Chemistry | Biochemistry » Tripszin tisztítása affinitáskromatográfiával

BIOKÉMIA II – GYAKORLAT Tripszin tisztítása affinitáskromatográfiával  Tripszin    A pancreas exocrin funkciójának egyik terméke, mely inaktív proenzim (tripszinogén) formájában termelődik. A duodenumban lévő bázikus közegben limitált proteolízis segítségével aktiválódik (részben az intermedier π-kimotripszin autokatalízise révén). A duodenumban fejti ki proteáz aktivitását. Specificitása, hogy bázikus aminosavak (Lys; Arg) mellet hasítja a peptidkötést.  Affinitáskromatográfia      Különleges helyet foglal el az elválasztás technikában, ugyanis a biomolekulák tisztítása kémiai szerkezetükön alapul. Az izolálandó anyagot (pancreas homogenizátum) a gélre visszük fel, ahol a gél speciális NH 3 + és a tripszin –OOC csoportjai között sókötés alakul ki. Ekkor a pH 8.5 körüli Az elúció során

csökkenő pH-jú eluensekkel öblítjük át a gélt, miközben 1 ml-es frakciókat gyűjtünk. Kezdetben mindenféle „szennyező” fehérje jön le, majd pH 2.6 körül protonálódik a –COO csoport és leválik a tripszin a gélről. Így az utolsó frakciókban lesz a tripszin.  Fehérjekeresés     A 10 frakció mindegyikét 280 nm-en (UV!) fotometráljuk, ami az aminosavak általános abszorpciós maximuma, így azokban a mintákban fogunk magas extinciót kapni, ahol magas a fehérjetartalom. Miután megvannak azok a minták, amelyik fehérjéket tartalmaz, mindegyikhez BAPNA-t adunk, amelyikben Arginin aminosav található, amely melletti amidkötést a tripszin specifikusan hasítja. A termék a PNA (para-nitro-anilin) sárga színű, 410 nm-en fotometrálható. Sárga termék azokban a frakciókban keletkezik, ahol tripszin található. Ahol a legmagasabb a tripszinkoncentráció, ott lesz a 410 nm-en a legnagyobb az extinkció