Chemistry | Biochemistry » A növényi olaj biokémiai megközelítésben

A növényi olaj egy fontos forrás mind élelmezési, mind ipari célokra. A magvak olajtartalmának növelése fontos célja a n övénynemesítésnek és a b iotechnológiának. A kukoricaolaj a legfontosabb mellékterméke a nedves és száraz őrlésnek, és magas koncentrációban tartalmaz többszörösen telítetlen zsírsavakat, ami miatt egy kiváló energiaés esszenciális zsírsavforrás étkezési és takarmányozási szempontból. A magas olajtartalmú kukorica nagyon vonzó táplálék a könnyen feldolgozható energiatartalma miatt. Az olajtartalom növelése lehetséges hagyományos tenyésztés útján. Több példa is van a magas olajtartalmú kukoricapopulációk fejlesztésére többszöri szelekció útján. Azonban a kereskedelmi magas olajtartalmú hibridek csökkent magmérettel és terméshozammal bírnak. Sok kutató próbálkozott az olajtartalom és -minőség „mennyiségi jelleg lókuszok” (quantitative trait loci, QTLs) azonosításával, hogy

növeljék vagy módosítsák a növények olaj tartalmát az olajbioszintézis-útvonal gének manipulálásával. Zheng és mtai azonosítottak egy olaj QTL-t, és rámutattak, ha a kukoricamag fejlődése közben növelik az acil-KoA, diacilglicerol-aciltranszferáz (DGAT) mennyiségét, akkor kb. 40 % -os relatív növekedést érhetnek el az olajtartalomban. Az olajszintézis és –tárolás sok lipidbioszintézis-enzim aktivitásának koordinálását igényli. A szóban forgó gének komoly ismeretének ellenére csekély sikert értek el a transzgénikus úton történő olajtartalom-növelésben. A lipidkötőfehérjék expressziójának módosítása egy másik lehetséges út a lipidbioszintetikus-útvonalak módosítására. Azon gének, melyek termékei fizikai kapcsolatba lépnek a lipidekkel növelhetik a lipidtartalmat azáltal, hogy csökkentik a lipidbontás mértékét. A gabonamag-keménység lókusz (Ha) funkcionális részét a puroindoline a és b gének (PINa,

PINb) együttesen alkotják, és meghatározzák, hogy a mag puha vagy kemény textúrájú legyen. Hasonló a struktúrájuk a nem specifikus lipid-transzfer fehérjékéhez (ns-LTPs) Mindkét PIN gerincét egy 10 ciszteinmaradékból álló harmadlagos szerkezet alkotja, mely 4, hurkokkal elválasztott alfa-hélixből áll, 5 diszulfid-híddal stabilizálva. Egyedi triptofángazdag régiókat találtak, melyek lipid-kötő helyekkel rendelkeznek, és valószínűleg ezek a PIN funkcióhoz szükséges aktív helyek. Úgy gondolják, hogy ez egy non-stick közvetítő, mely lehetővé teszi a PIN-nek, hogy a mag érése közben a keményítő szemcsékkel borított fehérjékhez kapcsolódjon, a keményítő szemcsék és a környező fehérjemátrix közötti adhézió megakadályozására. A különböző PIN-tartalmú gabonák poláris lipidtartalma között szignifikáns különbség van. A növényi lipidek az olajtestecskékben tárolódnak, általában triacilglicerolok (TAGs)

formájában. Csak néhány fehérjének van köze a lipidtestecskékhez Az oleozinok ilyen fehérjék, az olajtetecskéket kis egységekként tartják, és a magszáradás során megakadályozzák ezek egyesülését. Siloto és mtsai megfigyelték, hogy Arabidopsisban fontos szerepük van az olajtestecskék méretének meghatározásában. A PIN-nak és az oleozinoknak egyaránt lipidkötő helyeik vannak. Habár az oleozinok szerves részét képezik az olajtestecskéknek, a PIN-ek normálisan csak a keményítőszemcsékhez kapcsolódnak. A kísérletben tesztelték, hogy az idegen PIN-ek expressziója képes-e növelni a kukoricamag olajtartalmát. A puroindolinok endospermium specifikusak, és csak a Triticaceae családban fordulnak elő. Ezért PINa és PINb kódoló szekvenciát helyeztek kukoricába, kukorica ubiquitin promóter mögé, majd tanulmányozták a mag összetételét és olajtartalmát. Anyag és módszer Plasmid konstrukció A PINa and PINb expressziós

vektorokat (pUbiPina és pUbiPinb) Krishnamurthy és Giroux (2001) munkája alapján készítették. Ezek a Pina-D1a/Pinb-D1a allélokat tartalmazzák, melyek megtalálhatók minden puhamagvú hexaploid búzában. A szekvenciákat PCR-ral felsokszorozták, majd BamHI-val emésztették, ezután BamHI-emésztett és foszfatázzal kezelt pAHC17 plazmidba ligálták, a kukorica ubiquitin promóterétől és intronjától downstream irányba. Minden plazmidot szekvenálták, hogy ellenőrizzék a helyes orientációt és ligálást. A pBAR184 konstrukciót a szelekcióhoz használták, ami kukoricca ubiquitin promóter-Bar gén kazettát tartalmazott szelektálható markernek, bialaphos és glufosinate herbicidekkel szembeni rezisztencia által. Kukoricatranszformáció Iowa State University Plant Transformation Facility (standard protocols) Hi-II embriogenikus kukorica vonal (A188 x B73 beltenyésztett vonalak) Génpuska Az éretlen embriókba génpuskával bevitték a plazmidokat

1:2,5:2,5 M arányban (pBAR184:pUbiPina:pUbiPinb). PCR-ral ellenőrízték a beépülést, és a herbicid-rezisztens PINa/PINb pozitív T 0 vonalakat a B73-as vonallal porozták be. A T 0 és a l eszármazó növényeket egy-egy levél 0,1% ammónium-glufozinát festésével tesztelték herbicid rezisztenciára. A T 1 növények heterozigóták voltak a transzgénikus lókuszra nézve, ezért önbeporzással hozták létre a T 2 nemzedéket. Minden T 2 egyedet tesztelték, hogy tartalmazzák-e mindkét PIN gént, és a Bar jelenlétére. A T 2 növényektől származó T 3 egyedek közül több mint 12 egymást követő permetezett növény volt herbicid-rezisztens, és homozigóta PINa/PINb illetve bar pozitív. 5 növény herbicid érzékeny volt, és homozigóta PINa/PINb illetve bar negatív. A T 0 és T 1 növényeket a Montana State University egyik üvegházába ültették. A T 2 és T 3 növényeket az üvegházba, és a Floridai Egyetem szántójába ültették 2007-ben. A T 4

növényeket a Floridai Egyetem földjére ültették 2008-ban. Minden vonalat két sorba ültettek, 90 cm-es sortávolsággal. Egy sorba 15 növ ény került 30 c m-enként Az önbeporzott növényekről begyűjtötték a csöveket, majd 37 °C-on mesterségesen szellőztetett inkubátorban szárították 3 napig, majd szobahőmérsékleten tartották állandó relatív páratartalom mellett (30%). A magok nedvességtartalma 10%-os volt A magok minőségének ellenőrzése: 1. ezermagtömeg 2. keményítő- és fehérjetartalom 3. csíratartalom 4. olajtartalom Minden érték 3 f üggetlen származású homozigóta pozitív vagy negatív T 3 vonalat reprezentált 2007-ben, és T 4 vonalat 2008-ban. Ugyanabból a vonalból származó 3 kukoricacső magjait összekeverték. Sothern-blot és Northern-blot analízis A Southern-blot-hoz homozigóta transzgén+ T 3 vonalból származó növények fiatal leveléből nyert DNS-t használtak. A genomikus DNS-t Riede és Anderson (1996)

munkája alapján izolálták. A P32-jelölt próbák készítéséhez a búza PINa vagy PINb kódoló szekvenciáit használták templátnak. A Northern-blot-hoz 21 nappal a pollináció után fejlődő magokból izolált RNS-t használtak. Az RNS-t Trizol protokoll szerint vonták ki Csírakinyerés és összes olajtartalom 3 T 3 és T 4 vonalat vizsgáltak. 10 g magbelet beáztattak 20 ml 0,2% SO 2 és 0,5% tejsav tartalmú vízbe 50 °C-on 48 óráig. Ezután a perikarpiumot és a csírát eltávolították csipesszel A csírákat 2 na pig 37 °C -on szárították, majd megmérték a tömegüket. A csíratartalmat ezután a kinyert csíra és a teljes mintatömeg hányadosával adták meg. Az olajtartalom megállapításához 25 g teljes magot vagy szikanyagot üvegcsövegbe (1 x 10 cm) helyeztek, és teflonos, menetes kupakkal fedték. A csírát teflon mozsártörővel őrölték Ezután 1 m l 5%-os metanolos kénsavat, 25 µl 0,2%-os metanolos butilált hidroxi-tulént és

300 µl tulént adtak minden csőhöz. 100 µg gliceril-triheptodekanoát 20 µg/µL hexán-oldatban (zsírsav-metilésztert képzés) 30s vortex 90 °C, 90 min Szobahőmérsékletre hűtés 1,5 ml 0,9%-os NaCl oldat 2 ml hexán Keverés 3000 rpm, 4 min Felülúszó új csövekbe (FAME) Hexán extrakció ismétlése 2x GC Eredmények A T3 növényeket PCR-ral tesztelték, hogy tartalmazzák-e a P IN géneket és a h erbicid rezisztenciát. 7 független transzgénikus eseményből 3-at választottak ki további elemzésre (UP6, UP8, UP9). Southern-blottal megerősítették, hogy vonal független transzformációs esemény eredménye. Minden band egyedi volt a különböző transzgénikus vonalaknál, tehát mindegyik független integrációs esemény eredménye. FIG1 Northern-blot A Heron típusú búza RNS-ét alkalmazták a j elintenzitás kvantifikálásához. A nemtranszgénikus kontroll nem tartalmazott PINa vagy PINb transzkriptumokat Az transzgénikus vonalakban az expresszió

mértéke sokkal kisebb volt, mint a búza kontrollban, az UP8 és UP9 1-2%-át expresszálta. A kvantitatív rela-time PCR eredménye szerint a P INa és PINb transzkriptumok mérete (700 bp) megegyezett a Heron-éval. ELISA ELISA-val mérték a transzgénikus magvak PIN tartalmát. FIG4 A puroindolinek növelik a csíranövekedést és az olajtartalmat a magméret változása nélkül. Table 4 Az eredmények összefoglalása Annak ellenére, hogy az olajtartalombeli különbségek láthatóak voltak mindhárom vizsgált transzgénikus eseménynél, lehetséges, hogy a PIN-eken kívül más magyarázat is van a csíra megnövekedésre. Bár valószínűtlennek tűnik, de lehetséges, hogy a beépülés módosítja azon gének expresszióját, melyek meghatározzák a cs íra vagy az olajtartalom karakterisztikáját. Ez a vizsgálat egy új lehetőségre mutat, ha összehasonlítjuk korábbi kutatásokkal, melyek az olajtartalmat a bioszintetikus útvonalak megváltoztatásával

próbálták elérni. Az itt elért eredményeket először más termények esetében is meg kell erősíteni. Azt jósolják, hogy a PIN-ek túlexpresszálása használható lehet az olajtartalom növelésében, gabonák esetében a csírméret növelésével, olajos magvú terményeknél pedig a sziklevél méretének növelésével