Kémia | Felsőoktatás » Poliszacharidok, biopolimerek fermentációja

POLISZACHARIDOK (BIOPOLIMEREK) FERMENTÁCIÓJA (PSZ.) inulin (ß(21) A növényi poliszacharidokat régen alkalmazzák: keményítő, cellulóz, agar-agar, alginát, pektin . A mikróbiális poliszacharidokat néhány évtizede, de sok van! Dextrán, xantán, pullulán, szkleroglukán Unikális fiz. tulajdonság: gélképzés és viszkozitás növelés Lokalizáció: - sejtfal komponens - (felületi makromolekulához kapcsolódik) - Extracelluláris komponens: nyálkahártya: zselés kolónia, viszkózus tenyészoldat 1. Exo poliszacharid tulajdonságok, szerkezet: Alkotó komponensek: nagy változatosság karboxilcsop. hidroxilcsop. β-izomer pozícióban hidroxilcsop. α-izomer pozícióban C1 aszimmetrikus szénatom β-D glükóz piranóz forma (6 tagú gyűrű) a = a D-mannóz 2. szénatomján levő hidroxilcsop. helyzete glükurónsav polianionos jelleg: urónsav piroszőlősav kationkötők: Ca, Ba, Na a tisztításnál fontos b = a D-galaktóz 4. szénatomján levő

hidroxilcsop. helyzete L-glükóz A hidrofil/anionos jelleg erősödik ketálképzés mannóz -4 CH3 C -6 COOH észterképzés mannóz C6O-acetát a lipofil jelleg erősödik ecetsav propionsav glicerinsav borkősav? Ábra: a mikrobiális exopoliszacharidok egyes alkotóelemei 2 Exo poliszacharid szerkezet - Homo poliszacharid - Hetero poliszacharid 3 Homo poliszacharid típus ismert: + pullulán Ábrázolási módok (LINEÁRIS) CURDLÁN (OLDALLÁNC) SZLEROGLIKÁN (ELÁGAZÓ) DEXTRÁN Hetero poliszacharid: különböző cukrokat – ismétlődő „alegységeket” tartalmaz Alegység Pentaszacharid egység az anionos jelleg a hidrofil hatást erősíti Ábra: a xantán szerkezete háromféleképpen ábrázolva 3 Dextrán: Szacharóz Leuconostoc mesenteroides Dextrán – sacharáz dextrán +(n-1) Fruktóz Transzglikozilálás! Lineáris rész: α(1-6), elágazás α(1-4): glükóz polimer Irreverzibilis 100 %-os konverzió. Molekulatömeg: 15 000 – 500 000

Cukorgyárakban: léfertőződés Leván: Szacharóz Leván szacharáz Aerobacter levanicum Bacillus subtilis 2 Æ 3 fruktozid kötés leván +fruktóz+glukóz Konverzió: 62 % : fruktóz polimer Poliszacharid tulajdonság: viszkozitás, függ a hőmérséklettől és a nyírástól Olvadáspont Polimer Tm (kb.) ºC xantán 120 szukcinoglikán 70 szkleroglikán 150 velán 150 Tm felett degradálódás 4 A Tm feletti hőmérsékleten viszonylag kicsi a viszkozitás változása Ábra: A hőmérséklet hatása a viszkozitásra Nyírás (nyíróerő): kis nyíróerő: nagy viszkozitás nagy nyíróerő: kis viszkozitás Jó szivattyúzhatóság, porlaszthatóság Szerkezeti viszkozitás: áramlás xantán Gélképzés: általános tulajdonság Alginát: Ca-t igényel (poligerluronat) Funkció: kiszáradás ellen fagocitózis, fágok ellen tartalék tápanyag (xantán nem) immunológiai determináns Polihidroxibutirát (PHB) (3-OH vajsav polimer): észter (lehet 4-OH polimer is)

Polihidrroxi-alkanoát (PHA): (5 – 15 szénatomos sav) Alcaligenes enthrophus ICI 1982 Szabadalom: 11 – 16 ipari törzs: BIOPOL A sejt 80 %-a PHB: granulumban: tartalék tápanyag Biodegradábilis, biokompatibilis polimer 100 – 30 000 monomer. 5 2. A poliszacharidok bioszintézise általában: a bioszintézis a citoplazmában történik, ezután (közben) kijut a külső térbe dextrán, leván: extracelluláris szintézis: transzglükozilálás UDP – cukor Központi szerep: - cukor interkonverzió (cukor P. is!) Ábra: a cukorfoszfátok és cukor-nukleotid foszfátok interkonverziója GDP - cukor - energia a poliszacharid szintézishez Acetil CoA: ecetsav transzfer Szintézis: xantán Ábra: a xantán bioszintézisének egyszerűsített vázlata 6 Exo poliszacharid képzés genetikája: Xanthomonas campestris: xantán (mutációval) Xantán cluster nagy operon: 16 Kb DNS szekvencia: 12 gén hasítás BAM H1 restrikciós enzimmel 1Az egyes gének biokémiai

funkciói: I-V: transzferáz, I-V. Acy: acetiláz, I-II Ket: ketáz, Pol: polimeráz, Exp: export 2Xantán gének, gumB-M 3BAM H1 restrikciós térkép, amely megadja a 16 Kb-os xantán cluster fragmenseinek hozzávetőleges méretét (Kb) 3. POLISZACHARID FERMENTÁCIÓ (általános elvek) Tápközeg: normál. szénforrás: szacharóz (dextrán, leván), glükóz (többi poliszacharid) Fermentor: 50 – 200 m3, különleges keverővel Törzs, inokulum : N2 gáz ( -80 ˚C), liofilezett törzstenyészet „Papírcsík inokulum”: 1 évig stabil 4 ˚C - on 7 Fermentáció: pH: 6 – 7,5 (xantán opt. pH: 7; pH: 5 alatt a folyamat lelassul!) Hőmérséklet: a ˚C maximumig emelik: viszkozitás csökken, OTR: nő OTR: lásd alábbi ábra 3% xantán viszkozitása: 10 000 cP felett! Oxigen transfer rate – OTR Elmenő levegő: szűrés. Növénypatogén! Xantán: legfontosabb: 10 000 t/év. 408 M USD/év Xanthomonas campestris: növény patogén: káposzta, gyümölcsfák Minden

kimenő anyagot sterilezni! Könnyen befertőződik: xantán burok miatt tg =nagy, lassan növekszik Glükóz + NH3 : N-forrás szabja meg a végső %-ot (N-limit) (glutarátot helyettesítheti) Nagy a viszkozitás: I típusú fermentáció: Ábra: Xantán gumi batch fermentációja X. campestris-szel 4 – 5 % glükóz – 25 – 30 g xantán/l; konverzió: 70 % -os. pH szabályozás: 7 ± 0,3 . (Savképződés: termékképz lassul, leáll) Anyagátadás: holt terek ne legyenek Nagy keverő (kavaró) átmérő. 8 Buborék: nagy – gyorsan felszáll és kis relatív felület: OTR kicsi kis - stabil diszperzió (áll a buborék) – egyensúlyi gázösszetétellel: OTR kicsi Szukcinoglikán: III. típusú fermentáció, N-limit Ábra: Szukcinoglikán batch fermentációja Pseudomonas fajjal Dextrán: 10 – 20 % szacharóz + 2% CSL. Sejtnövekedés – termékképződés gyenge BIOGAL Enzimes technológia: nem gazdaságos Dextránképzéshez nem kell levegőztetés, csak kevés

(2 nap) O2 limit 0,5 g baktérium 80 g dextránt termel Tejsavképződés: pH szabályozás Kicsapás: metil-alkohol. Szűrés Pirogénmentes vízben oldás metil-alkoholos kicsapás Vérplazma: a) HCl. 100 ˚C lebontás (viszkozitás csökkenés) Frakcionált kicsapás – kis molekulatömeg – vérplazma, – nagy molekulatömeg: visszavezetés – HCl hidrolízis b) Enzimes hidrolízis: Dextranóz. P funiculosum 4. DOWN STREAM műveletek a.) Ultraszűrés (+porlasztva szárítás) 5 – 10 szeres koncentrálás (xantán) - dezinficiálni az oldatot (biol. Lebontás) – hátrány! - Kis molekulatömegű komponensek (tápoldatból) eltávoznak – előny. - Olcsóbb, nincs oldószervisszanyerés b.) Szerves oldószeres kicsapás: Metanol, Etanol, aceton, propan -2-ol Xantán: oldószer mennyisége csökkenthető (4x-re): Ca, K adagolásával. (Melegítés: 100 – 130 ˚C, 1 – 15 ’) Szárításnál vigyázni: robbanásveszély. Szárazon tárolandó: biológiai lebontás.

Élelmiszer célra (FDA): 10 000 sejt/g max! 9 Propilén-oxidos dezinficiálás + ˚C : megöli a sejteket. Kicsapás: Metanol; pH=5,6; 25% MeOH: viszkozitás csökkenés: centrifugálással: a sejt és a lebegő részek eltávolíthatók + 2 % KCr + 70 % MeOH: szűrés 5. ALKALMAZÁS - Por (élelmiszer célra: dezinficiálás) - Oldat 8 % ( + dezinficiáló anyag – eltartás) Xantán: 60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, salátadresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelő 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textil 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett) (Ca alginát sejt enzim immobilizálás: enyhe körülmények!) Dextrán: Vérplazma pótló: 6 %-os oldat, 50 – 100 000 Molekulatömeg Sephadex: gélkromatográfia Vizes kétfázisú rendszer elválasztás: kis felületi feszültség Liganddal: Enzimek PEG-Dextrán: növelni a megoszlást PEG-hez kapcsolt 6. CIKLODEXTRINEK (CD) (Schardinger dextrinek) (Szejtli

J) α - amilázzal hidrolizált (burgonya) keményítő ciklodextrin-glikoziltranszferáz (CGT-áz) (lineáris és) gyűrűs dextrinek CGT-áz: 1. Bac macerans 2. Alkalofil Bakt № 38-2 3. Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B subtilis-be CGT-áz gyártás: mikroba tenyésztés, CGT-áz izolálás CD gyártás: 1. Előhidrolízis: α – amilázzal 5 % keményítő 10DE értékig 2. Konverzió: CGT-ázzal 34 ˚C-on 58 % konverzió 3. α-, β-, γ- CD arány szabályozása (6,7,8 glükóz) Ábra: a ciklodextrinek szerkezete n = glükopiranóz egységek száma. n = 0: α-CD, 1: β-CD, 2: γ-CD CD izolálás 10 a.) Mikrobától is függ: 1,3 kezdetben elsősorban α-t 2. Kezdetben elsősorban β-t b.) Toluol adagolás: β-val zárványkomplex (αÆβ), a végén: 90 % β – CD, 1 % αCD c.) 1-dekanol adagolás: 36 % αCD és 3,7 % β CD d.) Enzim mennyiség 15 E CGT-áz/g keményítő : 24 % CD 90 E CGT-áz/g keményítő : 56 % CD β – CD termelés: 33 %-os

Keményítő. pH=7,2 (HCl), Ca(OH)2 + B subtilis α-amiláz 80 ˚C, 10’ hidrolízis. E inaktiválása: 120 ˚C, 30’ Konverzió: 50 ˚C CGT-áz, 5 % toluol + keverés 105 h! Komplex szűrés, vákuum bepárlás (toluol elmegy), szűrés, krist. α – CD termelés: jól oldódik, kristályosítani nehéz. Komplexáló vegyület: decanol Konverzió. Oldékonyság 140 mg/ml Nincs β és γ Kitermelés: 50 %. Dekanol vízgőzzel eltávolítható γ – CD termelés: β – CD gyártás mellékterméke. 750 g keményítőből 14 g γ – CD nyerhető ioncserélő oszlopon. Komplexáló szerrel: metil-etilketon-α-naftol keveréknél Konverzió CGT-ázzal. Oldhatatlan komplex Metanolban oldódik Ioncsere, aktívszenes tisztítás. Kitermelés: 20 % Elágazó CD: az 1,6 kötés beépülésekor 1,2,3 glükóz lehet a gyűrűn CD származékok: OH-hoz köthető. Legnagyobb mennyiség: metil, hidroxipropil CD. (Fig4) Ilyenkor az oldhatóság, a komplexképző tulajdonság, és a

vendégmolekula reaktivitása is módosul A CD „gazda molekula” adduktot, inklúziós komplexet képez a „vendégmolekulával” (Fig.3) α, β, γ és származékok: gazdamolekula választék: különböző vendéget köt Így növelni lehet az oldhatóságot: terfenadin (antiallergikum): 60 mg/6 l víz Æ60 mg komplex/1 ml víz. A reaktivitás is változik: ált csökken (Fig6) + Gyógyszerek Ábra: Az inklúziós komplexek képződésének vázlata. A kis körök jelölik a vízmolekulákat, amelyeket mind a hidrofób p-xilol molekula (potenciális vendég molekula), mind a ciklodextrin hidrofób ürege taszítja. Az inklúzió hajtóereje főként az apoláros-poláros kölcsönhatások (pl.: az apoláros CD-üreg és a víz, vagy az apoláros vendégmolekula és a víz között) apoláros-apoláros kölcsönhatásokra (vendégmolekula – CD-üreg) való kicserélődése jelenti. 11 Alkalmazás 1. Gyógyszer: oldhatóság nő, felszívódás Biohozzáférhetőség nő

Gyors oszcilláció Injekciók: vízben nem oldható vegyületek üreg méret: 1 mol: 1 g: Ábra: a β-ciklodextrinek szerkezete és az α,β illetve γ ciklodextrinek hozzávetőleges üregméretei Stabilizál: nem párolog el, oxidálás ellen, hőstabilitás nő Irritáló hatás csökken (indometacin) Prostaglandin E2- β-CD: szublingualis (szülés indítás) Prostaglandin E1- α-CD: injekció (érszűkület) Benexate- β-CD: gyomorfekély Fokhagymaolaj β-CD: koleszterin csökkentés Prognózis: néhány 100 t/év felhasználás 2. Élelmiszer, kozmetikum: Íz, zamat: illó vegyület – stabilizál Oxidálás ellen véd Hagyma β-CD: Élelmiszeraromák (Magyarországon 1983 óta) Alacsony koleszterint tartalmazó vaj előállítása (Belgium): olvadt vaj + β-CD, 1 lépésben a koleszterin 90 %-a eltávolítható 12 Kellemetlen íz, illat eltávolítás: kávé, tea, keserű íz. Kávé oldószermentes koffeinmentesítése Kozmetikumok: hosszú ideig megtartják az

illatot 3. Biotechnológia: Mikrobiológiai konverzió Hidrokortizon – β-CD Æ prednisolon (Udvardyné 1983) aciláz Lanatozid C – dimetil CD digoxin Hozam:20 %Æ50-60 % Β-glükozidáz Ábra: a lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinné. D = digitoxóz, G = D-glükopiranóz, Ac = acetil csoport Bordatella pertussis: zsírsav inhibeálja a növekedédt. + β-CD zsírsav komplex: jó szaporodás Mycobacterium leprae: nem szaporodott fermenterben, mivel az esszenciális palmitin és sztearinsavat nem tudta a vizes fázisból felvenni + dimetil β-CD: növekedés A dimetil – β-CD – zsírsav komplex helyettesíti a szérumot állat szövettenyészetekben: interferon, MCAB termelés Szennyvíz detoxifikálás. Klórozott aromás vegyületeknél: β-CD kis konc. nagy konc. nagy konc. szennyvíz eleveniszap nem toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus megy toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus leáll nem toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a

metabolizmus megy Ábra: a mérgező vegyületek tolerálható szintjét növeli a CD hozzáadása a mérgező szennyvízhez 13 Biospecifikus elválasztás: amilázok megkötése Mátrix CD E D CD D CD D S’E- komplex CYCLODEXTRIN GLIKOZILTRANSFERÁZ (Bac. Circulans) EC 24119 Klebsiella pneumoniae: E. klónozás B subtilis-be α- amilázzal hidrolizált keményítő 10 DE-ig E Lineáris és gyűrűs dextrinek β-CD előállítás 1.) 33 %-os keményítő: pH: 7,2, Ca++, α- amiláz, 80 ˚C, 1 h: hidrolízis 2.) 100 ˚C, 30’, E, inaktiválás 3.) 50 ˚C, 100 h, 5 % toluol, E2, konverzió 4.) Bepárlás: toluol elmegy Kristályosítás: Hozam: 90 % β-CD α-CD előállítás Konverzió: dekanol. Csak α-CD képződik Hozam: 50 % Dekanol vízgőzzel eltávolítható CD izolálás 14 Ciclodextrin (CD): α(6c), β(7c), γ(8c). Származékok Ábra: A kristályos heptakisz(2,6-di-O-metil)-β-ciklodextrin (DIMEB) és a véletlenszerűen hidroxipropilált

β-ciklodextrin szerkezete. Az iparilag előállított nem kristályosítható, véletlenszerűen metilezett β-ciklodextrin (RAMEB) ugyancsak kb. 14 metoxi csoportot tartalmaz, de véletlenszerű eloszlással. 15 Oldott enzim, vizes fázis: α, β és γ keverék képződik pH: 6, T= 55 ˚C Hozam: α=23 %, β=11 % A ciklodextrin inhibitálja az enzimet. α megkötés: sztearinsav ligandon – kitozán hordozón. Szelektivitás: 100 % β megkötés: ciklohexán – propánamid és n-kapronsavval. Toluol αÆβ (90 %) Az adszorbciós kolonnába vezetés előtt hűtés 30 ˚C-ra és 3 5 NaCl adagolás: megakadályozza az E. adszorpcióját a kolonnán MARCIAN Co. Japan termelés A CD gazdamolekula – vendégmolekeula. Addukt inklúziós komplex Ábra: a β-ciklodextrinek szerkezete és az α,β illetve γ ciklodextrinek hozzávetőleges üregméretei 16 Ábra: Az inklúziós komplexek képződésének vázlata. A kis körök jelölik a vízmolekulákat, amelyeket mind a

hidrofób p-xilol molekula (potenciális vendég molekula), mind a ciklodextrin hidrofób ürege taszítja. Az inklúzió hajtóereje főként az apoláros-poláros kölcsönhatások (pl.: az apoláros CD-üreg és a víz, vagy az apoláros vendégmolekula és a víz között) apoláros-apoláros kölcsönhatásokra (vendégmolekula – CD-üreg) való kicserélődése jelenti. Ábra: A megfelelő vendégmolekulákkal alkotott „duplex” CD szerkezetekkel létrejöhetnek akár Kdis ≈ 106-109 dm3 /mol inklúziós komplexek is 17 Ábra: A „gazda-vendég” kölcsönhatás vázlatosan. Az inkúziós komplex egy igen mozgékony „tároló”, amely az egyébként lassan oldódó „szabad” vendégmolekulát konstans koncentrációban tartalmazza. 18 Ösztradiol Progesztreron ampicillin prosztaglandin F Ábra: hatóanyag-ciklodextrin komplexek