Biológia | Genetika » Bakteriális genetika

7. heti szeminárium Bakteriális genetika Rekombináció A baktériumok genetikai analízisének előnyei • A baktériumok haploidok, a recesszív allélek hatásai is megjelennek a fenotípusban a hemizigótaság miatt • Generációs idejük rövid • Nagy létszámú populációk tarthatók fenn igen könnyen, olcsón • Ezen populációk egyedei genetikailag azonosak (klonalitás) A prokarióták genetikai változékonyságának forrása • Nincs szexuális szaporodás, csak géntranszfer, ahol egyirányú donor - recipiens viszony áll fenn, és csak egyetlen új kombináció keletkezik – Sejtek közötti géntranszfer • Transzformáció (DNS felvétele a környezetből) • Konjugáció (konjugatív plazmidokkal) • Transzdukció (fágok segítségével) – Sejten belüli géntranszfer (a kromoszóma különböző részei vagy kromoszóma és plazmid – plazmid és kromoszóma között) • Transzpozició (mobilis genetikai elemekkel) – inszerciós

szekvenciák – composite (komplex, összetett) transzpozonok – noncomposite transzpozonok – egyes fágok is transzpozonnak tekinthetők (pl.: Mu-fág) A prokarióta DNS felvétel jellemzői: • A donor sejt egy kromoszómális fragmentje kerül csak felvételre • Egyirányú a géntranszfer: donorrecipiens viszony • A DNS beépülése a genomba homológ rekombinációval történik • Fajok közötti gén transzfer lehetséges Bakteriális genetika: Bakteriofágok, transzdukció, restrikció 5 Bakteriofágok életciklusa • Litikus vagy virulens fág: a gazdasejtben történő szaporodás után általában a gazdasejtet lizálja és az utód fágrészecskék kiszabadulnak (pl. T4 fág) Kötődés specifikus receptorhoz A litikus ciklus Infekció Lízis Bepakolódás A gazda genom lebontása Összeszerelődés A vírus genom replikációja A fágok detektálhatók és számolhatók. 1. Keverjük a fág szuszpenziót baktériumsejtekkel 2. Adjunk

hozzá folyékony fedő agart 3. Szélesszük agar táptalaj felületén Fág részecske Fedő agar Alap agar pázsit Plaque Bakteriofágok életciklusa • Litikus vagy virulens fág: a gazdasejtben történő szaporodás után általában a gazdasejtet lizálja és az utód fágrészecskék kiszabadulnak (pl. T4 fág) • Lizogén vagy temperált fág: képes a gazdasejt genomjába beépülni, ott generációkon keresztül rejtve maradni, és ebből az állapotból bizonyos hatásokra kilépni, s átmenni a litikus ciklusba (pl. λ fág) A baktérium kromoszómába integrálódott fágot profágnak nevezik. A profágot hordozó baktériumot lizogénnek hívják. Ebben egy represszor a fág géneket kikapcsolja. A lizogén törzs hasonló típusú fágfertőzéssel szemben rezisztens. A profág indukciója a fág genomnak a gazdasejtből való kivágását, litikus fágként való szaporodását és a gazdasejt lízisét eredményezi. Kötődés specifikus receptorhoz

Infekció A lizogén ciklus A fág DNS cirkularizációja A baktérium osztódási ciklusai Fág kivágódás Belépés a litikus ciklusba Temperált fág A fág DNS integrálódása a baktérium genomba A transzdukció típusai • Generalizált transzdukció – A fágok litikus ciklusához kötött, melynek során bármely kromoszómális gén azonos valószínűséggel kerül átvitelre. A transzdukció típusai • Generalizált transzdukció: A fágok litikus ciklusához kötött, melynek során bármely kromoszómális gén azonos valószínűséggel kerül átvitelre. • Specializált transzdukció: A fágok lizogén ciklusához kötött, melynek során csak bizonyos gének kerülnek transzdukcióra. Konzervatív szakasz specifikus rekombináció! 3’ foszfodiészter kötés a rekombinázzal (Int = integráz) A fág konverzió jelensége Bizonyos lizogén fágok vagy integrálódásuk során inaktiválnak bakteriális géneket, vagy olyan

géneket hordoznak, amelyek megváltoztatják a recipiens sejtek fenotípusát. Fág konverzió az oka néhány patogén baktérium toxicitásának, mivel a profág hordozza a fehérje toxinok génjeit. Baktérium faj Toxin Corynebacterium diphtheriae Vibrio cholerae Shigella dysenteriae Escherichia coli O157 Clostridium botulinum Diphtheria toxin Cholera toxin Shiga toxin Vero cytotoxin Botulin (neurotoxin) Transzformáció • Természetes körülmények között csak lineáris DNS-t vesznek fel a sejtek • A DNS felvételéhez kompetenssé kell válniuk • A felvett DNS egyszálas formában lép homológ rekombinációba a baktérium DNS-ével A plazmidok csoportosítása • Méret szerint: – kisméretű plazmidok – nagyméretű plazmidok • F-plazmid • R-plazmid • F’-plazmid (merodiploidia = parciális diploid) • Replikáció szerint: – kis kópiaszámú plazmidok (ált. a nagyméretűek) – nagy kópiaszámú plazmidok (ált. a kisméretűek) •

Funkció szerint: – – – – – Fertilitásért felelős konjugatív plazmidok (F, F’) Rezisztencia transzfer plazmidok (R) Colicinogén, baktericinogén plazmidok Degradatív plazmidok Virulencia plazmidok Konjugatív plazmidok A sejtek lehetséges állapota az F plazmid lokalizációja szerint F+ törzs Hfr törzs DNS transzfer F+ és F- sejtek közötti konjugációjában F plazmid integrációja az E. coli kromoszómába Hfr – F- párosodás eseményei „Time of entry” vagy interrupted mating (megszakított párosodás) kísérlet Hfr a+ b+ c+ d e+ str-s x F- a- b- c- d- e- str-r Szelektálható markerek (a,b) Kontraszelektálható marker (str-r) Nem konjugativ plazmid mobilizálása Helyspecifikus recombináció Mobilis genetikai elemek a baktériumokban „Idegen” DNS darabok a baktérium genomban • Transzpozonok (mobilis genetikai elemek) • Rezisztencia-plazmidok és kazetta kromoszómák rezisztencia gének transzferéért

felelős régió SCCmec = Staphylococcal Casette Chromosome mec transzpozonokon kódolt rezisztencia gének ! Jelentőség: rezisztencia gének terjedése fajon belül (néha fajok között) ! Jelentőség: rezisztencia gének begyűjtése, multirezisztens törzsek kialakulása Genetikai rekombináció • Homológ rekombináció (800 bp) • Specifikus rekombináció (4-15 bp) – Transzpozíció – Szakaszra specifikus rekombináció • konzervatív – 3’ foszfodiészter kötés a rekombinázzal (Int = integráz) – 5’ foszfodiészter kötés a rekombinázzal (Hin-invertáz) • nem-konzervatív (T-receptor, antitestek) – Régió specifikus rekombináció (HO endonukleáz, bimbózó élesztő párosodási típus váltása) Homológ rekombináció endonukleázok 5’ RecA, SSB ligáz helikáz Konzervatív, szakaszra specifikus rekombináció 5’ foszfodiészter kötés a rekombinázzal (Hin-invertáz) Nem konzervatív, szakaszra specifikus

rekombináció A vérben előforduló leggyakoribb T sejtek kifejeznek egy antigén receptort (TCR) ami két polipeptid (alpha-α és béta-β) heterodimerje. Ezek mindgyikét egy-egy gén kódolja, ami V, D, J és C génszegmentekből szerelődik össze. A klaszterekbe rendeződött génszegmenseknek számos variációja lehetséges. alpha lánc gén szegmensek a 14-es és béta lánc gén szegmensek a 7-es kromoszómán találhatóak. T cell receptors (TCRs) Gene segments Vα 50 Jα 50 Vβ 20 Jβ 13 Dβ 2 Any alpha with any beta chain Combinations 2.5 x 103 alpha chains 520 beta chains 1.3 x 106 A V, J és D szegmensek közötti kapcsolódási diverzitás és nukleotidok hozzáadása az N régióhoz megnöveli a variánsok számát legalább 2.5 x 107-re Az átrendeződésben résztvevő enzimek: rekombinázok (lymphocyta specifikus), exonukleázok és ligázok. A rekombinázok olyan heptamer és nonamer konzervált szekvenciákat ismernek fel, melyek a V, D

és J exonok közelében vannak. Két rekombináció aktiváló génről (RAG1 és RAG2) kimutatták, hogy befolyásolja mind az Ig, mind a TCR gének átrendeződését. Régió specifikus rekombináció (élesztő párosodási típus váltása) Humán transzpozonok DNS transzpozonok A humán genomban a DNS transzpozonokat inaktívnak tekintjük, mivel bennük mutációk akkumulálódtak a gerincesek filogenezise során. Érdekesség, hogy az enzim, ami az immunglobulinok (V-DJ rekombináció) és a T-sejt receptorok (a közbeeső szekvenciák kivágása) éréséért felelős, valószínűleg egy transzpozázból alakult ki. Humán transzpozonok Retrotranszpozonok Az ugráláshoz a sejt RNS polimerázára (II vagy III) van szükségük, segítségükkel átíródnak RNS-sé, míg az eredeti DNS kópia a helyén marad. Az RNS kópia reverz transzkriptáz segítségével DNSsé íródik át, és ez a DNS illesztődik be egy új helyre a genomban. • Autonóm (virális

szupercsalád) • LTR retrotranszpozonok – endogén retrovírusok • Non-LTR retrotranszpozonok - LINE • Nem-autonóm (nem-virális szupercsalád) • SINE other transposons (L1 or Kpn-) Kódol • egy reverz transzkriptázt • egy endunkleázt RNS pol II működése szükséges RNS pol III, RT és endonukleáz szükséges, ezek máshol kódolódnak Alu eredete: 7SL RNS