Egészségügy | Betegségek » Dr. Matolcsy András - Onkohematológiai betegségek FISH vizsgálata

1 Onkohematológiai betegségek FISH vizsgálata Dr.Matolcsy András SE-I.szPathológiai és Kisérletes Rákkutató Intézet Az onkohematológiai betegségek korszerű diagnosztikája egyaránt megkívánja a szövetek vagy sejtek morfológiai, fenotípus és genotípus vizsgálatát. A genotípusban mutatkozó eltérések kimutatására kromoszóma, PCR és FISH vizsgálatok állnak rendelkezésre. A humán genom és az onkohematológiai betegségek genetikai feltérképezésével a mindennapi diagnosztikában könnyen és jól használható próbákat fejlesztettek ki. Az onkohematológiai betegségek morfológiai megjelenése és immunfenotípusa alapján célzott genetikai vizsgálatok végezhetők az adott betegségre jellemző FISH próbák segítségével. A FISH vizsgálatok indikációját leggyakrabban a következő kérdéscsoportok megoldására alkalmazzák: (1) A FISH vizsgálat számos esetben a morfológia és immunfenotípus alapján felvetett diagnózis

megerősítését szolgálja. Így például follicularis lymphomában a t(14;18), köpenysejtes lymphomában a t(11;14), Burkitt lymphomában a t(8;14), chronicus myeloid leukémiában a t(9;22), anapláziás nagysejtes lymphomában a t(2;5), myelodysplasias syndromában az 5q-, kromoszómális eltérések kimutatása támasztja alá a diagnózist. (2) Az onkohematológiai betegségek más csoportjában, mint például az acut leukémiák esetében a szubtípus besorolása és a megfelelő kezelés indikálása cytogenetikai vizsgálatokon alapszik. Ezen betegségcsoportban alapvető fontosságú a t(15;17), t(16;16), t(11q23) kromoszóma transzlokációk kimutatása. (3) A betegségek további csoportjában a citogenetikai eltérések prognosztikai csoportokat jelölnek. Például chronicus lymphocytas leukémiában a +12, del(13q14), del(17p13.1) kromoszómális eltérések kimutatása eltérő klinikai viselkedésű megbetegedésekre utal. (4) Végül egy onkohematológiai

betegségre jellemző genetikai eltérés alkalmas a betegség követésére, a minimális reziduális betegség kimutatására. 2 A FISH szerepe a Patológiában. Jelen és jövő Dr. Kovalszky Ilona, Dr Füle Tibor Semmelwies Egyetem I. sz Pathológiai Intézet A fluorescens in situ hibridizációt DNS kimutatására 1980-ban, mRNS azonosítására 1982-ben írták le. Az eljárás kutató módszerből gyorsan előrelépett diagnosztikus eszközzé és bevonult a molekuláris patológia fegyvertárába. A módszer előnye, hogy a nukleinsavakat egy sejt szinten illetve szöveti környezetben képes elemezni. A próbák kezdeti radioaktív jelzését felváltották a fluorescens festékek, melyek lényegesen jobb minőségű jel-háttérzaj arányt biztosítottak. Az eltelt 20 év során a képalkotó és analizáló rendszerek rohamos fejlődésének és a gyárilag előállított jelzett próbáknak köszönhetően ma a FISH technikai kivitelezése nem igényel különösebb

molekuláris biológiai előképzettséget, sokkal inkább az eszközigényessége az, mely gátat szab széleskörű elterjedésének. A DNS mennyiségi és minőségi változásai közül az eljárás kiválóan alkalmazható kromoszómák számbeli eltéréseinek vizsgálatára, gének szerzett, vagy öröklött deléciójának, vagy amplifikációjának kimutatására. Két gén eltérő színű jelölésével mód nyílik a transzlokációk kimutatására Ma a diagnosztikában három terület élvezi az eljárás nyújtotta lehetőségeket. Az első a fertőző ágensek kimutatása. A második a nem tumoros örökletes vagy szerzett genetikai betegségek felderítése, ahol a prenatális szűrést és a gyermekkori esetek vizsgálatát végzik. A harmadik, a patológusok számára legfontosabb terület a tumordiagnosztika. A hematológiai tumorok diagnosztikai protokolljában a FISH ma már nélkülözhetetlen. A szolid daganatok esetében is számos kromoszóma és génszintű

aberráció mutatható ki, ezek jelentős része azonban jelenleg sem a diagnózist nem segíti elő, sem a prognózisról nem ad információt. Kivétel az n-myc és a h er2 amplifikáció, melyek jelenléte befolyással van a terápia megválasztására. Hathatós segítséget várhatunk a FISH-től a lágyrésztumorok és gyermekkori sarcomák diagnózisában is. A jövő egyre újabb lehetőségeket tár fel, ezek közül kiemelendő az expressziós array-k bevezetése, a CGH, és a multikolor FISH. Ezek az eljárások azonban ma még nem részei a rutin molekuláris patológiai diagnosztikának. 3 A FISH alkalmazási területei a PTE Orvosi Genetikai Intézet klinikai gyakorlatában Dr.Czakó Márta-ProfDrKosztolányi György PTE-ÁOK- Gyermekfejlődéstani és Genetikai Intézet Intézetünkben 1998 ót a történnek FISH vizsgálatok. Az elmúlt években mind a metafázisos készítmények, mind az interfázisos minták analízise bevezetésre került a klinikai genetikai

diagnosztika és a kutatási feladatok ellátása érdekében. Az interfázisos mintán végzett FISH fő képviselője a magzati anueploidiák vizsgálata, ahol ez a technika a vizsgálat és az eredmények kiadásának idejét jelentősen lerövidítette. A magzati vizsgálatok indikációi: • Magas anyai életkor • Emelkedett Down kockázat • Suspect UH • Anyai aggodalom • Terhelő szülészeti anamnézis Természetesen a legtöbb vizsgálat az előrehaladott anyai életkor miatt történt. Viszonylag sok vizsgálatot végeztünk emelkedett kockázat miatt. Nyaki bőrredő vastagsága miatt kb évente 6 esetben történt magzati vizsgálat. Ugyan még kis számú, de az évek során valószínűleg egyre nagyobb arányú lesz az anyai aggodalom miatt történt vizsgálatok száma. Magzati aneuploidiák vizsgálatára intézetünkben 2002. áprilisa óta végzünk interfázis FISH vizsgálatot. (Emellett természetesen elindítjuk a t enyésztést is, mivel ma

Magyarországon a F ISH vizsgálat eredménye alapján nem indikálható terhesség megszakítás). Ebben az időszakban kb 400 minta érkezett, 2 esetben az alacsony sejtszám, 1 esetben, pedig a k ifejezetten véres amnionminta miatt nem történt FISH vizsgálat. A többi esetben 2 Down szindrómát és 2 Turner szindrómát találtunk. A tenyésztés során ezen kívül 2 kiegyensúlyozott transzlokációt észleltünk, azonban ezek a terhességek kihordásra kerültek. 2 mintában, kis százalékban (8%, ill 4%) egy 13-as ill egy 18-as számfeletti szignált detektáltunk, azonban ezeket nem tekintettük kórosnak (alkalmazási előírás alapján 10 % alatt nem tekintendő kórosnak), és a tenyésztés során sem detektáltuk. (Egyik terhességből már megszületett egy egészséges gyermek.) 4 Szellemi és testi elmaradásban szenvedő betegeken, ahol a klinikai kép és a kapott cytogenetikai eredmény jelentősen eltér, felmerül a szöveti mozaikosság kérdése.

Mozaikosság esetén a különböző sejtvonalakban sokszor eltérő arányban vannak jelen kóros sejtek. Ez nagyban befolyásolja a fenotípust és a prognózist. Mind a pontos genetikai diagnózis felállítása, mind az ismétlődés kockázatának megítélése szempontjából nagyon fontos a – lehető legkevésbé invazív módon nyerhető – kölönféle szövetek vizsgálata. Szöveti mozaikosságban az interfázis FISH viszonylag nagy számú sejt vizsgálatában segít nehezen tenyészthető mintákon (pl. vizeletből nyerhető laphámsejtek, hajgyökér sejtek, buccalis kenet sejtjei, esetenként izomszövet és bőrbiopszia vizsgálatára is sor kerül). A FISH technika alkalmazásának jóval elterjedtebb területe a m etafázis készítményeken végzett vizsgálat. Intézetünkben leggyakrabban a pontos és részletes fenotípus elemzés alapján felmerülő mikrodeléciós szindrómák vizsgálata zajlik. Minden ismert, ill gyári próbákkal lefedhető

mikrodeléciós szindróma vizsgálatát rutinszerűen végezzük. Emellett a hagyományos cytogenetikai vizsgálat által felvetett kromoszóma szerkezeti átrendeződések felderítésére kerül sor rendszerint, különböző painting, centroméra, teloméra és locus specifikus próbák alkalmazásával. A marker kromoszómák azonosítása a kóreredet szempontjából jelentős. Az idiopathiás mentális retardáció hátterében 2-10 %-ban szubtelomerikus átrendeződés áll az irodalmi adatok alapján. Intézetünkben, az elkövetkező hetekben kerül bevezetésre a szubtelomerikus átrendeződések vizsgálata, amivel a genetikai tanácsadásra értelmi elmaradással hozott betegek diagnosztikus vizsgálati lehetőségeit szeretnénk bővíteni. 5 Az MLL gén jelentősége Dr. Haltrich Irén SE- ÁOK II. Gyermekgyógyászati Klinika (ig: Fekete György) A csecsemőkori és gyermekkori akut lymphoid illetve a felnőttkori szekundér myeloid leukémiákban gyakran

előforduló MLL (Myeloid/ Lymphoid Leukémia vagy „Mixed Lineage Leukaemia”) gén aberrációja új megvilágításba helyezi a h ematológiai malignitások eredetét. A 11q23 régióban található gén az esetek mintegy 84%-ban 30 partner génnel képez reciprok transzlokációt, a maradék 16% deléciót, duplikációt, inverziót, amplifikációt, addiciót, tandem ismétlődéseket és fúziót jelent. A 100 kb nagyságú MLL gén 34 exonból áll, kódoló sequenciája 11, 9 kb, két ALU sequenciát és egy topoizomeráz II-kötőhelyet tartalmaz, közismert töréspontja az 5 és 11 exon között található. Az MLL átrendeződések etiológiáját etoposid hatással hozzák összefüggésbe, mely inhibálja a topoizomerázok „széttekerő” funkcióját és a topoizomerázokkal homológ szekvenciák törését eredményezi a gén 9 és 11 exonjában. Az MLL gén transzlokációs partnere és a l eukémia fenotípusa között szoros összefüggés van. Például a

4q21-es partner (MLL-AF4) myeloid –asszociált antigént is expresszáló pre B-sejtes ALL –ben, a 9p21-22-es partner (MLL-AF9) az AML-M5 FAB beosztású leukémiakban fordul elő leggyakrabban (95 illetve 75 %-ban). A többi fúziós gén (MLL-AF10; MLL-ELL; MLLELL; MLL-EEN stb) viszonylag ritkábban fordul elő, de jellegzetes fenotípussal társul Az MLL átrendeződések incidenciája a csecsemőkori (60-80%) és a felnőttkori terápiával öszefüggő (70-90%) leukémiákban a l egmagasabb. A 11q23 érintettség általában véve rossz prognozisú, ALL-ben az életkortól, AML-ben a transzlokációs partnertől függő. Egypetéjű ikertanulmányok azt bizonyítják, hogy „lappangási ideje” rövidebb a másfajta átrendeződést hordozó leukémiáknál. De topo II inhibitorral történő kezelés esetén is korábban jelentkezhet a szekundér leukémia mint másfajta kemoterápia esetén. Az MLL protein 431 kD nagyságú Karboxiterminális kétharmada egyrészt

nagyfokú homológiát mutat a Drosophila „trithorax” nevű proteinjével (SET domain, PHD finger), másrészt a többi emlősben is megtalálható HOX gének regulátora. Az MLL rearrangementek ezáltal a transzkripciós programot, illetve a HOX gének ellenőrzése alatt álló terminális differenciációs folyamatot (haemopoesist) zavarják meg. A fehérje aminoterminális harmada két DNS-kötő helyet (AT hook motivum, MT domén) tartalmaz A SET és a PHD domén egyik alléljának elvesztése érinti a normális haemopoesist, prediszponálja a sejtet másodlagos elváltozásokra. A trunkált MLL promoterével még beavatkozhat a t ranszlokációs partner „normál fehérjéjének” a f unkciójába. Mindezek eredménye a differenciáciáló gátlás, a proliferáció fokozódás, a programozott sejthalál iránti érzéketlenség, a szöveti invázió. A megfelelően agresszív kemoterápia elkezdése, illetve a csontvelő transzplantációra való felkészítés

szempontjából a 11q23 rearrangementek időbeni felismerése rendkívül nagy fontosságú. A klasszikus citogenetika mellett új, korszerű FISH metodika áll rendelkezesünkre. A Q-BIOgene dual-color FISH-próba két különböző színnel jelöli a hasadt gént, és 6 lehetővé teszi az MLL gén rendellenességeinek kimutatását citogenetikai preparátumokon, osztódó és nem osztódó sejtekből egyaránt valamint morfológiai célra kikent csontvelői készítményeken. 7 Kromoszomális eltérések genomszintű analízise komparatív genomiális hibridizacióval Dr.Balázs Margit DEOEC- Megelőző Élettani Intézet Bevezetés A komparatív genomiális hibridizáció (CGH) a fluoreszcencia in situ hibridizáció elvén alapuló molekuláris genetikai módszer, melyet 1992-ben Kallioniemi és munkatársai dolgoztak ki. CGH-el a tumor sejtek genomjában előforduló kromoszómális eltérésekről (relatív DNS-amplifikációkról és -deléciókról) nyerünk

információt. Ezzel a m ódszerrel a tumor genomban nemcsak ismert génamplifikációk és géndeléciók detektálhatók, hanem ismeretlen genetikai eltérések (DNS többletek és hiányok) is kimutathatók, valamint a CGH technikával lehetőség van a tumor sejtekben talált genetikai eltérések kromoszómális szintű feltérképezésére is normál kromoszóma preparátumokon. Egyetlen CGH kísérletből a tumor genomban előforduló valamennyi megabázis nagyságrendű genetikai alteráció detektálható. A standard citogenetikával szemben a D NS kópiaszám eltérések meghatározásához nincs szükség a tumorsejtekből kromoszóma preparátumok előállítására. A friss szöveti minták mellett archív, formalin-fixált paraffinba ágyazott szövetek genetikai analízise is megoldható, így lehetőség van a retrospektív vizsgálatokra is. A komparatív genomiális hibridizáció leírása A CGH a fluoreszcencia in situ hibridizáció elvén alapul, az alapvető

különbség az, hogy ennél a módszernél a target DNS minden esetben normál sejtekből izolált kromoszóma preparátum, amit phytohaemaglutinin-nal stimulált peripheriás limfocitákból nyerünk standard citogenetikai módszerekkel. A DNS próbák fluoreszcens festékekkel jelzett tumor (teszt DNS) illetve normál (referencia DNS) sejtekből izolált DNS-t tartalmaznak. A CGH reakció során a hibridizációs elegy három DNS komponenst tartalmaz (1. ábra), 1) a tumor sejtekből nyert DNS-t (zöld fluoreszcencia: fluoreszcein-izotiocianát: FITC), 2.) a normál sejtekből nyert DNS-t (piros fluoreszcencia: tetrametilrodamin-izotiocianát:TRITC) és 3.) jelöletlen Cot-1 DNS -t. A C ot-1 DNS segítségével a tumor és normál DNS-ben jelenlévő repetitív szekvenciák hatékony szuppressziója érhető el. A Cot-1 DNS-el meggátolható, hogy a centromérák tandem ismétlődő szekvenciáihoz történő kötődés miatt (pl. 1q12, 9q12, 16q12, 19cen) ezek a régiók intenzív

fluoresszcenciát mutassanak, ez u.i lehetetlenné tenné a kvantitatív analízist. 8 1. ábra A komparatív genomiális hibridizáció sematikus ábrázolása. (Kallioniemi et al. Cancer Biology, 4. 41-46 1993) A CGH módszernél a hibridizációs és a hibridizációt követő kísérleti körülmények hasonlóak a FISH-hez. A renaturáció során a FITC-dUTP-jelzett tumor DNS és T RITC-dUTP jelzett normál DNS a normál target kromoszómákhoz kötődik. Azokon a kromoszómális szakaszokon, melyeken a normál és tumor DNS kötődése azonos, egyenletes narancssárga fluoreszcencia figyelhető meg a piros és a zöld mikroszkópos felvételek egymásra vetítését követően. Ha a vizsgált tumor DNS-ben egy adott DNS szakaszon a normál DNS-hez viszonyítva DNS többlet van (pl. amplifikáció miatt) a target kromoszóma megfelelő szakaszán ezt a zölden fluoreszkáló tumor-DNS többlet kötődése miatt, erős zöld fluoreszcencia jelzi. A daganat sejtekben teljesen

deletált DNS hiánnyal jellemezhető kromoszómális szakaszok pirosan fluoreszkálnak. (2 ábra) 2. ábra A CGH képanalízis sematikus ábrája. A módszerrel a detektálható eltérések tartománya 1-20 Mb A fluoreszcencia intenzitások detektálása megfelelően kiválasztott gerjesztési (különkülön minden fluorofórra szelektív gerjesztési szűrő) és emissziós szűrökkel (a képek 9 esetleges eltolódása miatt egyetlen emissziós szűrőblokk) felszerelt fluoreszcens mikroszkóppal lehetséges. A teszt (tumor) és a r eferencia-DNS (normál) fluoreszcencia intenzitásainak pixelről-pixelre történő összehasonlításával történik a tumor DNS-ben jelenlévő genetikai kiegyensúlyozatlanságok (genetic imbalances) meghatározása. 3. ábra CGH kromoszóma profilok normál DNS-nek-normál DNS-el valamint tumor DNS-nek normál DNS-sel és tumor DNS-sel történő kohibridizációját követően. D C A CGH módszer előnyei és korláta:

Előnyök: • Egyetlen hibridizáció során a tumor genom DNS kópiaszám elváltozásai (DNS többletek, DNS hiányok, génamplifikációk és géndeléciók) normál kromoszóma preparátumokon kimutathatók. • CGH analizáló software alkalmazásával az eltérések kromoszómális szinten feltérképezhetők. • DOP-PCR-al kombinálva igen kis mennyiségű DNS genetikai analízise is megvalósítható. • Archív minták CGH analízisével retrospektív, célzott tanulmányok végezhetők. • Standard citogenetikai technikával nem analizálható daganatok kromoszómális eltéréseiről is szerezhető információ. CGH alkalmazásának korlátai: • Általában 10-20 Mb nagyságú deléciók és amplifikációk mutathatók ki, kisebb szekvenciákat (kb. 1Mb) átfogó DNS többletek c sak többszörös (5-10-szeres) génamplifikációknál detektálhatók. • A normál sejt kontamináció nem haladhatja meg az analizálandó mintában a 40%-ot. •

Strukturális eltéréseket nem lehet ezzel a technikával kimutatni. 10 A CGH technika tehát alkalmas arra, hogy a különböző stádiumú daganatok (pl. premalignus leziók, invazív tumorok és metasztázisok) analízisével a tumorok kialakulását és progresszióját genetikai eltérések alapján kövessük nyomon, valamint, hogy a tumorra jellemző genetikai hibákat azonosítsuk. Az elmúlt néhány évben CGH-el számos tumortípus esetén sikerült a tumor típusra jellemző, gyakran előforduló genetikai eltéréseket felismerni. Konzisztens genetikai eltéréseket és többszörösen amplifikált szekvenciákat találtak számos daganatban: pl. agy-, colon-, prosztata-, emlő- tumorokban, a melanoma egyes altípusaiban stb. Többszáz glioblasztoma tumor CGH analízisével kimutatták, hogy a 7-es kromoszóma többlete és a 10-es deléciója jellegzetes elváltozás erre a daganat típusra. Emlőtumorokban az ismert kromoszómális alterációk mellett (mint pl.

ERBB-2 [17q12] onkogénamplifikáció vagy a 17p [p53] deléció) korábban ismeretlen, de gyakori genetikai aberrációként jelent meg a 20q régió amplifikációja, ami úgy tűnik egy igen fontos onkogén jelenlétével kapcsolatos hiszen más tumor típusok esetén is gyakori genetikai eltérésként detektálták CGH-el. Ezeknek az eredményeknek az alapján sikerült azonosítani azt az amplifikált régiót, ami az emlődaganatok progressziójával kapcsolatba hozható CYP24 onkogént tartalmazza Emlőtumorra jellegzetes további DNS többleteket írtak le az 1-es, 8-as, 17-es, valamint deléciót 13q kr omoszóma szakaszokon. A CGH-el talált eltérések nem random kromoszómális alterációk, hanem tumor típussal és tumor stádiummal összefüggő eltérések. Információt szolgáltatnak olyan DNS specifikus szondák kidolgozására, melyek a hatékonyabb diagnózist célozzák meg. CGH eredmények ismeretében lehetőség van célzott FISH szondák

kifejlesztésére, melyek relevanciáját egyetlen kísérlet során akár több száz tumorból származó mintán (tissue array) lehet tesztelni. CGH microarray módszer A CGH felbontásának javítását és technika hátrányainak kiküszöbölését célozta meg a 90-es évek végén kidolgozott CGH array módszer. A tárgylemezre normál metafázisos kromoszómák helyett klónozott DNS szekvenciák ezreit rögzitik (BAC és YAC klónok). Mintegy 30000 CGH-arrayre alkalmas BAC és YAC klónt sikerült eddig előállítani. 11 4. ábra A CGH array technika sematikus ábrázolása A CGH array hibridizáció teljesen azonos elven alapul, mint a kromoszómális CGH metodika, alkalmazásával a CGH felbontása a próba méretének megfelelően lecsökkenthető. A CGH mikroarray technika alapja lehet 1.) cDNS alapú array CGH és genomiális DNS alapú array CGH (mátrix CGH név alatt is ismert technika). cDNS alapú array CGH-módszert először 1999-ben Pollack és mtsai

írták le. Ez a CGH array technika a konvencionális cDNS mikroarray-t alkalmazza targetként (4. ábra) Amint ez a 4os ábrából kiderül ennek a módszertani megközelítésnek az óriási előnye az, hogy átfogó analízisre ad lehetőséget nemcsak a génkópiaszámok eltéréseire, hanem, egyúttal a gének expressziójára vonatkozóan is, hiszen ugyanaz az array mRNA hibridizációra is alkalmas. A CGH array technika alkalmazásának korlátai: • A target cDNS szekvenciák mérete nem túlságosan nagy (0,5-2 kb), így a genomiális DNS hibridizációja sokszor gyenge, hiszen a genomiális DNS együttesen tartalmazza az intron és exon szekvenciákat. • A kereskedelemben kapható cDNS array-knél előfordul a hibás génhozzárendelés, aminek számos oka lehet és inkonzisztens eredményt szolgáltat. A CGH daganatkutatásban elért eredményeit Knuutila és mtsai. foglalták össze Az interneten is elérhető közlemények a CGH-el feltárt kromoszómális

rendellenességeket, a C GH eredmények alapján azonosított új géneket foglalják össze könnyen áttekinthető formában. Irodalom: Knuutila S, Bjorquist AM, Autio K, Tarkkanen M, Wolf M, Monni O, Szymanska J, Larramendy ML, Tapper J, Pere H, El-Rifai W, Hemmer S, Wasenius VM, Vidgren V, Zhu Y. DNA copy number amplifications in human neoplasms: review of comparative genomic hybridization studies. Am J Pathol 1998;152:1107-1123. 12 Knuutila S, Aalto Y, Autio K, Bjorquist AM, El-Rifai W, Hemmer S, Huhta T, Kettunen E, KiuruKuhlefelt S, Larramendy ML, Lushnikova T, Monni O, Pere H, Tapper J, Tarkkanen M, Varis A, Wasenius VM, Wolf M, Zhu Y. DNA copy number losses in human neoplasms Am J Pathol 2000;155:683-694. Pinkel, D., Segraves, R, Sudar, D, Clark, S, Poole, I, Kowbel, D, Collins, C, Kuo, WL, Chen, C., Zhai, Y, Dairkee, SH, Ljung, BM, Gray, JW, Albertson, DG High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nat

Genet 20:207-211, 1998 Yuko Sugiyama, Kazuo Sugiyama, Yasuo Hirai, Futoshi Akiyama, Katsuhiko Hasumi, Microdissection is essential for gene expression profiling of clinically resected Cancer Tissues Am J Clin Pathol 2002;117:109-116. Albertson D. and Pinkel D Genomic microarrays in human genetic disease and cancer Hum Mol. Genet2003; 12: 145-152 13 Prediktív citogenetikai eltérések chronicus lymphocytás leukaemiában Dr. Méhes Gábor PTE ÁOK Pathológiai Intézete A morfológiailag és immunfenotípus alapján meglehetősen homogén chronicus lymphocytás leukemia (CLL) kifejlődésében újabban különböző mechanizmusok szerepét igazolták. A betegség kialakulása jelenleg két B-sejt érési stádiumhoz is köthető, melyek génexpressziós (ZAP-70, CD38, IgD, IgM) és immunoglobulin nehézlánc (IgV H ) génátrendeződés alapján pre- ill. postfollicularis fázisnak felel meg A prefollicularis típust a gyors progresszió és lényegesen rövidebb túlélés

jellemzi, emiatt szoros klinikai kontrollt és intenzív kezelést igényel. A postfolliculáris típus ezzel szemben stabil, több évtizedes lefolyás várható Therápiás szempontból fontosnak bizonyult a progressziót, illetve stabilitást jelző cytogenetikai eltérések kimutatása. Cytogenetikai szinten ugyanis aberrációk találhatók a betegminták mintegy 50%-ában. Leggyakrabban a 12-es kromoszóma triszómiája került leírásra, melynek azonban prognosztikai szerepe egyelőre nem tisztázott. A kromoszóma és interfázis cytogenetikai adatok összesítése alapján a progresszió szempontjából a 17p és a 11q régiók érintettsége tűnik döntő jelentőségűnek, míg a normális karyotipus, illetve az izoláltan jelentkező 13q deletio stabil CLL fennállta mellett szól. A 17p, ezen belül a p13 (p53 gén) locus deletioja - valamennyi klinikai paramétert figyelembe véve - a legkedvezőtlenebb prediktív markernek bizonyult (Döhner, 2002). 11q d eletiot

meglehetősen széles tartományban, q13 i ll. q24 között írtak le, a leggyakrabban azonban a 11q22-23 locus szerepel. A hatásért az itt elhelyezkedő ATM (ataxia telangiectasia mutated) supressor gén vesztését teszik felelőssé. A kedvező prediktív jellegű 13q deletio pontos helye és a molekuláris mechanizmus szintén nem ismert. Gyakori a 13q14 l ocus érintettsége, mely a D13S25 kromoszómarégiót és gyakran az attól centromerikusan elhelyezkedő Rb1 gént foglalja magába. A CLL egyedi kezeléséhez a morfológiai és immunfenotípus vizsgálatokon túl a cytogenetikai jellegzetességek kimutatása is kívánatos, melyek megközelíthetők metafázis karyotipizálással és fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) alkalmazásával is, interfázis sejtmagokon. A betegség monitorozása, új subpopulatiok azonosítása leghatékonyabban a perifériás vérből izolált B-sejtek stimulálás után végzett vizsgálatával történhet. 14 A fluoreszcens in

szitu hibridizáció jelentősége a meddőség genetikai hátterének tisztázásában és a magzati genetikai diagnosztikában Dr.Tóth András, DrKékesi Anna Országos Gyógyintézeti Központ-Szülészet Genetika A meddőség miatt végzett asszisztált reprodukciós eljárások egyre szélesebb körben terjednek el hazánkban. Az infertilitás hátterében többek között a kromoszóma-rendellenességek és a spermatogenezis kóros megváltozása állhat. A szerkezeti kromoszóma-rendellenességek a beteg perifériás véréből állapíthatóak meg, a spermiumok numerikus kromoszómaanomáliái azonban csak a spermiumok közvetlen analízisével tisztázhatók, mivel ezek a meiózis során a hibás kromoszómaszegregáció eredményeként jönnek létre. A spermiumok citogenetikai vizsgálatára a fluorszecens in szitu hibridizáció (FISH) nyújt lehetőséget. A kezdeti eredmények arra utalnak, hogy a kóros sperma leletű férfiak egy részénél magasabb a spermiumokban a

numerikus kromoszóma eltérések aránya. A csökkent fertilitást okozó szerkezeti kromoszóma átrendeződések esetén is hasznos információval szolgálhat a spermiumok citogenetikai analízise. Így pl egy Y-3 transzlokációt hordozó betegünknél megállapítottuk, hogy az érett spermiumok 79%-a kiegyensúlyozatlan kromoszómakészletű. Azoknál a betegeknél, akiknél a citogenetikailag rendellenes spermiumok aránya jelentősen emelkedett, preimplantációs vagy prenatális diagnosztika javasolt a magzati anomáliák felismerése céljából. Anyagunkban olyan eset is előfordult, amikor a genetikailag ép spermiumok aránya minimális volt. Ilyenkor felmerül az asszisztált reprodukciós eljárások hiábavalósága. A prenatális diagnosztika során a FISH igen hasznos kiegészítő módszernek bizonyult. Az interfázis FISH alkalmazásával, a konvencionális kromoszómavizsgálatokhoz képest jóval nagyobb számú sejt analízisére adódik lehetőség. Megfelelő

előemésztés után a chorionban nem csak a trophoblast hanem a mesenchimális sejtekről is kaphatunk információt, így a diagnózis megbízhatósága jelentősen nő. A FISH révén a vizsgált kromoszómákra, akár a magzatvízsejtekről, akár a chorion sejtekről néhány napon belül megbízható eredményt kapunk. Ez a módszer nemcsak numerikus, hanem a strukturális anomáliák (mint pl a marker kromoszómák azonosítása) is fontos segítséget nyújt. Az előadásban még szó esik a FISH olyan további felhasználási lehetőségeiről is, mint pl. a preimplantációs genetika, a petesejtek, a néhány sejtes blastomerák, a mola és az abortátumok akár retrospektív (paraffinba ágyazott) vizsgálati lehetőségeiről, valamint ezek a jelentőségeiről is. 15 Nemi kromoszóma mozaicizmusok igazolása fluoreszcens in situ hibridizációval Dr.Dobos Matild, DrSzabó Judit, Prof Dr Fekete György SE-ÁOK II. Sz Gyermekgyógyászati Klinika A gonad dysgenesisek

heterogén csoportjába sorolt kórképek a nemi kromoszómákat érintő génmutációk vagy számbeli/szerkezeti nemi kromoszóma rendellenességek következményei. A külső nemi szervek a normális női állapottól a normális férfi status közötti széles skálát mutatják, az esetek mintegy 20 %-ában csak hypospadiasis és retentio testis kombinációja jelentkezik. A genitális és szomatikus fenotípus kialakulását az X-monosomiás sejtvonal aránya határozza meg, a f érfi fenotípushoz és közel normális testmagassághoz a 46, XY sejtvonal magasabb arányú jelenléte, míg a túlnyomóan X-monosomiás szöveti mozaicizmushoz női fenotípus, alacsonynövés és Turner-stigmák megjelenése társul. Az infantilis női fenotípussal megjelenő Turner-szindróma a kevés metafázis kromoszóma elemzését lehetővé tevő GTG sávmódszerrel csak a betegek 60 %-ában társul valódi Xmonosomiával, 15%-ban i (Xq), vagy különböző nemi kromoszóma mozaicizmus van

jelen, a t eljes genomban pedig PCR segítségével a b etegek 6-30%-ában Y-anyag jelenlétét mutatták ki. Ez magyarázza a Turner populációban észlelt jelentős fenotípusbeni eltéréseket. A fenotípus a különböző kromoszóma-összetétel milyenségétől, a normális és a kóros sejtek arányától és attól függ, hogy milyen szöveteket épít fel normális, ill. kóros sejtvonal Minél korábban alakul ki mozaik sejtvonal az embryonális életben, annál több szövetet érint (Blumethal, 1997). A IISz Gyermekklinika citogenetikai adatbázisából 15 leány vizsgálati eredményeit foglaljuk össze, a citogenetikai vizsgálat indikációja alacsonynövés Turner-stigmával vagy a nélkül, pubertás tarda és primer amenorrhoea voltak. Az újszülöttkorban felismerhető Turner-fenotípusú betegeket jelen vizsgálatból kizártuk A szöveti mozaicizmus eltérő voltát vizsgáltuk további 23 betegünkben is, akikben az X-monosomia legalább egy szövetben

Y-kromoszóma pozitív sejtvonallal társult. A betegek életkora 4 naptól 21 évig terjedt. A citogenetikai vizsgálatokat perifériás vérkultúrából tenyésztett lymphocyta kromoszómákon végeztük, GTG sávtechnikával értékeltünk 27– 50 metafázist. 25 beteg lymphocyta metafázis kromoszómáin végeztünk fluoreszcens in situ hibridizációt (FISH), majd a szöveti mozaicizmus további elemzésére a sz ájnyálhahártya sejtek interfázis magjainak FISH vizsgálatát végeztük el. Az alkalmazott D NA- próbák: wcpX é s wcpY, DXZ1 és DYZ1 (Q-BIOgene). A Turner-szindróma gyanúja miatt vizsgált 15 leány genitális fenotípusa infantilis női volt. Két szövet vizsgálata után 2 beteg esetében tiszta 45,X monosomiát találtunk, három betegben az X-kromoszóma aneuploidiáját már a G TG sávmódszerrel igazoltuk, két esetben lymphocyta és szájnyálkahártya FISH vizsgálata is megtörtént, amely a két szövetben eltérő arányú mozaicizmust

mutatott, a harmadik betegben csak metafázis kromoszómák FISH vizsgálatára volt módunk. 16 Lymphocyta metafázis kromoszómák vizsgálatával 10 beteg karyotípusa 46,XX, normális nőinek bizonyult, közülük 5 beteg metafázis kromoszómáin végzett hibridizáció (wcpX ) sem módosította az eredményt. A betegek szájnyálkahártya sejtjeinek elemzése (DXZ1) azonban 8 – 35 %-ban Xmonosomiát bizonyított 4 betegben a vérben és szájnyálkahártyasejteken egyaránt alacsony 4-7 %ban mutattunk ki X-monosomiát, és csak egy esetben vetettük el a citogenetikai rendellenesség lehetőségét a klinikai tünetek hátterében. Gonad dysgenesis gyanúja miatt vizsgált 23 betegünkben legalább egy szövetben Y-tartalmazó sejtvonalat találtunk. A genitális fenotípus 11 esetben döntően női, 4 esetben döntően férfi és 8 esetben átmeneti jellegű volt. A szöveti mozaicizmus eltérő volta ezekben az esetekben nem volt döntő szempont, hiszen a GTG

sávmódszerrel markernek látszó genetikai anyag természetének igazolása volt a cé l. A többszörös mozaicizmus, valamint az Ykromoszóma szerkezeti rendellenességének igazolása után azonban 5 esetben a mesenchymális és ectodermális szövetben feltételezhető különbségek összehasonlítására a FISH-t DXZ1 és DYZ1 próbával elvégeztük. A citogenetikai vizsgálatok 15 esetben 45,X/46XY mozaicizmust igazoltak, 7 beteg női külső genitáliával, 7 intersexualis jellegű külső nemi szervvel született és csak egy beteg volt genitálisan férfi. További 8 betegünkben Y-kromoszóma pozitív, többszörös, esetenként a nemi kromoszóma szerkezeti eltérésével társuló mozaicizmust észleltünk, a g enitális fenotípus 4 esetben női, 3 esetben férfi, egy esetben átmeneti jellegű volt. Buccális sejtekben és a lymphocytákban az XO/XY sejtvonalak aránya eltérő volt Nem megmagyarázható, hogy ugyanaz a genotípus miért jelentkezik ilyen eltérő

genitális fenotípussal. Hook és Wartburton már 1983-ban felvetette, hogy a cytogenetikai vagy molekuláris genetikai defektus különbsége okozza a fenotípus variabilitását, Held (1992) pedig, hogy az élve született X-monosomiás leányok legnagyobb részében rejtett nemi kromoszóma mozaicizmus van jelen. Az eltérő sejtvonalak ugyanazon szervezet különböző szöveteiben, különböző arányban vannak jelen, ezért ma már nem elegendő a mozaicizmus igazolására vagy kizárására egyetlen szövet vizsgálata. Elfogadott, hogy az X-monosomia mozaicizmusa az első vizsgált sejtvonalban 55%-ban, a másodikban 80 %-ban mutatható ki. A rejtett Y-sequencia jelenlétét jelentős eltéréssel igazolja az irodalom Turner-populációban, de átlagosan 20 %-ban lehet becsülni. Az aberrans gonadokban gyakran (mintegy 25 % -ban) alakul ki gonadobalstoma, különösen veszélyeztetettek azok a betegek, akiknek inkább női fenotípusuk van. A felnevelési nem, a kezelés és

a prognózis szempontjából fontos a molekuláris cytogenetikai technikákat a sávmódszerekkel társítva az előzőleg fel nem ismert markerek és szöveti mozaicizmusok korai felismerése. 17 Her-2 státusz meghatározás aspirációs cytologiai anyagon, FISH technikával. Első tapasztalatok. Dr. Sápi Zoltán Szent János Kórház, Pathologiai Osztály Semmelweis Egyetem, Onkopathologiai Tanszéki Csoport Fél év alatt a Szent János és Bajcsy Kórházak emlő aspirációs cytologiai anyagából (válogatás nélküli anyag) 52 esetben végeztünk FISH technikával (17-es chromosoma és Her-2 dual color FISH) H er-2 státusz meghatározást. 32 e setben (61%) nem volt amplificatio, míg 20 esetben (39%) amplificatiot tudtunk igazolni. 7 esetben tetrasomia volt amplificatio nélkül és 5 esetben a daganatsejtek legalább 10%-ában több mint 4 17 -es signál volt látható. Ezen utóbbi esetek mind amplificatiot mutattak. 1-1 esetben találtunk tri és monosomiát és

ezen esetekben a daganatsejtek mintegy 10%-ában kétszeres amplificatió volt. Masszív amplificatiot 7 e setben találtunk, 2-4 x-es amplificatiot 7 esetben (13%) és ezen esetek egy részében interpretációs probléma jelentkezett. Egyéb interpretációs problémával az esetek 9%-ában találkoztunk, de ezek döntően nem befolyásolták a végső megítélést. Konklúzió: az aspirációs cytologiai anyag igen alkalmas a Her-2 státusz pontos megítélésére, emellett finomabb elemzésekre és addicionális információk megadására (pl. 17-es chromosoma státusz meghatározása) is alkalmas. 18 A HER2 státusz meghatározásának algoritmusa gyakorlatunkban Dr. Orosz Zsolt Országos Onkológiai Intézet- Daganatpathológia A HER2/neu (c-erb-B2) az epidermalis növekedési faktor receptor családba tartozó, 185-kDa tömegű, tirozin-kináz aktivitású membránreceptor (p185HER2). A fehérjét kódoló gén a 17-es kromoszóma rövid karján (q21) helyezkedik el. A

HER2/neu gén amplifikációja az emlőrákos betegek 15-25%ában fordul elő, és ez az amplifikáció a membránban normálisan jelenlevő kb 20 000 Her2 fehérje megsokszorozódását (akár 2 millióig) eredményezi. A HER2/neu túltermelődés rosszabb prognózissal tárul, ugyanakkor lehetőséget ad az anti-HER2 monoklonális antitesttel (trastuzumab/Herceptin®) történő kezelésre. A kezelés potenciális cardiotoxicitása illetve az optimális terápiás eredmény eléréséhez alapvető fontosságú a terápiára alkalmas, azaz valóban HER2 pozitív betegek kiválasztása. A HER2 státusz daganatszövetből történő meghatározására alkalmazható módszerek, immunhisztokémia, fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) és valós idejű polimeráz láncreakció (RTPCR) közül egyik sem minősíthető „arany” standardnak. Mindhárom metódus alkalmas paraffinba ágyazott formalinban fixált minták vizsgálatára, így a vizsgálat során a mintavételi

hiba lehetősége minimálisra csökkenthető. Immunhisztokémiai vizsgálatra nagyszámú, különböző HER2 antitest áll rendelkezésre. Az immunhisztokémiai vizsgálat előnye, hogy a szöveti szerkezettel együtt elemezhető a HER2 reaktivitás. A módszer hátránya, hogy a membránpozitivitást mutató sejtek illetve a reakció intenzitásának megítélése - amit 0, +, ++ vagy +++-tel, jelölünk – nagymértékben szubjektív. A reaktivitást emellett a szövetek előkezelése és az immunhisztokémiai reakciók elvégzésének módja is jelentősen befolyásolhatja. A FISH vizsgálat sokkal pontosabb, kvantitatív értékelést tesz lehetővé, azonban a reakció értékelése időigényes, kivitelezése speciális képzettséget igényel, az értékeléshez, pedig fluoreszcens mikroszkóp szükséges. A meghatározás történhet kettős jelöléssel, a 17-es kromoszóma egyidejű kimutatásával, ilyenkor a normál 2 génkópia feletti számérték tekinthető

pozitívnak, illetve végezhetjük a vizsgálatot anélkül, ilyenkor 4 feletti génkópia jelenti az amplifikációt. Az Országos Onkológiai Intézetben közel 2 é ve végzünk rendszeresen HER2 meghatározást. Vizsgálati anyagunk részben saját, részben az ország más intézményeiből beküldött mintákból tevődik össze. A különböző immunhisztokémiai antitestekkel végzett HER2 protein meghatározás mellett Ventana Benchmark automatizált FISH készülékkel végezzük a gépkópiák kimutatását. Az előadásban bemutatásra kerülnek a lehetséges technikai és értékelési problémák, illetve az összegyűlt tapasztalatok alapján mára kialakított HER2 diagnosztikus algoritmus. 19