Biology | Genetics » A genetikáról

A Genetikáról 1. Mendeli elemzés A gén az öröklődés alapvető egysége, s a genetika a gén működés szabályszerűségeinek tanulmányozását helyezi fókuszpontba. Ezen belül foglalkozik a gének generációról generációra történő átadásával, a gének fizikai szerkezetével, a gének alternatív, vagy mutáns változatainak, az alléleknek az adott szervezetre gyakorolt hatásával, azaz a g enotípus és a gén(ek) által kialakított fenotípus kapcsolatával, valamint a homológ, anyai és apai kromoszómák között töréssel és újraegyesüléssel keletkező rekombinánsok tulajdonságaival. Mindezeket alapul véve a gén funkcionális, mutációs és rekombinációs egységként is felfogható. A gén helye a kromoszómán a lokusz, ami egy fizikailag pontosan meghatározott lokalizációt jelent. A gén koncepció kialakításához vezető úton az első lépéseket Gregor Mendel tette meg, miközben az öröklődés alapvető szabályszerűségeire

derített fényt. Az általa feltárt szabályok általános érvényűek, és mindez ideig feloldhatatlan ellentmondás nem merült fel használatuk során. Mendel kísérleteit borsóval végezte. Számos jellegzetes „bélyeget” tanulmányozott; ezek közül hét párt választott ki (1.1 ábra) Ezeket a jellegzetes, és egymástól elkülöníthető tulajdonság párokat mutató növényeket ún. tiszta tenyészetben állította elő, azaz a mag alakja, színe, a v irág színe, a h üvely formája, színe, a virág helye, valamint a növény magassága generációról generációra azonos módon öröklődött, amikor az utódok önbeporzással keletkeztek. A tulajdonság párokat hordozó növények (szülői, parental, P generáció) irányított beporzásakor ugyanakkor mindig az egyik szülőre jellemző jellegzetességet hordozó növényeket kapott (első utód, első filial, F1 generáció) (1.1 táblázat) Igen fontos tulajdonsága az F1 generációnak, hogy a mutatott

jellegzetesség, a fenotípus független a keresztezés irányától, azaz az egyik szülő petesejtjét a másik pollenjével termékenyítjük meg, vagy fordítva végezzük el a beporzást. Az F1 generáció egyedeinek önbeporzásakor a P generációra jellemző tulajdonságok újra előbukkantak, 3:1 arányban, mind a hét tulajdonság pár esetében (1.1 táblázat) Mindezen megfigyelések alapján egy modellt állított fel, ami az eddig vázolt viselkedést egyértelműen magyarázza (1.2 ábra) A modell megállapításai az alábbiak: 1. A ma géneknek nevezett öröklődő egységek, faktorok alakítják ki a fenotípust 2. A felnőtt borsó az adott jellegzetesség meghatározására két gént tartalmaz (apai és anyai); az F1 generációban megfigyelt egyik szülő tulajdonságát hordozó utódok domináns fenotípust alakítanak ki, függetlenül attól, hogy a recesszív fenotípus kialakítására alkalmas gént is hordozzák 3. A gén pár tagjai egyenlő mértékben

szegregálnak (válnak szét) az ivarsejtekben, így az ivarsejt csupán a gén pár egyik alléljét hordozza 4. Megtermékenyítéskor, zigóta kialakulásakor az utód egyed véletlenszerűen hordozza a szülői géneket Mindezek alapján Mendel első törvénye fogalmazható meg. Eszerint egy gén pár két tagja elválik egymástól, szegregál az ivarsejtek, gaméták képződése során, így az ivarsejtek fele a gén pár egyikét, fele a másikát hordozza. Megtermékenyítéskor e párok tagjai újra egyesülnek és a fenotípust együttesen alakítják ki. A fenti megállapításaink a genetika „nyelvén” tehát így szólnak: Az aa genotípusú élőlény homozigóta recesszív, az AA genotípusú homozigóta domináns. E két szülő keresztezése Aa heterozigótát, hibridet eredményez, ami fenotípusosan megkülönböztethetetlen az AA domináns homozigótától. Az Aa heterozigóta beltenyésztése/önbeporzása során az utódok ¼-e AA, ¼-e aa, 2x¼-e Aa

genotípusúvá válik (1:2:1 hasadás), ugyanakkor fenotípusosan, A dominanciája következtében 3:1 hasadás figyelhető meg. Voltaképp az előbbi monohibrid keresztezésekben megállapított szabályok alkalmazhatóak két bélyegükben eltérő tulajdonságokat hordozó növények keresztezésekor. Természetesen ebben az esetben is tiszta tenyészetek alkalmazásával végezhetjük el az immár dihibrid keresztezést. Mendel kísérleteiben ehhez zöld, sima, valamint sárga, rücskös borsót használt (1.3 ábra) A gaméták szintjén lejátszódó eseményeket a Punett tábla felhasználásával tudjuk szemléletesen követni (1.4 ábra), aminek segítségével a 9:3:3:1 dihibrid szegregáció levezethető. Mindezek alapján Mendel második törvénye fogalmazható meg: A gaméták képződése során egy gén alléljeinek szegregációja, szétválása, hasadása független egy másik gén alléljeinek szegregációjától. (Ez, mint később látni fogjuk, elsősorban

eltérő kromoszómákon elhelyezkedő gének esetében igaz). Mindezen egyszerű elvek természetesen alkalmazhatóak az emberi öröklésmenetek leírására, s voltaképp ebben rejlik a mendeli genetika univerzalitása. A családfa, pedigré felállításakor standard jelölést, szimbólumokat használunk (1.5 ábra) 2. Az öröklődés kromoszóma elmélete Gregor Mendel kísérleteit 1865-ben ismertette, hatásuk azonban a legszerényebb várakozástól is elmaradt; az akkori tudományos közvéleményt adatai felkészületlenül érték, magyarán nem értették meg (Naegeli). Kb négy évtizeddel később DeVries, Correns és Tschermak egymástól függetlenül Mendelével azonos következtetésre jutott, amit követően az öröklődés szabályszerűségeinek alapjait leíró nézetek széles körben elterjedtek. Így a XX század első évtizedeiben felmerült az igény az öröklődés anyagi alapjait biztosító hordozók, egységek azonosítására. A sejt ilyen

tulajdonságú alkotórészeit kromoszómaként sikerült azonosítani, s ezáltal az öröklődés kromoszóma elméletét felállítani. Ez azt mondja ki, hogy az öröklődő tulajdonságok kialakításához szükséges gének a kromoszómákon helyezkednek el. A ma már banálisnak tekinthető megállapítás forradalmi hatású volt a maga idejében, ugyanakkor felállításához hosszú út vezetett. E fejezetben ennek néhány állomásával ismerkedünk meg E helyen szükséges megismerkednünk az eukarióta sejtek osztódásának két eltérő módozatával. A számtartó osztódás, a mitózis a testi sejtekre jellemző, melynek terméke két, genetikailag azonos sejt keletkezése. Az ivarsejtek, gaméták keletkezését a m eiozis, számfelező osztódások teszik lehetővé, aminek eredménye négy, genetikailag eltérő sejt keletkezése (2.1 ábra) A mitózis morfológiailag megkülönböztethető, az osztódó sejt eltérő állapotait tükröző szakaszokra bontható. A

profázisban a kromoszómák tömörödni, kondenzálódni kezdenek, majd fénymikroszkópban láthatóvá válnak. A centromer kivételével a DNS szintézise lejátszódik A leány, sister kromatidákat a centromer tartja össze. Eltűnik a sejtmagvacska, a sejtmag membrán elkezd lebomlani, s a nukleoplazma egyesül a citoplazmával. A metafázisban a s ejtmag helyén kialakul a sejtmagi orsó, valamint a sejt két pólusának irányába mutató húzófonalak. A kromoszómák a sejt egyenlítői, equatoriális sikjában helyezkednek el. Az anafázisban a leány kromatidák szétválása kezdődik el; a páros egyik tagja a sejt egyik, míg a másik a sejt másik pólusa irányába vándorol. Ekkor lejátszódik a centromer osztódása is, s a kromatidák szétválása itt kezdődik. A telofázisban újra képződik a sejtmag hártya az elvált kromoszómák körül, a tömör, kompakt kromoszómák letekerednek, a sejtmagvacska újra láthatóvá válik. A fázis végén

lejátszódik a citoplazma osztódása is, új sejt membrán révén (2.2 ábra) A mechanizmusból adódóan az anya és leánysejt genetikailag egyenértékű, ugyanazzal a kromoszóma készlettel rendelkezik, általában. A meiozis két sejtosztódást, meiozis I-et és meoiozis II-őt jelent. A meiocytában már lejátszódik a még részleges DNS megkettőződése, s bár ebben az esetben is pro- meta- ana- és telofázisok váltakoznak, a mitózishoz viszonyítva komplikáltabb eseménysor játszódik le (2.3a és 23b ábrák) Ezek közül kiemelkedik az összetett és időigényes profázis I, amit még további egységekre szokás osztani. Ezek a leptotén, zygotén, pachytén, diplotén és a diakinezis. A leptotén szakaszban a kromoszómák vékony szálakként válnak láthatóvá, melyek chromomerákat tartalmaznak, egy gyöngyfűzérhez hasonlóan. A zygoténben a kromoszóma készlet, komplement homológ tagjai párokat, szinapszisokat alkotnak. A homológ kromoszómák

nukleotid sorrendjének nagyfokú hasonlósága nyilvánvalóan meghatározó szerepet játszik egy összezáródó zipzár szerkezetéhez hasonló struktúra létrejöttében. Végső állapotában az ún synaptonemális komplex keletkezik, amit a homológ kromoszómák határolnak kétoldalt. A pachytenben válik teljessé a szinapszisok képződése, melyek jellegzetes alakja alapján az egyes párok megkülönböztethetőek. A diplotenben kereszt alakú képződmények, chiasmák jönnek létre a nem-leány kromatidák között. Minden kromoszóma pár legalább egy chiasmát tartalmaz Ennek eredményeképp a nem-leány kromatidák, azaz az apai és anyai kromatidák precíz törése és újraegyesülése játszódik le, vagy más szóval rekombináció történik. Ennek jelentőségére a későbbiek során többször kitérünk. A diakinezisben további kromoszóma kondenzáció játszódik le, mintegy előkészítve és megkönnyítve a meiotikus osztódáshoz szükséges

mozgást, vándorlást. A metafázis I-ben a sejtmag membrán és a sejtmagvacska lebomlanak, s a h omológ párok egyenlítői síkban helyezkednek el, de centromerjük – mint mitózisban – még nem osztódik. Anafázis I-ben, a mitózishoz hasonlóan, a kromoszómák mozgása kezdődik meg a sejt ellenkező pólusai felé. Telofázis I-ben zárul a folyamat két sejtmag képződésével. A két sejtmag genetikailag nem egyenértékű, mivel vagy az apai, vagy az anyai leány kromatidákat tartalmazzák, szemben a mitózis során keletkező két sejtmaggal, melyek apai és anyai nem leány kromoszómákat tartalmaznak. A profázis II-ben a kromoszómák erőteljesen kondenzálódnak. Metafázis II-ben egyenlítői síkban rendeződnek és részben elválnak a kromoszóma párok egymástól. Anafázis II-ben a cen tromerek egymástól elválnak, és a s ejt pólusai felé mozdulnak el a kromoszómák. Telofázis II-ben négy sejtmag képződik (tetrád), melyek mindegyike nagy

valószínűséggel genetikailag eltérő tulajdonságú, azaz apai és anyai kromoszómák véletlenszerű keverékét hordozzák, melyek között rekombináns kromoszómák is találhatóak, azaz egyetlen kromoszóma mind apai, mind anyai eredetű. A meiozis ilyen mechanizmusa egy fajon belül tehát a sokszínűséget biztosítja az utódok között. A mitózis és a meiozis lépéseinek sematikus ábrázolását tartalmazza a 2.4 ábra Eukariótákban a genetikai nem meghatározás egyik lehetséges módja eltérő alakú, heteromorf kromoszómákhoz (X, Y) kötődik. E két kromoszóma eltérő mérete és információtartalma számos eljárással jól megkülönböztethető (2.5 ábra) Ebből adódóan az X/Y nemi kromoszómákat hordozók (ember esetében férfiak) X kromoszómás génjeik csupán egy példányban vannak jelen, azaz ezen gének tekintetében haploidok, hemizigóták. Emiatt Mendel első törvénye, a bélyegek kialakításáért felelős gének szétválása

nem érvényesülhet, így az öröklésmenet a mendelitől eltérő, és látszólagos anomáliát mutat. Nem véletlen tehát, hogy a kromoszóma elmélet genetikai, citológiai igazolása is nemi kromoszómákhoz kapcsolódik, ami egy azóta is igen hatékony modell szervezet, a Drosophila alkalmazásához kötődik. Morgan fehér szemű hímeket keresztezett piros szemű nőstényekkel. Az utódok mind piros szeműek voltak, azaz a piros szemszín domináns a fehérrel szemben. Az utódok aránya eltérő volt, ha ebből a keresztezésből származó nőstényeket piros vagy fehér szemű hímekkel keresztezte, illetve amikor fehér szemű nőstényeket piros szemű hímekkel keresztezett. Ezek az eredmények az alábbiak szerint magyarázhatóak. A Drosophila normális piros szemszínét kialakító gén mutációja fehér szemszínt eredményez. A gént az X kromoszóma hordozza; nőstények X/X, hímek X/Y kromoszóma szerelvénnyel rendelkeznek. Így a hímek X

kromoszómájukat kizárólag anyjuktól, az Y-t kizárólag apjuktól öröklik. Nőstények ezzel szemben egy-egy apai és anyai X kromoszómát hordoznak Mindezek figyelembevételével a nemhez kötődő öröklésmenet anomáliái megmagyarázhatóak, mint azt a 2.6 ábra mutatja néhány kombinációban 3. A mendeli elemzés általánosítása, kiterjesztése Habár a gén párok/allél párok Mendel által leírt viselkedése, azaz szétválásuk és szabad kombinációjuk törvényei jól követhető a genetika egyszerű, ám hatékony eszközeinek használatakor. Ezeket az eseményeket akkor észleljük, amikor egy-egy tulajdonság kialakításáért egy gén pár felelős, azaz két alléllel rendelkezik az adott szervezet. Mindehhez társul a dominancia viszonyok egyértelmű érvényesülése, a domináns/recesszív heterozigóta domináns fenotípusa. Ezzel szemben, amikor a dominancia viszonyok nem egyértelműen nyilvánulnak meg, vagy egy tulajdonság kialakításáért

kettőnél több allél felelős, vagy egy tulajdonságot egynél több gén alakít ki, vagy legalább két gén összehangolt kölcsönhatása következtében figyelhetünk meg egy fenotípust, akkor a nemhez kötött öröklésmenet látszólagos anomáliájához hasonló helyzettel szembesülünk. Ilyenkor az észlelt jelenségek interpretálása további elemeket igényel, ugyanakkor az öröklődés szabályai nem sérülnek, azok univerzalitása továbbra is érvényes. A homozigóta fenotípusokhoz viszonyítva a heterozigóta fenotípus alapján vonjuk le következtetéseinket. Nem teljes, inkomplett dominanciát például a fehér és piros virágú csodatölcsér keresztezésekor figyelhetünk meg; az F1 generációban rózsaszín szirmú virágokat kapunk, átmenetet a két fenotípus között. A rószaszínű virágok beltenyészete, önbeporzása ¼ rész fehér, ¼ r ész piros, 1/2 rész rózsaszín utódot eredményez, így érvényesül az 1:2:1 hasadás (3.1 ábra)

A heterozigóta fenotípus példázza az M-N emberi vércsoportok együttes, kodominanciáját. M/M és N/N homozigóták az M vagy N antigént hordozzák vörös vérsejtjeik felszínén, míg M/N heterozigóták mindkettőt. A sarlósejtes anaemia a vörös vérsejtek betegsége, ami a hemoglobin A fehérjét kódoló gén mutációja következtében alakul ki (3.2 ábra) Az S tulajdonságú mutáns hemoglobin oxigén szállítására csupán korlátozottan alkalmas, így súlyos hypoxiához/anoxiához vezető, halált is okozó betegség. Itt is kodominancia figyelhető meg: A/A homozigóták egészségesek, S/S homozigóták súlyos vérszegénységben szenvednek, míg A/S heterozigótákban e tünetek egy légkörnél alacsonyabb légnyomáson jelentkeznek. Töbszörös allélizmusról akkor beszélünk, ha egy tulajdonság kialakításában kettőnél több allél vesz részt. Diploid szervezetek, mint az em ber esetében a j elenség egy nagyobb populáción belül

érvényesül. Példa rá az ember AB0 vércsoportok kialakításáért felelős I gének viselkedése. Az i/i homozigóták 0, IA/IA vagy IA/i A, IB/IB vagy IB/i B, míg IA/IB AB vércsoportúak, így a három allél 4 fenotípust eredményez; ebből két allél domináns és egyben kodomináns, egy recesszív (3.3 ábra) Homozigóta letális allélek is alkalmasak a mendeli arányok megváltoztatására. Sárga szőrű és fekete szőrű egerek keresztezése sárga és fekete utódokat eredményezett 1:1 arányban. Ebből következik, hogy a sárga egerek s/f heterozigóták. A feketék f/f homozigóták voltak, s a sárga domináns a feketével szemben. Az s X s keresztezés azonban s:f=2:1 arányt mutatott Ennek oka az s/s homozigóták in utero letalitása, akik magzati korban elpusztulnak (3.4 ábra) Egy további tulajdonsága az s karakternek pleiotrópiája: Egy gén két vagy több tulajdonságot is befolyásol, a szőr színe mellett az életképességet is. Hasonló

öröklésmenetet mutat a Manx macska esete is, amely szintén homozigóta letális allélt hordoz, ami a f arok hiányával jár együtt (3.5 ábra) A helyzet még komlikáltabbá, ám nem reménytelenné válik, amikor egy-egy tulajdonságot nagyszámú gén határoz meg. Ebbe a k örbe tartoznak az emlősök szőr színét meghatározó, általunk ismert A, B, C, D és S gének (3.6 ábra) Az A gén a szőrszálon belül a festékanyag (melanin) eloszlása felett őrködik. Az A allél agouti (sárgás színű), míg az a allél fekete színt eredményez (3.7 ábra) Ennek letális, pleiotróp alléljáról már volt szó az előbbi paragrafusban. A B gén a pigment színét határozza meg. B fekete, b barna színt eredményez B A-val kombinálódva agouti, míg aa homozigótákban fekete színt ad. Az A a B b X A a B b (agouti) keresztezés az alábbi arányokat adja: 9 A – B – (agouti) 3 A – bb (fahéj) 3 a a B – (fekete) 1 a a b b ( barna), így tehát ezen gének

vonatkozásában a mendeli arányoktól eltérést nem tapasztaltunk. A C gén C allélje a szín kialakításáért felelős gén kifejeződését megengedi, míg a c allél megakadályozza. Más szóval a c/c homozigóta „felette álló”, episztatikus más szín génekkel szemben. Emiatt a c/c homozigóta egyedben pigment termelés nincs, így albino Az albinizmus az állatvilágban széles körben megfigyelt jelenség, s az emberre is vonatkozik (3.8 ábra) A C gén hőmérséklet-érzékeny allélje a ch (Himalaya), amely a t est hidegnek jobban kitett tájékain teszi lehetővé melanin felhalmozódását, ami a napfény fokozott abszorpcióját eredményezi (3.9, 310 ábrák) Episztatikus gének esetében azonnal felmerül a gyanú, hogy alkalmasak a m endeli arányok megváltoztatására. Végezzük el az alábbi keresztezést: B b C c X B b C c (fekete), ami az alábbi arányokat adja: 9 B – C – (fekete) 3 b b C - (barna) 3 B – c c (albino) 1 b b c c (albino),

azaz öröklésmenetünk 9:3:4 fenotípusos arányban szegregál; az ilyen pedigrét recesszív episztázisnak nevezzük. A labradori terelőkutya esetében is – a c c homozigótizmushoz hasonlóan – az e e homozigótizmus mind a B B mind a b b esetében a pigment lerakódást gátolja, ami a fekete:barna:arany szőr színek 9:3:4 arányú öröklésmenetét eredményezi (3.11 ábra) A D gén a pigmentáció erősségét szabályozza. A D D és a D d genotípusok jól kivehető pigmentációt eredményeznek, míg a d d f enotípus ennek „hígított” változatát okozza (3.12 ábra). Az ilyen típusú viselkedés a módosító gének sajátossága Az S gén a pigment eloszlást ellenőrzi a test egészén. Az S S vagy S s genotípus foltosodást nem okoz, az s s genotípus - az albino kivételével – ún. piebald foltosodást okoz (313 ábra) Egy adott genotípus kifejeződése sok esetben nem autonóm, más gének termékeinek kölcsönhatása képes befolyásolni

megnyilvánulását. A fent említett módosító és episztatikus gének példa erre az állításra, emellett még szokás a környezetet, mint módosító tényezőt említeni. A penetrancia ebben a kontextusban egy populáción belül százalékos arányban határozza meg azt, hogy a népesség hanyad részében érvényesül az adott genotípusra jellemző fenotípus. Az expresszivitás egy egyedre vonatkozó jellegzetesség, ami egy adott genotípusnak az egyén szintjén megfigyelhető fenotípusos kifejeződés mértékét jelenti (3.14 ábra). 4. Az eukarióta kromoszóma térképezés alapjai Mint korábban már láttuk, számos esetben tapasztalható eltérés a k lasszikus mendeli 1:2:1, 9:3:3:1 arányoktól. Ennek okaiként említettük a nemhez kötött öröklődést, gén kölcsönhatásokat, többszörös allélizmust, gén duplikációt, stb. Érdemes még felidézni, hogy a 9:3:3:1 hasadás akkor érvényesül, ha a vizsgált gének eltérő kromoszómákon

helyezkednek el. Ellenkező esetben fennálló viszonyokat taglalja e fejezet Közel száz éve a s zagos bükköny tanulmányozása során érdekes jelenséget jegyeztek fel, amikor a virág színét és a pollen alakját befolyásoló gének öröklésmenetét tanulmányozták, ugyanis az elvárt arányoktól teljesen eltérő eredményeket kaptak (4.1 táblázat) A Drosophila szem színét és a s zárny méretét kialakító gének esetében (4.1 ábra) a rendelkezésre álló információk alapján megmagyarázhatatlan jelenséggel szembesültek a kísérletezők: Szülők, P: pr+ pr+ vg vg X pr pr vg+ vg+ F1: pr+ pr vg+ vg Teszt keresztezés, testcross: pr+ pr vg+ vg X pr pr vg vg Az alábbi arányokat eredményezte: pr+ vg+: 157 egyed pr vg: 146 egyed pr+ vg 1165 egyed pr vg+ 1267 egyed összesen: 2735 egyed (4.2 ábra) Azonnal szembetűnő, hogy ez a számsor is lényegesen eltér a 9:3:3:1 arányoktól. A testcross alkalmazása azért lényeges, mert az egyik szülő

kizárólag recesszív alléljeivel járul hozzá az utód genotípusának kialakításához, így a másik szülőben lezajló meiozis eseményeit követhetjük könnyűszerrel az utódok elemzésekor. Számos egyéb gén pár alkalmazása során Morgan és munkatársai hasonló eredményeket figyeltek meg. Emiatt Morgan javasolta, hogy a tanulmányozott gén párok egy kromoszómán helyezkednek el, egymással kapcsoltak. A nem szülői kombinációk keletkezésével kapcsolatban feltételezte, hogy a meiozis során a nem-sister kromatidák között megfigyelhető átkereszteződés, a chiasma keletkezése biztosítja az új, nem szülői, rekombináns kombinációk megjelenését (4.3 és 44 ábrák) Mindezek alapján elmondhatjuk, hogy egyazon kromoszómán elhelyezkedő gének egymással kapcsoltak, s a meiozis során az eltérő információtartalmú nem sister kromatidák, vagy másképp anyai és apai kromoszómák közötti átkereszteződés, crossover, rekombináció

következtében új, eddig nem létező információtartalmú, rekombináns kromoszómák megjelenésére nyílik lehetőség (4.5 ábra) A rekombináció ezen módját intrakromoszomálisnak, kromoszómán belülinek nevezzük, míg eltérő kromoszómán elhelyezkedő gének szabad kombinációja során keletkező nem szülői kombinációk megjelenését kromoszómák közöttinek, interkromoszomálisnak (4.6 és 47 ábrák) Morgan és tanítványai észrevették, hogy a k apcsolt gének között észlelt rekombinációs gyakoriság (recombination frequency, RF), ami a rekombinánsok és az összes utód számának a hányadosa x 100%, változó értékeket mutat. Ennek felismerése vezetett a g enetikai térképezés koncepciójához, ami a g éneknek egymáshoz viszonyított távolságát tükrözi a kromoszómán. A chiasma keletkezésének mechanizmusa, fellépésének nem túl gyakori volta, valamint az a tény, hogy egy eukarióta kromoszóma több ezer gént is hordozhat, a

gének között fellépő rekombináció egy lényeges tulajdonságára enged következtetni. Eszerint közel elhelyezkedő gének között átkereszteződés kisebb, egymástól távolabb találhatóak között nagyobb gyakorisággal lép fel. Ezen az alapon definiálható a genetikai térkép egysége; ez két gén között azt a távolságot jelenti, ahol száz meiotikus termék között egy rekombináns keletkezik. A definíció alapján tehát a térkép egység egy százalékos rekombinációs gyakorisággal egyenlő. Más mértékegységekhez hasonlóan, Morgan tiszteletére, egy térkép egységet (map unit, mu) egy centimorgan-nak (cM) neveztek el (4.8 ábra) A genetikai térkép egy lényeges tulajdonsága additivitása. Ha A és B gének térképtávolsága 5 cM, és A valamint C gének távolsága 3 cM, akkor B és C távolsága 2 va gy 8 cM (4.9 ábra) Ez a kérdés egy további kétpontos keresztezéssel dönthető el, Bb és Cc allél párok alkalmazásával. A gén

térképezéssel megállapított helye a genetikai térképen a lokusz. A Drosophila szem színt és a s zárny méretét meghatározó géneket összesen 2735 utódot eredményező kísérletben tanulmányozták fenti példánkban. Definíciónk szerint, ha a két gén egy térkép egységnyi távolságra helyezkedne el, mintegy 27 r ekombináns utódot kapnánk. Ezzel szemben 303 a rekombinánsok száma, így a térkép távolság közöttük 303/2735=0.11, azaz 11 térkép egység, 11 cM, míg a rekombinációs gyakoriság 11% (4.8 ábra) Az eddigiek során kettős heterozigóta, dihibrid, két pontos keresztezésekről esett szó. Legyen három gén sorrendje A B C. Mint fenn láttuk, sorrendjük meghatározásához három két pontos keresztezés szükséges. Ez egyetlen hárompontos keresztezéssel helyettesíthető: A B C X a b c , ahol az Ab, Bc Ac stb. egyes rekombináns kategóriák a lokuszok közötti távolság függvényében jelentkeznek. Ezen rekombináns

kategóriáknál lényegesen kisebb gyakorisággal jelentkeznek az A b C és az a B c kettős rekombináns kategóriák (4.7 ábra) Ezek megjelenése azonnal a gének sorrendjére utaló információ (4.10, 411 ábrák) Intrakromoszomális rekombináció esetében soha nem figyeltek meg 50%-nál nagyobb rekombinációs gyakoriságot; ugyanakkor kellően nagy távolságban elhelyezkedő kapcsolt gének esetében a szülői és nem szülői kombinációk száma közel azonos lehet, így nem lehet eldönteni a rekombináció intra- vagy interkromoszomális voltát. A X2 (ejtsd: khí négyzet) próba segít ennek az állapotnak a kiküszöbölésében, az alábbi lépések szerint. Null hipotézisünkben feltételezzük a kapcsoltság hiányát, ami 1:1:1:1 szegregációt jelent. X2 rész értékeit minden egyes kategóriára kiszámoljuk. A kísérletileg megfigyelt (M) és a null hipotézis szerint várt (V) adatok felhasználásával: X2=(M-V)2/V adatoknak az összes kategóriára

vonatkozó összegével. Meghatározzuk a szabadsági fokok számát, ami az összes kategória száma –1 (egy két pontos keresztezés esetében 4-1). A szabadsági fokok számának megfelelő sorban leolvassuk a kalkulált X2 értékhez tartozó p valószínűségi értéket egy táblázatból. A null hipotézist 5%-nál nagyobb p érték esetében elfogadjuk, ennél kisebb értékek esetében elvetjük. 6. Kromoszóma mutációk: Kromoszóma szerkezeti változások A géneket ért mutációk a kromoszómának csekély részét érintik, így közvetlen kimutatásuk a citogenetika eszközeivel nem lehetséges. A kromoszóma szerelvény mikroszkópos tanulmányozása bizonyos esetekben észrevehető változásokra vet fényt; ilyenkor a változás a kromoszóma előbbinél lényegesen nagyobb részére terjed ki. Ugyanakkor a közvetlenül nem észrevehető kromoszóma szerkezeti változás, a gén mutációkhoz hasonlóan, genetikai eszközökkel kimutatható. A kromoszómák

megkülönböztetésére morfológiájuk nyújt lehetőséget. A kromoszómák mérete általában eltérő egy-egy szervezetben. A kromoszóma centromer helyzete alapján lehet telocentrikus (a centromer végállású), akrocentrikus (nem közép- vagy végállású), valamint metacentrikus (középen elhelyezkedő). A sejtmagvacska (nucleolus) a riboszomális RNS-t tartalmaz, melynek lokusza, a kódoló gének helye a nucleolaris organizátor régió, ami citogenetikailag felismerhető a határoló befűződésről. Legalább egy kromoszóma hordozza A Feulgen festék DNS-hez kötődik, és erőteljesen festi a génműködésből többé-kevésbé kizárt kromoszóma szakaszokat, a heteroeukromatint, míg a kevésbé kompakt, működő rész, az eukromatin halványabban festődik. A heterokromatin lehet konstitutív, például a centromer környékén, vagy fakultatív. Ugyanakkor ezek az alaktani bélyegek segítséget nyújthatnak a kromoszóma szerkezeti változások, a

deléció, a duplikáció, az inverzió és a transzlokáció megítélésében. Egy kromoszóma szakasz elvesztése a deléció, vagy deficiencia. Keletkezésükhöz két helyen beálló kromoszóma törés szükséges, akár interstíciális, akár terminális delécióról van szó (1. ábra). Ez utóbbi esetében is még működőképes kromoszómát csak akkor kapunk, ha a végén elhelyezkedő szerkezeti elem, a telomer nem sérül. Génen belüli, citológiailag ki nem mutatható deléció csupán egy gént érint. A deléciók általában jellemző tulajdonsága, szemben a pontmutációkkal, hogy nem revertálnak, akár egy vagy több gént érintenek. Homozigóta állapotban gyakran letálisak. Több gént érintő deléciók homozigóta állapotban letálisak, míg a normál homológgal együtt életképességet biztosíthatnak. Meiozis során jellegzetes megjelenésük a deléciós hurok (2. ábra) A deléció területére eső recesszív gének megnyilvánulása a

pszeudo-dominancia. A deléció közelében elhelyezkedő gének esetében a rekombinációs gyakoriság lecsökken. Deléciók alkalmasak genetikai térképezésre pszeudodominanciára alapozva (3 ábra) Az 5 hum án kromoszóma rövid (p) karjának terminális deléciója a macskasírás (cri du chat) szindrómát okozza, csecsemőkorban halálos (4. ábra) Bizonyos daganatok esetében is kimutathatók deléciós kromoszómák (5. ábra) Duplikáció egy kromoszóma részlet megkettőződését jelenti, s ebben a paragrafusban a közeli duplikációk tulajdonságait vesszük szemügyre. (Duplikáció történhet egy kromoszómán belül nagy távolságban, illetve a megkettőződött kromoszóma szakasz más kromoszómára is kerülhet). Amikor a megkettőződött szegment azonos irányú tandem, ha ellentétes reverz duplikációról beszélünk (6. ábra) Kettős rekombináció, melynek fellépte kis távolságokon belül meglehetősen csekély valószínűségű, mindkét

duplikáció esetében az eredeti, vagy deléciós kromoszómák képződéséhez vezethet (6. ábra) Beltenyészetben duplikációk homozigótává válhatnak. Ilyenkor aszimmetrikus crossover felléptére nyílik lehetőség, mely egy normál és egy triplikációt hordozó kromoszómát eredményez (7. ábra) Erre példa a Drosophila Bar duplikáció, ami fenotípusosan résszeműséget okoz, míg az aszimmetrikus rekombináció kettős Bar genotípust, és a fenotípus erősödését okozza (8. ábra) A duplikációk jelentősége a gén diverzifikáció jelenségében figyelhető meg, ami duplikációt követően új allélek, vagy hasonló szerkezetű, de eltérő funkciójú gének keletkezését jelenti, s amire nagyon sok példát láthatunk, mint pl. a globin gének esetében Emberben duplikációk fellépte igen ritka. Inverzió akkor keletkezik, ha egy kromoszómán egyszerre két törés keletkezik, a közbülső fragment 180 fokkal elfordul, majd a három fragment újra

egyesül. Paracentrikus az inverzió, ha a centromer e területen kívül esik, s a kromoszóma kar arányok nem változnak. Pericentrikus inverzióban a centromer is érintett, emiatt a kromoszóma kar arányok is megváltoznak. Inverzióban a genetikai anyag, a D NS mennyisége nem változik, emiatt általában életképes a h ordozó egyed. Heterozigóta állapotban citológiai megjelenése az inverziós hurok (9. ábra) Ezen belüli rekombináció dicentrikus híd és acentrikus fragment (elvész) keletkezéséhez vezet, majd mormál, inverziós és deléciós kromoszómák keletkeznek paracentrikis inverzió esetén (10 ábra). Pericentrikus inverzió esetén meiozisban normál, inverziós, valamint duplikációt és deléciót egyaránt hordozó kromoszómák keletkeznek (11. ábra). Míg az inverziós kromoszómára erőteljes szelekciós nyomás nem nehezedik, addig rekombinációs termékei hátrányosak, viselőik általában elpusztulnak (12. ábra) E tulajdonságuk

alapján az inverziós kromoszómákat balanszereknek nevezzük, mivel alkalmasak a rekombináció nélküli állapot fenntartására, így kiegyensúlyozott letális mutációt hordozó kromoszóma változatlan, rekombináció nélküli fenntartására, szelekciójára és elkülönítésére. Nem homológ kromoszómák közötti részek kicserélődése során transzlokációs kromoszómák keletkeznek. Ha az esemény egyidejűleg két nem homológ kromoszómát érint, beszélünk reciprok transzlokációról (13. ábra) Két normális és két transzlokációs kromoszómát hordozó heterozigóta esetében meioziskor a homológ párosodás során fellépő affinitás következtében jellegzetes konfiguráció alakul ki, amiben nem négy, hanem nyolc kromatida vesz részt (14. ábra). Habár a m eiozis során a cen tromerek térben elválnak egymástól, a M endel második törvényében meghatározott szabad kombináció lehetősége fennáll. Közeli, szomszédos (adjacent-1)

szegregációkor a normális (N) és transzlokációs kromoszómákat (T) hordozó meiociták keletkeznek, míg alternáló szegregációkor a n ormál és a transzlokációs kromoszómák egymástól elválnak (14. ábra) Az alternáló szegregáció termékei életképesek, míg a közeli szegregációé gyakorta életképtelenek, mivel bennük duplikációs-deléciós régiók találhatóak. A Down szindróma kialakulásának egyik módja a 21-es kromoszóma nondiszjunkciója következtében fellépő triszómia (Non-diszjunkció során a homológ kromoszóma pár meiozisban nem válik el egymástól; emiatt az egyik meiotikus termék ebből kettőt, a másik egyet sem hordoz). Ugyanakkor a 21-es kromoszóma transzlokációja is alkalmas a tünet együttes kiváltására szomszédos, adjacent szegregációban , a mikor a 21-es kromoszóma vonatkozásában parciális triszómia lép fel (15. ábra) Minden bizonnyal a humán 2-es kromoszóma is egy transzlokációs termék. A

csimpánz, a gorilla és az orangutan kariotípusa itt mutat lényeges különbséget, mivel bennük a humán 2es-re jellemző mintázat két külön kromoszómán mutatható ki. 7. Kromoszóma számbeli változások A kromoszóma mutációk másik nagy csoportját képezik a kromoszóma számban beálló változások. Két lényeges csoportja ezen mutációknak vagy a kromoszóma szerelvény egészét, vagy ennek csupán egy részét, de legalább egy kromoszómát érint. Diploid eukarióta szervezetek kromoszóma száma 2x, mely két monoploid kromoszóma készletből (x) tevődik össze. A monoploid kromoszóma készlet egész számú többszörösét hordozó szervezetek euploidok; poliploid szervezetek kettőnél több kromoszóma készlettel rendelkeznek, a 3x triploid, a 4x tetraploid, az 5x pentaploid, stb. A haploid kromoszóma szám, n, a gamétákban elhelyezkedő kromoszómák számát jelenti; egy diploid szervezetben tehát n=x, egy tetraploid esetében viszont n=2x

(7.1 ábra) Monoploid szervezetek a normális életciklus során keletkezhetnek, míg más esetben az életciklus spontán vagy indukált zavarai következtében is felléphetnek. Normális életciklusuk során a hím méhek, darazsak és hangyák monoploidok. Létrejöttük parthenogenezissel magyarázható, amikor a nem megtermékenyített petesejt kezdi meg az egyedfejlődést. Ivarsejtek a homológ kromoszóma pár hiányában meiozisban nem jöhetnek létre. Annak a valószínűsége, hogy mindegyik kromoszóma ugyanarra a pólusra vándoroljon (1/2)x-1, ahol x a monoploid kromoszóma szám. Ez a mechanizmus rendkívüli módon nem hatékony; ezt úgy kerülik meg, hogy ivarsejteket mitózissal képeznek. A monoploidia a növényi genetikában és a nemesítésben bír komoly jelentőséggel. Diploid növény pollenjéből haploid, egyben monoploid sejttenyészet hozható létre, amiből teljes növény nevelhető fel (7.2 ábra) Haploid szervezetek esetében a genotípus

azonnal megnyilvánul, így kívánatos tulajdonságok (növényvédőszer elleni rezisztencia) viszonylag könnyen szelektálhatók, illetve mutációval indukálhatók. A monoploidia okozta sterilitást indukált diploidizációval lehet megyszüntetni kolhicin segítségével. Ez a drog megakadályozza a mitotikus orsók képződését, így két kromoszóma készlettel rendelkező homozigóta diploid sejtek keletkeznek, amikből fertilis növények állíthatók elő (7.3 ábra) Poliploid szervezetek körében megkülönböztetjük az egy faj kromoszóma számának többszörösét tartalmazó autopoliploid, valamint az eltérő, de közeli fajokból keletkező allopoliploid organizmusokat. Ez utóbbi esetben a részlegesen homológ kromoszómákat homeologoknak nevezzük. Triploidok spontán módon is keletkezhetnek, ugyanakkor célzottan is előállíthatóak, egy 4x (tetraploid) és egy 2x (diploid) keresztezéssel. A triploidok sterilek; ennek oka, hasonlóan mint a monoploidok

esetében, a kromoszóma párosodás anomáliái meiozisban. A három homológ kromoszóma trivalensen kapcsolódik össze, majd uni- és bivalensként válnak szét (7.4 ábra) E két lehetőség fellépte azonos valószínűségű, s a diploid és a haploid kromoszóma szám közötti átmenetet, aneuploidot eredményez. Míg egy triploidban a gének arányai nem változnak, addig aneuploid esetében az eddigi sztöchoimetria felborul, a genom kiegyensúlyozatlanná válik, aminek egyik következménye sterilitás. A jelenség ugyanakkor a fogyasztás szempontjából előnyös tulajdonsággal ruházza fel a triploid növényeket, melyeknek nincs magjuk (banán, szőlő, dinnye). A 4x genomú autotetraploidok véletlenszerűen is keletkezhetnek, ugyanakkor kolhicinnel a 2x genom irányítottan kettőzhető meg. Lévén 4 páros szám, a mono- és triploidok esetében megfigyelt anomáliák ritkán lépnek fel (7.5 ábra) Egy AA aa heterozigóta tetrapliodban a normális esetben

fellépő szabad allélkombináció következtében, azaz minden lehetséges allél konfigurációt azonos valószínűségűnek tekintve, az Aa, AA és aa gaméták keletkezésének aránya 8:2:2, vagy 4:1:1. Homozigóta gaméta keletkezésének valószínűsége így 1/6, zigótáé 1/6x1/6= 1/36, azaz 35:1 fenotípusos arányokat figyelhetünk meg, ha A teljes mértékben domináns (7.6 ábra) Az autotetraploid szervezetekre jellemző az erőteljesebb növekedés, robosztusabb megjelenés (Lásd: Címoldal). A klasszikus allotetraploid szervezet előállítása a káposzta (Brassica) és a retek (Raphanus) keresztezésével Karpacsenko nevéhez fűződik. Mindkét szervezet diploid, haploid kromoszóma számuk (n) 9. A keresztezés ritka eseményeként az egyébként majdnem steril hibrid magokat termelt, 36 kromoszómával. Ennek keletkezése az egyébként 18 kromoszómát tartalmazó genom spontán megkettőződése során vált lehetségessé. Végső soron egy új faj

keletkezett, a Raphanobrassica (7.7 ábra) Egy igen jelentős poliploid szervezet a hexaploid búza (2n=6x=42). Keletkezésének rekonstrukcióját a 78 ábra mutatja három, az A, a B és D genomok egyesülése során, amihez két megkettőződés szükséges. Poliploidia állatokban is előfordul, ilyen pl. a lazac és a pisztráng Ember poliploidiája in utero letális. Aneuploidia a vad típushoz hasonlítva egy, legfeljebb néhány kromoszóma elvesztését vagy nyerését jelenti. Az aneuploid nomenklatura ennek megfelelően egy diploid szervezet esetében 2n-1, egy kromoszóma hiányában beálló monoszómiát, 2n+1 egy kromoszóma többlet miatti triszómiát, valamint 2n-2, egy kromoszóma pár hiányából adódó nulliszómiát különbözteti meg. A nulliszómia ismereteink szerint csupán búzában tolerált kondíció, ahol a négy homeológ képes kompenzálni egy homológ kromoszóma pár hiányát (7.9 ábra) Az aneuploidia okát elsősorban a hibás meiozis

során fellépő non-diszjunkcióban kereshstjük. A jelenség mind az első, mind a második meiotikus osztódáskor felléphet (7.10 ábra) Mindkét esetben n+1 és n-1 gaméták keletkeznek. Erre humán példa a 44 +1X monoszómiás kromoszóma komplement, a Turner szindróma. Az érintettek steril nők, jellegzetes fenotípusos megjelenéssel (7.11 ábra) Az X monoszómia életképessége tette lehetővé néhány X kromoszómához kapcsolódó genetikai betegség (vérzékenység, vörös-zöld színtévesztés) génjének erre a k romoszómára való térképezését. Fellépésének gyakorisága 1 5000 élve született leánygyermek között. A 2n+1 triszómia egyik példája a 44, XXY komplement, ami a Klinefelter szindrómát okozza. Az érintettek szellemileg retardált, steril férfiak, fellépési gyakorisága 1 1000 élve született fiúgyermek között. A fenotípust a 712 ábra mutatja Máig nem zárult le a vita az erőteljes testalkatú XYY triszómiát hordozó

férfiak erőszakra, bűncselekmények elkövetésére való hajlamukkal kapcsolatban. Érdekes módon az érintettek mormális X vagy Y spermiumokat képeznek, és soha XY-t vagy YY-t, fertilisek. A leggyakoribb humán triszómiás kondíció a Down szindróma, 44, X X (vagy XY), +21 aneuploidia, ami az élveszületések 0.15 % -át érinti, nemtől függetlenül Az érintettek szellemileg súlyosan visszamaradottak (IQ= 20-50), jellegzetes külső megjelenéssel (7.13 ábra). Érdekes módon az anyai életkor előrehaladtával a Down szindróma fellépésének gyakorisága szoros összefüggést mutat, erőteljesen emelkedik (7.14 ábra) Citogenetikai, illetve nem-invazív biokémiai szűréssel a betegség kimutatható. További triszómiás humán kondíciók a 13-as kromoszóma triszómiája (Patau szindróma), valamint a 18-as triszómia (Edwards szindróma). Mindkét esetben az érintettek a születést követő néhány héten-hónapon belül elhaláloznak. Voltaképp amit

genetikai betegségben érintett élveszületések során látunk, az csupán a jéghegy csúcsa. A 2-es, a 1 6-os és a 2 2-es kromoszómák triszómiája igen gyakori spontán abortált embriókban, és a 21-es triszómia is kb. hússzor gyakoribb vetélésekkor, mint azt élveszületések során tapasztaljuk. Mindemellett a kromoszóma mutációk tekintélyes hányadát képezik a genetikai eredetű okokra visszavezethető betegségeknek (7.15 ábra) Rekombináció baktériumokban és vírusaikban. I. Bakteriális konjugáció XX. s zázad ne gyvenes éveiben többé-kevésbé elfogadottá vált az a nézet, miszerint a genetikai rekombináció alapvető életjelenség, aminek érvényessége várhatóan a teljes élővilágra kiterjed. Ugyanakkor a rekombináció, a kapcsoltság felfedezése eukariótákhoz kötődött, így teljesen nyitott kérdés volt a jelenség puszta léte is prokariótákban. 1946-ban J Lederberg és E. Tatum figyelemreméltó kísérletet írt le, ami a

baktériumok közötti természetes módon történő gén átvitel, a bakteriális konjugáció, valamint a baktériumokban végbemenő rekombináció felismeréséhez vezetett. Ezt követően genetikai ismereteink tekintélyes bővülése prokarióták és vírusaik tanulmányozásához kötődött, mint pl. a genetikai anyag szerkezete és működése, a genetikai kód feltörése, a gén fogalom cisztronként való definiálása, a gén mutációk mechanizmusa, a gén kifejeződés átírás szintjén való szabályozása. Mindemellett egy új diszciplina, a molekuláris genetika is ezidőtájt formálódott, elsősorban prokarióták körében nyert adatok alapján. Baktériumok egyszerű körülmények között tenyészthetőek szuszpenzióban, illetve agar lemez felületén (1. ábra) Lederberg és Tatum kísérleti elrendezése roppant egyszerű volt Két különböző genetikai bélyeget, ún. markert hordozó, emiatt növekedésükhöz eltérő táptalaj kiegészítést

igénylő E. coli törzsek (A és B) keverékét táptalaj kiegészítést nem tartalmazó, ún. minimál táptalajra szélesztették (2 ábra) Ilyen körülmények között mind az A, mind a B törzs növekedésre képtelen, azaz telepet nem képez, míg ezek keveréke – bár igen kicsi, 10-7 gyakorisággal – telepet képezett (3. ábra) Igen lényeges tulajdonsága volt az így kinőtt telepeknek, hogy szerzett tulajdonságukat generációkon át megőrizték. A fenti eredmények kézenfekvő, ám mindenképp rosszmájú interpretációjaként merült fel az „átetetés” feltételezése, azaz A és B törzsek kölcsönösen olyan anyagokat készítenek, amelyek növekedésükhöz szükségesek. A baktérium sejtek számára átjárhatatlan pórusméretű szűrővel ellátott U alakú cső (Davis-féle U cső, 4. ábra) két szárába helyezett A és B törzsek minimál táptalajon telepet soha nem képeztek. Ez a k ísérleti elrendezés kizárta az átetetés szerepét a n

övekedésben, ugyanakkor a sejtek közvetlen fizikai kapcsolatának szükségességere utalt. A fentiekben bemutatott eredmények változatlanul tartalmaztak olyan elemeket, amelyek a jelenség mögött meghúzódó genetikai eseményre utaltak. Feltételezhető volt, hogy gén átvitel játszódhat le A és B törzsek között, így kézenfekvőnek tűnt a folyamat irányának tisztázása, ami Hayes nevéhez fűződik, amihez streptomycint használt. A drog a 30S riboszomális alegységhez kapcsolódva az mRNS téves leolvasását és működésképtelen fehérjék szintézisét okozza, s a sejtet elpusztítja. A streptomycinre érzékeny A törzs kezelését követően a hatóanyagot kimosva, majd B törzzsel összekeverve vad típusú telepek képződtek. A fordított kísérletben a f olyamat nem játszódott le. Ezek alapján megalapozottá vált az a v élemény, miszerint – az egyébként életképtelen – A törzs ------> B törzs irányú az információ átvitel, ami

a donor, vagy „hím” törzs esetében nem igényelt fehérje szintézist (5. ábra) Mindemellett továbbra is feltételezhető volt, hogy a folyamatban a két törzs fizikai kapcsolata szükséges (6. ábra). E. coli-ban viszonylag könnyen állítható elő streptomycin rezisztens törzs Amennyiben a konjugációban részt vevő partnerek csak egyike rezisztens, a folyamatot követően a másik partner elpusztítható. A fenti példánál maradva a donor streptomycin érzékeny, szenzitív (strs) A törzs és rezisztens (strr) B törzs együttes tenyésztését és az A sejtek elpusztítását követően a B sejtek körében viszonylag nagy, mintegy 10-4 gyakorisággal jelentek meg donor tulajdonságú klónok. Ugyanakkor a donor tulajdonság elvesztését is ki lehetett mutatni Ez a megfigyelés egy fertilitási faktor, F létére utaló jel, ami mintegy ingázik a sejtek között (7. ábra). Azaz F birtokában (F+) „hím”, donor, hiányában (F-) „nő”, recipiens

tulajdonságú a sejt, és az F+<------>F- átmenetek akadálytalanul játszódnak le. Az F+ tulajdonságú sejtek körében L. Cavalli-Sforza egy olyan törzset izolált, melynek donorként való alkalmazása során a recipiens sejtekben nagyságrendekkel több, 10-4 gyakorisággal lehetett rekombinánsokat kimutatni. Emiatt az ilyen tulajdonságú sejtek képezik a „high frequency of recombination”, Hfr törzseket. A donorként való alkalmazásuk során kiváltott nagy gyakoriságú rekombináció az F faktor más fizikai állapotára, a kromoszómába történt beépülésre utaló jelzés (8. ábra), s az így keletkezett Hfr törzs már alkalmas – kedvező esetben – a teljes kromoszóma átvitelére (9. ábra) A Hfr törzsek gén átviteli képessége mechanizmusának további elemeit Jacob, Wollman és Monod kísérletei derítették fel. A Hfr strs a+ b+ c+ d+ x F- strr a- b- c- d- keresztezés során a sejtek közötti fizikai kapcsolatot turmixgéppel

szüntették meg, majd streptomycint tartalmazó táptalajra szélesztették az exkonjugánsokat, elpusztítva a donor sejteket. Megfigyelték, hogy az alkalmazott genetikai bélyegek egymást követő szigorú sorrendben jelentek meg az idő függvényében (10. ábra) Felismerték, hogy az időtől függő megjelenés a bélyegek, markerek fizikai távolságát tükrözik, így a folyamat kiaknázható a genetikai térképezés szempontjaból, ahol a t érkép egysége az idő (11. ábra) A konjugációs rendszer további tulajdonságaként figyelték meg a kezdő ponttól távolabbra elhelyezkedő bélyegek állandóan csökkenő gyakoriságú felbukkanását az exkonjugánsokban (10. ábra) A jelenséget átviteli, transzfer gradiensként definiáljuk. Ennek megfelelően a recipiens sejtek körében a Hfr tulajdonság utoljára, és igen kis gyakorisággal jelenik meg. A későbbiek során számos Hfr törzset állítottak elő, amelyek donorként való alkalmazása során

megállapították, hogy ezek a konjugáció során kezdeményezett gén transzfer kezdőpontjában és irányában különbözhetnek egymástól, azaz a kromoszóma más és más pontján iniciálódik az átvitel 12. á bra) A nagyszámú Hfr törzs tanulmányozása alapján megállapítható, hogy az E. coli kromoszóma kör alakú, amire nézve Cairns autoradiográfiás kísérlete közvetlen bizonyítékot szolgáltatott. (Cairns radioaktív timidinnel jelölte in vivo a kromoszómát, majd a sejtek óvatos lízisét követően a készítményre fényérzékeny filmet helyezve detektálta a sugárzást). A konjugáció pontos mechanizmusának megértéséhez szükséges az F faktor természetének megállapítása. F+ sejtekből viszonylag egyszerű biokémiai módszerekkel egy kis méretű extrakromoszómális elem, plazmid állítható elő, ami a bakteriális kromoszómához hasonlóan szintén kör alakú képződmény. A Hfr sejt képződése során egyszeri

átkereszteződést követően a plazmid beépül a kromoszómába, és recipiens sejt jelenlétében képes a kromoszóma átvitel megindítására (Campbell-modell, 13. á bra) A kromoszómába való beépülés tulajdonságával rendelkező plazmidokat szokás még episzómáknak is nevezni. A kromoszómába való beépülés több helyen, mindkét irányban lehetséges. Ennek szükségességét a késői gének átvitelének esetleges volta indokolja, tekintettel az átvitelkor fellépő transzfer gradiensre. Ellenkező esetben ugyanis a beépülési helytől távoli gének gyakorlatilag ki lennének zárva a rekombinációból. A gén átvitel mechanizmusának lényeges eleme az, hogy a donor sejtből származó genetikai információ egyes szálú DNS-ként kerül a recipiens sejtbe, ahol a kiegészítő szál szintézisével kettős szálúvá válik, s alkalmas rekombináció létrehozására. A Hfr törzsek további tulajdonságai között meg kell említeni a mindkét

irányban történő beépülés következményeit. Emiatt a gén átvitel iránya is az óramutató járásával megegyező vagy azzal ellenkező irányú lehet (12. ábra), ugyanakkor a kapott térképek egyenértékűek A gén átvitel az F faktor belsejében iniciálódik, azaz egy adott Hfr törzs esetében minden esetben ugyanarról a pontról indul (12. ábra) Az F+ állapottal összehasonlítva voltaképp ugyanaz a mechanizmus figyelhető meg, csupán a Hfr törzs F faktora mintegy „mellékesen” a teljes kromoszómát hordozza, óriási in vivo rekombináns plazmidként. Az F faktor ez utóbbi tulajdonsága tette lehetővé az igen nagy méretű (~100 kilobázispár, kbp) idegen DNS befogadására alkalmas klónozó vektorok kifejlesztését. Az ily módon nyert in vitro rekombináns klónokat nagyfokú stabilitásuk, sejtenként egy kópiaszámuk következtében bakteriális mesterséges kromoszómaként (bacterial artificial chromosome, BAC) emlegetjük. A BAC klónok

jelentősen felértékelődtek a véletlenszerű, Craig Venter (Celera Genomics) által képviselt genom projektek térhódításával. Az adott szervezetből származó genomi DNS-t 3 kbp, 10 kbp és 100 kbp méretű inszertet hordozó plazmidokban reprezentetíven klónozták, majd a rekombináns plazmidokra specifikus lánckezdő primerek alkalmazásával mintegy 500 nukleotid hosszúságú szekvenciát határoztak meg. A kapott adatokat nagy teljesítményű számítógépekkel dolgozták fel, aminek során az átfedő szekvencia részleteket illesztették össze. Ez a stratégia teljes fokú automatizálást tesz lehetővé, s eredményképp a humán genom feltárása egy évnél kevesebb időt vett igénybe. A kromoszómába épült F faktor vagy az eredeti állapot visszaállításával, vagy nem precíz kivágódás során a b eépülési hely melletti DNS darab magával ragadásával hagyhatja azt el. Ez utóbbi esetben keletkező plazmid az F’ faktor. Az F’ faktor nem

integrálódott állapotában is természetesen lejátszódik gén átvitel, ez azonban kizárólag az általa hordozottakra korlátozódik. Az F’ faktor közvetítésével létrejött gén átviteli folyamatot szexdukcióként is szokás emlegetni. Így tehát egy meglehetősen rugalmas rendszer áll elő, melyben az összes irányban játszódhatnak le az átalakulások (14., 19 ábrák): F- <------> F+ <------> Hfr <------> F’ Elektronmikroszkópban jól kimutathatók az F+ sejtek ún. s ex pilus-ai, am elyek a recipiens sejt felismerését teszik lehetővé, valamint egy csőszerű fehérjeképződmény, a konjugációs híd, melyen keresztül egyes szálú DNS formájában jut át a genetikai információ a donorból a recipiens sejtekbe. Az átviteli, transzfer gradiens léte, azaz a késői gének egyre kisebb gyakoriságú megjelenése az exkonjugánsokban érthetővé válik a mechanizmus ismeretében: A képződött konjugációs híd enyhe mechanikai

behatásra elszakad, s ezáltal a gén átvitel is megszűnik (6. ábra) Eukariótákban a rekombinációs események (általában) két teljes genom között játszódnak le. Ezzel szemben prokariótákban csupán részleges, korlátozott diploid állapotról, merozigóta képződéséről beszélhetünk, ahol nem képződik reciprok rekombináns. Mindemellett kettő, vagy ennél több, de páros számú átkereszteződés szükséges ahhoz, hogy életképes rekombinánst kapjunk. Egy, vagy páratlan számú átkereszteződés lineáris szerkezetet eredményez, ami nem életképes (15. ábra) A konjugáció során az idő függvényében megjelenő markerek elnagyolt genetikai térkép elkészítésére ad lehetőséget. Ennek következtében közeli gének távolságának meghatározása céljából a különböző rekombináns kategóriák megjelenésének gyakoriságát kell alapul vennünk. Végezzük el a Hfr met+ arg+ leu+ strs x F- met- arg- leu- strr keresztezést A

konjugációt követően a strr és leu+ telepeket elemezzük. Ennek oka a következő: A gén átvitel során a leu+ tulajdonság jelenik meg utoljára. Ennek felbukkanása az exkonjugánsok körében garancia a másik két, korábbi gén átvitelére, s a streptomycin alkalmazása a donor sejteket pusztítja el. Így tehát az alkalmazott minimál táptalajt streptomycinnel, argininnel és metioninnel egészítjük ki. A kísérleti elrendezésben a leu+ az ún szelektált marker, szemben a nem szelektált arg és met bélyegekkel (16. ábra) A keletkezett leu+ strr telepek további elemzése az alábbi viszonyszámokat eredményezte: leu + + + + arg + + - met + + : 5% : 5% : 90% : 0.002% Az adatokból következik, hogy a leu-arg és az arg-met lokuszok közötti távolság megegyezik, és 5-5 térképegységgel egyenlő (17. ábra), azonban sorrendjüket nem mutatja A legkisebb gyakorisággal megjelenő + - + rekombináns kategória ugyanakkor a sorrendre utaló információ, s

megjelenésének kis gyakorisága keletkezésének mechanizmusában rejlik. Míg a + - - vagy a + + - rekombináns kategóriák csupán a régiót érintő két átkereszteződést igényelnek, addig a + - + csoport négyet (17. ábra) Két igen közeli gén sorrendjének eldöntésére szolgáló eljárás a reciprok keresztezés. Végezzük el a Hfr a+ b+ c x a b c+ és az F- a b c+ x a+ b+ c keresztezéseket annak eldöntése érdekében, hogy a gének sorrendje a b c vagy a c b, és szelektáljunk csupán a vad típusú, + + + rekombináns kategóriára. Amennyiben a gének sorrendje a b c, a reciprok elrendezésű keresztezések külön-külön nagyjából azonos számú rekombinánst eredményeznek (18. ábra) Amennyiben a sorrend a c b, a fenti elrendezések egyike négyszeres átkereszteződés révén szolgáltat vad típusú rekombinánst, ami igen kis gyakoriságú a másik konfigurációhoz viszonyítva (18. ábra) A DNS közvetítette transzformáció során a donor

sejt DNS-ét juttatjuk a recipiens sejtbe. A donor DNS páros számú átkereszteződés során beépülhet a gazda sejt genomjába, a 20. ábrán bemutatottak szerint. Függetlenül a DNS bejuttatásának mechanizmusától, a rekombináció hely specifikusan játszódik le a befogadó sejtben. Bár korlátozott mértékben, a transzformáció is alkalmas – többek között – genetikai térképezésre, némiképp az általános transzdukcióra emlékeztető mechanizmus szerint. 9. Bakteriofágok A baktériumok vírusai a „baktériumokat faló” bakteriofág részecskék. Az Ecoli T-páros fágjainak egyike, a T4-es példáján figyelhetjük meg a bakteriofágok főbb összetevőit, a fehérjékből álló fej, nyak, farok, véglemez és szál képződményeket, valamint a f ejbe csomagolódott kettős szálú DNS-t (címlap, 1. ábra) A nukleinsav összetevő más fágok esetében RNS is lehet, s mindkét esetben találunk egyes vagy kettős szálú DNS-t vagy RNS-t

hordozókat. A bakteriofágok felfedezése a XX század első évtizedeiben történt, amikor antibiotikumok hiányában bakteriális eredetű fertőző betegségek leküzdésének eszközét (is) látták bennük. Az ilyen célú alkalmazások azonban nem terjedtek el A fágok viszonylag egyszerű szerkezetének és kisfokú genetikai komplexitásának megfelelően a sejtek elpusztításához vezető, ún. lítikus életciklusa is viszonylag komplikációmentes. A fertőzés a fág nukleinsavának a gazda sejtbe történő befecskendezésével indul. Ezt követően a sejt metabolizmusa átalakul, és a fág alkotórészek termelésére áll át. Az egyes alkotórészek érett, kész fág részecskékké állnak össze a fertőzött sejtben, majd a sejt szétesik, lizál, s a kiszabaduló fágok újabb sejteket támadhatnak meg. Az itt vázolt fág életciklus, amely minden esetben a g azda sejt elpusztításához vezet, az ún. virulens fágok sajátsága. Agarban rögzített

baktérium szuszpenzió a virulens fággal való fertőzés helyén üvegszerűen feltisztul, tarfolt, plaque keletkezik (2., 3, 4 ábrák) A képződött tarfolt fenotípusa, a plaque morfológiája a fertőző részecske genotípusára utaló információkkal is szolgálhat. A gyors (r, rapid) lízis során nagy, míg lassú lízis esetén kis tarfolt keletkezik. A már említett T páros fágok egyike, a T 2 esetében az r- tulajdonságúak nagy, míg az r+ fágok kicsi, tűszúrás méretű tarfoltokat képeztek. A bakteriofágok a fertőzhető gazdák köre alapján is megkülönböztethetőek (h, host range). Eszerint amennyiben a baktérium szuszpenzió két különböző gazda sejtjeinek keverékéből áll, melyek csak egyike fertőzhető, a tarfolt zavarossá válik, hiszen a nem fertőzhető sejtek zavartalanul osztódhatnak. Az előbbi példával élve mindkét sejtet fertőzni képes T2 fág h-, míg kizárólag az egyiket elpusztító h+ tulajdonságú. Így a

kicsi-nagy, zavaros-tiszta fenotípusok kombinációi szelekciós lehetőséget adnak a kísérletező kezébe, pl. a h- r+ fágok tiszta és pici tarfoltot képeznek (5., 6 ábrák) A fentiek alapján már elképzelhető, hogy fágok esetében is elvégezhető a keresztezés, a genetikai elemzés, és a t érképezés. Ehhez csupán az szükségeltetik, hogy egyidejűleg, egy gazda sejtben két különböző fág szaporodjék, és megsokszorozódásuk során közöttük rekombináció játszódjék le. E cél elérése érdekében a k ét fág többé-kevésbé azonos számú egyedét tartalmazó keverékével, nagy sztöchiometriai feleslegben hajtjuk végre a fertőzést. Az a viszonyszám, ami megmutatja a fág/gazdasejt arányát, a fertőzés multiplicitása (multiplicity of i nfection, moi). Egy tipikus kísérletben az ún m oi értéke 10 kör üli Ezzel elérhető, hogy a számunkra értékes kettős fertőzés nagy gyakorisággal forduljon elő, ugyanakkor ennek elmaradása

sem zárható ki. Úgy is mondhatnánk, egy fág keresztezés populációs jelenség, minek következtében a leolvasott értékek – ha kismértékben is – kísérletről-kísérletre változnak. Végezzük el a T 2 fág mutánsainak keresztezését a h- r+ x h+ r- transz elrendezésben, és számoljuk meg a h+ r+ és h- r- rekombinánsokat, valamint az összes keletkezett tarfoltot, beleértve a szülői kombinációkat mutatókat is. [Cisz elrendezésről akkor beszélünk, ha az azonos kromoszómán azonos jellegű bélyegek, markerek találhatóak, esetünkben ez a h- r- x h+ r+ konfiguráció (7. ábra) Ugyanakkor genetikai szempontból a cisz vagy transz elrendezésben elvégzett keresztezések egyenértékűek, s a belőlük levonható következtetések azonosak.] A rekombinációs gyakoriságot az R GY, R F=[( h+ r+) + (h- r- ) ]/ összes tarfolt hányados fejezi ki. Ez az érték ugyanakkor nem az összes eseményt reprezentálja, hiszen pl a szülői fágok egymás

közötti rekombinációjának, vagy kettős rekombinációnak a termékei nem mutathatók ki, nem mérhetőek. Függetlenül attól, hogy az átkereszteződés azonos vagy eltérő fág genomok között játszódik le, ez általában diploid állapotban lezajló eseménysort takar, szemben a bakteriális konjugáció esetében megfigyelt részleges diploidiával. A. Hershey eltérő géneket érintő r mutációkat hordozó T2 fágokat használt térképezési kísérletei során, sematikusan r x - h+ x r x + h- elrendezésben. A keresztezés eredményeit a 10-3 táblázat tartalmazza. A táblázat adatainak felhasználásával az egyes gének egymáshoz viszonyított helyzetét tudjuk páronként a térképen elhelyezni (10-25a ábra), majd segítségükkel négy különböző térképet tudunk megszerkeszteni, melyek mindegyike hűen tükrözi a kísérleti eredményeket (10-24b ábra). Tekintettel arra a tényre, miszerint egy genomot kizárólag egy térkép mutat be helyesen,

emiatt joggal gyanakodhatunk kísérleti adataink elégtelen voltára. További keresztezéssel az r c és r b gének közötti kapcsoltság nagyobb értéket mutatott az r b – h között mértnél, így r b és r c közrefogja h-t (10-24b ábra), azaz eredetileg négy térkép vázlatunkból csupán kettő marad. E két opció közötti választás érdekeben az r a – r b és az r a – r c gének közötti rekombinációs gyakoriság meghatározása szükséges. A kísérlet meglepő eredményt adott, mivel a két távolság egyenlőnek bizonyult Ennek az egyértelmű ellentmondásnak a feloldása úgy vált lehetségessé, hogy a térképet kör alakban ábrázoljuk (10-25 ábra). A későbbiek során ennek okára is fény derült A T páros fágok, beleértve a T2-őt is, redundáns genommal rendelkeznek, azaz a fág fejekbe a teljes genomnál nagyobb DNS csomagolódik be, s ennek következtében a fág populáció egyedei egy-egy kromoszomális régiót kétszeresen,

redundáns módon hordoznak. Ez az állapot azért következhet be, mert a fág genom replikációjához egy gyűrűvé záródott genom szolgál templátként, amiről a „gördülő gyűrű” (rolling circle) mechanizmussal hosszú, lineáris DNS szintetizálódik. A fág érésekor az így elkészült DNS-t a f ejbe „csomagoló” mechanizmus a genom méreténél nagyobb egység felvételét teszi lehetővé, az egyedi fág részecskék redundánssá válnak. Ennek következtében a rekombinációs gyakoriságok két átkereszteződés eseményeit demonstrálhatják, ami a t érkép távolságok torzításához vezet (Lásd: Kiegészítő anyag). Bizonyos körülmények között bakteriofágok alkalmasak gének átvitelére az általános vagy a speciális transzdukció során. Egymástól különböző Salmonella törzsek keverékéből kiindulva vad típusú rekombinánsokat nyertek. A jelenség első megközelítésban emlékeztetett az Ecoli esetében megismert

konjugációra. Azonban amikor a két törzset egy Davis-féle U-cső két szárába helyezték, a konjugációval ellentétben a gén átvitel ilyen körülmények között is megfigyelhető volt. A gyanú a Salmonella typhimurium mérsékelt, P22 fágjára terelődött, amely számára a csőben elhelyezett szűrő átjárható volt. Általános transzdukció során az alábbi események játszódnak le: Fág fertőzést követően a gazda sejt kromoszómája véletlenszerűen feldarabolódik. Bizonyos fágok, köztük a P1, a P22 képes arra, hogy a fág fejbe a saját genomjához hasonló méretű, de a gazda sejtjéből származó DNS-t csomagoljon be. A fág ezt a DNS-t injektálja a gazda sejtbe, ahol páros számú átkereszteződések során rekombináns keletkezhet (9. ábra) Mivel ez a mechanizmus csupán a hordozott, idegen DNS méretére, s nem pl. információ tartalmára szelektív, így a kromoszóma bármely helyéről származó darab juthat a fág fejbe. Elsősorban

közeli gének átvitelére alkalmas, így nagy felbontású genetikai térkép készíthető segítségével. A P1 fág alkalmazásával elvégezhetjük a leu thr azi génekre vonatkozó általános transzdukciós kísérletet, és alkalmazzuk a s zelektált – nem szelektált markerek „trükkjét”. A kotranszdukciós értékek alapján a gének sorrendje és távolsága meghatározható az alábbiak szerint. Minél nagyobb két marker együttes transzdukciójának (kotranszdukciójának) valószínűsége, annál közelebb helyezkednek el egymáshoz viszonyítva. Ugyanakkor, a mechanizmusból adódóan, a fág genom (ez utóbbi 1-2 %-a az E. coli genomnak) m éretét meghaladó távolságban elhelyezkedő gének a kotranszdukcióból ki vannak zárva (10. ábra) Annak eldöntésére, hogy két gén a kotranszdukció során kapcsolt, vagy független események során figyelhetjük meg jelenlétüket a rekombinánsok között, egy egyszerű számítás alkalmazható. Végezzük el

A B gének általános transzdukcióját - - gazdában, ahol három féle rekombinánst kaphatunk: ++, +-, -+ kategóriákat. Legyen P a ++ rekombináns kategória keletkezésének valószínűsége (0<P<1). Legyen a +- és -+ rekombináns kategóriák fellépésének valószínűsége egyenlő, (1-P)/2. E két független esemény egyidejű bekövetkezésének valószínűségét a két esemény bekövetkezte valószínűségének szorzata adja meg. Ha a szorzat kisebb mint P, A B kapcsolt, ha nagyobb, nem kapcsolt Az előbbiek szerint a P=[(1-P)/2]2 egyenlet megoldása adja azt az értéket, ahol ez a dilemma nem eldönthető. A fentiek során láttuk, hogy a virulens fágok csoportjába tartozóak fertőzhető gazdán tiszta tarfoltot képeznek, a sejteket maradéktalanul elpusztítják. A tarfolt zavarossága ugyanakkor a fertőzést túlélő baktérium sejtek jelenlétére utal. Az ilyen sejtek a továbbiakban ugyanazzal a fággal nem fertőzhetőek, „immunissá”

válnak. A fág fertőzésre ellenálló, rezisztens sejtekből spontán módon kicsi, külső behatásra, pl. UV fénnyel történő megvilágítás eredményeképp lényegesen nagyobb gyakorisággal fertőzőképes részecskék, ép fágok szabadulnak ki. Ezekkel végrehajtott fertőzést követően újfent zavaros tarfolt képződését tapasztalhatjuk, amelyekből rezisztens sejtek izolálhatóak (11. ábra) Ezeket a sejteket lizogénnek nevezzük, s ennek a k iváltására alkalmas fágok a m érsékeltek, a t emperáltak körébe tartozóak. Az ilyen viselkedés mögött meghúzódó események tisztázása az E. coli λ fágjának alaposabb tanulmányozásával valósult meg. Egy Hfr x F-(λ) konjugáció során a lizogén recipiensben a gén átvitel során ismert események játszódtak le, azaz a megfelelő markerekkel ellátott recipiens sejtek körében rekombinánsok jelentek meg. Ugyanakkor a Hfr (λ) x F- keresztezés során a recipiens sejtek lizáltak, bennük λ

fágok keletkeztek. A kísérleti eredmények alapján kimondhatjuk, hogy a lizogénia állapotában a s ejt valószínűleg tartalmazza a fág genomját, s ennek következtében citoplazmájában olyan fehérjék jelennek meg, amelyek ezt az állapotot stabilizálják. Emiatt a lizogén recipiens továbbra is lizogén marad. Fordított esetben a λ genom nem lizogén környezetbe kerül a konjugáció során, s ez a miliő a fág gének aktiválódásának kedvez a fékentartó mechanizmus hiányában. A lizogénia illetve a lítikus ciklus közötti választás összefüggésbe hozható a λ fág genom eltérő státusával. A Campbell feltételezte, hogy a λ fág esete sok tekintetben emlékeztet az F faktor viselkedésére, azaz a ci rkuláris fág genom beépülhet, integrálódhat a gazda sejt kromoszómájába, és profág képződik (12. ábra) A beépülés helyének meghatározása érdekében a Hfr(λ) x F-(λ), valamint a Hfr x F keresztezések összehasonlítása

nyújtott értékes információt. Megfigyelhető ugyanis, hogy a gal és bio operonok egymáshoz viszonyítva később jelentkeznek a lizogén exkonjugánsokban, mint a nem lizogének esetében. E két operon között található egy rövid, mind a λ fágban, mind a baktérium kromoszómájában fellelhető nukleotid sorrend, a kapcsolódó (attachment, att) régió, mely mentén a rekombináció lezajlik. A beépülés következtében az Ecoli kromoszóma mérete kb. 1% -al, a gal és bio operonok egymáshoz viszonyított felbukkanása kb. egy perccel megnő Speciális transzdukció a már többször említett λ fág alkalmazásával hajtható végre. A profág hibás kivágódása során kis gyakorisággal defektív fág részecskék keletkeznek (13. ábra), mivel a folyamat során fág gének maradnak a kromoszómán, ugyanakkor a beépülési helytől jobbra vagy balra elhelyezkedő gal és bio lokuszok egyike a fág DNS-sel eltávoznak. Az ilymódon keletkezett fág

részecskék defektívek, önmagukban nem képesek a befogadó sejt kromoszómájába beépülni. Ép fág genom jelenléte ugyanakkor biztosítja a beépüléshez szükséges fehérjék szintézisét, és mindkét genom beépülését (14. ábra) Az ebből a lizátumból előállított fágok fele ép, fele defektív lesz, s ez a fág keverék már igen nagy gyakorisággal képes transzdukcióra (high frequency of transducing, hft lysate). Ez az állapot ugyanakkor lehetővé tesz a domináns, vad típusú gént (gal vagy bio) hordozó fág genommal történő komplementációt. 1963-ban az E.coli genetikai térképe mintegy száz gén helyét mutatta meg (15 ábra), míg 1990-ben ez a szám több, mint 1400 volt (16. ábra) Ezt követően készült el az Ecoli genom nukleotid sorrendjének meghatározása. A genom mintegy 4x106 nukleotid hosszúságú, mintegy 4000 gént tartalmaz, s a legpontosabban elkészíthető térképet reprezentálja (17. ábra). 10. Gén mutáció E

fejezet tárgyalásakor kiindulási pontunk a vad típus, a leggyakoribb, legadaptívabb allél. A gén mutáció ezt az allélt érinti, ekkor előremutató, forward mutációról beszélünk. A reverzió (back mutáció) a mutáns fenotípusnak a vad típussá történő visszaalakulása egy második mutációs esemény következtében. A testi sejteket ért szomatikus mutáció állatokban nem öröklődik, szemben az ivarszervek sejtjeit ért germinális mutációkkal, melyek öröklődhetnek (10.1 ábra) Szomatikus mutáció esetében mozaikos szerkezetű egyedeket figyelhetünk meg, s a mozaik folt nagysága mutatja azt, mikor következett be a változás az egyedfejlődés során (10.2 ábra) Genetikai szempontból a germinális mutációk jól követhetőek, generációról generációra megnyilvánulnak (10.3 ábra); a továbbiakban elsősorban ezekkel foglalkozunk A mutációk természete alapján lehetnek recesszívek; szervezettől függetlenül megállapítható, hogy a

géneket ért mutációk mintegy 95 %-a recesszív. A fennmaradó rész domináns, és a v ad típussal kombinálódó heterozigóta mutatja a domináns fenotípust. A mutációknak különböző típusait ismerjük. Morfológiai mutánsok az egyed külső megjelenésében mutatkoznak meg (10.4 ábra) Létfontosságú gént érő mutáció gyakran letális, ami elsősorban homozigóta állapotban jelentkezik (10.5 ábra) Kondícionális mutációk fenotípusukat feltételesen, a külső körülmények változásának következtében fejtik ki. Tipikus példájuk a hőmérséklet érzékeny mutációk; a fenotípus permisszív körülmények között nem jelentkezik, restriktív állapotban igen (10.6 ábra) A mutáció egyaránt lehet hideg- vagy meleg érzékeny. A szintetikus reakcióutak génjeinek megváltozásai biokémiai mutációkat eredményeznek. Vegyük például az A->B->C->D konszekutív folyamatot, melynek lépéseit egy-egy fehérje, enzim katalizálja. D anyag

jelenlétében bármilyen típusú hiba esetén a n övekedés biztosított, míg B jelenléte kizárólag az A->B lépésben hibás, auxotróf mutáns növekedését képes biztosítani (10.7 ábra) Funkció vesztéses, null mutáns esetében nincs funkcióképes gén termék (általában fehérje); leaky (lyukas) mutáns esetében ha csökkent mértékben is, de a gén termék még valamelyest funkcióképes, míg funkció nyeréses mutáció a gén terméket új feladat ellátására teszi alkalmassá (10.8, 109, 1010 ábrák). E tulajdonságuk következtében a funkció nyeréses mutációk általában dominánsak Mutációk kimutatásának egyszerű lehetősége az, amikor fenotípusosan is észrevehető változással jár együtt. A kukorica C allélje domináns és bordó színt kölcsönöz a kukorica szem endospermiumának, míg a c allél homozigóta állapotban világos sárgát. Növények endospermiuma triploid; két petesejt fúzióját követően termékenyíti meg

egy pollen sejt. Amikor cc petesejtet CC pollennel termékenyítünk meg, az endospermium ccC genotípusú, és bordó színű, míg C->c mutáció esetén sárga (10.11 ábra) A germinális mutációk kimutatásának ilyen eljárása a specifikus lokusz teszt; a spontán fellépő mutációk kicsi gyakorisága következtében sok munkát igénylő eljárás. A mutációs gyakoriságát egy populációban felbukkanó mutáns egyedek száma határozza meg. Ez a szám génről-génre változhat, amint az néhány kukorica gén esetében megállapítható (10.12 ábra) A mutációs rátát valamilyen biológiai időegység (generációs idő, sejtosztódási idő) alatt fellépő mutációk szám határozza meg. A két jelenség összefügg, mivel egy mutánst is tartalmazó populáció kialakulása időben lejátszódó esemény. Mikrobiális szervezetek mutánsai számos eljárással dúsíthatóak. Tápanyag kiegészítést nem tartalmazó ún. m inimál tápoldatban vad típusú

fonalas gombák növekednek, míg auxotróf mutánsai nem. A növekedő és nem növekedő kultúrák szűréssel elválaszthatóak (1013 ábra) Auxotróf mutáns baktériumok minimál tápoldatban nem növekednek, vad típusú sejtek igen. A tenyészetet penicillinnel kezeljük; a drog az osztódásban lévő sejteket elpusztítja, míg a nem osztódó mutánsokat nem. Bakteriofágokkal szembeni rezisztencia a sejteket új tulajdonsággal látja el. Az Escherichia coli sejtek között kis gyakorisággal keletkeznek a T1 fággal szemben rezisztens telepek. Felmerült a k érdés, vajon ezek a t elepek élettani adaptáció, avagy mutáció következtében mutatják e tulajdonságukat. S Luria és M Delbrück egy egyszerű kísérleti elrendezéssel adták meg a választ, amit azóta fluktuációs tesztként emlegetünk. E coli folyadék tenyészetét két egyenlő részre osztották, majd az egyik fél részt további húsz egyenlő részre osztották (az eredeti térfogat 1/40-e,

néhány tized ml). Ezután a tenyészeteket növesztették, majd a sejteket agar felületére szélesztették, amire előzőleg nagyszámú T1 fágot kentek. A nagy térfogatú tenyészetben jelentkező rezisztens telepek száma nemigen változott kísérletről kísérletre, míg a kis térfogatú tenyészetekben ez rendkívüli módon szórt (10.14 ábra) A jelenség a rezisztenciát eredményező spontán mutáció fellépésének véletlenszerű voltával magyarázható, hiszen fiziológiai adaptáció hasonló számú rezisztens telep keletkezését tenné lehetővé (10.15 ábra) Spontán mutációk kialakulása sok esetben a DNS replikáció hibáira vezethető vissza. Az így keletkezett hibákat egy javító rendszer, az ún. p osztreplikációs javítás, repair, korrigálja E rendszer elemeinek mutációja, ugyanakkor, az így keletkezett hibákat meghagyja. Ilyen tulajdonságúk eszerint az ún. mutátor gének A spontán mutáció ritka esemény, ezért olyan szervezetek

esetében, ahol megengedett, mutációkat indukálunk. Egy gén funkciójának megértését mutáns alléljainak tanulmányozása nagymértékben segíti elő. E célból legelőször Röntgen sugárforrást használtak, de más ionizáló sugárzás UV, radioaktív) is használható; e fizikai ágensek gyakran kromoszóma töréseket indukálnak. Az UV fény ciklobután szerkezetű timidin diméreket indukál; javításuk mutáció miatti elmaradása UV fény (napfény) érzékenységet eredményez, ami a x eroderma pigmentosum betegségben nyilvánul meg. Alkiláló szerek (metil- vagy etil metán szulfonát, N-metil-N-nitrosoguanidin) a guanin 6-os O atomját és a timin 4-es O atomját alkilálják, éterkötést kialakítva. Az O-6-metilguanidin a timinnel, az O-4-metil-timidin a guaninnel képez bázispárt, ami GC<->AT tranzíciót okoz (missense mutáció). Interkalálódó ágensek (proflavin, akridin oranzs) a kettős spirál bázispárjai közé ékelődnek, és egy

nukleotid beépülését vagy delécióját okozzák (frameshift mutáció). Ez az eszköztár mutánsok előállításának hatékony lehetőségét biztosítja laboratóriumi modell szervezetekben. Indukált letális mutációk kimutatásának egy lehetőségét a Drosophila X kromoszómájára kidolgozott ClB teszt adja. A rövidítés a következő elemekből áll: C, rekombinációt megakadályozó kromoszóma átrendeződés, inverzió (balanszer); l, letális, B, Bar (résszeműség). Vad típusú hímeket mutagenizálunk, majd ClB/X nőstényekkel keresztezzük Az l allél miatt résszemű hímek nem keletkeznek. A résszemű nőstények hordozzák a ClB, valamint a hímekből származó X kromoszómát, ami lehet vad típusú, de hordozhat letális mutációt is (m). Ezeket a nőstényeket páronként keresztezzük vad típusú hímekkel Abban a keresztezésben, melyben nem keletkezik hím (ClB/Y és m/Y), az X kromoszóma letális allélt hordoz, ami nőstényekben

fenntartható (10.16 ábra) Az élelmiszer, kozmetikai, stb. ipar termékeivel kapcsolatban jogos elvárás, hogy alkotórészeinek egyike sem legyen (lehetőleg) mutagén természetű. Bruce Ames egy viszonylag egyszerű mutagén tesztet dolgozott ki (Ames teszt). Hisztidin auxotróf Salmonella sejteket minimál táptalajra szélesztünk, majd a feltételezett mutagénnel megcseppentjük. A reverzió, vagy back mutáció az anyag mutagén természetére utaló jel (10.17 ábra) Gyakorta előfordul, hogy egy anyag önmagában nem, lebomlási terméke viszont mutagén. Ezért az Ames teszt része az az eljárás, amikor a v izsgált anyagot patkány máj homogenizátummal kezelik, majd az enzimatikus átalakuláson átesett mintát is hasonlóan tesztelik. A GÉN KIFEJEZŐDÉS SZABÁLYOZÁSA Meglehetősen széles körben ismert az a nézet, miszerint az élő szervezetek sejtjeinek génjei nem egyidőben, állandóan működnek, hanem a sejt, illetve a szervezet igényeinek

megfelelően. Így pl a vörös vértestekben mintegy tucatnyi aktív gén található, míg a központi idegrendszer sejtjeiben ez tízezres nagyságrendű. Mindebből következik, hogy a sejteknek rendelkezniök kell a gének ki- és bekapcsolásának képességével, megfelelően fenti állításunknak. Mindemellett feltételezhetjük, hogy az alapvető ellenőrző folyamatok rendkívül finom fehérje-nukleinsav kölcsönhatáson alapuló jelenségek. Az első alaposan feltárt szabályozási folyamat az E.coli laktóz operon működésének leírása volt (1 ábra) A folyamat sematikus összegezése szerint laktóz hiányában a r epresszor fehérje meggátolja a l aktóz hasznosításáért felelős gének átírását, míg laktóz jelenlétében a represszor „leesik” a DNS-ről, lehetővé téve ezáltal a mögötte elhelyezkedő gének átírását. Az ilyen típusú szabályozó rendszert negatív kontrolként is emlegetik, utalva a represszor átírást gátló

természetére. Természetesen a laktóz operon működése ennél komplikáltabb, így ismerkedjünk meg ennek alapos részleteivel, elsősorban Jacob és Monod nyomán. Egyedüli szénforrásként glicerint tartalmazó táptalajon növekedő E.coli sejtek tenyészetéhez tejcukrot vagy analógját (2. ábra) adagolva néhány percen belül megfigyelhető új, addig a sejtekben kimutathatatlan fehérjék, a β-galaktozidáz és a laktóz permeáz megjelenése, melyek alapvető fontossággal bírnak a laktóz metabolizmusában (1. ábra) Radioaktív nyomjelzéses technikát alkalmazva kimutatható volt, hogy a jelenség de novo fehérje szintézisen alapul, s nem pedig raktározott fehérjék mozgósítása történik. A tejcukor eltávolításával ugyanakkor rendszerként viselkedtek a sejtek: Az említett polipeptidek szintézise is leállt. Feltételezték, hogy a jelenség mögött az indukáló hatású tejcukor és a β-galaktozidáz közötti kölcsönhatás húzódhat meg.

Ennek érdekében számos analóg vegyületet szintetizáltak, amelyek eltérő induktív hatásúak voltak, ugyanakkor hasíthatóságuk kinetikája ezzel nem egyezett. Mindemellett a kísérlet azt a megfigyelést is eredményezte, hogy a β-galaktozidázzal összemérhető mennyiségű transzacetiláz fehérje is keletkezik. A fenti biokémiai adatok megerősítést nyertek a későbbi genetikai elemzés során, ami szintén koordinált gén kifejeződésre utaló jelenséget indikált, valamint a poláris mutációk fellépésének magyarázatául szolgált. Eszerint a lac operon három gént (Z, Y, A, 1 á bra) tartalmaz, és pl. egy nonsense (stop) mutáció a mögötte elhelyezkedő gén termékének megjelenését drasztikusan lecsökkentheti. Ugyanakkor alkalmas nonsense szuppresszor ezt a hibát – legalábbis részlegesen - képes kijavítani. Az itt megfigyelt jelenségek vezettek a prokariota gének policisztronos természetének felismeréséhez. A lac operon további

genetikai elemei egyikeként az I gént azonosították (1. ábra) Mutáns alléljeinek viselkedése meglepő volt: Nem az enzim aktivitását, hanem szintézisét, termelését érintették, így kézenfekvőnek tűnt feltételezni az I gén represszor fehérje termékenek a lac gének átírásában gátló szerepét. Ennek igazolására I- Z- F- tulajdonságú recipiens sejtekbe vad típusú Hfr donor tulajdonságú sejtek segítségével juttatták be a fenti gének vad típusú alléljeit. Ebben a kísérleti elrendezésben az említett génekre nézve diploid állapot áll be merozigóta, részleges diploid formában. A donor gén termékek megjelenése a konjugációt követő néhány percben kimutatható volt (3. ábra) A képződött konjugáns sejtek egyik feléhez induktort adagoltak, míg a másikat e nélkül hagyták. Megfigyelhető, hogy az induktor jelenléte vagy hiánya eleinte a képződött aktív fehérje szintézisét nem befolyásolja, később azonban

induktor hiányában a szintézis leáll, jelenlétében erőteljesen folytatódik. A megfigyelések magyarázata az alábbi: Az I- Z- F- sejtekben a vad típusú Z+ allél megjelenése az aktív fehérje szintézisével párosul mindaddig, míg az I gén termékének citoplazmás koncentrációja egy küszöb értéket meghaladva – induktor hiányában - a lac operon átírását meggátolja. Induktor jelenlétében természetesen a szintézis fennmarad. Ilyen típusú komplementációs teszt elvégzésének egyszerűbb, ugyanakkor megbízhatóbb lehetőségét kínálta az I gént hordozó F’ faktor alkalmazása. Ebben az esetben ugyanis a részleges diploid állapot állandósul a plazmid jelenléte következtében. A +/- diploid állapotú sejtek a fentiekben leírtak szerint viselkedtek, azaz a + tulajdonság domináns a – felett, azaz az ép represszor ektopikus kifejeződése elégséges az indukálhatóság fenntartásához (4. ábra) A represszor hipotézis további

alátámasztásához nyújtott adalékot az IS mutáció viselkedése: Induktortól függetlenül a lac operon átírása nem történt meg. Továbbá, az IS mutáns mind az I+, mind az I- allélek vonatkozásában dominánsnak bizonyult (4. ábra) Mindezen kísérletek arra engedtek következtetni, hogy az I gén terméke kettős természetű: Átírást gátló hatása DNS-hez történő kötésre, induktorral történő kölcsönhatása pedig a kis molekulákkal, pl. laktózzal való komplex képzésére utal (5. ábra) Előbbi feltételezésünk az operátornak (O) nevezett DNS régióban bensőséges fehérje-DNS kapcsolatra utal. Ennek bizonyítékaként szolgálnak az OC (operator constitutive) mutációk A mutánsok fenotípusának jellegzetessége az indukciós állapottól független állandó, konstitutív génkifejeződés, valamint ennek domináns volta O/OC diploid állapotban (6. ábra) Ez a mutáció típus az ún. cisz dominancia, mivel nem a cisztront, hanem az

előtte elhelyezkedő szabályozó régiók egyikét, a sajátos szimmetriával rendelkező operátort érintik (6. ábra) Az ott elhelyezkedő nukleotid sorrend változása nem teszi lehetővé a fehérje-DNS kapcsolat kialakítását, míg az I- mutánsokban – működőképes operátor jelenlétének dacára – a fehérje DNS kötő motívumának változása okozza ugyanezt (6. ábra) A cisz dominancia jelensége a lac operon működése megértésének így lényeges eleme 7. ábra) Második feltételezésünk az induktor-represszor kölcsönhatásban rejlő szabályozásra utal. Erre szolgál bizonyítékként a lac represszor allosztérikus tulajdonsága, miszerint a fehérje második kötőhelye az induktor dokkolásának biztosít teret. Ekkor a fehérje egy jól mérhető konformáciő változáson esik át, ami a DNS kötő kapacitás elvesztését eredményezi, lehetőséget adva a transzkripciónak. Az IS mutáció eszerint az induktor kötőhelyet érinti, így a

represszor „fennragad” az operátoron. Az átírás kezdeményezésének további alapvető feltétele a működőképes promoter (8. ábra) Ennek mutációi – hasonlóan az operátor mutációkhoz – cisz dominanciát mutatnak, azaz képesek meggátolni a mögöttük elhelyezkedő gének átírását. E.coli sejtek erőteljes preferenciát mutatnak glükóz hasznosítása szempontjából Így glükóz és laktóz jelenlétében kizárólag az előbbit fogyasztják, holott az induktorként viselkedő laktóz jelenléte hasznosítását mindenképp indokolná. Ennek oka a represszor által közvetített szabályozásra rétegződő újabb, pozitív természetű kontrol folyamat, a katabolit represszió. E folyamat kulcsszereplői a katabolit aktivátor protein (CAP), valamint a ciklikus AMP (cAMP). Glükóz jelenléte alacsony cAMP szinttel társul, emiatt a CAP nem képes a lac operon promoteréhez kapcsolódni, ezáltal alacsony sebességű átírás figyelhető meg. A cAMP

koncentráció emelkedése glükóz fogytán lehetővé teszi a CAP-cAMP komplex kialakítását, kapcsolódását a promoterhez, s az ott elhelyezkedő DNS meggörbítését. Mindezek együttesen a lokusz nagy sebességű átírását eredményezik (9-11 ábrák). Represszor közreműködése az átírás gátlásában a negatív, míg a CAP átírást serkentő viselkedése a pozitív szabályozásra példa, megállapodás szerint (12. ábra) Az arabinóz operon működése hasonló elveken nyugszik, s mind a pozitív, mind a negatív szabályozás elemei fellelhetők benne. Az operon három gént kódol (araB, araA, araD), további genetikai elemei az araC gén, valamint az I és O cisz elemek. Arabinóz jelenlétében a C fehérje-arabinóz, valamint a CAP-cAMP komplexek mindegyike szükséges a hatékony átíráshoz. Arabinóz hiányában a C fehérje egyidejűleg képes kapcsolódni az O és I elemekhez, ezáltal hatékonyan gátolja meg a lokuszon történő átírást (18-20

ábra). Szintetikus reakcióutak szabályozása során gyakran megfigyelhető mechanizmus a visszacsatolásos gátlás elvén alapul, azaz a képződött termék lép fel a szintézis inhibitoraként. Így van ez a a triptofán bioszintézisének során is: Feltételezték – ellentétben a lac operonnal – a represszorhoz kötött triptofán képezi az operon transzkripciós gátlását. Ennek megfelelően a trpR (represszor) mutánsok folytatták a triptofán szintézist az aminosav jelenlétében is. Ugyanezek a m utánsok a s zintézis sebességének tízszeres növekedését eredményezték, amennyiben a triptofánt a tápoldatból gondosan eltávolították. A jelenség kettős, egymásra épülő szabályozásra utaló jelként fogható fel, kicsit emlékeztetve a lac operon katabolit repressziós folyamatára. A trp operon két cisz elemét kell kiemelnünk, mint a jelenségért felelős objektumokat, a policisztronos mRNS 5’ végén elhelyezkedő attenuátor és vezető

(leader) szekvenciákat (14. ábra) A promoter és az operátor régiókat követő vezető szekvencia egy rövid peptidet kódol, mely egyebek mellett triptofánt is tartalmaz. Amennyiben triptofán elegendő mennyiségben áll rendelkezésre, a szintézisnek nincs akadálya, s a riboszóma átfut ezen a s zakaszon. Emiatt a 3 ’ irányú attenuátor szakasz egy hajtű szerkezetet vesz fel, s az átírás tovahaladását meggátolja (18-25 ábra). Triptofán hiányában a riboszóma időzik a vezető peptidet kódoló szakaszon, emiatt az attenuátor egy energetikailag kedvezőbb szerkezetet vesz fel, ami egyidejűleg az átírás folytatását teszi lehetővé (15. ábra) Hasonló szabályozási mechanizmus figyelhető meg a fenilalanin és a hisztidin operonok esetében is a vezető peptid tekintetében. Természetesen szem előtt kell tartanunk azt a tényt is, miszerint prokariotákban az átírás és a fordítás térben és időben nem válnak szét, szimultán folyamatok. Az

előbbiek ismeretében könnyűszerrel értelmezhetjük a λ fág életciklusának szabályozását a represszor-operátor model fényében. Ismert, hogy a λ fág képes a gazda szervezet genomjába épülve lizogéniára, valamint a sejtek elpusztítása révén lízisre egyaránt. Makroszkópikusan úgy követhetjük e két eseményt, hogy egy pillantást vetünk a vad típusú fág tarfoltjaira, melyek zavarosak, jelezve a fertőzést túlélő, lizogén sejteket. A λ fág genetikai tanulmányozása során tiszta tarfoltot eredményező mutánsokat izoláltak, melyek a lizogén sejtek felülfertőzése vonatkozásában kétféle viselkedést mutattak: Vagy fertőzték, vagy nem azokat. Hipotézisként felállíthatjuk modelünket, miszerint – hasonlóan az Ecoli I és O mutánsaihoz – a megfigyelés represszor-operátor kölcsönhatáson alapul, jelesül a fertőzőképességüket megtartó mutánsok a domináns karakterű O, azt elvesztő társaik a recesszív I mutánsok

viselkedésére emlékeztet. Azaz, a lizogén sejtekben bőségesen rendelkezésre álló represszor fehérje a λ operátor mutánsaiban működésképtelen, míg magában represszorjában hibás mutánsokban hatékony a lízis gátlásában. Genetikai térképezéssel két szorosan kapcsolt operátor jelenlétére lehetett következtetni, a r epresszort kódoló cI gén jobbján és balján elhelyezkedő O R és O L elemeket (16. ábra) További elemzés az O R elem nagyobb felbontását eredményezve megmutatta, hogy itt valójában három kötőhely található, az O R 1, O R 2, és az O R 3 (17. ábra) A fehérje-DNS kötés erősségét illetően (azaz a kötés beálltát követő szabadenergia csökkenés vonatkozásában) az alábbi hierarchia állapítható meg: O R 1> O R 2>O R 3, minek következtében először az 1-es, majd a 2es elem telítődik. Ennek kettős hatása van: Gátlás alá kerül a cro gén átírása, és felerősödik a cI génen zajló

transzkripció (17. ábra) A keletkező represszor mennyisége így elegendővé válik a 3-as elem telítésére, s ennek következtében a cI gén átírása leáll, a lizogénia állapota stabilizálódik. A fentiek során ismertetett represszor tulajdonságú fehérjék többségére megállapítható, hogy ún. helix-turn-helix szerkezetűek, ahol a két helikális struktúra képezi a polipeptidnek a DNS nagy árkában való kötés képességét, míg az induktort kötő alegység ettől térben elválik. További jellemzőjük, hogy (általában) tetramer szerkezetűek aktív formájukban (18. ábra) Soksejtű eukariótákban igen gyakran megfigyelhető a gén kifejeződés tér- és időbéli orchestrálása, azaz az egyedfejlődés szakaszai, a testtájak, szövetek, szervek sokszor alapvetően eltérő kifejeződési mintázata. Ebből adódóan eukariota szervezetek természetes tulajdonsága a gén kifejeződésnek átírási szintű szabályozása. A folyamat –

hasonlóan a prokarioták esetében megfigyeltekhez – a genom ellenőrző pontjai, az ún. cisz elemek, valamint ezekkel kölcsönhatásba lépő fehérjék, a transz faktorok összehangolt működésén alapul. Így beszélhetünk promoterről, ahol a mRNS-t „gyártó” RNS polimeráz II kapcsolódik, promoter közeli és távoli elemekről (ez utóbbiakat enhancerként ismerjük, élesztőben megfelelőjük UAS, upstream activating sequence). Tipikus promoter elemeket tüntet fel a 19 ábra, egyúttal kiemeli az átírás szempontjából lényeges szakaszokat (TATA, CAAT, GC azonos értelmű, konszenzus szekvenciák). Enhancerek gyakran a célzott géntől nagy távolságban elhelyezkedő, az átírás sebességét gyakran nagyságrendekkel megemelő szabályozó elemek, s gyakran több gén kifejeződésére képesek hatni (19. ábra) A DNS ellenőrző pontjain ható fehérjék DNS-t kötő szerkezeti elemeik alapján oszthatók fel. A már megismert helix-turn-helix

motívummal rendelkező transzkripciós faktorok csaladjába tartoznak pl. az egyedfejlődés szabályozásában kitüntetett szereppel bíró homeotikus fehérjék DNS kötő tulajdonságú peptidje, a homeo „doboz” (box), amely egyúttal a célzott szekvenciák felismerésére is szolgál (20. ábra) A cink ujj (zinc finger) fehérjék – nevükből adódóan – cink iont tartalmaznak koordinatív kötésben (20. ábra), és pl szteroid receptorokban fordulnak elő nagy számban. A leucin zipzár (leucine zipper) homo- és heterodimer képzésére hajlamos a szabályosan ismétlődő leucin aminosavmaradékok mentén, és alkotja pl. a c -jun, c-fos proto-onkogén család tagjait A helix – hurok (loop) – helix szerkezetű fehérjék szintén dimer képzésére alkalmas polipeptidek, szintén proto-onkogén tulajdonságúak, mint pl. a c-myc gén terméke Külön kérdés lehet a transzkripciós faktorokot kódoló gének aktiválása, bekapcsolása. Számos esetben az

esemény kis molekulák, másodlagos hírvivők által kiváltott jel átviteli rendszerekhez köthetőek. Aktiváló tulajdonságú vegyületek pl peptid hormonok (inzulin), szteroidok (ösztrogén), vagy a cAMP. Mindemellett eukariota gének transzkripciós aktiválása jóval több fehérje egyidejű kölcsönhatását igényli, mint ez a prokarioták esetében megfigyelhető, emiatt egy hatalmas transzkriptoszómáról beszélhetünk aktív átírás esetén (21., 22 ábrák) A szabályozó fehérjék és a DNS meghatározott szakaszai között fellépő együttműködés hatására a gén kifejeződés tér-időbeli szabályozását viszonylag egyszerű kísérleti rendszerekben követhetjük nyomon, a cisz elem (promoter) vezérlése alá eső riporter gén (b-galaktozidáz) segítségével, vagy in situ hibridizációval (23., 24 ábrák) A gén aktivitást szabályozó cisz elemek biokémiai módosítása is szerepelhet gén kifejeződést szabályozó tényezőként, mint

pl. az ún CpG szigetek citozinjának 5-ös pozíciójú metilezése, mely az átírás ellen hat. Külön említést igényel a lokuszról képződött mRNS alternatív vágásából adódó, a gén kifejeződés színesítését eredményező hatás, az RNS és fehérje izoformák képződése. Többek között ennek az effektusnak tulajdonítják a kifinomult gerinces egyedfejlődési, fiziológiás, viselkedésbéli stb. folyamatok meglétének és szabályozásának lehetőségeit. E megállapítás különösen annak a megfigyelésnek a fényében értékelhető kellő súllyal, ami szerint növények feltehetően több génnel rendelkeznek, mint pl. az ember A sejt, szervezet számára nagy mennyiségben igényelt gén termékek előállítását megsokszorozódott, redundáns gének működése teszi lehetővé, mint pl. a rRNS, vagy hiszton gének esetében Átlagosnál nagyobb igénybevétel esetén (pl petesejtekben) figyelhetjük meg pl. a rRNS gének nagyszámú

extrakromoszomális másolati példányát gyűrűs formában kierősítve, amplifikálva