatnak el, az egészségesekhez nem. Ennek a jelenségnek az a biokémiai alapja, hogy az egészséges agyi kapillárisokban a bradykinin receptorok teljes mértékben hiányoznak, ami azt eredményezi, hogy a bradykinin penetráció korlátozott. Ennek köszönhetően a gyógyszerek az egészséges szövetekhez nem jutnak el [22,27]. Egy más terápiás módszer, amellyel a klinikumban próbálkoznak, a közvetlen gyógyszer

adagolás. Ennek során a szubkután a skalpba implantálnak egy műanyag eszközt, amelyen keresztül közvetlenül az agyba juttatják be a hatóanyagot. A módszer azonban sok problémát vet fel. Egyrészt az emberi agyban a liquor és a gyógyszer célterülete igen közel lehet egymáshoz (néhány cm). Mivel a gyógyszerek esetében penetrációra és diffúzióra is számíthatunk, így előfordulhat, hogy kisebb mennyiségben jut el a kóros részre [28]. 2.52 Nem invazív technikák, kolloidális gyógyszerhordozók A kolloidális gyógyszerhordozó rendszereket az elmúlt évtizedben széleskörűen alkalmazták a hatóanyagok irányított, hatékony célba juttatására. Ez annak köszönhető, hogy a nanorészecskék csökkentik az immunreakciók lehetőségét, ezáltal a hatóanyagok nagyobb hatásfokkal jutnak el a célszövethez, így határozottabban érvényesülhet gyógyító hatásuk. Azonban mindehhez a hordozó rendszereket kontrollálni kell tudni, vagyis

pontosan ismernünk kell a részecskék méretét, felületi tulajdonságait, stabilitását, hatóanyag-tartalmát. 2.521 Polimer micellák A polimer micellák olyan gyógyszer szállító rendszerek, amelyek egy amfifil 22 kopolimerből épülnek fel. Ez a kopolimer kétféle monomerből áll, amelyek közül az egyik hidrofil (héj), a másik hidrofób (mag). Azért előnyös ez a struktúra, mert a kétféle monomer arányát változtatva, a célszervtől függően választhatjuk meg a részecskék fizikai-kémiai és farmakológiai tulajdonságait. A hidrofil héj nagyban hozzájárul ahhoz, hogy a polimer micellák gyógyszerhordozóként alkalmazhatóak legyenek, ugyanis a hidrofil felszín biztosítja a micellák diszpergálódását, valamint a sztérikus stabilizáció révén csökkenti a nem kívánt kölcsönhatásokat a gyógyszer és a sejtek, fehérjék közt. Védik a hatóanyagot a biológiai környezet okozta inaktiválódástól, így az anyag biológiai

szempontból hozzáférhetőbb lesz és a fokozatos hatóanyag leadásnak köszönhetően jóval tovább marad a szervezetben, így nem szükséges többszöri gyógyszer bevétel [29]. Előnyös tulajdonságuk, hogy vizes közegben termodinamikailag és kinetikailag stabilak. Méretük 10- 100 nm-es mérettartományban helyezkedik el, amely megfelel a vér-agy gáton való átjuttatás méretkövetelményének [16]. Említésre méltó eredmény Kabanov és munkatársai észrevétele miszerint a poloxamer polimerből készült micellákat antitestekkel konjugálva lényegesen javul a haloperidol agyi disztribúciója, így jelentősen megnőtt a gyógyszer hatékonysága [30]. 2.522 Liposzómák A liposzómák kisméretű vezikulák, amelyek unilamelláris vagy multilamelláris foszfolipid kettősrétegből állnak. Általában biokompatibilis és biodegradábilis lipidek építik fel, amelyek nagyon hasonlóak a biológiai membránokhoz. A biofizikai sajátságaik nagyon

különbözőek lehetnek. Előnyös tulajdonságaik közé tartozik, hogy a szervezetben az eloszlásukat kontrollálhatjuk, befolyásolhatjuk a kémiai sajátságaik módosításával kölcsönhatásukat a különböző sejtekkel, ezáltal a gyógyszerszállítás módját változtathatjuk. A liposzómát, mint gyógyszerhordozót a központi idegrendszer sokféle kóros elváltozása ellen lehet alkalmazni, mivel a kémiai sajátságaik a terápiásnak célnak megfelelően módosíthatók. A következők szakaszban néhány fontosabb példát mutatok be. A polietilénglikollal (PEG) bevont liposzómák rendelkeznek azzal a nagy előnnyel, hogy felületük hidrofilebb volta miatt hosszabb időt töltenek a vérkeringésben, és a retikulo hisztiocita rendszer (RHS) is kevésbé támadja meg őket. 23 Mindez lehetővé teszi, hogy szelektíven a tumoros vagy gyulladásos területen adják le az általuk hordozott hatóanyagot. Napjainkban elsősorban a rákos megbetegedések

kifejezetten glioblastoma és metasztázis esetén, kezelése során alkalmazzák, a hatóanyag pedig doxorubicin, ami az egyik leggyakrabban alkalmazott hatóanyag rákos betegedések kezelésénél [33]. (Caelyx® néven kereskedelmi forgalomban kapható) A gyógyszerek liposzómák segítségével történő aktív célba juttatás ötlete a múlt évtizedben merült fel elsőként a kutatókban [31,33]. Az ötlet gyakorlatilag a „Trójai faló” elven alapszik, miszerint ha a liposzómák kis hatékonysággal vagy egyáltalán nem jutnak be a célsejtbe, akkor konjugáljuk olyan antitesttel vagy ligandummal, amelyeknek van receptora az adott sejten. Ez az elképzelés pl a vér-agy gáton való átjutást olyan részecskék számára teszi lehetővé, amelyek egyébként nem lépnének be az agyba. Ha például monoklonális antitesthez (MAb) konjugáljuk a PEGgel borított liposzómát, a konjugátum a képes a MAb vér-agy gát felszínén lévő receptorjához kötődni és

így receptor mediált endocitózis segítségével bejutni az agyba. A MAb mint a „Trójai faló” segít átjutni a liposzómáknak a biológiai gátakon, így azok elérhetik a célsejtet, és ott kifejthetik terápiás hatásukat [32,33]. 2.523 Nanorészecskék Az utóbbi évtizedekben egyre inkább nyilvánvalóvá vált, hogy a gyógyszerek célba juttatásának az egyik leghatékonyabb és legelőnyösebb módszere, hogy gyógyszerhordozóként biokompatibilis nanorészecskéket alkalmazunk. Nanorészecskének nevezzük azokat a szerves (általában polimer) vagy szervetlen anyagból felépülő carrier rendszereket, amelyek mérete legfeljebb 200 nm. A nanorészecskék belsejébe gyógyszereket és egyéb szervezetbe bejuttatandó molekulákat zárhatunk. A gyógyszerhordozók az esetek többségében polimerből készülnek, amelyek széles skálája áll rendelkezésünkre. Például: polikaprolakton, poliszacharid, politejsav (PLA), poliglikolsav (PGA), kitozán. Ezek

közül azok a legelőnyösebbek, amelyek biokompatibilisek és biodegradábilisek is. Ilyen a politejsav és a poli(D,L-tejsavglikolsav) kopolimerek [21] Az utóbbi időben egyre nagyobb figyelem irányul a politejsavra és a tejsav/glikolsav különböző arányú, random kopolimerjére. Ennek elsősorban az az oka, hogy ezek az anyagok teljesítik a gyógyszerhordozóktól elvárt két alapkövetelményt 24 miszerint legyenek biokompatibilisek és biodegradabilisek. A PLGA poliészter molekula, amely könnyen hidrolizál, és a szervezetben természetes körülmények között is megtalálható tejsavra és glikolsavra bomlik. Szerkezetét a 4 ábrán tüntettem fel 4. ábra: A PLGA szerkezete A másik nagy előnye, hogy szabályozott hatóanyag leadást biztosít. Ennek megfelelően a központi idegrendszert érintő betegségek esetében is gyógyszerhordozó jelöltek közt van. Ebben az esetben a sikeres hatóanyag célba juttatás elsődleges feltétele a vér-agy gáton

való átjutás. Fontos a megfelelő méret, felületi tulajdonságok, biokompatibilitás, stabilitás a vérben, célszervhez való affinitás. A méret azért lényeges, mert egy bizonyos átmérő felett sztérikus okokból nem juthat be a részecske. A felületi tulajdonságoknak elsősorban a fehérje abszorpció, illetve lipidoldékonyság miatt van jelentősége. Ugyanis ha hidrofób egy objektum felülete, megtapadnak rajta a fehérjék, és a mononukleáris fagocita rendszer aktivizálódik. Ennek következtében az anyag kiürül a véráramból, és a májba vagy a lépbe jut. Mindkét jelenség komoly befolyásoló tényező a vér-agy gáton való átjutást illetően. A biokompatibilitást is elvárjuk egy gyógyszerhordozótól, hiszen ha az anyag nem összeegyeztethető a szervezettel, vagyis immunreakciókat vált ki, kikerül a véráramból, így eleve nem érheti el a hatóanyag a célszervet. Összefoglalva, a következők tulajdonságokkal kell rendelkeznie egy

gyógyszerhordozónak:  a részecskék mérete legyen kisebb, mint 100 nm  ne legyen toxikus, sokkal inkább biodegradábilis és biokompatibilis  legyen stabil a vérben  ne aggregálódjon  a RHS ne távolítsa el  hosszú legyen a vérben a tartózkodási ideje 25  költséghatékony, egyszerű előállítási módszerrel készüljön [14, 33]. Az elvárt feltételeket ezidáig egy anyag sem tudta önmagában teljesíteni. Sok esetben az a probléma, hogy az előállítás, konjugálás során mások az elvárások, mint a szervezetbe, célszervbe való bejuttatás, hatóanyag leadás során. Ennek az az egyszerű megoldása, hogy a nanorészecskék felületét módosítják. A PLGA esetében ez hidrofilebbé tételt jelent, amelyet különböző biokompatibilis polimerekkel (pl. PEG, poliszorbát, Pluronic®) lehet megvalósítani. Elsősorban a fehérjeabszorpció megelőzésében van nagy szerepük Az intravénásan adagolt gyógyszerekre

először a RHS reagál. Ennek köszönhetően a kívánatosnál gyorsabban kiürülnek a véráramból és májban, lépben, csontvelőben halmozódnak fel. Ha azonban a felületmódosítással csökkentjük a fehérjeabszorpciót, a RHS számára nem lesz elérhető a részecske, így hosszú ideig a vérben maradhat, eljuthat a célszervhez [33]. A felületaktív anyagnak az előállítás és tárolás során is meghatározó szerepe van, ugyanis megakadályozza a részecskék aggregálódását, elősegíti diszpergálódásukat. A részecskék felületének módosítása tehát a fehérje abszorpció és ezzel együtt a véráramból való gyors kiürülés kiküszöbölése miatt szükséges. Ezzel ellentétes tény viszont, hogy a sejtmembránon való átjutáshoz hidrofób tulajdonság szükséges. Az ideális felszín tehát nem teljesen hidrofil, csupán csak annyira, hogy a fehérjék ne tapadjanak meg rajta. A gyógyszerhordozók felületének hidrofilebbé tételét

különböző polimerek segítségével érhetjük el. Erre alkalmas pl a polietilén-oxid Egyik lehetőség, hogy beépítjük a részecskét alkotó polimerbe, így blokk-kopolimer alakul ki. Ennek a szerkezetnek az a hátránya, hogy a PEO akadályozza a fehérje természetű anyagok felszabadulását a nanorészecskéből. Ezt kiküszöbölhetjük, ha valamely PEO-tartalmú vegyületet adszorbeáltatunk a gyógyszerhordozó felületére, így a molekula hidrofób része rögzíti a részecske felületén a polimert. A polimer PEO-t tartalmazó része pedig a közegbe nyúlik, így hidrofilebbé teszi a felületet [34-36]. A céljainknak a Pluronic® felelt meg a legjobban, így ezt használtam a PLGA nanorészecskék felületének módosítására. A Pluronic® egy blokk-kopolimer, amely polipropilénoxid (PPO) és polietilénoxid (PEO) részekből épül fel. A felület hidrofil jellege, ahogy az előbb említettem, a felületi rétegben lévő PEO mennyiségétől függ.

Szerkezete az 5 ábrán látható. 26 5.ábra: Pluronic F127 szerkezete A nanorészecskék többféle módszerrel előállíthatók. A módszereket három nagy csoportba sorolhatjuk: gőz-, szilárd- és folyadékfázisú technikák. Ezek közül a szerves nanorészecskék előállítására leggyakrabban használatos a folyadékfázisú technika. Többféleképpen alkalmazhatjuk, így pl. ismerünk emulziós módszereket: olaj/víz (O/W), víz/olaj (W/O), olaj/víz/olaj (O/W/O), nanoprecipitáció, Graham-módszer, beoltásos módszer, redukciós módszer. Mivel a kísérletek során nanoprecipitációs eljárással állítottam elő a nanorészecskéket, így a továbbiakban ezt a módszert jellemzem. A nanoprecipitációs eljárás megegyezik a klasszikus oldószer kicseréléses technikával. Az eljárás során két fázist hozunk létre: az egyik egy vizes fázis (ebben van oldva a felületaktív anyag), a másik egy vízzel elegyedő szerves fázis (ebben van oldva

polimer). A vizes fázishoz óvatosan, keverés közben, cseppenként adagoljuk a polimeroldatot. Mivel a polimer vízben oldhatatlan, így nanoméretű részecskék formájában kicsapódik az oldatból. A folyamat végeredményeként 100-200 nm-es mérettartományba eső részecskékből álló nanoszuszpenziót kapunk [37,38]. Az eljárás nagy előnye, hogy könnyen, gyorsan megvalósítható, nem igényel szonikálást, egy mágneses keverő elegendő hozzá, nem szükséges magas hőmérséklet, nincs olaj/ víz határfelület, amely sok esetben roncsolja a fehérjéket. A méretcsökkentést az irodalomban talált eredmények alapján terveztük meg [40,41]. Ezek alapján úgy tűnt, hogy a vizes fázis térfogatarányának növelése, illetve a polimer koncentrációjának csökkentése mindenképpen szükséges a 100 nm alatti méret eléréséhez. Ez a további munka során egy korábbi közleményben leírt eredménynek köszönhetően [42] a szerves fázis összetételének

változtatásával egészült ki. Az előállított nanorészecskék jelölésére fluoreszcens festékeket alkalmaztam. Ezeket irodalmi előzmények alapján választottam ki [42,43]. A továbbiakban ezeket fogom jellemezni. 1. Fluoreszceinek: Az egyik leggyakoribb biológiai jelölőanyag, ftaleinek családjába tartozó fluorofor 27 festék. Szerves oldószerekben jól oldódik, vízben viszont alig Izotiocianát formában alkalmazzák általában, ugyanis a tiocianát csoporton keresztül könnyen lehet kötni különféle molekulákhoz. A vér-agy gáton nem jut át, mivel a szervezetben fehérjék kötődnek hozzá. A fluoreszcein, fluoreszcein Na-sója és karboxi-fluoreszcein festékeket használtam a vizsgálatok során. Szerkezetük a 6 ábrán látható 6.ábra: a) fluorescein, b) karboxi-fluorescein szerkezeti képlete 2. Rhodaminok: A rhodaminok szintén fluoreszcens jelzőanyagok. Több fajtájuk ismeretes, amelyek csak néhány kémiai csoportban különböznek

egymástól. (7 ábra) Ezek közül a leggyakrabban használt a rhodamin B. A rhodamin B egy olyan fluoreszcens anyag, amely szerkezetéből adódóan ugyan bejut az endothelsejtekbe, de onnan egy aktív efflux pumpa (MDRP-k irányítják) hatására ki is ürül. Így intakt érszerkezet esetén nem jelenik meg az agyban. Sérült érszerkezet esetén azonban kiáramlik és megfesti a sérült területet. 7.ábra: a) rhodamin B, b) rhodamin B base, c) rhodamin 6G szerkezeti képlete 28 3. Célkitűzések Az ELTE Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriumában már korábban is folytak kutatások a PLGA nanorészecskék gyógyszerhordozóként való alkalmazásával kapcsolatban. A részecskéket PLA és PLGA polimerekből, nanoprecipitációs eljárással állították elő, Pluronic® -ot alkalmazva felületmódosításra. Ennek során a szerves fázis/vizes fázis aránya 1:4-nek adódott, a polimer oldószere pedig aceton volt. A PLGA egy biokompatibilis,

biodegradábilis kopolimer, amelyből egyszerű eljárással nanorészecskét lehet előállítani. A felülete könnyen hidrofilebbé tehető, amely még kedvezőbbé teszi a gyógyszerhordozóként való hasznosítását. Stabil rendszert alakíthatunk ki, ugyanis a Pluronic® nemcsak a felület hidrofilizálása miatt szükséges, hanem gátolja az aggregációt is. Ezek alapján azt mondhatjuk, hogy a PLGA hordozók alkalmasak lehetnek a központi idegrendszert érintő betegségek kezelésében hatékony gyógyszerformulák kialakítására. Munkám során egyik célom az volt, hogy kidolgozzak egy olyan hordozórendszert, amely megfelel a vér-agy gáton való átjutás feltételeinek, vagyis a részecskék mérete 100 nm alatti, felületük hidrofil, Pluronic®-kal borított, biokompatibilis, és megfelelő fluoreszcens jelölő anyagot tartalmaz. A munkám másik célja a vér-agy gát permeabilitásának in vivo vizsgálata, különböző festékekre és hordozórendszerekre,

ép és sérült állatokban. A vizsgálatokhoz Wistar, albínó, felnőtt patkányokat használtunk. 29 4. Kísérleti összefoglaló: 4.1Felhasznált anyagok: PLGA 50/50, tejsav/glikolsav random kopolimer, tejsav-glikolsav arány 1:1, M = 50 000 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Pluronic® 12700, Mw = 12200 g/mol, poli(etilén-oxid)-poli(propilén-oxid)-poli(etilén-oxid) (PEO-PPO-PEO) blokk-kopolimer, BASF Hungaria Kft., Magyarország Aceton alt., M = 58,08 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Dializáló csövek, Cellulóz észter membrán, M = 20 000 g/mol, Float-A-Lyzer, Spectra/Por, Hollandia Kétszer desztillált víz (felületi feszültsége nagyobb, mint 71,5 mN/m) Fluoreszcein (C20H12O5) M= 332.31 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Fluoreszcein Na-sója (C20H10Na2O5 ), M= 376.27 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Karboxifluoreszcein (C21H12O7 ), M= 376.32 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Rhodamin 6G (C28H31N2O3Cl ), M= 479,01 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország

Rhodamin B (C28H31ClN2O3 ), M= 479,01 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Rhodamin B base (C28H30N2O3),M= 442.55 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország 4.2 Nanorészecskék előállítása 4.21 Nanoprecipitáció A nanorészecskék előállításához nanoprecipitációs módszert alkalmaztunk. A nanoprecipitációs eljárás a következő lépésekből áll. Elsőként két oldatot (szerves és vizes fázist) készítünk. A szerves fázisban, ami lehet etilacetát, etilformiát, dimetil szulfoxid, acetonstb feloldjuk a polimert, amelyből szeretnénk a nanorészecskéket kialakítani. A vizes fázisban, amely általános esetben négyszerese a szerves fázisnak, pedig egy felületaktív anyag kerül feloldásra. Esetünkben a szerves oldószer az aceton volt, ebben oldottuk a PLGA-t 2 g/l koncentrációban, a vizes fázisban lévő felületaktív anyag pedig a már említett Pluronic 12700. A következő lépés a szerves oldat a vizes oldatba való csepegtetése volt. Ennek során a

vizes fázist egy főzőpohárba öntöttük, és mágneses keverővel kevertettük. Ezután a szerves és a vizes fázis egyesítése következik, amelyet egy fecskendő segítségével cseppenként történt. Mivel az eljáráshoz használható polimerek hidrofób tulajdonságúak, így vízbe csepegtetve nanoméretű, gömb alakú részecskék formájában kicsapódnak. A vízzel elegyedő szerves fázist keverés mellett eltávolítjuk. Ezt mi fülke alatti elpárologtatással oldottuk meg Majd az 30 esetlegesen kicsapódott, nagyobb polimer részecskéket asztali centrifuga segítségével eltávolítottuk, így a folyamat végére egy vizes nanoszuszpenziót kaptunk. (Ez megegyezik a klasszikus szollal.) 4.22 Az eljárás kidolgozása Ha az előbb említett általános recept alapján dolgozunk, akkor kb. 130-150 nm átmérőjű részecskéket kapunk. Ezt szerettük volna lecsökkenteni 40-80 nm-re a folyamat különböző paramétereinek módosításával. Elsőként a

szerves és vizes fázis térfogatarányának változtatásával próbálkoztam. Az eredeti 1:4 arányt először egységenként 1:10-ig, majd nagyobb lépésekben 1:40-ig változtattam. A kísérletek körülményeit az 1 táblázat mutatja Minta száma 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Szerves fázis V / ml c(PLGA) / gl-1 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 10 1 10 1 10 1 10 Vizes fázis V / ml c(F127)/ gl-1 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 2 10 2 14 2 20 2 28 2 30 2 40 2 10 2 20 2 30 2 40 2 A szerves/vizes fázis aránya 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10 1:14 1:20 1:28 1:30 1:40 1:10 1:20 1:30 1:40 1. táblázat: A PLGA nanorészecskék előállításának körülményei Másodsorban a (szerves fázisban lévő) PLGA-koncentráció csökkentésének részecskeméretre gyakorolt hatását vizsgáltam. A szerves fázisban a PLGA koncentrációját 10 g/l és 1 g/l között változtattam. A kísérleti körülmények az előző esethez hasonlóak voltak A rendszerek

előállításának körülményeit a 2. táblázatban szemléltettem 31 Szerves fázis Minta száma V / ml c(PLGA) / gl-1 1 2 3 4 5 1 1 1 1 1 5 4 3 2 1 Vizes fázis V / ml c(F127)/ gl-1 10 10 10 10 10 2 2 2 2 2 A szerves/vizes fázis aránya 01:10 01:10 01:10 01:10 01:10 2. táblázat: A PLGA koncentráció csökkentése során alkalmazott kísérleti körülmények Az irodalomban kutatva találtam egy eljárást, amelyet ugyan másfajta, nanorészecske előállítására használatos módszer során alkalmaztak, de úgy gondoltuk hasznos lehet, ha kipróbáljuk [41]. Ez pedig a következő volt; a szerves fázishoz 15% etanolt adtak a részecskék képződésének elősegítése miatt. Többféle módon, többféle mennyiségben próbálkoztam etanol hozzáadásával. Ezek során növeltem az arányát a szerves fázisban, illetve a vizes fázishoz adtam különböző mennyiségekben. A kísérletek során a szerves és vizes fázis aránya minden esetben 1:10 volt. A

kísérleteket jellemző adatokat a 3 táblázatban foglaltam össze. Szerves fázis V(EtOH) / μl V(Aceton) / μl c(PLGA) / gl-1 150 850 2 500 500 2 0 1000 2 Vizes fázis V(EtOH) / ml V(Víz) / ml 0 10 0 10 5 5 3.táblázat: Etanol hozzáadásával előállított rendszerek c(F127)/ gl -1 2 2 2 4.23 Fluoreszcens anyagok A célkitűzésekben megfogalmazott feladatok megoldása végett jelölni kellett a részecskéket. Mivel a felületüket nem akartam megváltoztatni (kovalens kötés kialakítása a részecske és a festék között pedig ezzel járhatna), ezért a részecske belsejébe minden egyéb kötődés nélkül akartam bezárni a molekulákat. Ez azért is volt előnyös, mert jól modellezi a későbbi, gyógyszermolekulával történő munkát is. Az irodalmi előzmények segítségével választottam ki a használt fluoreszcens festékeket [42]. A legtöbb festéket eddig a jelölni kívánt molekulához kapcsoltan alkalmazták. A fluoreszcens anyagot a szerves

fázisban oldottam. Az irodalomban talált mennyiségi adatok alapján úgy látszott, hogy a PLGA koncentrációjának 1%-a elegendő az in vivo vizsgálatokra is alkalmas fluoreszcens jelölés eléréséhez [43]. Ezt kétféleképpen alkalmaztam 32 A kutatócsoportunk korábbi tapasztalatai alapján a sikeres kapszulázás érdekében a szerves fázisban kell lennie a bezárni kívánt anyagnak. Így elsőként azokat a festékeket használtam, amelyek inkább hidrofób tulajdonságúak voltak, így oldódtak az acetonban. Majd kipróbáltam a hidrofilebb festékek vízben való oldása esetén milyen hatásfokkal történik meg a kapszulázás. Minden esetben 2 mg/ml-es, acetonos PLGA oldat volt a szerves fázis, illetve 2 mg/ml volt a F 127 koncentráció a vizes fázisban. Így a festékek koncentrációja 0,02 mg/mlnek adódik, amelyet töményebb oldatukból való hígítással értem el Az esetlegesen be nem záródott molekulákat dialízissel távolítottam el, amelyet

fluorimetriás mérésekkel követtem. A dialízis során cellulóz észter membrán dialízis csöveket alkalmaztam. Az egyik végét lezártam egy madzaggal, a másik végére egy üveg gyűrűt rögzítettem, majd felakasztottam egy lombik fogóra. A szuszpenziót beletöltöttem, majd a csövet desztillált vízbe merítettem. A dializáló vizet fél óránként cseréltem A legtöbb esetben másfél óráig tartott a dialízis, a dializáló térfogat 250 illetve 300 cm3 volt. A fluorimetriás méréseket a Varian Cary Eclipse típusú fluoreszcens spektrofotométeren végeztem el Scan módban, az első mérés előtt Prescan-t futtatva. 4.3 A részecskék jellemzése 4.31 Dinamikus fényszóródás mérés Ha egy részecskét fénnyel besugárzunk, a fény szóródik a tér minden irányába (Rayleigh-szórás). A szórt fény intenzitása pedig információt hordoz a részecske méretéről A besugárzó fény és a szórt fény frekvenciája a Doppler-effektusnak

köszönhetően különbözik, amelynek az a következménye, hogy a szórt fény interferenciájának mértéke folyamatosan változik. Ez az interferencia-fluktuáció hordozza számunkra az információt, amelyet a térerő autokorrelációs függvénnyel (g(τ))jellemezhetünk. g(τ) = Aexp(−Γτ) ahol 1/Γ a relaxációs idő, τ pedig a korrelációs idő. Γ = Dq2, ahol D a kollektív diffúziós állandó q pedig a szórási vektor: 4 πn Θ  q= sin   λ 2   ahol n a közeg törésmutatója, λ a lézer fényforrás hullámhossza, θ a szórási szög. 33 A kollektív diffúziós állandót a következőképp számolhatjuk ki: D=D0 (1+kc) A kollektív diffúziós állandóból az Einstein-Stokes egyenlet segítségével számíthatjuk ki a részecskék méretét feltételezve, hogy a részecskék gömb alakúak és a szórt fény intenzitásfluktuációja a transzlációs diffúzió következménye. D0 = kT 3 πηd ahol k a Boltzmann-állandó T a

hőmérséklet, η a közeg viszkozitása, d a részecske átmérője. A méréseket Brookhaven típusú fényszóródásmérő berendezéssel (8. ábra) végeztem el vizes közegben az alábbi beállítások mellett: λlézer=488 nm, tmérési= 1 perc, T=25 °C. Amennyiben a minta a méréshez túl töménynek bizonyult, 2-3-szorosára hígítottam fel. 8. ábra: A fényszóródásmérő berendezés elvi vázlata [Forrás: Borsos Attila: Elektromosan töltött nanogélek vizsgálata, TDK dolgozat, 2007] 34 4.32 Pásztázó elektronmikroszkópos mérés (SEM) A pásztázó elektronmikroszkópia egy olyan képalkotó módszer, amely segítségével a minták felszínéről kapunk információt. A műszer működési elve röviden: a vizsgált tárgy egy meghatározott területét elektronnyalábbal végigpásztázzuk, és az elektronnyaláb és a minta kölcsönhatásából származó jeleket egy detektor érzékeli, és képpé alakítja. Ezzel a módszerrel nemcsak a minta

morfológiája határozható meg, hanem számos más tulajdonság is vizsgálható vele. (Pl kémiai sajátságok) A számunkra elsősorban érdekes felszíni topográfia tanulmányozása során a felszínről visszaszóródó, nagy energiájú elektronok és a néhány nm mélységből származó szekunder elektronok bírnak jelentőséggel. A műszer vázlatos felépítése az 9. ábrán látható A méréseket FEI Quanta 3D típusú nagy felbontású kétsugaras készüléken végeztük. Néhány mintáról készült SEM kép, amely alapján méretet, illetve méreteloszlást határoztam meg. A minta előkészítés során egy speciális mintatartóra szénszalaggal (kétoldalú ragasztóként, illetve elektromos vezetőként funkcionált) nagy tisztaságú, sima grafit (HOPG, Highly Ordered Pyrolytic Grafite) réteget rögzítettem, és erre csöppentettem fel 5 μl mintát, amelyet ezután levegőn beszárítottam. A mintákat szén- és arany bevonat nélkül vizsgáltuk

Kipróbáltunk olyan mintát is, amely üveglapra lett felcseppentve és vékony aranyréteg volt rápárologtatva. Ebben az esetben is speciális mintatartóra rögzítettük szintén szénszalaggal az üveglapot. 9. ábra: A SEM vázlatos felépítése 35 4.33 Atomi erő mikroszkópos (AFM) mérés Az atomi erő mikroszkóp a pásztázó tűszondás mikroszkópok családjába tartozik, amelyek közös tulajdonsága, hogy a kép a mikroméretű szonda és a minta kölcsönhatásának következményeként jön létre. Az AFM szondája egy, a végén elvékonyodó tű, amely általában szilíciumból vagy szilícium-nitridből készül. A tűhöz kapcsolódik egy laprugó, amelynek meghajlásából következtethetünk a minta és a tű között fellépő erő nagyságára. A tűt és a laprugót egy piezoelektromos szkenner mozgatja, amely (ideális esetben) a tér mindhárom irányába atomi pontossággal tér ki. A tű és a felszín közt a távolság függvényében

különböző vonzó és taszítóerők lépnek fel, amelyek információt hordoznak a minta felszíni érdességéről. Az AFM mérés során tulajdonképpen a laprugó elhajlását detektáljuk. Ez optikai módon történik a következőképpen: a laprugó tükröződő hátoldalát megvilágítjuk egy lézerrel. A lézerfény a tű és az ezzel együtt a rugó mozgását követve verődik vissza a négyosztatú detektorra, amelyen a visszavert fény pozíciójából következtethetünk a rugó elmozdulására, így a felszín morfológiájára. A készülék vázlatos felépítését a 10 ábrán láthatjuk A méréseket Park System Xe-100 (Dél-Korea) típusú készülékkel, nem-kontakt módban NCS15-ös tűvel (Mikromasch, Észtország) (erőkonstans 40 N/m) 1-0,5 Hz szkennelési sebességgel végeztük el. A kiértékeléshez XEI 171-es szoftvert használtunk A méréseket egy olyan rendszerről készítettük, amely fluoreszcein Na-sójával volt jelölve, és nem tartalmazott

Pluronic-ot . 10. ábra: AFM sematikus felépítése 36 4.34 Fluorimetriás mérések A fluoreszcens spektroszkópia alapjelensége a lumineszcencia egyik fajtája: a fluoreszcencia. A lumineszcenciának nevezzük az elektrongerjesztési állapotban történő fénykibocsátást. Ha az elektron termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az alapállapotba (két szingulet állapot közti átmenet), akkor fluoreszcenciáról, ha több, különböző multiplicitású állapoton keresztül jut el az alapállapotba a molekula, akkor foszforeszcenciáról beszélhetünk. A fény abszorpciós és emissziós folyamatait a Jablonskidiagramon (11 ábra) követhetjük nyomon 11. ábra: Jablonski-diagram A kapszulázott fluoreszcens anyagokat, illetve a dializáló vizet spektrofotometriásan jellemeztem. A mintákat a Varian Cary Eclipse típusú fluoreszcens spektrofotométeren mértem. Az alábbi mérési módszert alkalmaztam: először meghatároztam az abszorbciós

spektrumot, majd ez alapján a számítógép automatikusan kiválasztotta a besugárzó hullámhosszt, illetve a detektorfeszültséget. A fluoreszcens spektrofotométer vázlatos felépítése a 12. ábrán látható 37 12.ábra: A fluoriméter elvi felépítése 4.35Rediszpergálhatóság és stabilitás vizsgálata A stabilitásvizsgálathoz kiválasztottam egy rendszert. Ez a fluoreszcein Na-sóját tartalmazta, és a mérete kisebb volt a többi festékkel készült részecskéknél. Bizonyos idő (1h, 1 nap , 1 hét .stb) elteltével mindig ugyanolyan körülmények közt elvégeztem a DLS mérést A mérések között a mintát hűtőben, - 4°C-on tároltam. A rediszpergálhatósági vizsgálat kivitelezésére a nanoszuszpenziót liofilizáltuk. Ennek során az anyagot lefagyasztottuk, majd egy nagyvákuumot létrehozó készülékre tettük, amely az oldószert eltávolította a mintáról. (Gyakorlatilag szublimáció történik) Így a folyamat végén a

nanorészecskék szilárd por formájában álltak rendelkezésre. Ezt a port diszpergáltattuk ugyanolyan térfogatú kétszer desztillált vízben, mint amelyben készült. A rediszpergálhatóság vizsgálatára is a fluorescein Na-sóját tartalmazó rendszert választottuk ki. 4.36 A biológiai vizsgálatnál használt metodikák 4.361 Kísérleti állatok és a műtét Kísérleteinkhez albinó kifejlett Wistar patkányokat használtunk (200-400 grammos, hím és nőstény vegyesen), egy-egy anyaghoz 2-3 állatot. A narkózist ketaminnal (20 mg/ testtömegkg) és xilazinnal (80 mg/ testtömegkg) hoztuk létre. 38 Ezután a következett az anyag beadása. Többféle beadási módszert kipróbáltunk, ezek a következők voltak: intraperitonális, intrahepatikus, intrakardiális és intravénás (combvénába, illetve vena cava inferiorba). Az utóbbi vált be, így a beadásoknál a vena cava inferiorba injektáltam az anyagokat. Az injektálás után 10 percet vártam A

sérülést a koponya megfelelő darabjának eltávolítása után sztereotaxiás berendezéshez erősített, száraz jégbe hűtött rézrudat érintettünk az agyhoz. Az előkísérletek alapján azt találtuk, hogy húsz másodperc szükséges az optimális fagyasztott lézió eléréséhez. Ezután vártunk különböző időtartamokig vártunk (10 perc, 1 óra, 3 óra, 6 óra) és csak eztán injektáltuk a rhodamint szintén vénásan. 4.362 Feldolgozás Fixálás: Az injektálások utáni megfelelő várakozási idő leteltével decapitatiot hajtottunk végre az állatokon, majd eltávolítottuk az agyakat a koponyából és 4 %-os paraformaldehid oldatba helyeztük őket 24 órára. Általában az immerziós fixálást használtuk, mert a perfúzió során kimoshatjuk az agyi erekben lévő festékanyagot vagy az alkalmazott nyomás szétfeszítheti az erek falát, így téve átjárhatóvá azokat, vagyis a perfúziós fixálással meghamisítanánk a vér-agy gát

vizsgálatának eredményeit. Fontos volt, hogy a fixálás és a metszés között a lehető legkevesebb idő teljen el, ugyanis félő volt, hogy az agyi erekbe bejutott festék a paraformaldehidben kioldódva utólag festi meg az agyat. Metszés: A metszeteket vibrációs mikrotrom segítségével készítettem (13.ábra) A vibrációs mikrotromot alapvetően két részre oszthatjuk: egy kádra és a pengére. A kádban találunk a speciális mintatartóra felragasztott agy rögzítésére alkalmas helyet. A penge kivehető, minden alkalommal újat használunk Szabályozni lehet a penge haladásának gyorsaságát és az amplitúdót. A metszés 500 cm 3 0,1 mol/dm3-s foszfát-pufferben történik. 50-100 μm vastagságú coronális metszeteket készítettem. A coronális metszetek a koszorúvarrattal párhuzamosan, az agy hossztengelyére merőleges szeletek az agyból. 39 13.ábra: Vibrációs mikrotrom (http://wwwvibratomecom) 4.363 Vér-agy gát vizsgálata A vér-agy gát

permeabilitásának vizsgálata kezdetén szerettünk volna pozitív és negatív kontroll vegyületet. Az Evans-kék és a rhodamin szerepeltek negatív kontrollként. Az Evans-kék 2 m/m%-os oldatából testtömegkg-onként 10 ml-t adtunk, a rhodamin B 1 m/m%-os oldatából pedig 5 μl-t ttg-ként. Vizsgáltunk biszakrilamid réteggel bevont fluoreszcensen jelölt fehérjét is. Emellett az anyagok mellett kontrollként felületi réteg nélküli, fluoreszcensen jelölt fehérjét is vizsgáltunk. A festékekkel való kísérletek alapján 10ml/testtömegkg mennyiségben injektáltuk ezeket az anyagokat. Az általam előállított PLGA-nanorészecskéket szintén ilyen mennyiségben adtuk, a kontrollok a tiszta fluoreszcens festékek voltak. A fluorescein-Na-sója 20mg/ml-es koncentrációban injektálva volt detektálható. 4.364 Nissl-festés Ez a festési módszer az idegsejtek elektív feltüntetésére használható. A festés krezil-ibolya festékkel történik, enyhén savas

oldatban az alábbi protokoll szerint: 1. A felhúzott 10 μm-es metszetet a következő oldata tesszük 90 percre  krezil-ibolya 0,1 g  cc. ecetsav 0,2 ml  desztillált víz 100 ml 40 2. Differenciálás 96%-os alkohollal 5 percig 3. Víztelenítés és derítés izopropil-alkohol-xilol sorozatban. 4. Elzárás Kanada-balzsamban. Eredmény: sejtmagok és a Nissl-rögök ibolyaszínű3k. [46] 4.365 Immunhisztokémiai vizsgálat Előkezelés: 90 percig 20%-os normál kecskesavóval szobahőmérsékleten, a nemspecifikus immunglobulin-kötőhelyek blokkolására. Ezt 30 perces PBS-es mosás követte, primer antitesteket tettünk rá és 40 óráig 4°C-on fibronektin, immunglobulinG ellen. Előhívás: előtte 30 percig mostuk PBS-sel, majd 3 órán keresztül inkubálódtak a szeletek szekunder (fluoreszcens) antitestek jelenlétében. Ismét 30 perces PBS-es mosást követően glicerin víz 1:1 arányú elegyéből történt a felhúzás. Képalkotás: A

szeletekről Olympus BX-51 mikroszkóphoz csatlakoztatott DP50 digitális kamerával készítettünk képeket. (Mindkét eszközt az Olympus Optical Co Ltd, Tokyo, Japánból származik.) Többféle szűrőt alkalmaztunk a választott jelölőanyagnak megfelelően. 41 5. Eredmények 5.1 A nanoprecipitációs eljárás során tapasztaltak . Az általunk felhasznált polimer minden esetben a PLGA 50/50 kopolimer volt, amelyet 10 g/l-es törzsoldatból hígítottam a megfelelő töménységűre. A vizes fázisban sok esetben egy felületaktív anyag található. A tapasztalatok azt mutatják, hogy 2 g/l koncentrációban alkalmazva elegendő a részecskék 100%-os felületi borítottságának eléréséhez. Az általunk használt felületaktív anyag Pluronic® 12700 (F127), de ismeretesek más e célra használható anyagok is (pl. Tween, polivinilalkohol, Pluronic® más fajtái) A felületaktív anyagra a részecskék felületi tulajdonságainak módosítása miatt van szükség,

esetünkben így tehetjük hidrofilebbé a PLGA felületét. Erre a biológiai alkalmazások miatt van szükség. Egyrészt azért, mert a gyógyszerhordozók hidrofób felülete immunreakciókat válthat ki, amely megakadályozza a hordozó részecske, így a gyógyszer célba jutását. 5.2 Méret meghatározás fényszóródásméréssel Az elkészült PLGA részecskék méretét igyekeztem minél hamarabb meghatározni. Az előállítás során a szerves fázis térfogata mindegyik esetben 1 ml volt, a vizes fázisba pedig mindegyik esetben 2 g/l koncentrációban Pluronic® 12700 felületaktív anyagot oldottam. Az 4.táblázat tartalmazza a kapott méretet méret (d) és polidiszperzitás (PD) adatokat (A d a hidrodinamikai átmérő átlagérték, a szórás pedig az ismételt mérésekből adódik.) 42 Minta száma c(PLGA) / gl-1 Vizes fázis / ml d / nm PD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 10 10 10 10 4 5 6 7 8 9 10 14 20 28 30 40 10

20 30 40 133±1,0 120±1,0 123±5,0 136±2,0 117±0,5 120±0,1 113±0,8 117±0,3 110±1,1 132±1,5 116±4,1 113±0,6 131±1,6 136±0,2 136±1,9 141±3,4 0,085±0,010 0,095±0,030 0,073±0,030 0,094±0,040 0,088±0,007 0,079±0,002 0,094±0,01 0,053±0,03 0,085±0.01 0,077±0,030 0,139±0,003 0,089±0,01 0,104±0,007 0,086±0,007 0,082±0,014 0,130±0,033 4.táblázat: A fényszóródásmérés eredménye Az eredeti recept szerint dolgozva, amikor a szerves fázis/ vizes fázis aránya 1:4, a polimer koncentráció 10 g/l és a Pluronic® koncentráció 2 g/l, 120-140 nm közötti méretet kapunk. (Az általam ilyen körülmények között előállított nanorendszerben (1) lévő részecskék átlagmérete 133 nm.) Mivel ezek tájékozódó mérések voltak, így minden rendszert egyszer állítottam elő. Az ígéretesnek bizonyuló eredményeket többször (3-4-szer) megismételtem A táblázatban látható standard deviáció a mérés hibájára utal, három párhuzamos mérés

alapján számoltam ki. Látható, hogy a részecskék méretét viszonylag kis hibával lehet mérni A mért értékek alapján kiválasztottam azokat a nanoszuszpenziókat, amelyekben a részecskék az eredeti recept esetén kapott méretnél kisebbek voltak (5-ös, 6-os, 7-es, 8-as, 9-es rendszer) és újra elvégeztem a nanoprecipitációt. A 11-es és 12-es rendszert nem vittem tovább, mert egyrészt a fényszóródásmérésnél igen kicsi volt a beütésszám (<100 kcps), másrészt a nagyon híg rendszer a további céljainknak nem felelt meg, harmadrészt a kiválasztott négy nanorendszerhez hasonló méretű nanorészecskék voltak bennük. A kiválasztott öt nanorendszert megpróbáltam reprodukálni, illetve az esetleges hibákat (pl. a szerves fázis túl gyors csepegtetése) kiküszöbölve még kisebb méretű nanorészecskéket előállítani. A reprodukciók során az kapott eredményeket az 5. táblázatban foglaltam össze 43 Minta száma c(PLGA) / gl-1 5

6 7 8 Vizes fázis / ml d / nm 5 5 5 5 8 9 10 14 PD 123±7,0 120±5,5 118±5,0 124±7,0 A szerves/vizes fázis aránya 0,120±0,020 0,100±0,020 0.097±0,010 0,115±0,030 01:08 01:09 01:10 01:14 5. táblázat: A minták előállításának ismétlése során kapott adatok A táblázatban feltüntetett értékek három-négy minta átlagértékei, illetve ezek szórásai. Azt tapasztaltam, hogy a részecskék előállítása viszonylag kis szórással, nagy hatékonysággal reprodukálható. Az adatokat kiértékelve a DLS program Double Exponential módjával azt tapasztaltam, hogy a részecskék nagy része 100 nm körül van az 7-es rendszer esetében. A többi rendszernél ennél nagyobb értéket kaptam, illetve a polidiszperzitás értékek is lényegesen nagyobbak voltak. Így további méretcsökkentés céljára az 7-es rendszert választottam. A következő lépés a PLGA koncentrációjának csökkentése volt, amellyel a 6. táblázatban bemutatott eredményt

kaptam. Minta száma I II III IV V c(PLGA) / mgml-1 d / nm PD 5 4 3 2 1 125±5,0 113±10 127±3,0 100±5,7 103±10 0,089±0,010 0,073±0,004 0,096±0,010 0,098±0,009 0,130±0,012 A szerves/vizes fázis aránya 01:10 01:10 01:10 01:10 01:10 6.táblázat: A koncentráció-csökkentés eredménye A táblázatban szereplő értékek szintén három minta átlagértékei, illetve szórásai. Ezeket az eredményeket is megvizsgáltam Double Exponential módban, és azt találtam, hogy a IV-es és V -ös rendszer esetén a részecskék nagy része 100 nm alatti mérettartományban helyezkedik el. Azonban az V-ös rendszer fele olyan tömény, mint a IV-es, vagyis kevesebb részecske található benne, így kisebb a beütésszám is, ami bizonytalanabbá teszi a mérést, valamint a IV-es rendszer esetében jobb polidiszperzitás értéket kaptam. Ezek alapján azt mondhatjuk, hogy a IV. rendszer adta a legjobb eredményt, így a továbbiakban 2 g/l-re módosítottam a 44 PLGA

koncentrációját a szerves fázisban. A következő lépés az etanol alkalmazása volt, amely az eddigiekhez képest kb. 10 %-kal csökkentette az eddig elért méretet. Többféleképp adagoltam, ennek összefoglalása látható a 7. táblázatban Minta száma 1e 2e 3e Szerves fázis Vizes fázis EtOH / μl Aceton / μl EtOH / ml Víz / ml 150 850 0 10 500 500 0 10 0 1000 5 5 d / nm PD 95 0,089 214 0,111 156 0,1 7.táblázat: Az etanol a különböző fázisokba való adagolásának hatása a méretre A 2e esetben a PLGA már a vizes fázishoz való hozzáadás előtt kicsapódott, valószínűleg ezért kaptunk a vártnál nagyobb méretet. A 3e esetben pedig fehér csapadék formájában megjelentek az oldatban a kicsapódott és nagymértékben aggregálódott részecskék. Az 1e esetben azt tapasztaltam, hogy nem mindegy a hozzáadás sorrendje, tudni illik a felhasznált PLGA-oldatokat 20 mg/ml-es acetonos törzsoldatból készítettem hígítással. A hígítás

során acetont és etanolt adtam az oldathoz. Ha az utóbbit adtam hozzá először, akkor kicsapódott a PLGA, ami nagyobb méretet eredményezett a fordított változathoz képest. Ez alapján azt mondhatjuk, hogy az etanol elősegítette a PLGA részecskék kicsapódását, illetve gátolta az aggregációjukat, így átlagban kisebb átmérőjű részecskéket kaptunk. Így a továbbiakban az 1e szerint jártam el a nanorészecske előállítás során Ezek alapján a kísérleti körülmények összefoglalva:  Szerves fázis/vizes fázis aránya 1:10  PLGA koncentrációja a szerves fázisban 2 g/l  A szerves fázis összetétele: 15 % EtOH, 85 % Aceton. 5.3 Fluoreszcens anyagok A különböző fluoreszcens festékeket hidrofilitásuktól függően elsődlegesen más-más 45 módszerrel jutattam a részecskékbe. Azonban a kísérletek során azt tapasztaltam, hogy a festékek többsége oldódik mind a vizes, mind a szerves fázisban. Ebből kiindulva mind a

szerves, mind a vizes fázisban oldott festékkel megpróbáltam nanoprecipitációs módszer segítségével a jelzett részecskéket előállítani. A két módszer közt a kísérletek során tapasztalt különbség a következő volt. Ha a vizes fázis tartalmazta a fluoreszcens anyagot a dialízis kevesebb ideig tartott, a nanoszuszpenzió közege kevesebb festéket tartalmazott, mint a szerves fázisban lévő jelölő anyag esetében. Ez azt mutatja, hogy ha a vizes fázisban van a fluoreszcens anyag, a kapszulázás nagyobb hatékonysággal megy végbe. A be nem záródott fluoreszcens anyagot dialízissel távolítottam el. Ennek során nagy odafigyelést igényelt az a tény, hogy ha túl sokáig folytatjuk, akkor megkezdődhet a részecskék degradációja, így az azokból kiáramló festék mennyiségét is (hibásan) a be nem záródott festék mennyiségéhez vesszük. Ezt előkísérletekkel lehet kiküszöbölni, amelyek során viszonylag gyakran (20-30 percenként)

cseréljük a dializáló vizet, így meghatározva a dialízis idejét. Az eredményeket az 8. és 9 táblázatban foglaltam össze A 8 táblázat tartalmazza a szerves fázisban lévő festékekkel előállított nanorészecskék tulajdonságait, a 9. táblázat pedig a vizes fázisban lévő festékkel előállított nanorészecskék tulajdonságait. Festék Rhod B Rhod B base Rhod 6G Fluorescein Karboxi-fluorescein A c(PLGA) / c(festék) / szerves/vizes gl-1 gl-1 fázis aránya 2 01:10 0,02 2 01:10 0,02 2 01:10 0,02 2 01:10 0,02 2 01:10 0,02 d / nm PD 177±13 88±4,7 134±16 118,4±3 147,2±1 0,091±0,014 0,07±0,01 0,078±0,018 0,090±0,021 0,088±0,01 8.táblázat: Nanorészecskék előállítása olyan módon, hogy a festék a szerves fázisban volt oldva, c=0,02 g/l Festék Rhod B Rhod B base Rhod 6G Fluorescein Na sója A c(PLGA) / c(festék) / szerves/vizes gl-1 gl-1 fázis aránya 2 01:10 0,02 2 01:10 0,02 2 01:10 0,02 2 01:10 0,02 d / nm PD 115±10 106±12

113±14 76±10 0,065±0,010 0,088±0,024 0,062±0,012 0,098±0,018 9. táblázat: Nanorészecskék előállítása olyan módon, hogy a festék a vizes fázisban volt oldva, c=0,02 g/l 46 A rhodamin B base a szerves fázisban, a fluorescein Na-sója pedig a vizes fázisban adta a legkisebb méretet. Az általam előállított fluoreszcens anyaggal jelölt nanorészecskék szuszpenziója a karboxi-kumarin kivételével színes volt. A fluoreszcens mérések során igen nagy intenzitást tapasztaltam. (A fluoreszcencia intenzitásukat összehasonlítva azt tapasztaltam, hogy a fluorescein Na-sójával készült nanorészecskéknek a legintenzívebb az emissziójuk.) A többi részecske fluoreszcens aktivitását a 10. táblázat mutatja Festék Rhodamin B Rhodamin B base Rhodamin 6G* Fluorescein* Fluorescein Na-sója λ em / nm 576.91 582.89 553.97 512.80 515.97 I /au 475,688 293.627 274.873 452.236 497.145 λ ex / nm 554 560 528.05 488.53 491.94 Detektor voltage / V 500 450

500 450 450 10.táblázat: A festékkel jelölt részecskék fluoreszcens spektrofotométerrel mért fluoreszcens intenzitása Arra is kíváncsiak voltunk, hogy tényleges mennyi fluoreszcens festéket sikerült bezárni. Ezt a spektrofotometriás mérések alapján határoztuk meg Az anyagveszteségeket mindenhol igyekeztünk pontosan rögzíteni. A dialízisre használt víz fluoreszcens aktivitását mérve egy referencia alapján következtetni tudtunk az abban lévő anyag mennyiségére, így meg tudtuk állapítani a milyen mennyiségben záródott be a festék a részecskébe. Ez például a rhodamin B base esetében azt jelenti, hogy a kapszulázott festék „koncentrációja” 0,019 g/lnek adódott. Hasonlóképpen a többi rendszer esetében is a festék legalább 80%-a kapszulázódott. 5.4 Pásztázó elektronmikroszkópos mérések A pásztázó elektronmikroszkópos méréseket nagy vákuumban végeztük, 5-15 keV elektronárammal. A minták rhodamin B base,

fluorescein Na-sója, fluorescein festékeket tartalmaztak. A mérések során a mért mintákban szinte minden esetben a részecskéket gömb alakúnak láttuk. Néhány mintában előfordultak kevésbé szabályos aggregátumok, de ezekben 47 is viszonylag jól kirajzolódtak az azokat felépítő kisebb, gömb alakú részecskék. (Lásd 15 ábra d része.) A mikroszkóp alatt ugyanakkor jól lehetett látni, amit a fényszóródásmérő kiértékelő programja is mutatott, hogy a részecskék nem monodiszperzek, átmérőjük 20-70 nm-es tartományon belül mozog, de láttunk 1-1- nagyobb aggregátumot is. Valószínűleg ezek miatt kaptunk a DLS mérés során nagyobb értéket, mint ennél a mérésnél. A méreteloszlást 200 részecske méretének meghatározásából számoltam a fluorescein Na-sóját tartalmazó minta esetén. Azt az eredményt kaptam, hogy a részecskék legnagyobb része (75%-a) 20-34 nm-es mérettartományba esik (ld 14. ábrán) Ez biztató a

további vizsgálatokat nézve. A méreteloszlás ábrázolása a SEM mérések alapján 35,0% 30,0% 25,0% % 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 14 17 20 24 27 30 34 41 47 54 61 68 392 d / nm 14.ábra: A méreteloszlás ábrázolása a SEM mérések alapján A mérések során néhány problémába ütköztünk, amelyek miatt nem tudtuk éles, közeli képeket készíteni. Ezek egyike volt, hogy az elektronsugár hatására lassan fogyott a minta, ami talán annak tudható be, hogy nem alkalmaztunk semmilyen vezető bevonatot, így az volt a benyomásunk, mintha a részecskét egy burok venné körül, és ez tűnne el idővel az elektronnyaláb hatására. A mikroszkóp kezelésében jártas szakemberekkel konzultálva arra jutottunk, hogy ez a burok valószínűleg valamilyen szerves anyagból állhat, de ennél közelebbit sajnos ezidáig nem sikerült kideríteni róla. Ennek köszönhetően azonban sok esetben nem lehetett élességet állítani. A problémát a

vezetőréteggel való bevonás 48 megoldhatja, ezért készítettünk olyan mintát is, amelyre aranyat gőzöltünk. A mi esetünkben nagyon kis méretű részecskékről van szó, így ehhez mérten a bevonatnak is igen vékonynak kell lennie. Azonban a bevonat vastagságát sajnos a rágőzölés során nem lehet szabályozni, így céljainknak nem felelt meg a keletkezett aranybevonat, ugyanis túl vastagra sikerült. Ennek köszönhetően a pásztázó elektronmikroszkóppal az arany szerkezetét láttuk, és nem észleltük a részecskéinket. a) b) c) d) 15.ábra: SEM mérés során fluoreszcein Na-sóját tartalmazó, Pluronic F127-tel bevont PLGA részecskékről készült képek 49 5.4 Atomi erő mikroszkópia Az AFM mérések sok esetben problémába ütköztek, mert hasonló jelenséget tapasztaltunk, mint a SEM esetén, a részecskéket egy burok fedte, ami lehetetlenné tette a méret leolvasását. Több mintával próbálkoztunk (üres, rhodamin B base-t,

fluoresceint, fluorecein Na-sóját tartalmazó részecskék), de szinte minden esetben ezt tapasztaltuk. Előállítottam olyan rendszert is, amelynél kevesebb F127-t használtam a nanoprecipitációs eljárás során. Annál a rendszernél, amely egyáltalán nem tartalmazott felületaktív anyagot tudtuk felvenni a 16. ábrán látható képeket Ebben az esetben azonban viszonylag jó egyezést tapasztaltunk a DLS méréssel kapott értékekkel. Az utóbbival kapott értékek átlaga 156 nmnek adódott, AFM-pal pedig szintén 150-200 nm-es mérettartományban vannak a részecskék a magasságukat tekintve. A szélességük nem ebben a mérettartományban, azonban ez származhat abból is, hogy a kúp alakú AFM-tű nyílásszöge túl nagy, így nem tudja kellően letapogatni a kisméretű részecskéket. Jól látható ezeken a képeken is, hogy nem monodiszperz rendszerről van szó. 16. ábra: Fluoreszcein Na-sóját tartalmazó, F127 nélküli PLGA részecskékről készült

AFM kép 5.5 Rediszpergálhatóság és stabilitás A stabilitás vizsgálat során azt az eredményt kaptam, hogy az eltelt idő során nem változott jelentősen a részecskék mérete. Míg a vizsgálat kezdetekor 83 nm átlagos átmérőt 50 mértem, addig a végén (3 hét elteltével) ez 88 nm-re változott. Ez a különbség kevesebb, mint 10 %, ami nagyon biztató eredmény a további felhasználást illetően. Az eredményeket a 17 ábrán szemléltettem. 120 100 90 60 88 d / nm d / nm 80 40 86 84 82 20 80 0 1 2 3 4 5 6 7 t 0 0 1 2 3 4 5 6 7 t 17. ábra: A stabilitás méréseredményének ábrázolása Az egyes számok az alábbi időtartamokat jelöli: 1. első mérés, 2 1 h után, 3 24 h óra után, 4. 1 hét , 5 2 hét, 6 3 hét elteltével mért értékek Ez a jelentős stabilitás annak tudható be, hogy a részecskék külső rétegében nagy mennyiségben Pluronic® helyezkedik el, amely megakadályozza az aggregációt, illetve elég

kicsi a nanoszuszpenzióban lévő részecskék száma. Végeztünk arra vonatkozóan is kísérleteket, hogy mi történik abban az esetben, ha a Pluronic® mennyiségét jelentősen (tizedére) lecsökkentjük, illetve teljesen elhagyjuk. Azt az eredményt kaptuk, hogy a részecskék mérete nagyobb mértékben nőtt két hét elteltével, mint előző esetben. Ez megerősíti a Pluronic® használatának szükségességét A rediszpergálhatóság során a diszpergálásra szánt víz a mintához való adagolása után szinte teljes mértékben eltűnt a szilárd anyag. A teljes diszpergálódás eléréséhez 6 percig ultrahangos keverő segítségével kevertettem. Ezek után az apró, szálas csapadék is eltűnt a szuszpenzióból. 51 Mindezek alapján elmondhatjuk, hogy sikerült 100 nm alatti átlag méretű részecskéket előállítani, méretüket többféle mérési módszerrel meghatározni, majd azokat fluoreszcens festékkel megjelölni, amelyek mennyiségét és

fluoreszcens aktivitását mérni tudtuk. A kapott eredmények alapján a rhodamin B base festéket, illetve a fluorescein Na-sóját tartalmazó részecskéket választottuk ki további biológiai vizsgálatok számára. 52 5.7 Biológiai vizsgálatok 5.71 Vér-agy gát vizsgálata ép agyban rhodaminnal Sértetlen állatokba intravénásan rhodamint injektálva, jól kirajzolódott az érhálózat. Olyan cirkumventrikuláris szervekben, ahol hiányzik a vér-agy gát (pl. eminentia mediana, szubfornikális szerv, area postrema) egyenletes fluoreszcens felhő figyelhető meg, vagyis ezeken a helyeken az erekből kilépett a rhodamin. Ez azt jelenti, hogy a festék bejutott az agyba, de a vér-agy gáton csak a speciális helyeken (cirkumventrikuláris szervek) tudott átjutni. (18/1 ábra d és e) 5.72Vér-agy gát vizsgálata ép agyban Evans-kékkel Szintén sértetlen állatokba intravénásan injektáltunk Evans-kéket. Ebben az esetben a várakozásnak megfelelően a

nemcsak az előbb említett cirkumventrikuláris szerveknél tapasztalunk egyenletes felhőt, hanem az agy többi területén lévő erek körül is. Áteső fényben is jól látszik. (18/1 ábra a, b és c) 5.73Vér-agy gát vizsgálata ép agyban fluoreszcein-izotiocianáttal jelölt nanoméretű kompozit anyaggal A fentiekkel megegyező körülmények közt adtuk be az anyagokat. Az kompozit anyag mellett alkalmaztunk kontrollt is. Az anyag esetében azonban az agy többi részén lévő erek körül szintén látható egy fluoreszcens felhő, amely arra utal, hogy az anyag számára a vér-agy gát átjárható. (18/2ábra f és h) Ha Rhodaminnal együtt adtuk, akkor is tapasztaltuk a fluoreszcens felhőt, az ereket pedig jól kirajzolta a rhodamin. Azt tapasztaltuk, hogy a cirkumventrikuláris szervekben a kontroll és az anyag injektálása esetén is megjelenik szintén a fluoreszcens felhő. (13/2 ábra g és i) 5.74Vér-agy gát vizsgálata ép agyban fluresceinnel illetve

rhodamin B base-zel jelölt nanorészecskékkel A fentiekkel megegyező körülmények közt injektáltuk be az nanoszuszpenziót. Szintén alkalmaztunk kontrollt. Ez a fluorescein fiziológiás sóoldatban elkészített oldata volt Ebben az esetben nem láttuk az erekben az anyagot, valószínűleg túl kis mennyiségben adtuk be. Jelenleg ezen próbálunk változtatni, tudni illik az intravénásan beadható folyadék mennyisége limitált. 53 18/1. ábra: A vér-agy gát vizsgálat ép agyterületeken beleértve a cirkumventrikuláris szerveket is a) Evans-kék feltöltés után, ahol a vér-agy gát áteresztő megjelenik a kék szín. Ld Eminentia mediana b) .szubfornikális szerv c) plexus chorioideus. d) Rhodaminnal való feltöltés után, ahol a vér-agy gát áteresztő az erek nem rajzolódnak ki. Pl eminentia mediana e) Rhodaminnal feltöltött agyi érrendszer. 54 18/2. ábra: Vér-agy gát permeabilitásának vizsgálta biszakril-amiddal körülvett,

fluoreszcensen jelölt fehérjék (kompozit anyag) segítségével ép agyterületeken f) és h) A kompozit anyag kontrollja által megfestett agyi erek kétféle nagyításban g) és i) A kompozit anyaggal kezelt ép agyterületek kétféle nagyításban. Jól megfigyelhető egy fluoreszcens ’felhő’, amely arra utal, hogy az anyag számára véragy gát átjárható. j) Rhodamint és a kompozit anyagot együtt adva az előbbi kirajzolja az ereket, az utóbbi esetében pedig a fluoreszcens ’felhőt’ látjuk. 55 5.75 Vér-agy gát vizsgálata fagyasztásos léziót követően Elsőként áteső fénnyel vizsgáltuk a szeleteket. A léziót világos, lencse alakú területként azonosítottuk, amelyet alulról sötét zóna határolt. Nissl-festést alkalmazva a lézió területén szintén világosabb a metszet, illetve neuronok alig szinte csak sejtmagok láthatók a mikroszkóp alatt. (Ezek nagy valószínűséggel a gliasejtek magjai) (19 ábra a és b) A fagyasztásos

léziót követően rhodamint adva az injektálástól számított egy óra után majdnem teljesen homogén, erősen fluoreszkáló területet figyeltünk meg. Ezen a részen az erek vagy egyáltalán nem vagy csak alig voltak láthatók. Ez a terület megfelelt annak, amit átvilágítással láttunk a sérülés helyén. (19 ábra d, e ésf) Lézió után a fibronektin és az immunglobulin-G is megfelelő immunreakcióval kimutathatóvá vált az agy kiterjedt területén. Ennek oka a vér-agy gát károsodása, így a plazmában keringő anyagok számára átjárhatóvá vált az endothelium. 56 19. ábra: Fagyasztásos lézió utáni immunhisztokémiai változások a) Nissl-festés nyomán a sérült terület szintén elhatárolódik b) Nagyobb nagyítással látható, hogy ezen a területen a neuronok szinte eltűnnek, a látható citoplazma nélküli sejtmagok feltehetően gliasejtek. c) Áteső fényben egy világos terület rajzolódik ki (sérülés), amelyet sötét

zóna határol d) Rhodaminnal való festés láthatóvá teszi a sérülést, vagyis azt a területet, ahol a vér-agy gát átjárhatóvá vált. e) A kiáramlott rhodamin megfesti a sejtek roncsait. (Konfokális mikroszkóppal készült kép a lézió területéről) f) Nagyobb nagyítással látható, hogy a rhodamin alig körvonalazza az ereket a lézió területén (piros terület), de jól kirajzolja az ép agyszövetben (sötét háttér). 57 6. Az eredmények értelmezése 6.1 A nanorészecskék előállítása és jellemzése során tapasztaltak magyarázata A várakozásoknak megfelelően a fluorescein Na-sójával jelölt nanorészecskének lett a legnagyobb a fluoreszcens intenzitása. Bár a PLGA burok kicsit eltolja az emissziós hullámhosszt, és elnyeli az emittált fény egy részét, összehasonlítva vele ugyanilyen koncentrációjú festékek vizes oldatának fluoreszcens intenzitását azt tapasztaltuk, hogy nincs jelentős különbség a két érték

között. Ez azt jelenti, hogy az irodalomban talált értékektől (a festék koncentráció a PLGA koncentráció egy százada [39]) nem kell jelentősen eltérni, elméletileg detektálhatók az átjutott részecskék. Többféle módszerrel is meghatároztuk a részecskék méretét. A módszereket összehasonlítva azt mondhatjuk, hogy a fényszóródásmérés elsődleges tájékozódásra alkalmas, azonban mivel átlagméretet határoz meg, sok esetben félrevezető lehet, egy, az átlagtól jóval eltérő nagyságú részecske nagyon befolyásolja a kapott adatot. Ez ki tudjuk valamelyest úgy védeni, hogy a quadratikus modellen kívül más modellt is alkalmazunk a kiértékelés során a rendszerünkre. Ilyen lehet például az Exponential vagy Double Exponential. Ezek segítségével megbecsülhetjük, hogy a mérendő szuszpenzióban milyen arányban vannak jelen az egyes méret-tartományba eső részecskék. A pásztázó elektronmikroszkópos mérés ennél pontosabb

képet ad, mert fizikai mivoltukban láttatja a részecskéket, így lemérhetjük átmérőjüket, készíthetünk statisztikát, megfigyelhetjük a méreteloszlást. Ez a módszer tehát jobban, pontosabban jellemzi a nanorendszerünket, mint az előző. Azonban mint az eredmények idetartozó részeiben írtam, több esetben problémába ütközött a mérés, amit eddig nem sikerült kiküszöbölni. 6.2 A biológiai vizsgálatok során tapasztaltak magyarázata Sértetlen állatokban a festékek adagolása során tapasztaltak összhangban vannak a szakirodalomban megjelent eredményekkel. Ennek megfelelően az Evans-kék és rhodamin festék, illetve a kontrollként használt FITC-albumin és a fluorescein Na-sója nem jutott át a vér-agy gáton, csak az erekben és a cirkumventrikuláris szervekben jelent meg. A kompozitanyag esetében viszont átjárható a vér-agy gát. Ez annak köszönhető, hogy az így előállított nanorészecskék 40-50 nm-es mérettartományban

vannak, és a felületük igen hidrofób, vagyis lipofil. 58 A sérülések után a várakozásnak megfelelően a rhodamin feltöltötte az ereket, a cirkumventrikuláris szeveknél pedig, ahol a vér-agy gát hiányzik, diffúzan szétterjedt az agyszövetben. A sérült szövetben szintén az utóbbit tapasztaltuk Az immunhisztokémiai vizsgálatok szerint a fibronektin és az immunglobulin-G ugyanazokon a területeken jelent meg, ahol a rhodamin. Az agy ezen részén találtunk neuronpusztulást, ezt tekinthetjük sérült vér-agy gáttal rendelkező területnek [40]. A hasonlóságok mellett érdemes megvizsgálni a használt anyagok közti különbözőségeket is. Az immunhisztokémiai vizsgálatok során tapasztaltak szerint sérülések esetén a fibronektin és az immunglobulin-G tovaterjed a corpus callosum mentén. Ennek következménye, hogy a corpus callosum mentén glia-reakció jelenhet meg még az ellenoldali féltekében is a lézió miatt [41]. A

fehérjék az útvonalat tekintve paracellulárisan jut(ná)nak át, ezt ép barrier esetén a szoros zárókapcsolatok gátolják. Elvileg pl a rhodamin is bejuthatna az agyba, lipofilitása és mérete révén. Azonban a vér-agy gát vizsgálatára használt festékek nagy része nem egyedi molekulaként van jelen a szervezetben, hanem fehérjékhez általában albuminhoz kötötten, és csak kis százalékban fordulnak elő szabad formában. Emellett akadályozzák a bejutást a P-glikoproteinek és multidrog-rezisztencia proteinek, amelyek efflux pumpaként funkcionálnak. 59 7. Összefoglalás és kitekintés A munkám célja egyrészt olyan PLGA nanorészecskék előállítása volt, amelyek elsősorban méretük és felületi tulajdonságuk révén alkalmas gyógyszerhordozók lehetnek a központi idegrendszer betegségeinek kezelése során, másrészt a központi idegrendszerbe való bejutás feltételeinek, vagyis a vér-agy gát permeabilitásának vizsgálta in vivo

módon különböző festékek és nanoméretű részecskék segítségével. Elsőként olyan hordozórendszert állítottam elő nanoprecipitációs módszerrel, különböző paraméterek módosításával, amelyek átmérője 100 nm alatti és felülete elég hidrofil ahhoz, hogy ne ürüljön ki a szervezetből az RHS által. A méretet dinamikus fényszóródás, pásztázó elektronmikroszkópos és atomi erő mikroszkópos mérésekkel ellenőriztem. Ezután fluoreszcens festékeket zártam a részecskékbe A bezárás hatásfokát fluoreszcens spektrofotometriás mérésekkel ellenőriztem. A részecskék méretét ebben az esetben is a fent felsorolt módszerekkel ellenőriztem. A részecskék méretének és fluoreszcens intenzitásának ismeretében kiválasztottam két rendszert, amelyeket in vivo is teszteltem. Ez a két rendszer a fluoreszcein-Na-sóját és a rhodamin B base-t tartalmazó nanoszuszpenziók voltak, amelyek átlagos mérete 66 (±5) nm, illetve 80(±7)

nm, fluoreszcens intenzitásuk megfelelő az in vivo vizsgáltok számára Vizsgáltam stabilitásukat kétszer desztillált vízben, illetve rediszpergálhatóságukat. Ezek során igen biztató eredményeket kaptam, hogy 3 hét alatt 10%-ot sem változott a részecskék mérete, illetve a liofilizált minta néhány perces ultrahangos kevertetés után teljes mértékben diszpergálódtak a részecskék. Ezek mellett a vér-agy gát permeabilitásának vizsgálatára használtam Evans-kék és rhodamin B festéket, illetve biszakrilamid réteggel bevont, fluoreszcein izotiocianáttal jelölt fehérjéket. Az in vivo vizsgálatokat ép és sérült állatokon végeztem Az eredményeket összefoglalva elmondhatom, hogy sikerült 100 nm alatti fluoreszcens festékkel jelölt PLGA nanorészecskéket előállítani nanoprecipitációs eljárással, amelyek felületét Pluronic segítségével tettem hidrofilebbé. A továbbiakban szeretnénk többet megtudni a gyógyszerhordozó

szerkezetéről, illetve hogy pontosan hol helyezkedik el benne az anyag. Vizsgáltam a vér-agy gát permeabilitását Evans-kék, rhodamin festék és nanoméretű anyagok segítségével. A festékekkel az irodalmi előzmények által várt eredményeket kaptuk, tehát csak speciális helyeken jutnak át a vér-agy gáton, így megfelelő kontroll vegyületek voltak, illetve lesznek a további vizsgálatokhoz. A kompozit anyag átjutott a vér-agy gáton, 60 ezt bizonyította az erek körül megjelenő fluoreszcens felhő. A kompozit anyag kontrollja, ahogy vártuk szintén csak a speciális helyeken jutott át a vér-agy gáton. További terveink között szerepel a fehérjét borító biszakrilamid réteg kicserélése biodegradábilis, biokompatibilis polimerre.Erre alkalmas lehet pl PLA vagy PLGA Az általam előállított PLGA nanorészecskék biológiai vizsgálata során egyenlőre még nem született értékelhető eredmény, mivel a megengedett injektálási

térfogattal úgy tűnik túl kevés anyag kerül az állatba. Jövőbeli terveink között szerepel ennek a problémának a kiküszöbölése, továbbá a központi idegrendszert érintő rákos betegségek kezelésére használt gyógyszerek közül pl. a doxorubicin kapszulázása. Ez igen erős citosztatikum, és káros hatással van normál sejtekre Az eredmények azt mutatják, hogy a nanoprecipitációs módszerrel előállított részecskék megfelelnek az olyan gyógyszerhordozókkal szemben támasztott követelményeknek, amelyeknek a célterülete az agy. Így továbbfejlesztésük, különféle gyógyszerekkel való tesztelésük releváns lehet a központi idegrendszer betegségeinek leküzdésében. 61 9. Summary One aim of my work was to produce such PLGA nanoparticles that can be used as carriers in treating diseases of the central nervous system, due to their size and surface parameters. Another aim was to examine in vivo the conditions of the transport

into the central nervous system, that is, the permeability of the blood-brain barrier, using different dyes and nanoparticles. At first, by modifying certain parameters, using nanoprecipitation method I created a carrier system with diameter below 100 nm and with surface hydrofil enough not to empty from the body by RHS. I checked the size of the particles with dynamic light scattering, scanning electron microscope and atomic force microscope measurements. Then I wrapped fluorescent dyes into the particles. The efficiency was tested by fluorescent spectrofotometric measurements. I checked the size of the particles with the above mentioned methods, again Based on the size and the fluorescent intensity of the particles I have chosen two systems, which I tested in vivo, as well. These systems are the nanosuspensions containing the fluorescein-Na-salt and the rhodamin B base. The average size of these particles is 66(±5) nm and 80(±7) nm, respectively. Their fluorescent intensity is

suitable for in vivo tests I tested their stability in doubly distilled water and their redispersibility. The results were quite promising. The size of the particles altered with less than 10% during three weeks, and they copletely dispersed after three minutes of sonication. I also used Evans blue and rhodamin B dyes to examine the permeability of the blood-brain barrier, and proteins marked by fluorescein isothiocyanate and coated with bisacrylamide layer. The in vivo experiments were performed on intact and injured animals. To summarize the results, I managed to produce PLGA nanoparticles of size under 100 nm marked by fluorescent dye using nanoprecipitation method, and the surface of these particles was made more hydrofil by pluronic. We would like to obtain additional knowledge about the structure of the carrier, and the exact location of the dye wrapped into it. I examined the permeability of the blood-brain barrier with Evans blue, rhodamin dye and nanoparticles. In case of the

dyes, we obtained results analogous to that in the literature, ie, these dyes are transported through the blood-brain barrier only at certain special places, so they are and will be appropriate control compounds for the experiments. The composit was transported through the blood-brain barrier, as the fluorescent "cloud" arond the vessels prove it. According to the expectations, the control of the composit was transported through the blood-brain barrier only at the special places, as well. We plan to switch the bisacrylamid layer coating the protein to a biodegradable, biocompatible polimer. PLA or PLGA might be 62 an appropriate choice for this. The biological examination of the produced PLGA have not yet yielded a result, as it seems that the allowed injection volume is not enough for this purpose, but we will work on the solution of this problem. Another problem to solve in the future is the encapsulation of the drugs used for the treatment of cancers affecting the

central nervous system, such as doxorubicin, as this is a very strong cytostatic agent, and it damages the normal cells. The results show that the particles produced by the nanoprecitipation method agree with the expectations for a carrier of which the target area is the brain. Thus improving and testing them with various drugs can be relevant in treating the diseases of the central nervous system. 63 Irodalomjegyzék: [1] M. Deli, M Kálmán: Vér-agy gát: kölcsönhatás gliasejtek és az agyi endothelsejtek között In: Szerk. Zs Huszti, M Kálmán: Glia, Akadémiai Kiadó, Budapest, 351-367, 2008 [2] P. Röhlich: Szövettan, Folpress Nyomdaipari Kft, Budapest, 203-204, 1999 [3] H.Bauer, H-C Bauer, R F Haseloff, I E Blasig: The role of glia in the formation and function of the blood-brain barrier In: Edited by Helmut Kettenmann and Bruce R. Ransom: Neuroglia, Oxford University Press, 325-333, 2004 [4] H. Wolburg,W Risau: Formation of the blood-brain barrier In: Sedgwick

Mather:Anatomy and Physiology of the Nervous System 763-776, 2010 [5] W. M Pardridge: Blood-brain barrier biology and methodology, Journal of Neurovirology, 5,556-569, 1999 [6] Zs. Darvas, V László: Sejtbiológia, Semmelweis Kiadó, 147-148, 2005 [7] P. Ballabh, A Braun, M Nedergaard: The blood-brain barrier: an overview Structure, regulation, and clinical implications, Neurobiology of Disease, 16, 1-13, 2004 [8] V. Ádám: A membránok szerkezete In: Szerk V Ádám: Orvosi biokémia, Medicina Kiadó, Budapest, 437-438, 2006 [9] F. Hajós: A neuroglia szerkezete In: Szerk Zs Huszti, M Kálmán: Glia, Akadémiai Kiadó, Budapest, 18-20, 2008 [10] Nico B, Cantino D, Sassoé Pognetto M, Bertossi M, Ribatti D, Roncali L.:Orthogonal arrays of particles (OAPs) in perivascular astrocytes and tight junctions in endothelial cells. A comparative study in developing and adult brain microvessels, Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology,26,1, 103-109, 1994 [11] R. Balabanov, P

Dore-Duffy: Role of the CNS microvascular pericyte in the blood-brain barrier, Journal of Neuroscience Research, 53 (6), 637-644, 1998 [12] J. Correale, A Villa: Cellular Elements of the Blood-Brain Barrier, Neurochemistry Research, 34, 2067-2077, 2009 [13] A.Armulik, A Amramsson, C Betsholtz: Endothelial/Pericyte Interactions, Circulation Research, 97, 512-523, 2005 [14] M. Ramsauer, D Krause, R Dennietzel: Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes, FASEB Journal, 16, 1274-1276, 2002 [15] S. Bhaskar, F Tian, T Stoeger, W Kreyling, J M d l Fuente, V Grazú, P Borm, G Estrada, V. Ntziachristos, D Razansky: Multifunctional Nanocarriers for diagnostics, drug delivery and targeted treatment across blood-brain barrier: perspectives on tracking and neuroimaging, Particle and fibre toxicology, 7(3), 1-25, 2010 64 [16] F.LCardoso, D Brites, M A Brito: Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy, and possible investigation approach,

Brain Research Reviews,64, 328-363, 2010 [17] M.I Alam, S Beg, A Samad, S Baboota, K Kohli, J Ali, A Ahuja, M Akbar: Strategy for effective brain drug delivery, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 40, 385-403, 2010 [18] Y. Deguchi, T Terasaki: Transport of basic peptides at the blood-brain barrier, In: Edited by A. J Kastin: Handbook of biologically active peptides, Academic Press, London, 1446, 2006 [19] W. dos Santos, J Rahman, N Klein, D Male: Distribution and analysis of surface charge on brain endothelium in vitro and in situ, Acta Neuropathologica, 90(3),305-311, 1995 [20] E. M Taylor: The Impact of Efflux Transporters in the Brain on the Development of Drugs for CNS Disorders, Clinical Pharmacokinetics,41(2), 81-92, 2002 [21] E. Garcia-Garcia, K Andrieux, S Gil, P Couvreur: Colloidal carriers and blood-brain barrier (BBB) translocation: A way to deliver drugs to the brain?, International Journal of Pharmaceutics, 298, 274-292, 2005 [22] G. Lehne: P-glycoprotein as a

Drug Target in the Treatment of Multidrug Resistant Cancer, Current Drug Targets, 1, 85-99, 2000 [23] B.V Zlokovic: Can blood-brain barrier play a role in the deverlopmentz of cerebral amyloids and Alzheimers disease pathology?, Neurobiology Disease, 4, 23-26, 1997 [24] Popescu Toescu Popescu, Bajenaru, Muresanu, Schultzberg, Bogdanovic: Blood-brain barrier alterations in ageing and dementia, Journal of Neurology Science, 283, 1-2, 99-106, 2009 [25] E. A Neuwelt, K R Maravilla, E P Frenkel, S I Rapaport, S A Hill, P A Barnett: Osmotic blood-brain barrier disruption computerized tomographic monitoring of chemotherapeutic agent delivery, Journal of Clinical Investigation, 64, 684-688, 1979 [26] K. L Black, N S Ningaraj: modlation of brain tumor capillaries for enhanced drug delivery selectively to brain tumor, Cancer Contr, 11,165-173, 2004 [27] N. B Chauhan: Trafficking of intracerebroventricularly injected antisense oligonuctleotides in the mouse brain, Antisense Nucleic Acid Drug

Delivery, 12, 353-357, 2002 [28] M. F Francis, M Cristea, F M Winnik: Polymeric micelles for oral drug delivery: Why and how, Pure Application Chemistry, 76, 7-8, 1321-1335, 2004 [29] Adv. Drug Delivery Rev 54, 167, 2002 [30] A. V Kabanov, E V Batrakova, N S Melik-Nubarov, N A Fedoseev, T Y Dorodnich, V. Y Alakhov, V P Chekhonin, I R Nazarova,V A Kabanov: A new class of drug carriers: micelles of poly(oxyethylene)-poly(oxypropylene) block copolymers as microcontainers for 65 drug targeting from blood in brain, Journal of Controlled Release, 22, 2, 141-157, 1992 [31] P. Hau, K Fabel,U Baumgart, P Rümmele, O Grauer, A Bock , C Dietmaier, W Dietmaier,J. Dietrich, C Dudel, F Hübner,T Jauch, E Drechsel, I Kleiter, C Wismeth, A Zellner, A. Brawanski, A Steinbrecher, J Marienhagen, U Bogdahn: Pegylated liposomal doxorubicin-efficacy in patients with recurrent high-grade glioma,Cancer, 100, 6, 1199–1207, 2004 [32] J. Huwyler, D Wu, W M Pardridge: Brain drug delivery of small molecules

using immunoliposomes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93, 14164-14169, 1996 [33] Y. Zhang, Y-f Zhang, J Bryant, A Charles, R J Boado, W M Pardridge: Intravenous RNS interference gene therapy targeting the human epidermal growth factor receptor prolongs survival in intracranial brain cancer, Clinical Cancer Research, 10, 3667-3677, 2004 [34] PR Lockman, RJMumper, MA Khan, DD Allen: Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier,Drug Development and Industrial Pharmacy, 28, 1, 113, 2002 [35] P.D Scholas, AGG Coombes, LIlium, SS Davis, M Vert,MC Davies: The preparation of sub-200 nm poly(lactide-co-glycolide) microspheres for site-specific drug delivery Journal of Controlled Release, 25, 145-153, 1993 [36] É. Kiss, K Dravetzky, K Hill, E Kutnyánszky, A Varga: Protein interaction with a Pluronic-modified poly(lactic acid) Langmuir monolayer, Journal of Colloid and Interface Science, 325, 337-345, 2008 [37] É.

Kiss, I Bertóti, E I Vargha-Butler: XPS and Wettability Characterization of Modified Poly(lactic acid) and Poly(lactic/glycolic acid) Films, Journal of Colloid and Interface Science 245, 91–98, 2002 [38] Kiss Éva, Gáspár Miklós, Léránt István, Bertóti Imre, Machovich Raymund: Poli(etilén oxid)-dal borított felületek fehérjeadszorpciója és vérkompatibilitása Magyar Kémiai Folyóirat 107 337-344 (2001) [39] U. Bilati, E Allémann , E Doelke: Development of a nanoprecipitation method intended for the entrapment of hydrophilic drugs into nanoparticles, European Journal of Pharmacy Science, 24, 67–75, 2005 [40] S. Stainmesse, A-M Orecchioni, ENakache, F Puisieux, H Fessi,Colloid Polymer Science, 273, 505-511, 1995 [41] P. Legrand, S Lesieur, A Bochot , R Gref, G Barratt, C Vauthier,W Raatjes: Influence of polymer behaviour in organic solution on the production of polylactide nanoparticles by nanoprecipitation Colloid Polymer Science, International Journal of

Pharmaceutics 344,33– 43, 2007 [42] U. Bilati1 , EAllémann, E Doelker: Development of a nanoprecipitation method intended for the entrapment of hydrophilic drugs into nanoparticles, European Journal of Pharmaceutical Sciences 24,67–75, 2005 66 [43] E.G de Jalón, M J Blanco-Príeto, PYgartua, S Santoyo: PLGA microparticles: possible vehicles for topical drug delivery, International Journal of Pharmaceutics, 226, 181-184, 2001 [44] S.Stainmesse, A-M Orecchioni, E Nakahe, ÍF Piusieux, H Fessi: Formation and stabilization of a biodegradable polymeric colloidal suspension of nanoparticles, Colloid and Polymer Science, 273, 505-515, 1995 [45] K. Tahara, YMiyazaki, Y Kawashima , J Kreuter: Brain targeting with surface-modified poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) nanoparticles delivered via carotid artery administration, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 77, 84–88, 2011 [46] M. Dr Krutsay: Szövettan technika,Medicina Könyvkiadó, Budapest, 90-91, 1980 67