Kémia | Biokémia » Dr. Kutasi József - Fermentációs biotechnológia

Dr. Kutasi József - Fermentációs biotechnológia 1. Fermentációs technológiák általában 1. Bevezetés 2. Törzsek izolálása, screening 3. A törzsek nemesítése, törzsfejlesztés, törzsfenntartás 3.1 Törzsfenntartás 4. Ipari fermentációs tápanyagok, fokozatok, eljárások 4.1 Fermentációs eljárások 4.2 Nyersanyagok 4.3 Fermentációs fokozatok (Scale-up) 2. Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek 1. Aminosavak 1.1 Nátrium-glutamát 1.2 L-Lizin 1.3 L-triptofán 2. Enzimek 2.1 Fehérjebontó enzimek, proteázok, peptidázok 2.2 Keményítőbontó poliszacharidázok és oligoszacharidázok 2.3 Pektinázok és lipázok 2.4 NSP (nem keményítő típusú) enzimek 2.5 Enzimek a takarmányozásban 3. Vitaminok 3.1 B12 vitamin (ciano-kobalamin) 3.2 B2 vitamin (Riboflavin) 3.3 Karotinoidok 3.4 A C-vitamin (L-aszkorbinsav) és az E-vitamin (alfa-tokoferol) bioszintetikus előállítása 3.5 Az új szuper E-vitamin: az astaxanthin 4.

Antibiotikumok 4.1 Béta-laktám antibiotikumok 4.2 Penicillinek 4.3 Cefalosporinok 4.4 A klavulánsav 4.5 Aminosav és peptid antibiotikumok 4.6 Glükozidok, amino-glükozidok, cukorszármazékok 4.7 Makrociklusos-lakton-antibiotikumok 4.8 Tetraciklinek és antraciklinek 4.9 Aromás antibiotikumok 4.10 Antibiotikus citosztatikumok 4.11 Takarmány és növényvédelmi antibiotikumok 5. Anyarozs alkaloidok 5.1 Előfordulásuk, jelentőségük 5.2 Szaprofita Claviceps törzsek fermentációs tenyésztése 6. Szerves savak 6.1 Almasav 6.2 Citromsav 6.3 Itakonsav 6.4 Ecetsav 6.5 Tejsav 3. Speciális fermentációs termékek és eljárások 1. Egysejt fehérjék(SCP) 1.1 Gombák és baktériumok SCP-i 2. Egysejt olajok 2.1 Az esszenciális SCO olajok élettani hatásai a humán szervezetre és jelentőségük. 2.2 Az esszenciális olajok előfordulása 2.3 A politelítetlen zsírsavak (PUFA egysejtolajok) bioszintézise mikroszervezetekben. 2.4 EPS és DHS forrás egysejtolaj termelő

algák fejlesztése 2.5 A politelítetlen esszenciális ω-3 zsírsavak nagy tömegű felhasználása takarmányadalékként 3. Rekombináns génmódosított termékek 3.1 Gyógyászati célú termékek rekombinációs előállítása 4. Immunológiai termékek 4.1 Az emlőssejtek speciális tenyésztése 5. Koleszterinszint csökkentő mevinin savak 6. Növényi és emlős növekedési hormonok 7. Biológiailag lebomló poliszacharid műanyagok 8. Élelmiszeripari termékek rekombinációja (pl Almasav előállítás) 9. Bioenergia előállítás rekombináns módszerekkel 4. Bioenergia források 1. Biogáz termelés 1.1 Biogáz alapanyagok 1.2 Metántermelés 2. Bioetanol előállítás 2.1 Az etanoltermelés bioszintézise 2.2 Bioetanol gyártás gabonából vagy melaszból 2.3 Bioetanol gyártás növényi rostokból és faipari hulladékokból 5. Galéria 6. Videótár 7. Szószedet A táblázatok listája 2.1 A főbb gabonafélék rostalkotó és NSP tartalma (Fekete 1994) 2.2 A

főbb gabonafélék rostalkotó és NSP tartalma (Fekete 1994) 3.1 Különböző mikroorganizmusok és tengeri halak olajának zsírsav összetétele (KYLE és GLADUE 1992, Tocher és mtsi.1998) 3.2 Mikroalgák zsírsav- és EPA összetétele rázott lombikos kultúrában néhány halfajjal összehasonlítva (KYLE és GLADUE 1989) 3.3 Jól szaporodó algák biomasszája és lipidtartalma (YANGMANITCHAI és WARD 1989) 3.4 Különböző mikroorganizmusok és tengeri halak olajának zsírsav összetétele (KYLE és GLADUE 1992, Tocher és mtsi.1998) 7.1 Szószedet Előszó A biotechnológia forradalmát az utóbbi négy évtizedben emlegetik és valóban, azóta tömegméretűvé vált alkalmazása a laboratóriumokban és az iparban. A mikroorganizmusokkal való fermentációs munka az élelmiszeripar számos ágában, a gyógyszeripar egyes – igen fontos – területein és a vegyipar bizonyos ágaiban is alapvető technológiai folyamattá vált. Ugyanakkor az iskolai

tankönyvek még mindig mostohán kezelik, sőt nem is tárgyalják e tudományt, pedig ma már megállapítható, hogy az alapvető kémiai, fizikai, biológiai ismeretek mellett a 21. század új önálló tudományágának tekinthetjük. Mindezek miatt a hétköznapi ember egyre értetlenebbül áll a különböző biotechnológiai folyamatok és termékek előtt. Pedig a biotechnológia nem új, az alkoholos erjesztést (sör és borgyártás), a kenyér kelesztését, az aludttej előállítását, a pálinkaerjesztést, a szalámi vagy sajtok penészedését már ősidők óta alkalmazzák és ismerik. A fermentációs biotechnológia tudományos hátterét először az antibiotikumok termelése teremtette meg. Létrejött a fermentációs ipar, és kb az 1960-as évektől magas színvonalúvá fejlődve már géntechnológiai termékeket is előállít. A géntechnológia természetesen nem azonos a biotechnológiával - ez előzőekből jól látható -, csak annak egy fontos

ága, szelete. A biotechnológia a mikrobiológia, genetika, növénytermesztés, élelmiszeripar és biokémia integrálása annak céljából, hogy a mikroszervezeteket ipari célra hasznosítsák. Ennek a könyvnek az a célja, hogy példákkal illusztrálva megismertesse, miként lehet fermentálni és így előállítani biotechnológiai termékeket, valamint mind a középiskolások mind az egyetemeken tanulók számára hasznos biotechnológiai ismereteket nyújtson. Igaz, nincs benne minden, ami a diákok általános tudásához szükséges, ugyanakkor tanulni lehet belőle, ezért tankönyvnek nevezhető. Jó olvasást! 1. fejezet - Fermentációs technológiák általában Tartalom 1. Bevezetés 2. Törzsek izolálása, screening 3. A törzsek nemesítése, törzsfejlesztés, törzsfenntartás 3.1 Törzsfenntartás 4. Ipari fermentációs tápanyagok, fokozatok, eljárások 4.1 Fermentációs eljárások 4.2 Nyersanyagok 4.3 Fermentációs fokozatok (Scale-up) 1.

Bevezetés A fermentáció olyan technológiai folyamat, amelynek során a jelen levő élő mikroorganizmusok szaporodásának, életfolyamataik és enzimjeik hatására bonyolult biokémiai változások mennek végbe az alapanyagokban. E folyamatot jellemzően baktériumok és/vagy gombák – kivételes esetekben algák, növényi eukarióta sejtek esetleg emlőssejtek - használatával végzik, és szénhidrátok lebontása során primer, illetve szekunder metabolitokat (anyagcseretermékeket) állítanak elő, vagy biokonverzióval értékes anyagokat alakítanak át. Tipikus fermentációs termékek az aminosavak, enzimek, vitaminok, antibiotikumok(pl. penicillinek, sztreptomicinek, tetraciklinek, stb.), konvertált szteroidok (biotranszformáció) és rekombináns fehérjék (pl. r-inzulin, rkalcitonin, stb) Természetesen termékek lehetnek önmagukban is a baktériumok és gombák (biomassza), vagy általuk előállított fehérjék és olajok (pl. probiotikumok,

egysejt-fehérjék és olajok). A mikrobákkal való gyártás alapvető művelete tehát a mikrobák elszaporítása. A technológia fő szempontjai a következők: a kívánt anyagot (fehérjét, molekulát, enzimet stb.) termelő mikrobafajt megtaláljuk (felfedezés), izoláljuk és azonosítjuk, majd ezekből a megfelelően termelő mikrobatörzset kiválasztjuk (screening). A kiválasztott törzsek tenyésztési körülményeit megállapítjuk, végül üzemi körülmények között (scale-up) a fejlesztett mikroorganizmus adott pl. metabolit előállítását optimalizáljuk és a fermentációs léből (fermentlé) vagy magából a mikrobasejtekből ezt az anyagot kinyerjük. 2. Törzsek izolálása, screening A tulajdonképpeni biotechnológiának, mint önálló tudománynak a megjelenésérol a penicillin előállításának, mint az első antibiotikummal kapcsolatban kidolgozott steril technikának és az izolált törzsek nemesítésének és kezelésének

kidolgozásától beszélhetünk. Sir Alexander Fleming még a laboratóriumába véletlenül bejutott penészgombából izolálta és fedezte fel a kórokozókat pusztító penicillint. Amerikai kollégái már – feltételezve, hogy más penésztörzsek nagyobb mennyiségben is képesek lehetnek penicillin előállításra – klasszikus értelemben biotechnológiai szűrést végezve választották ki a világ első ipari gyártásba vont nagy koncentrációban penicillint előállító Penicillium chrysogenium gombatörzset. Tisztatenyészet előállítása és az izolátum azonosítása Steril mikroszkópos minta(natív) készítés steril boxban. Ezek a vizsgálatok minimálisan a mikrobák százaira vagy akár ezreire is kiterjed egy– egy program esetén. Ezért steril oltószoba, lamináris boksz (oltófülke) Függőleges levegőáramlású oltóhely. A készülék a felül elhelyezett HEPA szűrőlamellákon keresztül steril csíramentes levegőt fúj a

munkaasztalra, így a levegőben előforduló fertőző csírák nem veszélyeztetik a mikrobiológiai munkát. UV germicid lámpákkal, autoklávok, certoklávok (speciális kuktafazekak), A certokláv felfűtés alatt. A nyomásmérő 0,5 bar túlnyomáson van A certoklávon nyomásmérő, hőmérő, biztonsági szelep, gőzkiengedő nyílás(fekete) és reteszes zár található.Nagybetűs többnyelvű felirat figyelmeztet a forró felületre Nagyobb edények, fermentorok sterilzésre a vízköpenyes autoklávok alkalmasak. Működésük elve azonos a certoklávokkal, a különbség hogy a telített nagynyomású gőz a készülék köpenyében képződik. Az óriás autokláv felső részén találhatók a nyomás és hőmérők, párosával, külön-külön mérve a belső tér és a köpeny hőmérséklete és nyomása. Az újabb típusu autoklávok reteszes-karos (kék színű borítás)zárószerkezettel vannak ellátva a nehézkes 10-15 óriás csavar helyett.A biztos

működést a készülék oldalán nyomásmérő automata biztosítja, amely 1,2 atm túlnyomáson tartja a steilezési idő alatt belső tér nyomását. A hőlégsterilező ajtaján felül az analóg hőmérő, az ajtó mellett az fél automatika időzítő szerkezet látható. inkubátorok (aerob, anaerob és szén-dioxid termosztátok), homogenizátor, steril üveg és műanyag eszközök (Petri-csészék, pipetták), A gamma sugárzással sterilezett műanyag petricsészék ma már széles körben elterjedtek. Leforrasztott zacskókban forgalmazzák, speciális már kiöntött agar táptalajjal együtt is. Képünkön a laboraratóriumban steril boxban már kiöntött és megdermett agar táptalajt tartalmazó steril petriszészéket látunk. A gamma sugárzással sterilezett 1, 5, 10, 25 ml-es pipetták már széles körben elterjedtek. Hátrányuk, előnyük is:egyszer használatosak, ugyanakkor garantáltan sterilek.Leforrasztott zacskókban egyenként vagy tízesével

húszasával csomagolják mérlegek, pH mérő, Üvegpipettákat bádogdobozban vagy nátronpapírban (sterilezési hőt elviseli, illetve a nedvességre nem foszlik) sterilezhetünk. Vortex kémcsőkeverő, kémcsőforgató, körkörös kitérésű malomszita- vagy síkrázógép és mikroszkóp, A biotechnológiai munkákhoz elengedhetetlen a nagy nagyítású fáziskontraszt feltétű mikroszkóp (400x, 650, 800x, 1000x-os), így könnyen megkülönböztethetők és vizsgálhatók a baktériumok, mivel testük átlátszatlan és fekete, Továbbá az életképességi és pl. spórafestési vizsgálatokhoz fluoreszcens festékkel jelölve a mikroorganizmusokat, különböző hullámhossszúságú gerjesztő fénnyel megvilágítva fluoreszcencia alapján jellemzhetők. A fáziskontraszt feltét tárcsája (középen )biztosítja a megfelelő élességet a különböző naygításokhoz, alul a baktériumokat átvilágító lámpa kimenő nyílása látható. valamint megfelelő

mikrobiológiai és analitikai vegyszerek szükségesek a munkák kivitelezéséhez. Természetesen csak steril eszközökkel és steril környezetben lehetséges a mikroorganizmusokkal való munka! (Az 1.- 15 kép, mozgó bemutatja ezeket az eszközöket pl. lamináris boksz működését) A mikroba izolálás lehetséges közvetlenül vagy dúsítással a környezeti elemből (pl. talaj, víz, növénybelső). A talajból közvetlenül készítünk szuszpenziót, homogenizáljuk és agarlemezen szélesztéssel vizsgáljuk, vagy több lépés után a mintából több nap után feldúsuló mikroorganizmusokat szélesztjük. A szélesztés során különböző agar tartalmú táptalajokat kell alkalmazni a minta jellegétől és a kívánt organizmus fajtájától függően. A célvegyület termelési képességén túl, fontos, hogy fermentációra kiválasztott törzs ne legyen patogén, ne termeljen toxikus anyagokat, és a törzs legyen élettanilag állandó, azaz a

változékonysága minimális. 3. A törzsek nemesítése, törzsfejlesztés, törzsfenntartás Mikroorganizmusok izolálása talajból, screening és kinyerés sematikus ábrája. A vadtípusú törzsek sohasem szintetizálnak nagy mennyiségben a kérdéses vegyületből, ezért célzottan nemesíteni szükséges őket. A fermentációs folyamatokban munkára fogott mikroorganizmusok szülőegyede, a vad törzs (wild-type strain) mindig a természetbol izolált. Ezeket a törzseket tovább vizsgálva szelekcióval, esetleg mutánsnyeréssel választják ki, meghatározott vizsgálati szűrő módszerekkel (screening) a keresett metabolitot, enzimet, stb. termelő mikroorganizmusokat Ez lehetséges tisztán szelekcióval csak a legjobban termelő altörzsek kiválasztásával vagy mutációs, illetve ha máshogy nem lehetséges, rekombinációs technikával. A mikroorganizmusok genetikailag könnyen manipulálható szervezetek. A mikrobiológiai gyakorlatban jól ismert klasszikus

mutációs technikákkal (pl. nitrozo-guanidinnel, etil-metil-szulfonáttal mint mutagén anyaggal való kezelés vagy UV besugárzás) a DNS bázissorrendjének véletlenszerű átalakításával mutáns sejtvonalak állíthatók elő. Enzimatikusan emésztve a baktérium sejtfalat (pl. lizozimmal), olyan protoplaszt tenyészetet hozhatunk létre, amely érzékenyebb a mutációs kezelésekre, másrészt egymással vagy más tenyészet protoplasztsejtjeivel fuzionálva új un. hibrid sejtvonal állítható elő Sőt, közvetlenül a genetikai állományba beavatkozva - vektorokkal géneket a sejtekbe juttatva, olyan transzformánsokat hozhatunk létre, amelyekben többszörös mennyiségben halmozódnak fel a keresett vegyületek. Továbbá ahhoz, hogy a fermentációs módszer gazdaságos legyen, sokszor olyan nemesített törzsek szükségesek, melyek tenyészthetőségi tulajdonságai jobbak, mint a vad típusú törzsé. A nemesített törzseket, sejtvonalakat legáltalánosabban

liofilizálással (fagyasztva szárító), ahol ez nem lehetséges folyékony nitrogénben tartósítják. 3.1 Törzsfenntartás Mikroorganizmusok élő és tiszta tenyészetek formájában történő fenntartására valamennyi mikrobiológusnak szüksége van. Mint ahogy a kémia vagy biokémia is megszünne vegyszerutánpótlás nélkül, úgy a mikrobiológia is erősen függ a tiszta és stabil tenyészetek elérhetőségétől. Legtöbb vegyszerrel ellentétben, melyek könnyen tárolhatók, a mikroba tenyészetek eléggé érzékenyek és fertőződhetnek, változhatnak vagy elpusztulhatnak kellő szakértelem hiányában. A megfelelő törzsfenntartási módszereknek így igen nagy jelentőségük van. A kutatók egy része már a múlt század végén javasolta olyan helyek létrehozását, ahol mikroorganizmusokat tárolnának nagy számban tudományos és egyéb célra. Az 1904- ben alapított Centraalbureau voor Schimmelcultures ( CBS, Baarn, Hollandia) lett az első

kisebb centrum, amely élesztő- és fonalasgombákat élő állapotban megőrzött, fenntartott és mások számára is szolgáltatott. A korai gyűjtemények a mezőgazdaság, az erjesztési iparok és a gyógyászat kisebb igényeit elégítették ki. A penicillin felfedezése és iparosítása 1928-1945 között rendkívüli módon megnövelte az ilyen jellegű gyűjtemények jelentőségét. Az ezt követő évtizedekben a gyógyszeripar a biológiailag aktív vegyületek gazdag tárházát találta meg a mikroorganizmusokban. Ezzel párhuzamosan az orvostudomány, a mezőgazdaság, az élelmiszeripar, a környezetvédelem és más területek fejlődése is egyre nagyobb mikroba választékot igényelt. Az 1980-as években a törzsgyűjtemények fejlődésének újabb lökést adott a biotechnológia bázisú fermentációs iparágak azóta is tartó fellendülése. A gyűjteményekben tárolt mikroorganizmusok ugyanis gyakran képezik új termékek vagy új technológiák még ki

nem aknázott erőforrásait. Az elterjedtebb törzsfenntartási és konzerválási módszerek az alábbiak:  Időszakos átoltás tenyésztő tápközegekre (ferde agaros tenyészet kémcsőben aerob mikrobák esetében ill. szúrt kultúra anaeroboknál) Az átoltott tenyészeteket megfelelő hőmérsékleten inkubáljuk kellő ideig, majd a kifejlett tenyészeteket felhasználásig hűtőszekrényben tároljuk + 4 C-on. Az átoltások gyakorisága az adott mikrobától függ, ez a periódus néhány héttől (baktériumok zöme) 1/2-1 évig (fonalas- és élesztogombák) terjedhet. A Bacillus licheniformis tenyészete 24 óra 30 C-os inkubáció után nő ki ilyen szépen agarferdén. A Thermomyces lanuginosus xilanáz enzimet termelő gombák 10 nap 50 C-os inkubáció után nőnek ki az agar ferdéken és termelnek vörösesbarna színanyagot. A Saccharomyces cerevisiae élesztő tenyészet 48 óra után tejszerű felületet ad az agaron. A ferdéken szépen kinőtt

Streptomyces albus tenyészetek jellegzetes grízes felületűek.  Ásványolaj alatti tárolás: a ferde agaros tenyészet egészét vagy egy darabját steril ásványolaj alatt tartjuk. A ráöntött olaj gátolja a táptalaj kiszáradását, a beoldódó csekély mennyiségű levegő életben tartja az aerob mikrobákat relatíve hosszabb ideig (max. néhány évig)  Fenntartás steril homokban vagy talajban. Elsősorban spórás baktériumok (pl. Bacillus) és sugárgombák (pl Streptomyces) fenntartásához előnyös A talaj a mikroba természetes környezetét jelenti. Az alkalmazott talajnak vagy homoknak kellően száraznak kell lennie.  Vízmentes szilikagélen történo konzerválás. A kiszárításnak kíméletesnek kell lennie.  Liofilezés (fagyasztva-szárítás). A mikroorganizmusban és környezetében lévő víz eltávolítása kíméletes módon történik, alacsony hőmérsékleten (-30 -40 C), nagy vákuum mellett. A jégkristályok

szublimálásán alapszik tulajdonképpen a módszer. Vivőanyagok (pl szérum-fehérje) csökkentik a mikrobapusztulást a folyamat alatt. Az ampullában lévő vákuum erősen redukálja a kíméletesen megszárított tenyészet raktározás (tárolás) alatti hőpusztulását. Az eltarthatósági (visszanöveszthetőségi) idő - mikrobától függően - az 5 - 50 év tartományban van. A fáziskontraszt feltét tárcsája (középen )biztosítja a megfelelő élességet a különböző naygításokhoz, alul a baktériumokat átvilágító lámpa kimenő nyílása látható. Egyszerre sok kópiában, sok ampullában érdemes törzseket liofilizálni, így akár 100 évre is elegendő tenyészet tartósítható. Fagyasztás -50 C-on vákuumban A tenyészetek liózása  Mélyhűtéses fagyasztás a -30 - -80 °Chőmérséklet tartományban, védőfolyadékok (pl. glicerin, dimetilszulfoxid, cukoralkoholok, fehérjék, stb) jelenlétében. Jelenleg mechanikus működésű

hűtőszekrényekkel már -80 °C is biztosítható. Minél alacsonyabb a tárolási hőmérséklet, annál kisebb a mikrobák hőpusztulása. Évekig tárolhatók így a mikrobák A módszer sebezhetősége: hosszabb áramszünet  Tárolás folyékony nitrogénben (-196 C). Évtizedekig-évszázadokig tárolható így a mikroorganizmusok zöme. A párolgási veszteségek pótlásáról gondoskodni kell. Védőfolyadékok ua mint fentebb Relatíve drága módszer A tartós tárolási módszerek közül napjainkban leginkább a liofilezést és a folyékony nitrogénben történő tárolást alkalmazzák (sok esetben, biztonsági megfontolásból, ugyanazon törzsek esetében mindkét módszert is, ha a törzsek fenntartásának fontossága ezt megkívánja). Replika gyűjtemény szükséges a legnagyobb, legfontosabb gyűjtemények esetében: ugyanazon gyűjtemény kisebb kópia (lió ampulla, folyékony nitrogénes kapszula) formájában egy másik helyszínen (50-100 km-re) is

el van helyezve a föld alatt. Erre azért van szükség, hogy elemi csapás esetén (földrengés, tűzvész) az igen nagyértéket képviselő eredeti gyűjtemény újra visszaállítható legyen. Szállításra, postázásra (ügyfelek kiszolgálására) elsősorban a liofilezett tenyészet (üvegampullában) vagy a friss leoltás (pl. ferde agaros tenyészet kémcsőben) alkalmazható Némely esetben száraz jéggel hűtött formában történik az érzékeny tenyészetek postázása. A folyékony nitrogénben történő tárolással konzervált tenyészetek nem alkalmasak szállításra. Tözsek tartósítása folyékony nitrogénben. A világon fellelhető mikrobiológiai törzsgyűjtemények száma 1000 körüli lehet. Ma már nem ritkák a több tízezer mikroorganizmust számláló gyűjtemények. Ezek az iparilag fejlett országokban találhatók. A világ talán legnagyobb, sokszor NRRL-nek rövidített gyűjteményében (US Department of Agriculture, Northern Regional

Research Center, Peoria, Illinois) mintegy 80.000 mikrobát tartanak fenn Valamivel kisebb, de talán ismertebb gyűjtemény az American Type Culture Collection (ATCC), ahol a tárolt mikrobák száma megközelíti a 60.000-et A nagy európai és japán gyűjtemények 1030000 közötti mikrobalétszámmal rendelkeznek Magyarországon a három legjelentősebb törzsgyűjteménynek az Országos Közegészségügyi Intézet (OKI) Bakteriológia Osztálya, a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem (KÉE) Mikrobiológia Tanszéke, valamint a Budapesti Műszaki Egyetem (BME) Mezőgazdasági Kémia Technológia Tanszéke ad otthont. Az OKI-ban a humán egészségügyet szolgáló Orvosi Baktériumok Magyar Nemzeti Gyűjteménye található. A fenntartott mikroorganizmusok (döntően baktériumok) száma mintegy 3500. A Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen működik a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye. Itt a szabadalmi letéti mikroorganizmusok

tárolásán túlmenően elkezdték a mezőgazdasági és ipari felhasználású mikroszervezetek gyűjtését és raktározását is. Jelenleg mintegy 1600 törzset tartanak fenn, kétféle módszerrel: liofilezéssel (fagyasztva szárítással) és folyékony nitrogénben történő tárolással. Magyarországon ez az egyetlen hely ahol szabadalmi védelem alá (szabadalmi letét) helyezhetünk bármilyen a biotechnológiai iparban hasznosítható mikrobát. A BME-n (Budapesti Műszaki Egyetem) mintegy 2000 mikroorganizmust tárolnak, liofilezett tenyészetek formájában. A TUB rövidítéssel (Technical University of Budapest) jelölt gyűjtemény a mezőgazdasági, ipari és környezetvédelmi célú kutatásokat, valamint az oktatást szolgálja. 4. Ipari fermentációs tápanyagok, fokozatok, eljárások 4.1 Fermentációs eljárások Módszer tekintetében alapvetően két fő lehetőség jöhet szóba: a szubmerz (folyadék kultúrás) és szilárd (solid state fermentation,

SSF) közegű fermentáció. A szubmerz tenyésztés jóval elterjedtebb, ez a jelenlegi ipari fermentációk túlnyomó többségére igaz, továbbá a felületi, szilárd tenyésztés starter, inokulum (oltó) kultúráit is folyadék tenyészetekkel biztosítják. A szubmerz fermentációt a jobb mérhetőség, szabályozhatóság jellemzi. A batch- fermentáció a folyadék fermentációk szakaszos üzemmódja. A batch tenyészetekben a mikrobák szaporodásában négy fázist lehet megkülönböztetni (grafikon):  Lag fázis: Ha sejteket az egyik táptalajból egy másikba oltunk át a sejtszám az első néhány órában organizmusaink a környezetükhöz. nem változik, ekkor adaptálódnak  Log fázis: A lag fázis végére az adaptálódott sejtek szaporodásnak indulnak és a sejtszám megtöbbszöröződik a növekedés exponenciálissá válik.  Stacioner fázis: A növekedés gyengül az elfogyó szénforrás, nitrogénforrás vagy a

felhalmozódó az anyagcserében termelődő toxikus anyagok miatt.  Stacioner fázis: A növekedés gyengül az elfogyó szénforrás, nitrogénforrás vagy a felhalmozódó az anyagcserében termelődő toxikus anyagok miatt.  Pusztuló fázis: Erre a fázisra a biomassza energiatartalékának elfogyása és a sejtek elhalása jellemző. Grafikon Baktérium tenyészet növekedési görbéje A batch fermentációk továbbfejlesztett változatai a feeding fermentációk, ahol a fermentáció kezdetén a tápoldat fontosabb összetevőit kisebb koncentrációban alkalmazzák, majd a fermentáció előrehaladtával folyamatosan kis adagokban a fermentléhez adagolják. A mikroorganizmus által előállított termék maximális bioszintézisét gyakran feed-back gátlás akadályozza, ez - amennyiben deregurált mutánsok nem alkalmazhatók – megfelelő fermentációs időben táptalajkomponensek adagolásával (feeding) kivédhető. A szubmerz fermentációk

speciális változata a folyamatos fermentáció, ahol a bioreaktorba folyamatosan vezetik be a steril tápoldatot és egyidejűleg ugyanolyan mennyiségű átalakított fermentlevet visznek ki a rendszerből (kemosztát és plug-flow reaktor). Fermentor Levegőliftes fermentor Folyadék sugaras fermentor A szilárd, felületi (SSF) tenyésztést elsősorban penészgombák szaporítására használják. Ilyen körülmények között a levegőztetés egyszerűbb, mivel a nagy felületen elhelyezkedő mikrobák könnyen érintkeznek a levegővel. Az alacsony nedvesség tartalomból (20-50%) következően a helyigénye kisebb, mint a süllyesztett fermentációé, és így a hatóanyagok kinyerése is egyszerűbb. Táptalajuk, szubsztrátumaik egyszerűek akár lehet csak búza vagy rizskorpa (penészkorpás eljárás). Nagy hátránya, hogy a folyamat szabályozása, mérése a tápközeg inhomogenitása miatt nem megoldható. Tözsek tartósítása folyékony nitrogénben. A

felületi tenyésztés tálcás eljárása során pl. a búzakorpát 50% nedvességűre nedvesítve sterilezik, majd lyuggatott fenekű fémtálcákra helyezik. A felületi tenyésztés tálcás eljárása során pl. a búzakorpát 50% nedvességűre nedvesítve sterilezik, majd lyuggatott fenekű fémtálcákra helyezik.(Kép) A tálcákat kamrákba helyezik és megadott hőmérsékleten 1-5 napig inkubálják. SSF tenyésztő üzem kamrái. A tálcákat kamrákba helyezik és megadott hőmérsékleten 1-5 napig inkubálják tálcás tenyésztés - Üzemi felületi tenyésztés kép Forgodobos fermentor A jelenlegi fermentációs biotechnológiai ipar túlnyomó többsége szubmerz aerob (levegőztetett) fermentáció, ezért a következő fejezetekben ezeket tárgyaljuk 4.2 Nyersanyagok A mikroorganizmus táptalajoknak mindazokat az elemeket tartalmazni kell, amelyek a sejt saját anyagainak felépítéséhez és anyagcseretermékek előállításához szükséges. A kívánt

biotechnológiai termékek termeléséhez elengedhetetlen az optimális fermentációs táptalaj összetétele. Ez a táptalaj-optimalizálás Meg kell választani a helyes táptalajt (összetétel, adagolások), és az ezen a táptalajon előnyösen alkalmas tenyésztési körülményeket (oxigénellátás, hőmérséklet). A termelés céljára szolgáló tápoldatokat előállítási módukban is optimalizálni kell, mivel az előkészítés során minden esetben csíramentesíteni, sterilezni kell. Fontos tehát a komponensek összetétele, minősége, az oldás vagy szuszpendálás sorrendje, kicsapódások megakadályozása, a sterilezett tápoldat változásai, pH értékek előtte és utána, sőt szükség lehet egyes összetevők külön sterilezésére és adagolására. A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak A világon jó néhány gyártó van,

amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb. Ezekből az anyagokból elsősorban un inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb. Ezekből az anyagokból elsősorban un inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A képen baktériumok általános tenyésztésére alkalmas

speciális több összetevőből álló Nurient agar és Nutrient tápleves(broth)táptalajokat látunk. A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb. Ezekből az anyagokból elsősorban un inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A képen baktériumok, gombák tenyésztéséhez használható egyszerű táptalajösszetevők láthatók. Gazdaságossági okokból az ipari termelést olyan u.n főtáptalajokon kell biztosítani, amelyek gyakran komplex, alig meghatározható összetételűek, sok esetben élelmiszeripari melléktermékek,

hulladékok. A szénhidrátok – pl glükóz, szacharóz - a mikroorganizmusok általános energiaforrásai, azonban tisztán a költségtényezők miatt nem alkalmazhatók. A melasz a cukorgyártás során a cukorrépa feldolgozásakor keletkező anyalúg a legolcsóbb kb. 50%-ban szacharóz tartalmú szénforrás E mellett vitaminokat, nyomelemeket, sőt nitrogént is tartalmaz. A glükózszörp (izoszörp) a kukoricakeményítőből nyert glükóz enzimatikus átalakítás során nyert köztitermék, amely mintegy fele-fele arányban tartalmaz glükózt és fruktózt a melaszhoz hasonló koncentrációban. A malátakivonat a sörgyártás során malátásított árpa vizes, nedves kivonata. Összetettebb szénforrás, mint az előzőekben felsoroltak, mivel nemcsak hexózokat, hanem diszacharidokat, triszacharidokat egyaránt tartalmaz fehérjék, aminosavak és vitaminok mellett. Itt érdemes megemlíteni, hogy mind a malátakivonat, de más %-os mennyiségben egyszerű

redukáló cukrokat (glükóz, fruktóz) és mellette aminosavakat, fehérjéket tartalmazó táptalajokat kíméletesen kell sterilezni. A Maillardreakció során a fehérjék aminocsoportjai vagy maguk az aminosavak reagálnak a cukrok karbonil csoportjával és ezeket a mikrobák nem képesek hasznosítani. Sok esetben a megoldás a monoszacharid tartalmú szénhidrátok külön sterilezése és adagolása. A kukoricaliszt vagy maga a kukoricakeményítő és dextrin is alkalmas szénforrás lehet. A cellulóz, növényi olajok és metanol csak speciális esetben alkalmazhatók. Nitrogén-forrásként a leggyakrabban élesztőkivonatot, különböző hús, kazein, zselatin és szójaliszt hidrolizátumokat, peptonokat, és húskivonatokat (beef-extract) alkalmaznak, elsődlegese a laboratóriumi munkában. Üzemi körülmények között a penicillin gyártásnál is áttörést és nagy termelékenységet értek el a kukoricakeményítő előállítás közben keletkező

kukoricapréslé, a kukoricalekvár használatával Ez az anyag ma már a biotechnológiai ipar fő nitrogén és vitamin forrása. Fő komponense elsősorban az aminosavak, míg cukortartalma a tejsavbaktériumok révén tejsavvá alakul. Legújabb kísérletek szerint a lekvár szárítását is megoldották, így állandó minőségű kukoricalekvár-por felhasználása is lehetségessé vált. A kukoricalekvár fő jellemzője az élő tejsavbaktériumok jelenléte, amely nem megfelelő sterilezés esetén a fermentáció és a kezdő biotechnológus réme lehet. Használatuknak azonban nincsen akadálya, mivel a tejsavbaktériumok nem spórás szervezetek, így sterilezéssel könnyen elpusztíthatók. Ezeknél kevésbé alkalmas, de költségtényezők miatt sok helyen használt a szójaliszt, amely a szójaolaj kivonási gyártás után visszamaradt komplex tápanyag. A szójaliszt fehérjéi csak lassan metabolizálódnak, ezért csak hosszabb idejű fermentációk esetén

alkalmazzák. Minden előkészített tápoldatot, oldatot, kémcsöveket és lombikokat, valamint a fermentorokat és a hozzá tartozó oltócsöveket sterileznünk kell. Az általános gyakorlat a hősterilezés, ez a legfontosabb módszer, ekkor a legtöbb tápoldatot, hacsak nem túl érzékeny, 5-10 perces előfőzéssel kell előkészíteni. Csíramentes anyagokat 121 C-on 1,2 atm telített gőznyomáson 25 perc időtartam alatt lehetséges előállítani. A kisebb csöveket, lombikokat certoklávban, Lombikok sterilezése certoklávban. a fermentorokat autoklávokban Sterilezett 5 literes fermentor autoklávban. míg a több 100-1000 literes fermentorokat helyben direkt gőzbevezetéssel sterilezzük. Az elv minden esetben ugyanaz, bár nagyobb térfogatban (5-10 liter) hosszabb sterilezési időre lehet szükség (45-60 perc) hasonlóan a nagyobb fermentorokhoz. A vitaminokat, hormonokat sterilezett kerámia vagy membrán szűrőn (0,45 mikométeres pórusú) átbocsátva

szűrjük csíramentesre és a már sterilezett tápoldatokhoz adagoljuk steril fülkében, vagy szobában. Szubmerz baktérium tenyészet rázógépen. Szubmerz gombatenyészet rázógépen. 4.3 Fermentációs fokozatok (Scale-up) A fermentációs eljárás első lépéseként lombiktenyészetekben rázógépeken optimalizáljuk a gombák és baktériumok tenyésztését. Rézköpenyes általános fűtő bakterológiai termosztát analóg kijelzővel, rázógéppel Hűtő, fűtő temosztát Certomat 12 férőhelyes rázógéppel. A biotechnológiai gyakorlat a következő: az agar ferdéken tenyésztett nemesített organizmusokat 100 ml steril tápanyagokat (tápleves) tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikba mosva (oltva), majd azokat rázógépre helyezve szaporodástól függően meghatározott hőmérsékleten 1-10 napig fermentáljuk. Ez a tenyésztés a nagyipari fermentáció laboratóriumi modellezése. A rázatott lombikok falán a percenkénti 300-450es rázatási

fordulat miatt (rpm rotary per minute) folyadékfilm alakul ki, amelyben a gyors gázcsere lehetővé teszi a mikroszervezetek intenzív légzését. A fermentáció során igen fontos a jó oxigénellátás biztosítása. A mikrobák szaporodása energiát igénylő folyamat (pl. fehérje-, zsírsav-szintézis), s csak a légzés biokémiai mechanizmusával keletezik jó hatásfokkal ez az energiamennyiség. A második fermentációs lépcső a már keverőkészülékkel és levegőztető berendezéssel ellátott üvegfermentorok. 5 literes fermentor pH, oxigén és hőmérséklet szenzora Lecsomagolt 5 literes fementor sterilezés előtt. Ezek már hasonlítanak az üzemi termelőkészülékekhez, hasznos térfogatuk 5-20 liter. Ezekben az edényekben a táptalaj bár eltér az inokulumok összetételétől, de még nem a termelő táptalajt tartalmazza. Ebben a térfogatban fő cél - hasonlóan az inokulum tenyészetekhez – hogy a mikroorganizmusok maximális mennyiségben

szaporodjanak el. A fermentorok oltásánál fő szempont az oltási százalék meghatározása, azaz hogy milyen mennyiségű pl. baktérium lét mossunk adott térfogatú fermentorhoz Általában baktériumoknál ez 0,1-1,0 %, gombáknál és növényi sejteknél 3-10 % inokulum fermentlevet (pl. a lombikban szaporított baktériumok tenyészetét) adagolunk Csővezetékek hálózata köti össze a steril fementorteret a külvilággal. Jobbra az adagoló üvegek láthatók, amelyekből steril szilikoncsöveken áramlik a folyadék. A készülék hűtővizzel és fűtéssel szabályozza hőmérsékletét, ez rendszer a piros gumicsöveken keresztül működőképes. A sárga vízálló vezetékek látják el árammal a keverőmotort és a fermentor szabályozó tornyát (a kép jobb oldalán). A sterilezéshez a csövek végeit és a pH, oxigén szenzor csatlakozóit nátronpapírba és alufóliába csomagoljuk, ez utóbbit a papír nedvesedésének elkerülésére.A fehér, kerek

0,2 mikrométer pórusátmérőjű steril levegőszűrő még csomagolatlanul lóg a fermentor oldalán. Sok esetben félüzemi, kísérleti üzemi léptéket is beiktatnak (pilot-plant), 100 – 3000 liter térfogatban. Ebben a térfogatban már termelő léptékről beszélhetünk és a fermentáció során már főfermentációs optimalizált táptalajokra oltunk és tenyésztünk. Az üzemesíthetőség megítélésekor ez a félüzemi lépték fontos a következő befejező lépték megvalósításához. Rozsdamentes acél helyben sterilezhető 10 liter hasznos térfogatú párosával elrendezett félüzem. A félüzemi fermentor fején helyezkednek el a szondák. Biztonsági hőálló üvegablak biztosítja a belátást. A fermentorüzem oltófermentorai 100 literes térfogatúak. Rozsdamentes acél megfelelő fejmotorral és műszerekkel(pH és hőmérséklet, nyomás mérése). Az üzemi femenotorokon már nem a fejen, hanem a test oldalsó részén vezetik be az

érzékelőket. A modern főüzem 4 köbméteres fermentort működtet. A bonyolult csövezés és számítógép vezérlés lehetővé teszi a tápanyagok csővezetéken történő betöltését, ezekben a fermentorokban már nincs bebújónyílás, szükségtelen. A modern jól szigetelt köbméteres fermentor két emelet között fér el. A kép tetején a fermentor tengely nagyteljesítményű motorja látható(zöld). a csővezetékeken mágnesszelepek láthatók (piros és fekete), melyek a számítógépes vezérlést biztosítják. Végül a termelő fermentáció a termék szükséges mennyiségének megfelelően 1-450 köbméter térfogatban főfermentációs táptalajon folyik. A fermentorokban optimális oltási százalékkal inokulálunk és az előző léptékekben kidolgozott paraméterek szerint tenyésztünk. 10 literes fermentor sterilezése. 100 literes fermentorüzem bemutása. 1 köbméteres fermentorüzem bemutatása. Fermentorüzem mikroprocesszoros

programvezérelheto adagoló automatikája. A laboratóriumi eljárások ipari méretben való kifejlesztése (Scale-up) során nagy fontosságú a levegőztetés, hőmérséklet és keverés értékeinek pontos meghatározása. Amint a fermentorban a sterilezett tápoldatot mikroorganizmusokkal beoltják, a levegő formájában adott oxigénen és a pH szabályozásra adagolt savon vagy lúgon kívül az egész folyamat ideje alatt a rendszer összetétele, a biomassza és a metabolitok koncentrációja állandóan változik. Ezért igen fontos a szaporítás alatti pH-beállítás és hőmérséklet megválasztása. A tenyészetek hőmérséklete befolyásolja a szaporodást, ugyanakkor az egyes metabolitok képződését serkentik vagy gátolják, ezért ezeket nehéz összeegyeztetni. Hasonló a helyzet a pH optimummal is A hőmérsékletet a növekedés, de a termékképződés szempontjából is optimalizálni kell. Nagy tömegű (5 köbmétertől) számolni kell a szaporodási

folyamatok hőtermelésével és az esetleges hűtési kapacitás növelésével. A levegőztetés steril szűrőkön keresztül történik szűrőmembránok, vagy szűrőgyertyák alkalmazásával. A sterilezéshez a csövek végeit és a pH, oxigén szenzor csatlakozóit nátronpapírba és alufóliába csomagoljuk, ez utóbbit a papír nedvesedésének elkerülésére.A fehér, kerek 0,2 mikrométer pórusátmérőjű steril levegőszűrő még csomagolatlanul lóg a fermentor oldalán. A fermentorokba a levegőadagolás mérése rotaméterrel történik 0,1-1,0 vvm (levegő térfogat/tápoldat térfogat percenként) mennyiségben. A levegőztetés a fermentáció közben felhasznált oxigén mennyiségétől függ, így pl. intenzív szaporodási időszakban log fázis - nagyobb mennyiségben szükséges Stacioner vagy lag fázisban jóval kevesebb, pl. 1 köbméteres fermentorba 30 köbméter óránkénti levegőadagolás is elegendő lehet ( 0,5 vvm). A kívülről behatoló

szennyeződések veszélyének csökkentésére a beáramló levegő visszatartásával a fermentorokban 0,1-0,6 bar túlnyomást hoznak létre, és ez természetesen befolyásolja az oxigén és szén-dioxid oldhatóságát. Az oxigén beoldódása az egyik legfontosabb paraméter, ezért megfelelő levegőátbuborékoltatással (levegő lant) és keveréssel kell gondoskodni a teljes fermentlé minden részletének oxigénellátásáról. A keverést többféle kiképzésű keverővel (pl turbina keverőlapátok), vagy levegőlift (air-lift) alkalmazásával oldják meg. A folyadéksugaras (jet) fermentorokban a fermentlé folyamatos keringetésével biztosítják a levegőellátást. Kisméretű (2-4 mikrométer) bacillusok. 2. fejezet - Klasszikus biotechnológiai módszerekkel előállított termékek Tartalom 1. Aminosavak 1.1 Nátrium-glutamát 1.2 L-Lizin 1.3 L-triptofán 2. Enzimek 2.1 Fehérjebontó enzimek, proteázok, peptidázok 2.2 Keményítőbontó

poliszacharidázok és oligoszacharidázok 2.3 Pektinázok és lipázok 2.4 NSP (nem keményítő típusú) enzimek 2.5 Enzimek a takarmányozásban 3. Vitaminok 3.1 B12 vitamin (ciano-kobalamin) 3.2 B2 vitamin (Riboflavin) 3.3 Karotinoidok 3.4 A C-vitamin (L-aszkorbinsav) és az E-vitamin (alfa-tokoferol) bioszintetikus előállítása 3.5 Az új szuper E-vitamin: az astaxanthin 4. Antibiotikumok 4.1 Béta-laktám antibiotikumok 4.2 Penicillinek 4.3 Cefalosporinok 4.4 A klavulánsav 4.5 Aminosav és peptid antibiotikumok 4.6 Glükozidok, amino-glükozidok, cukorszármazékok 4.7 Makrociklusos-lakton-antibiotikumok 4.8 Tetraciklinek és antraciklinek 4.9 Aromás antibiotikumok 4.10 Antibiotikus citosztatikumok 4.11 Takarmány és növényvédelmi antibiotikumok 5. Anyarozs alkaloidok 5.1 Előfordulásuk, jelentőségük 5.2 Szaprofita Claviceps törzsek fermentációs tenyésztése 6. Szerves savak 6.1 Almasav 6.2 Citromsav 6.3 Itakonsav 6.4 Ecetsav 6.5 Tejsav 1. Aminosavak

Aminosavakat nagyon széles körben alkalmazzák az élelmiszeriparban mint ízjavítókat, mint pl. a Na-glutamátot A L-lizin, triptofán aminosavakat az aminosavakban szegény takarmányok feljavítására, míg más aminosavakat antioxidánsként alkalmazzák élelmiszerekben. Előállításuk lehetséges fonalas gombák fermentációjával közvetlenül, vagy aminosav prekurzorok, köztes termékek átalakításával élesztős vagy bakteriális fermentációval. 1.1 Nátrium-glutamát A Na-glutamátot ízjavító hatása miatt Japánban az 1900-as évek elején szója és búzasikér hidrolizátumból kezdték előállítani. 50 évvel később a Corynebacterium (Micrococcus) glutamicum fermentációjával kezdték biotechnológiai úton is gyártani. Diplo és tetracoccus típusú sejtek. Micrococcus sp .baktériumok mikroszkópos felvétele Kémiai szintézissel is lehetséges, de többségében mikrobiálisan állítják elő, Corynebacterium, Brevibacterium,

Microbacterium és Arthrobacter törzsekkel, de rekombinációval E. coli törzsek is képesek Minden glutaminsav termelő törzs biotint igénylő keto-glutarát-dehidrogenáz blokkolt. A glutaminsavképző mikoorganizmusok az Embden – Meyerhof úton glükózból vagy akár acetátból citráton és izocitráton keresztül alfa-ketoglutársav keletkezik, miközben az izocitrát dehidrogenáz által NADPH2 keletkezik. A NADPH2 katalizálja az alfa-keto-glutarát glutamáttá alakítását glutaminsav dehidrogenáz segítségével (reduktív aminálás folyamata). Folyamatábra az Embden-Meyerhof útról és glutamát bioszintézisről A sejt permeábilitása fontos tényezője a glutaminsavképzésnek. Ez növelhető biotinhiánnyal, olajsav-auxotrófokkal, zsírsavak vagy penicillin hozzáadásával, illetve glicerin-auxotrófokkal. A biotin hiánya növeli a sejtmembrán károsodását, a sejtmembrán foszfolipid tartalmának csökkenésével, így a sejtben intracellurálisan

termelődő glutaminsav kiválasztódhat a fermentlébe. Ellenkező esetben a sejtben koncentrálódva feed-back gátlás alakul ki. Az olajsav – auxotrófok szintén a sejtmembrán foszfolipid tartalma szempontjából defektesek. A baktérium sejtfalszintézis gátló penicillin adagolásával még magas biotintartalom mellett is növekszik a termelés, így akár nagy biotin koncentrációjú melasz szénforráson is lehetővé vált 60-100 g/literes hozammal a fermentációs gyártás. 1.2 L-Lizin A növényi takarmányok lizin hiányát régóta adalékanyagokkal (halliszt, húsliszt, takarmányélesztő) próbálják pótolni, majd az utóbbi években a biotechnológiai úton nagy tisztaságban előállított L-lizin hozzáadása került előtérbe. Homoszerin vagy metionin-szerin kettős auxotróf mutánsok alkalmasak hatékony lizintermelő törzseknek, ennek magyarázata a lizin bioszintézise: a lizin baktériumokban az diamino-pimelinsav (DAP), a fonalas gombákban,

élesztőkben és algákban aminoadipinsav úton szintetizálódik. A lizin bioszintézis folyamatábrája Amennyiben mutagénkezeléssel sikerül olyan baktérium telepeket izolálnunk, melyek nem képesek homoszerin (homoszerin auxotróf) vagy metionin és treonin (metionin és treonin auxotróf) előállítására, úgy az aminosavak szintézis útja a lizin felé terelődik. A homoszerin képző homoszerin – dehidrogenáz a bakteriális lizin termelés kulcsenzime. Ez az enzim treonin és metionin adagolással represszálható, kikapcsolható. Ugyanakkor a lizin szintézis köztitermékét előállító aszpartokináz enzimjeit a metionin a treonin, az izoleucin sőt, a lizin is represszálja, amennyiben túl sok van jelen a sejtekben (feed-back gátlás). A lizin szintézis specifikus enzimje a dihidro-dipikolinát-szintáz szintén feed – back gátlást mutat lizin jelenlétében. Ahhoz, hogy a lizin túltermelést el lehessen érni, ezeknek az enzimeknek a működését

auxotróf mutánsok előállításával kell kikapcsolni. A lizinfermentáció során egy magas termelőképességű Brevibacterium flavum vagy Corynebacterium glutamicum baktériumtörzset szaporítanak fel melasz, kukoricalekvár és ammónium-szulfát alapú tápoldaton. Az auxotróf törzsek igényesek, ezért a táptalajhoz adagolni kell treonin, homoszerin és metionin aminósavakat (szójaprotein-hidrolizátum) és a biotintartalomnak magasnak kel lennie (melasz). Megfelelő kevertetés és levegőztetés mellett a fermentáció ideje 72-96 óra, amelynek végén a fermentlé L-lizin tartalma 30-100 gramm/liter. A feldolgozás megkezdése előtt a lizint stabilizálják: a fermentlé pH-ját sósavadagolással 5.0-re állítjuk és nátrium-szulfitot adagolunk Élesztőgombákkal (pl. Crptococcus laurentii) a L amino-kaprolaktám enzimes átalakítása lehetséges lizinné. Az amino-kaprolaktám 10%-os oldatát élő vagy szárított sejtekkel keverik össze, így 24 óra alatt

az amino-adipinsav út amino-kaprolaktám hidroláza szinte maradék nélkül L-lizint konvertál. 1.3 L-triptofán A triptofán előállítása elsősorban kémiai szintézissel történik, valamint előanyagok (prekurzorok) fermentatív enzimes átalakításával. Tipikus eljárás a Hansenula anomala élesztőtenyészethez adagolt antranilsav átalakítása vagy Bacillus subtilis indol konverziója. Lehetséges indol és L-szerin adagolt E. coli tenyészetek triptofán szintézise (triptofán - szintetáz reakció), vagy Proteus tenyészetek triptofanáz enzimjével indolból és piruvátból triptofán termelés. A baktériumok által extracellulárisan a fermentlébe kiválasztott aminosavakat nem feltétlenül kell kinyerni, hanem préselt élesztő - praktikusan pék- vagy sörélesztő hozzáadásával a fermentlevet besűríthetjük 15-20% szárazanyag- tartalomra, majd szeparálás és szűrés nélkül az összfermentlevet porlasztva szárítjuk. Az előállított magas

aminosavtartalmú (200-400 gramm/kilogramm) élesztőpor takarmányadalékként közvetlenül felhasználható. Az eljárás előnye, hogy szemben a szintén mikrobiális úton előállított tisztított aminosavak gyártásával, környezetszennyező melléktermékek nem keletkeznek, valamint az ezeknél a portermékeknél gondot okozó higroszkóposság az élesztősítéssel megszűnik, és a termék szárítása és tárolása lényegesen egyszerűbb. 2. Enzimek Az enzimek az élő szervezetekben lejátszódó biokémiai reakciókat irányító katalizátorok, kémiai természetüket tekintve globuláris fehérjék. Enzimeket széles körben állítanak elő ipari fermentációval. A mosószerek nagy mennyiségben tartalmaznak fermentációs proteázokat, az állattakarmányokba pl. amilázokat, cellulázokat, xilanázokat, glükoamilázokat adagolnak a jobb takarmányhasznosulás érdekében, és pektinázokat, lipázokat a gyümölcslevek előállításánál.

Mindezeket baktériumok és gombák fermentációjával lehetséges előállítani. A gombák és baktériumok anyagcsere folyamataikban alapvető szerepük van az enzimeknek. A biotechnológiában elsősorban a sejten kívüli (extracelluláris) enzimtermelést alkalmazzák, mikor a fermentlébe vagy a szilárd közegbe választódnak ki a hatékony enzimek, enzimcsoportok. Extracellularis enzim gyartásának folyamatábrája 2.1 Fehérjebontó enzimek, proteázok, peptidázok A mosószerek 70-80%-a tartalmaz fermentációs proteázokat, ezért ezek termelési mennyiségüket tekintve a legjelentősebb enzimcsoport. 1915-ben Otto Röhm szabadalma indította el a modern mosóporgyártást és gyártanak azóta is mosóporadalékot proteolitikus enzimeket termelő mikrobák segítségével. Proteázokat még a tejipar is hasznosít, valamint a takarmányipar (lásd később). Ezek az enzimek a fehérjéket hasítják, illetve a peptidek keletkezésén át aminosavig bontják a

proteineket. A proteinázok az eredeti fehérjemolekulákat (endopeptidázok), a peptidázok (exopeptidázok) viszont a peptideket hasítják. A termelő szervezetek szerint megkülönböztetünk bakteriális és gomba eredetű, valamint savas, semleges illetve lúgos környezetben aktív proteázokat. A mosószerekhez adagolt lúgos proteáz elsősorban Bacillus baktériumok fermentációjából származik, így a legismertebb bacillopeptidázok a Subtisilin Carlsberg (B. licheniformis), a Subtilisin Novo és BPN (B amyloliquefaciens) Ezek az enzimek lúgos tartományban (pH 8-11) hatnak és magasabb hőmérsékleten is stabilak, tekintve a mosógépekben alkalmazott körülményeket (90 C-os főzőmosás). Nagy proteáz aktivitású fermentleveket fehérje tartalmú tápközegben szubmerz rendszerekben az oxigén nagy parciális nyomása mellett állítanak elő. Semleges kémhatású proteázokat Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces baktériumok és Aspergillus gombák

állítanak elő. Elterjedésük korlátozott, főleg a bőrgyártásban cserzésre használják. Kisméretű (2-4 mikrométer) bacillusok. Hajlott jellegzetes pálcák. Bacillus subtilis mozgása. Pseudomonas sp. A gombákból nyerhető savas proteázokat az állattakarmányozásban (lásd lent) és a sajtgyártásban alkalmazzák. A tejfehérje, a kazein kicsapásához a tejet koaguláló rennin (a borjú gyomrának kivonatát, a rennit használták régen) típusú proteázokat kevernek a sajt fajtájának megfelelő starterkultúrával (pl. Lactobacillusok) már savanyított tejhez Ilyen savas peptidázok termelésére Mucor, Aspergillus vagy a legújabb kutatások szerint hőtűrő, ezért stabilabb proteázt termelő Thermomyces, Humicola gombák is alkalmasak. A gombafonalak kusza szövevénye jól megfigyelhető, nem spórázik. Xilanáz enzim termelésére képes. A szaprofiton Thermomyces lanuginosus ( Humicola lanuginosa ) fajok egysejtű, sötét szinű, gömbölyű

konidiumai a Phaeosporarae (Vajna L. 1987) nemzetségre jellemző bélyeg. Az ebbe a nemzetségbe tartozó Epicoccum, Humicola, Tricholadium és Clasterosporium fajok konidiumai magánosan alakulnak ki, a konidiumanyasejteken fejlődő duzzanatok formájában (Scmiedeknecht M, 1975). A csúcsi konidium alatt és oldalán még egymás után további konidiumok is képződhetnek, ilyenkor a konidiumtartó csúcsán konidiumfürtök jönnek létre. A konidiumok módosult csúcssejtek, a vegetativ tenyésztest részei, nem új képletek. Széles alapon izesülnek a hifához, csak a telep szétesése után válnak szabaddá. Ezek az aleuriokonidiumok úgynevezett tallospórák, melyek a hifák feldarabolódásával jönnek létre ( Vajna L. 1987 ). Ezen fajok mindegyike növényi maradványokon él és a szaprofitonok közé sorolandók, gyakran fordulnak elő magasabbrendű növények levelein pl: kukoricalevélen. Sok fajuk termofil, hőrezisztens mikroorganizmus, mely alapvetően

megkülönbözteti őket más mezofil vagy pszichrofil fajoktól ( lásd izolálási procedúra). Potato dextróz agaron vörösbarna pigmentképzésre képes. Történeti érdekesség a Taka proteáz, amelynek előállítását Takamine dolgozta ki már az 1900-as évek elején. Ez a rizsalapú penészkorpás SSF eljárás a japánok ősi rizserjesztő penészkultúráját a híres szaké (rizspálinka) előállításához használatos koji-t hasznosítja. 2.2 Keményítőbontó poliszacharidázok és oligoszacharidázok keményitőbontó enzimek hasitási helyei A keményítőhidrolizátumok nagy szerepet játszanak az élelmiszeriparban, mint adalékok. Ma már az édesítőanyagokat és cukrokat nagyrészt kukorica- és kisebb részt burgonyakeményítőből állítják elő fermentált keményítőbontó enzimek segítségével, míg a cukorrépa felhasználásának részaránya egyre kisebb. Ezek az anyagok határozzák meg az édesipari és konzervipari termékek ízét,

édességét és állagát. A burgonya és kukorica keményítőtartalmát amilázokkal dextrinné, majd maltózzá és glükózzá lehet hidrolizálni. Régen az amilázos kezelés legfőbb módja a sörgyártásból jól ismert malátázás volt, ahol a maláta amiláztartalma biztosítja az enzimaktivitást. A cukorgyártásnál már mikrobiális amilázzal hidrolizálnak. A keményítő glükóz egységekből álló poliszacharid, amelyben 1,4 és 1,6 glükozidos kötések váltakoznak. Az alfa-amilázok a keményítő 1,4 glükozidos kötéseit bontják és mind Bacillus, Micrococcus baktériumok és mind Aspergillus, Trichoderma fonalas gombák termelik. A legfontosabbak a B amyloliquefaciens, B licheniformis és az Aspergillus oryza. Fermentációjukat szubmerz módon végzik, nem glükóz alapon, mivel az u.n katabolitrepresszió miatt az indukáló szénhidrát, a keményítő jelenlétében termelődik csak amiláz. A termelést Bacillusokkal magas 45 C-os hőfokon végzik Az

Aspergillusok fermentációja alacsonyabb hőfokon, de több napon át tartó folyamat. Az 1,6 glükozidos kötések bontását a béta - amilázok végzik, ezek növényi eredetűek. Az Aspergillus kannapenész fonalai vastagok, szintén kuszán úsznak tenyészetükben. Az amilázokkal elfolyósított keményítőt glüko-amilázokkal lehetséges elcukrosítani, ekkor a hidrolízis köztes terméke a maltóz végterméke a glükóz szirup. Az Aspergillus awamori-al vagy Rhizopus gombatörzsekkel lehetséges keményítőalapú 3-5 napos fermentációs előállításuk. A glükóz a répacukorhoz mérten kb. 70% édesítőerejű, ezért szükséges egy részét a szacharóznál kétszer olyan édes fruktózzá alakítani (lásd izocukor előállítás). Ezt a glükóz-izomeráz enzimmel végzik, amelyet nagy mennyiségben a Bacillus coagulans baktérium tenyésztésével állítanak elő. Rengeteg baktérium képes ilyen enzim előállítására pl. Streptomyces, Arthtrobacter,

Micromonospra, Nocardia, Brevibacterium, Micrococcus. A fermentáció attól különleges, hogy xilóz alapú, ahol a xilán és a xilóz tartalmú búzakorpa biztosítja a glükóz-izomeráz (xilóz izomeráz) indukcióját. 2.21 Izocukor előállítás Széleskörben alkalmazott enzimtechnológiai eljárás az izocukor előállítása. Az izocukor glükóz-fruktóz elegy tömény vizes oldata, amelyet az élelmiszeriparban nagy mennyiségben édesítőszerként használnak. Előnyös tulajdonsága, hogy nehezen kristályosodik, illetve erős nedvszívó képessége miatt megakadályozza a készítmény vízvesztését. A felhasznált nyersanyag: kukorica A szemekből eltávolítják a fehérjetartalmú csírát, amelyet állati takarmányként hasznosítanak. A csírátlanított szemeket megőrlik, és a keményítőt elkülönítik, majd gondosan tisztítják. Ezután αamiláz enzimet adnak hozzá, és 85-94 °C-on, 5-6 pH-n előhidrolizálják a keményítőt Ezt az enzimet

hevítéssel inaktiválják, és a lehűtött oldathoz amiloglükozidáz készítményt adnak, amely glükózig viszi tovább a hidrolízist. Az így kapott glükóz-oldatot immobilizált glükóz-izomeráz enzimmel feltöltött oszlopokon engedik át, aminek hatására egyensúlyi reakció során a glükóz egy része fruktózzá izomerizálódik. A kapott oldatot tisztítják és töményre (körülbelül 64 m/m %-osra) bepárolják. 2.3 Pektinázok és lipázok A pektin számos növényi sejtfal alkotórésze, így zöldségek, gyümölcsök és takarmányok nagy mennyiségben tartalmazzák. A pektin részlegesen metilezett galakturonsav, amely az arabinoxilánokkal áll, mint struktúra összetartó réteg szoros kapcsolatban. A pektinázok legnagyobb felhasználási területe a gyümölcslékészítő ipar, mivel a pektinek ezeket a folyadékokat besűrítik, így enzimes elbontásukkal a viszkozitás lecsökkenthető. A pektinázokat régebben penészgombák pl. Aspergillus

niger szilárd felületi tenyésztésével állították elő, de ma már a szubmerz pl. Rhizopus fermentációt alkalmazzák. A penészgombák készítményei legalább 6 féle pektináz típusú enzimet tartalmaznak, amelyek a poligalakturonsav hasítási helyei szerint exo és endo peptidázok egyaránt lehetnek. Az enzimtermelő fonalas gomba Aspergillus niger fehér szálas telepei jól látszódnak fekete háttérrel. A lipázok a növényi és állati eredetű olajokat (glicerin–észtereket) zsírsavakra és gliceridekre hasítják. Felhasználásuk korlátozott, bár mind a humán gyógyászatban, mint emésztés elősegítő, mind a takarmányiparban (lásd következő fejezet) hasznosítják. Előállításuk elsősorban penészgombák fermentációjával lehetséges, úgy, mint Aspergillus, Penicillium, Rhizopus törzsek, de amennyiben a táptalajt olajokkal vagy zsírokkal egészítjük ki élesztőgombák (Torulopsis, Candida) és baktériumok

(Micrococcus, Lactobacillus) is kiválasztják fermentlevükbe. 2.4 NSP (nem keményítő típusú) enzimek A nem keményítő típusú (NSP) poliszacharidok, amelyeket többféle módon osztályoznak a következők: szénhidrát egységek és kötések alapján van a cellulóz (1-4 kötések), egyéb béta-glükánok (kevert 1-3, 1-4 kötések), pentozánok (arabinoxilánok), galaktomannánok és pektinek. A legelterjedtebb hemicellulózok a xilánok és xiloglükánok (arabinoxilánok). Összekötőként szerepelnek a pektin és cellulóz frakció között A lebontás során mindezen rost anyagokat bontani kell, a következő enzimekkel: 1. pektinázok (lásd előző fejezet) 2. xilanázok (endo-1,4-beta-xylanáz) 3 cellulázok (Mivel több enzim csak együtt képes megbontani a cellulózt, ezért többféle enzim alkotja együttesen a cellulázok csoportját: cellobiohidroláz (exo-1,4-beta-cellobiohidroláz), glükanáz (endo és exo1,4–beta-glükanáz) glükozidáz

(beta –glükozidáz). Az NSP enzimeket ipari méretekben gombák tenyésztésével biotechnológiai úton állítják elő (12, 17). Az előállított gomba enzimkeverékek fő összetevői: celluláz, xylanáz, 1,4-béta-endoglükanáz, béta-glükozidáz, alfa-amiláz és alfa-galaktozidáz. Ezek közül a celluláz és xylanáz enzim a legtöbb termékben dominánsan van jelen (4, 12, 14). Az enzimtermelő gombatörzsek elsősorban a mikroszkopikus és tömlősgombák közül kerülnek ki, mint például az Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Trichoderma viridis és Humicola insolens, melyeket víz alatti fermentációval tenyésztenek fel (3, 17). Ugyanakkor ezen gombák szilárd közegű tenyésztése (pl. penészkorpás) is célravezető lehet (1, 11, 15). Mindezeket az enzimeket elsősorban a papírgyártás során a faanyagok feldolgozásánál, a ruhaiparban a pamutanyagok pl. farmerek koptató kezelésére, illetve a takarmányiparban (lásd lent) hasznosítják.

Enzimtermelő gombatenyészetek oltása ferdékről rázott lombikokba. 2.5 Enzimek a takarmányozásban A takarmányok NSP, fehérje, olaj tartalma az állatok bélrendszerében önmagukban lassan és csak részlegesen tud csak lebomlani. Ennek fő oka, hogy egyrészt a bélcsatorna emésztőenzimjei ezekhez a nehezebben bontható anyagokhoz nem képesek hozzáférni, másrészt a gabonafélék magvait döntő részét alkotó struktúraalkotó poliszaharidokat csak speciális enzimtermelő mikrobák képesek lebontani. Az állatok csak a bélcsatornájukban élő mikroorganizmusok segítségével képesek felhasználni a növényi sejtfal szénhidrátjait. Azokban az állatfajokban, amelyekben a bélcsatorna kiürülése gyors és kevés a bélben élő mikroorganizmus, korlátozott a nem keményítő típusú szénhidrátok lebomlása. A proteáz enzimeket az állattakarmányozásban a jobb takarmányhasznosulás érdekében, elsősorban baromfi és sertés

takarmányadalékaként is használják. Ezeknek a monogasztrikus állatoknak az emesztőenzimjei képesek ugyan bontani a növényi fehérjéket, de hasznosulásuk fokát jelentősen növelik az állatok takarmányába kevert enzimkészítmények. Az állattakarmányozásban felhasználandó proteáz enzimeknek működőképesnek kell maradniuk a monogasztrikus állatok gyomrában uralkodó savanyú kémhatáson, ezért igen fontos olyan enzimek alkalmazása, amelyek savas kémhatáson is működőképesek maradnak (gomba enzimek), Összetevő (% sza.) Zab Árpa Rozs Búza Összes rost 29,6 17,2 12,8 10,6 Glükóz*a 12,2 7,9 3,9 3,1 Uronsav*b 1,1 0,5 0,8 0,4 Lignin 8,4 1,2 1,7 0,9 Béta-glükán 3,2 3,8 1,3 0,8 Arabinóz*c 1,5 2,2 2,6 2,1 Xilóz* 5,4 4,5 4,5 3,3 Mannóz 0,3 0,5 0,6 0,5 Galaktóz 0,7 0,4 0,6 0,5 aa cellulóz részeként ba hemicellulóz részeként caz arabinoxilán részeként 2.1 táblázat - A főbb gabonafélék rostalkotó és NSP tartalma (Fekete 1994) A

gabonafélék béta-glükán és arabinoxilán tartalma a genotípus és a termesztési körülmények függvényében széles határok között mozoghat. Az árpában és a zabban főleg béta-glükánok, kisebb mértékben arabinoxilánok fordulnak elő. A rozsban tritikáléban és a búzában nagyobb mennyiségben találhatók az arabinoxilánok. Mindezek indokolttá teszik az NSP enzimek alkalmazását. Ugyanakkor a gabonatakarmányok keményítő és más keményítő típusú anyagainak lebontásának meggyorsításához és így a hozam fokozásához - bár az állatok bélrendszerében lévő enzimek erre képesek –, a takarmányokat alfa-amilázokkal is kiegészítik. A takarmányokhoz a nagyüzemekben nagy mennyiségben adagolt szója relatív alacsony 30-35% poliszacharid tartalommal rendelkezik, amelyben csak kis mennyiségben van jelen keményítő. Az NSP tartalom eléri a 18-22 %, így a szemes takarmányokhoz mérten, hasonló mennyiségben van jelen

nehezen bontható rostanyag, amelynek jelentős része galaktomannán. Így itt, a megfelelő takarmányhasznosulás eléréséhez a speciális alfa- galaktozidáznak, mint galaktomannán bontó enzimnek jelentős szerepe van. A szemestakarmányok napraforgó- és kukorica-olaj tartalmának lebontásának gyorsításához lipázokat is alkalmaznak a nagyüzemekben. A legújabb kutatások szerint a baromfitápok szemestakarmánya nagy mennyiségű foszfort tartalmaz, de ennek 60-75%-a fitinsavhoz kötött. A fitinsavhoz kötött foszfor és egyéb komplex kötésben lévő elemek (Fe, Ca, Zn) felszabadításához a speciális fitázenzimre van szükség. (19, 58) Ez az enzim, amely a fitátot inositolra és szervetlen foszforra hidrolizálja, kis mennyiségben megtalálható a növényi takarmányokban, mikroorganizmusok is termelik, a baromfiban azonban csak kis mennyiségben fordul elő, így a baromfi (és a monogasztrikusok) a fitinkötésben levő foszfort alig tudják

hasznosítani. Más foszforforrásokkal kell az állatok igényét kielégíteni, ami több problémát is felvet. Költséges, esetleges túladagolása az egyéb ásványi anyagok felszívódását is befolyásolja, a hasznosítatlanul kiürülő foszfor a környezetet terheli. (19) (56) Előállításuk is nagy hozzáadott értéket képvisel, mivel bár különböző gombatörzsek képesek termelni, legtöbbször a penészgomba fitáz génjét bakteriális vagy élesztő genomba transzformálva rekombináns fitáz fehérjét állítanak elő szubmerz módon (lásd rekombináns termékek). Fitinsav Enzim Mikroorganizmus példák Saccharomyces cerevisiae Keményítő bontó alfa-amiláz, amiláz, glükóz-izomeráz, stb. glüko- Gombák Aspergillus niger Aspergillus oryzae Aspergillus awamori Enzim Mikroorganizmus példák Bacilus coagulans Streptomyces sp. Thermomoospora sp. Baktériumok Pseudomonas spp Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus licheniformis

Thermomyces lanuginosus Thermomyces aurantiacus Aspergillus niger Gombák Aspergilus oryizae Talaromyces emersoni NSP hidrolizáló enzimek xilanáz, celluláz, béta-glükanáz, alfa-galaktozidáz, pektináz stb. Aureobasidium pullulans Trichoderma spp. Humicola insolens Chlostridium thermocellum Baktériumok Bacillus subtilis Bacillus stearothermophilus Aspergillus niger Aspergillus oryzae Lipáz, Proteáz Gombák Thermomyces lanuginosus Trichoderma spp. Enzim Mikroorganizmus példák Bacillus subtilis Baktériumok Bacillus stearothermophilus Saccharomices cerevisiae Gombák Fitázok Aspergillus ficuum Aspergillus niger Pseudomonas spp Baktériumok Bacillus subtilis 2.2 táblázat - A főbb gabonafélék rostalkotó és NSP tartalma (Fekete 1994) 3. Vitaminok A mikroorganizmusok felhasználhatók vitaminok, pl. tiamin, riboflavin, folsav, pantoténsav, piridoxal, B12 vitamin előállítására. A baktériumok és élesztőgombák a legtöbb vitamin

előállítására, vagy azok előanyagainak, u.n prekurzorok szintézisére egyaránt képesek. Ipari méretekben a B12 vitamin és a riboflavin, valamint az Aprovitamin béta – karotin mikrobiális előállítása lehetséges Az astaxanthin bár nem vitamin, mint új antioxidáns hatású karotinoid szintén ebben a fejezetben kerül taglalásra. 3.1 B12 vitamin (ciano-kobalamin) B12 vitamin (ciano-kobalamin) Ezt a vitamint kizárólag mikroorganizmusok szintetizálnak és az emberi szervezet a táplálékból vagy a bélflóra által termeltből fedezi szükségletét. Legegyszerűbb előállítása is ez utóbbin alapul, mivel a szennyvíziszap kg-onként 4-10 mg-ot tartalmaz, azonban a különböző szennyező anyagoktól való elválasztása miatt mégis költséges. Külön fermentációs eljárásokat dolgoztak ki szennyvíziszapból származó baktériumpopulációkkal illetve Bacillus, Streptomyces, Kleibsella, Propionibacterium, és Pseudomonas törzsekre. A

Bacillus cereus tenyészetbe mártott oltókaccsal a baktériumtenyészet kiszéleszthető, 24 óra 35 C-os inkubálás után önálló baktériumtelepek is nyerhetők. Érdekes formák is rajzolhatók,akár színes baktériumtenyészetekkel is, melyek 24 óra múltán válnak láthatóva. Ezzel a technikával maga Fleming az antibiotikum feltalálója is szórakoztatta magát üres óráiban. A törzseket ampullákba zárva "liózzák" is a képen látható módon évtizedekig tárolhatják. 3.11 Előállítása Minden eljárásban közös, hogy kobaltsók hozzáadásával (10-100 mg) tenyésztenek metanol, izopropanol, etanol alkoholos, illetve propándiol, dekánok vagy paraffin szénforrásokon. Szénhidrogéneken nem lehet szennyvíziszapból kitenyészthető kevert elérni megfelelő hozamokat. A baktériumpopulációk lehetnek a leghatékonyabbak, ahol anaerob eljárásban (levegőtől elzárt) metanolos tenyésztéssel 3035 mg/l koncentráció érhető

el. Szintén anaerob eljárásban Propionibacterium 2-4 napos tenyészeteiben a dezoxiadenozil-kobinamid képződik, míg egy második 3-4 napos aerob fázisban dezoxiadenozil-kobalamin képződhet. Egylépcsős aerob folyamat a Pseudomonas tenyészetek B12 vitamin előállítása azzal a megkötéssel, hogy a kobalt mellett 5,6-dimetil-benzimidazolt is adagolni kell. A hozamot javíthatja még a betain is, ezért a jó betainforrás melaszt is adagolnak a fermentáció során a táplevesbe. B12 vitamin előállítása A kobalamin teljes mennyiségben intracellulárisan a baktériumsejtekben halmozódik fel, ezért a tenyészeteket hőkezelésnek vetik alá (pl. sterilezés 12125-30 perc), így az élő baktériumok szétesnek és elpusztulnak. Az oldatba vitt kobalamint cianokobalaminná alakítják és a 80%-os Cnyersterméket állattakarmányként vagy további tisztítás után gyógyszerként használják fel. 3.2 B2 vitamin (Riboflavin) A rivboflavint sok gomba és

baktérium szintetizálja. Kémiai szintézise is lehetséges, ezért erős versenyben áll a mikrobiológiai előállítással. Riboflavin Ismert, hogy Clostridium, Mycobacterium, Candida, Pichia törzsek egyaránt képesek riboflavin előállításra. Két tömlősgomba törzset vontak termelésbe az Eremothecium ashbyii és az Ashbya gossypii-t. Mindkét törzs 2000-6400 mg riboflavint képes szintetizálni micéliumhoz kötve és fermentlébe kiválasztva. A fermentáció kukoricalekvár és glükóz alapú, amelyet energiaforrásként szolgáló lipidekkel (pl. szójaolaj) egészítenek ki. A versenyképes fermentációs eljárást hátráltatja, hogy viszonylag hosszú, 7 napos steril tenyésztést igényel 29 °C hőmérsékleten. Több száz köbméterben nyilvánvalóan ilyen fermentációt folytatni költséges eljárás. Továbbá a riboflavint hőkezeléssel kell a micéliumoktól szabaddá tenni. Bioszintézis 3.3 Karotinoidok A karotinoidok kizárólag

növényi vagy mikrobiális eredetűek. 40 szénatomos poliizoprének, melyek konjugált kettős kötéseket tartalmaznak. Többségükben alfa- vagy béta-ionon gyűrűket találhatunk a molekula két végén. Két nagy csoportjuk van: az egyik a karotinok: alfa, béta- karotin és likopin, a másik a xantofilliok csoportja: lutein, violaxanthin, neoxanthin, zeaxanthin, flavoxanthin, luteinepoxid, astaxanthin és antheraxanthin a leggyakoribbak. Mindegyik karotinoid az aciklusos poliénből, a likopinból vezethető le, amely 11 konjugált kettőskötést tartalmaz. A karotinoidok szénhidrogénláncot, a xantofillok oxigenált szénláncot tartalmaznak. A karotinoidok sokszor zsírsavésztetek formájában növények és algák olajtartalmában, illetve karotinoidprotein komplexek formájában a fotoszintetikus membránokban. A karotinoidok közül a béta-karotin a legismertebb, mint A-provitamin. Az élelmiszeripar festékanyagként használja nagy mennyiségben. A likopint és

xantofillokat szintén az élelmiszeripar használja, margarinok sajtok színezésére. Baromfi takarmányokba is belekeverik a hús és a tojás színezésére. A kozmetikai ipar orális barnulássegítőként és barnítókrémek hatóanyagaként alkalmazza a xantofillokat. Karotinoidok szerkezete Karotinoidokat kizárólag kémiai szintézissel állítják elő, bár a xantofillokat néha növényi anyagokból is kivonják. A mikroorganizmusok fermentatív karotinoid előállítása nem gazdaságos, bár nagyon sokféle képes karotinoidok, béta- karotin, likopin és zexantin és astaxanthin szintézisre. Karotinoidokat különböző élesztő törzsek (pl Rhodotorula) és Streptomycesek, Mycobacteriumok képesek szintetizálni. Xantofillokat a baktériumok közül a Pseudomonasok, Micrococcusok, Mycobacteriumok, Chlorhobacteriumok, az algák közül pedig a Bacillariophyta, Chlorophyta és Cyanophyta fajok termelnek. A legismertebb a Blakeslea trispora fonalas

gomba, amelynek megfelelő zigospórás ivaros (+ és -) keverékkultúrája 3 g/l béta-karotin termelésére képes. Stimulálni triszporsavakkal, mint karotin előanyagokkal, valamint szerves zsíroldóanyagok és kerozin adagolásával lehetséges a törzsek béta- karotin termelését. A termelés aktivátora lehet az izoniazid béta-iononnal kombinálva. A-provitaminként csak a béta-ionon gyűrűt tartalmazó béta-karotin hatásos, az alfa és gamma karotin nem. A béta –ionon önmagában toxikus, a karotinképzést növényi olajok jelenlétében serkenti. Triszporsavak A béta-karotin tartalmú micélium közvetlenül az állatok takarmányába keverhető. Folyamatábra 3.4 A C-vitamin (L-aszkorbinsav) és az E-vitamin (alfa-tokoferol) bioszintetikus előállítása A klasszikus C-vitamin előállítás glükózból indult ki, ahol katalitikus redukcióval Dszorbittá alakították. Az Acetobacter suboxidans törzsei a D –szorbitot képesek régioszelektív

oxidációval L-Szorbózzá alakítani. C-vitamin Az L-szorbóz acetálással 2-keto-L-glükonsavvá alakítható, amely az L-aszkorbinsav kémiai szintézisének prekurzora. Ma már kizárólag tisztán kémiai szintézissel gyártanak C-vitamint. Az E-vitamint szintén szintetikusan gyártják, de az alfa-tokoferol molekula egyes struktúráit lehetséges többlépcsős biotranszformációval is előállítani Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast), Pseudomonas, Geotrichum és Clostridium baktériumok közreműködésével. 3.5 Az új szuper E-vitamin: az astaxanthin Egy 1967-es kutató expedíció során Phaff és munkatársai egy különös élesztőgombát izoláltak japánban, fák gyantájából. Az astaxanthin karotinoid termelő Phaffia rhodosyma fiatal 24 órás rózsaszínű telepei agarlemezen. élesztő astaxanthint termelt és számos cukrot képes volt fermentálni, szemben a többi hasonló karotinoid termelővel. Szokatlanul alacsony fehérje, viszont magas

lipid és szénhidráttartalma volt. Az élesztőgomba először a Rhodozyma montanae, majd később felfedezőjéről a nemzetség a Phaffia, az egyetlen ide tartozó faj a Phaffia rhodozyma nevet kapta. Az astaxanthin a fő komponensnek bizonyult az élesztő által termelt karotinoidok közül, a festékanyag mintegy 85%-át téve ki. Astaxanthint természetes úton tengeri rákokból és kagylókból lehet kinyerni, sőt szintetikus úton is elő lehet állítani. 2 nap tenyésztés után a Phaffia törzs grammonként 300-400 mikrogramm astaxanthint termel, amely literenként 6-8 mg-ot jelent. A termelés irodalmi adatok szerint kb duplájára növelhető (4). A Haematococcus pluvialis spórás sejtjeinek karotinoid tartalmának fő komponenense szintén az astaxanthin, amely a festékanyagainak mintegy 95%-át teszi ki. Ez az organizmus a legnagyobb mennyiségben termeli az astaxanthint a természetben. Az alga sikeresen alkalmazható, mint hús és tojás színjavító, illetve

gyökfogó. Haematococcus algatörzs egy hét tenyésztés után grammonként 20-30 mg astaxanthint termel, amely literenként 10-15 mg-ot jelent. Az alacsony nitrogén és foszfátkoncentráció, a levegőztetés és az intenzív megvilágítás az astaxanthin termelő algaspórák elszaporodását stimulálja. Asztaxantin szerkezeti kép 3.51 Felhasználása a takarmányozásban A Phaffia rhodozyma 1990-es években került előtérbe került, mint lehetséges ideális takarmány-kiegészítő és természetes astaxanthin forrás, mint hús és tojás színjavító, illetve gyökfogó. Alkalmazási területe elsősorban pisztrángokra és egzotikus madarakra terjedt ki, mivel ezek nem képesek pigmentanyaguk szintézisére és szervezetükben az élesztő-astaxanthin könnyen abszorbeálódott. A vad törzs hozzávetőleg 100-200 ppm / szárazanyag mennyiségű pigmentet tartalmaz, 6 nap tenyésztés után, ezért nagy mennyiségben kellett alkalmazni, mely nem volt gazdaságos.

Elkezdődtek a kutatások, az optimalizálási kísérletek a biomassza és a pigmentmennyiség növelését célozva meg. Az elmúlt évek során nagy mennyiségű adat halmozódott fel a szaporítás optimalizálásával, a lehetséges szénforrások alkalmazásával, mutáció lehetőségével kapcsolatban és fokozottan astaxanthin termelő Phaffia törzseket hoztak létre. Elsősorban csirke tojókon végeztek etetési kísérleteket, ahol 1-4 milligramm astaxanthin/kg takarmány alkalmaztak. A tojások színének változása 2 mg/kg takarmány esetén már megfelelő volt, míg 4mg/kg esetén a csirkék szöveteinek karotintartalma a kísérlet két hete alatt egyenletesen emelkedett. Ez a mennyiség a tojások keltethetőségére is pozitív hatást gyakorol, és mintegy 5,0 százalékponttal több tojás kikelése várható astaxanthinnal etetett tojóknál. In vitro kísérletekben csirke embrió fibroblasztokban 0,110 nM astaxanthin koncentráció esetén az oxidativ

stressz alá helyezett szövet antioxidáns enzim aktivitása a normál szintre esik vissza, így a szuper-oxid-dizmutáz és a kataláz aktivitása lecsökken, míg a glutation-peroxidáz aktivitása a normál értékre tér vissza. Kérődző állatokon - elsősorban teheneken - nagy számú béta- karotin etetési kísérleteket végezetek, ezek analógiájára astaxanthin etetése is végrehajtható, mérve a vér öszkarotin koncentrációját és az antioxidativ enzimek aktivitását. Sertéseket Evitaminnal, mint potenciális antioxidánssal már régóta etetnek Az astaxanthin, mint "szuper E-vitamin" versenytársa lehet az E-vitaminnak, mivel antioxidativ aktivitása in vitro kísérletekben mintegy százszorosa az E-vitaminnak. 3.52 Humán felhasználása Az utóbbi évek kutatási eredménye szerint nemcsak az előzőekben vázolt marginális felhasználása lehetséges az astaxanthinnak, hanem antioxidánsként, gyökfogóként a humán gyógyászatban is

alkalmazható. Antioxidáns aktivitása mintegy tízszerese a bétakarotinénak és mintegy százszorosa az E-vitaminnak Glutation-peroxidáz, kataláz és super-oxid-dizmutáz enzim aktivitás mérések ezt megerősítik. Hatékonyan gátolja a lipidperoxidációt Magas oxigéntenziójú vérben is kifejti antioxidáns hatását, szemben a bétakarotinnal amely ilyen körülmények között mint oxidációs gyök viselkedik Immunstimuláns hatása is meghaladja a béta-karotinét. Bár A-provitamin hatása nincs, egér lépsejteken végzett in vitro kísérletek szerint kisebb koncentrációban (2 x 10-8 M) képes stimulálni a thymociták sejtproliferációját, az interleukin-2 és a poliklonális antitestek termelődését, mint a béta-karotin (2 x 10-7 M). A stressz okozta káros mellékhatások kivédésére az astaxanthint japán kutatók, mint táplálék-kiegészítőt ajánlják. Amerikai szabadalom szerint központi idegrendszeri betegségeknél és szemsérüléseknél az

astaxanthin sikerrel alkalmazható. Továbbá számos retinoid tartalmú gyógyszernek fontos alapanyaga (5), valamint a szem retina fotoreceptorainak domináns pigmentanyaga (3). Kozmetikumként is alkalmazható Francia szabadalmi eljárás szerint Rhizobium meliloti tenyészet exopoliszacharidjának és Haematococcus tenyészet biomasszájának keverékét használják fel, mint gyógyhatású krém hatóanyagot. A gyomorfekélyt okozó Helicobacter pylori baktérium fertőzés megelőzésére és kezelésére svéd szabadalmi eljárás szerint az alga-astaxanthin alkalmazható. A stressz okozta káros mellékhatások kivédésére az astaxanthint japán kutatók, mint táplálék-kiegészítőt ajánlják. 4. Antibiotikumok Általában mikroorganizmusok által termelt anyagok, amelyek más mikroorganizmusok szaporodását már kis mennyiségben gátolják vagy elpusztítják azokat. Az antibiotiukumok döntő többségét gombák és sugárgombák fermentációjával

állítják elő. Mint ismeretes, az antibiotikumokat elsősorban sebfertőzések és különböző fertőző betegségek esetén citosztatikumként, alkalmazzák, másodsorban kemoterapeutikumként pedig daganatok ma már széleskörben elpusztítására és immunszupresszánsként szervátülteskor a szerv kilökődésének megakadályozására. 4.1 Béta-laktám antibiotikumok A penicillint a skót Alexander Fleming fedezte fel 1929-ben véletlenszerűen. A vizsgált Staphylococcus aureus Petri-csészés tenyészetébe a levegőből penész spóra hullott, és a kinőtt fonalasgomba telep körül megindult a fertőző baktérium lízise. Az izolált hasznos penészgomba (Penicillium notatum) által termelt penicillin nagyobb adagokban sem volt toxikus az emberi szervezetre. Az addig antiszeptikumként az orvosi gyakorlatban használt fertőtlenítőszerek a sebfertőzéseknél, súlyosabb légúti és más belső szervi gyulladásoknál hatástalanok voltak, mégis

sokáig nem ismerték fel a felfedezés óriási jelentőségét, így a penicillin fermentáció kidolgozása, a hatóanyag kinyerése, tisztítása, kémiai szerkezetvizsgálata és gyógyászati kipróbálása mintegy 10 évet váratott magára Angliában. E B Chain biokémikusnak sikerült a penicillin izolálása és kinyerése a P notatum tenyészetéből. Számtalan manipuláció átmosás, szűrés után egy sárgaport egy báriumsót nyert ki, amely kb. 500 egység penicillint tartalmazott mg-onként A penicillin un. Oxford-egységének definíciója: A szer azon legkisebb mennyisége, amely 1 cm3 vízben oldva 2,5 cm átmérőjű körben teljesen meggátolja a Staphylococccus aureus kórokozó mikroba fejlődését. Az antibiotikumok hatásvizsgálata a mai napig hasonló módon történik agar-agar Petri-csésze tápagarokon, ahol az agar felületén elszaporított kórokozókat antibiotikummal átitatott korongokkal gátolják és mérik a gátlási zóna átmérőjét. Az

Egyesült Államok vezetése, párhuzamosan azzal a döntéssel, hogy a szövetségesek oldalán részt vesz a Németország elleni háborúban, megadta a kellő támogatást az érdekelt kutató és ipari csoportoknak ahhoz, hogy az akkor még csak tudományos érdekességgel bíró, de igen perspektivikusnak látszó vegyület, a penicillin előállítását ipari szinten oldják meg. Statisztikai adatok bizonyították ui azt, hogy az I világháborúban több ember halt meg sebfertőzésben, mint a hadszíntereken. Az adott helyzetben (USA várható belépése a II. világháborúba az 1940-es évek elején) egy fertőzések ellen hatásos gyógyszer előállítása így katonai szemponttá vált. A 40-es évek legelején a téma az Egyesült Államokba került, ahol a cél a termék ipari előállításának megoldása lett, nem utolsósorban üzleti megfontolásból. A munka első lépése Fleming eredeti izolátumánál hatékonyabban termelő vad törzs felkutatása volt. A

megvizsgált nagyszámú izolátum közül 1943-ban legjobb termelőnek a helyi (Peoria, Illinois állam) piac kidobásra ítélt rothadt sárgadinnyéjéről elkülönített Penicillium chrysogenum NRRL 1951 törzs bizonyult. Ez a törzs lett a szülő-egyede mindazon ipari mutáns törzseknek, amelyekkel jelenleg a világ igen sok országában a penicillint előállítják. Ez a nemesítés vezetett a Wis Q 176 Wisconsin törzsvonalhoz, amelyet a legtöbb penicillin előállító gyártó átvett és nemesített tovább klasszikus mutagenezis technikával (screning). A 80-as évek óta a biotechnológusok rendelkezésére áll a protplaszfúziós technika, ahol a mutáns növelt penicillin termelő törzsek sejtjeit fuzionálva új hibrid hiper penicillin termelő sejtvonalak voltak előállíthatók. Fleming tudatában volt felfedezésének világméretű jelentőségére, ezért eljárását és a penicillint nem engedte szabadalmaztatni, hanem a gyógyítás érdekében az

1950–es évektől kezdve a világ minden országának rendelkezésére bocsátotta. Magyarországon maga Fleming adta át a penicillin termelő törzsét az Országos Közegészségügyi Intézetnek. 4.2 Penicillinek A természetes penicillinek a Gram-pozitív baktériumok növekedő sejtjei ellen hatásosak. Támadási helye a baktérium sejtfalát alkotó murein. A mureinbioszintézis során a muraminsavhoz csatlakozó pentapeptid molekula. Az oldallánc két terminális (végső) aminosava D-alanil-Dalanin, amely peptidhidak révén összekapcsolódnak. Penicillin jelenlétében ezek a peptidkötések nem tudnak létrejönni, így a sejtfal szintézise gátlást szenved, a baktériumok lizálnak (a citoplazma kiáramlik a sérült sejtfalon keresztül), elpusztulnak. Penicillin szerkezete A murein bioszintézis gátlása A penicillin molekula a béta-laktámgyűrű felhasadásával inaktiválódik, így azok a baktériumok, amelyek képesek a penicillin–béta-laktamáz

enzim szintézisére, azok védettek a penicillinnel szemben. A béta laktámgyűrűhöz kapcsolódó 6 aminopenicillinsav (6-APS)-hoz egy savmaradék oldallánc van, amely többféle lehet, aszerint, hogy milyen prekurzorokat adagolunk a fermentációhoz. Prekurzor adagolás nélkül a penicillin G-t használják terapeutikusan. Penicillin –G, mint természetes penicillin Több mint 100 bioszintetikus és félszintetikus penicillin származékot állítottak már elő, ezek: fenoxi-metil penicillin, propicillin, methicillin, oxacillin, ampicillin (Gramnegatívok ellen hat). Az eljárások lényege, hogy vegyi úton kiterjedtebb antimikrobás hatásspektrumú és béta-laktamázokkal szemben ellenállóbb molekulákat kapjanak. A penicillin bioszintézis egyik fő útja a lizinnel közös L-alfa-amino-adipinsav szintézis, ahol a homocitrát-szintáz enzim gátlásával nemcsak a lizin, hanem a penicillin szintézis is gátlást szenved. A penicillin bioszintézise A penicillin G-t

és V-ét (fenoxi-metil-penicillin) P. chrysogenum Wisconsin törzsének fermentációjával több száz köbméteres óriás fermentorokban állítják elő. A penicillinfermentáció folyamata A P. chrysogenum spórákkal oltott fermentorokban a gombafonalból összeálló pelletek képződnek, melyeknek nem szabad tömör golyós tenyészetekké válnia, mivel ez az optimális penicillin termelést levegőadagolással,120-150-r.pm akadályozza. fordulatszámú A fermentálás turbinás 0,5-1,0 keverővel, 25-27 vvm °C hőmérsékleten, 96-144 órán át folyik. A tenyésztést kukorica lekváron, szójaliszten, élesztőkivonton valamint glükózon, melaszon (10%) esetleg tejcukron végzik, és a fermentáció során folyamatosan adagolnak prekurzorként fenil-ecetsavat és/vagy fenoxiecetsavat 0,5-0,8 % mennyiségben a megfelelő penicillin származékok előállításához. A penicillinek a szaporodási fázist követő trofofázis és idiofázis során, mint

szekunder metabolitok termelődnek. A penicillint a gomba kiválaszja a tápoldatba, így a gombafonalak leválasztása után a fermentációs folyadékból butil-acetáttal vonják ki a tiszta penicillint. Szilárd felületi tenyészet oltása gomba oltóanyaggal. 4.3 Cefalosporinok A cefalosporint a Cephalosporium acremonium sugárgomba tenyészetében mutatták ki, amelyet végül Acremonium chrysogenium névvel osztályoztak, de a kimutatott antibiotikum keverék neve nem változott. Ilyen anyagokat más gombák is előállítanak pl cefamicineket bizonyos Streptomycesek. Magányos baktérium fonal. Az általuk előállított anyagok ma ugyanolyan fontosak, mint a penicillinek. Cefalosprinok szerkezete Béta–laktám–dihidro-tiazin származékok. Gyengén toxikusak ugyanakkor hatásspektrumuk széles az ampicillinnel összehasonlíthatók, csak egyes Grambaktériumok képesek inaktiválni. Bioszintézisük első lépései a benzil-penicillin szintézishez hasonlóak

és a penicillin N molekula kialakulásához vezet. Gyűrűbővüléssel deaceto-oxi-cefalosporin C képződik, amely cefalosporin C-vé alakul. A lizin adagolása serkenti a cefalosporin képzést Maga a fermentáció hasonló a penicillin eljáráshoz. 25-28 °C-on kukorica-lekvár, húsliszt, szacharóz vagy glükóz adagolással 90-160 órát nagy oxigénráta alkalmazásával végzik. A hozam 20 g/l is lehet. A penicillinek kémiai úton is átalakíthatók cefalosporinokká, ezért a penicillin relatív olcsósága miatt fermentáció helyett a kémiai szintézis széles körűen elterjedt. 4.4 A klavulánsav Újfajta béta-laktám gyűrűs rendszernek számított a 80-as években. Az amoxicillinnel kombinálva találkozhatunk vele a gyógyszertárban. A béta-laktám-oxazlidin gyűrűs rendszert a Streptonyces clavuligerus állítja elő cefalosporiniok mellett. Felfedezése és használata a kevert antibiotikumok bevezetését eredményezte, mivel önmagában antibakteriális

hatása nagyon gyenge, ugyanakkor gátolja a béta – laktamázok (a penicillin gyűrűjének felhasítója, ezzel inaktiválója) működését, így penicillinnel együtt alkalmazva igen széles skálán a penicillin hatásossá válik a kórokozókkal szemben. 4.5 Aminosav és peptid antibiotikumok Ezekről az antibiotikus citosztatikumok fejezetben bővebben is írunk, mivel erősen toxikus vegyületek, felhasználásuk korlátozott. A nem citosztatikum D-cikloszerin (D-4amino-3-izoxazolidon) a baktériumok sejtfalszintézisének (lásd a penicillin hatásmechanizmusa ábra) inhibítora az alanin racemáz gátlója szintetikusan is előállítható vagy egyes Streptomyces törzsek fermentlevéből kivonható. A legerősebb hatású antibiotikum a Mycobacterium tuberculosissal szemben, ezért antituberkulum. Sokszor rifampicinnel vagy sztreptomicinnel kombinálják a még jobb terápiás hatás elérése érdekében (+izonikotin-hidrazid mint szintetikus vegyületet is

adagolnak). Cikloszerin A virginiamicinek a Gram-pozitív baktériumok ellen hatásosak és széleskörűen alkalmazták az állattartásban betiltásukig (lásd a 2.46 fejezetet) Sterptomycesek állítják elő. Virginiamicin A Bacillusok számos peptid antibiotikum előállítására képesek pl. gramicidineket, polimixint, bacitracint. Gram-negatív baktériumok ellen hatásosak, a cink bacitracin az egész világon elterjedt takarmányadalék volt betiltásáig. Magyarországon ezt az antibiotikumot gyártották (Phylaxia) utoljára takarmányadalékként a 90-es évek végéig braziliai állattenyésztőknek. A sziderokrómok kelátképzésre képes peptid antibiotikumok, amelyek vasat megkötő képességükkel egyes baktériumok szaporodását gátolni képesek. A szideromicineket ipari előállítása még nem valósult meg, azonban a mezőgazdaságban egyes sziderokróm termelő törzseket vashiányos talajokon alkalmaznak. A Pseudomonas. fluorescens törzsek kevés vas

jelenlétében a vasat összegyűjteni képes, un. szidrofórokat termelnek (Kloepper et al, 1980) Ennek következtében a rizoszférában szaporodó más baktériumok és gombák, - mivel a sziderofórokból a vasat hasznosítani nem tudják - a vashiány miatt gátlást szenvednek. Másrészt ezek a sziderofórok vashiányos talajon a növények növekedését serkentik, mivel a vasat megkötve közvetlenül a növényeknek képesek átadni. Ezért ezeket a mikrobákat PGPR (Plant Growth Promoting gyökérbaktériumoknak nevezték el. Rhizobacteria), növényi növekedésserkentő A Streptomyces pilusus növekedésserkentő szideraminját vasforgalmi zavarok gyógyítására is használják (ferrioxiamin). 4.6 Glükozidok, amino-glükozidok, cukorszármazékok A legjelentősebbek az amino-glükozidok, a legismertebbek a sztreptomicin, gentamicin, tobramicin. Hatásspektrumuk széles, elsősorban Gram-negatív baktériumok ellen használatosak, Gram-pozitívok ellen is

hatnak. Gram-negatív erős fertőzés esetén a cefalosporinok mellett ezek az antibiotikumok jelentik a megfelelő hatásos anyagokat. Elsősorban tuberkulumok, mellékhatásaik miatt (vese és fülkárosító toxinok), valamint plazmidon hordott rezisztencia átadó képességük miatt hasznátuk korlátozott. Baktérium ellenes hatásuk különleges: az arra érzékeny baktériumok fehérjeszintézisét gátolja, ahol a riboszómákon a fehérje molekula szekvencia leolvasásában hibákat okoz, ezért leállítja a fehérjemolekulák szintézisét. Sztreptomicin, Neomicin, Kanamicin A sorban különleges helyet foglal el a Bacillus circulans által termelt ribosztamicin butirozin amino glükozid, bár gyártására egyelőre nem került sor. D glukoz A Streptomycesek amino-glükozid biosziontézisének óriási irodalma van. A Str griseus és Str. bikiniensis sztreptomicin bioszintézisét egy un A faktor indukálja Sztreptomicin bioszintezis A kanamicin, gentamicin, tobramicin

hozamai nem érik el a penicillin fermentációját, 1000-2000 mikrogramm/ml, kivétel a sztreptomicin, amely a 25 g/l-t is elérheti. Természetesen itt is megfelelő szelekciós és mutációs munka előzte meg a megfelelő törzsek használatát. Ezeket a penicillinhez hasonlóan óriási több százezer literes fermentorokban állítják elő, 28-30 °C-on, megfelelően sok levegőztetéssel (0,5-1,0 vvm) 4-7 nap alatt. Az amino-glükozidok szintézise a glükózból indul ki, ezért szénforrásként glükóz vagy glicerin adagolható. Sok esetben konyhasó adagolása is szükséges a szekunder metabolit kanamicin, sztreptomicin és neomicin előállításhoz. A cukorszármazék glikopeptid vankomicin és cukoramid linkomicin Staphylococcus Gram-pozitív baktériumok ellen hatásosak. Mellékhatásaik miatt csak penicillin túlérzékenység vagy más antibiotiukummal szemben ellenálló korokozó esetén alkalmazzák. A linkomicinnel szemben a kórokozók gyors rezisztencia

kialakulást figyelték meg. Hatásmechanizmusukat a fehérjeszintézis riboszómáin a transzfer tRNShez kötődve fejtik ki Linkomicin A foszfo-glikolipid moneomicin Gram-pozitív és rezisztancia plazmidot hordozó Gram-negatív baktériumok ellen hatásos. Az EU antibiotikum tilalmáig, 2006-ig széles körben használt takarmány-kiegészítő. A murein–sejtfal szintézis transzglikolizálását gátolja a baktériumokban. 4.7 Makrociklusos-lakton-antibiotikumok Az eritromicin és tilozin ismert makrolid antibiotikumok. A sugárgombák 1-2 %-a képez makrolid vegyületeket, melyek Gram-pozitív baktériumok, elsősorban Staphylococcusok és diphtéria baktériumok ellen alkalmazhatók eredményesen. Ismert az eritromicin, tilozin és leukomicin, melyeket a penicillinre érzéketlen kórokozók ellen vetnek be. Bár csak kismértékben toxikusak használatuk során hamar keresztrezisztencia alakul ki, ezért terápiás alkalmazásuk korlátozott. Hatásmechanizmusuk: a

fehérjeszintézis gátlását okozzák a riboszómák 50S alegységéhez kötődve. Eritromicin Az eritromicin terápiásan jól ismert és az első lakton antibiotikum, amit a gyógyításban bevetettek. A Streptomyces erytheus tenyésztése szójaliszt (szénforrás is), ammóniaszulfát, kukorica lekvár nitrogénforrásokon és keményítő szénforráson 25-33 °C-on optimális 3-7 napig. A tilozin fermentációja a szterptomicinhez hasonlóan glicerin vagy előnyösebben glükózon történik. A polién makrolid antibiotikumok – pl. tilipin, amfotericin, nisztatin - gombaellenes hatásukról ismertek és az eukarióta sejtfal membránszterinjeit támadják. Hatásukra a membrán permeábilitása megváltozik, tönkremegy. Toxikusságuk nagy, ezért elsősorban külsőleges felhasználásuk lehetséges. Többféle Streptomyces törzs képes előállításukra A rifampicin, mint kromofór makroiciklusos antibiotikum igen erős Gram–pozitív és kissé gyengébb Gram-negatív

baktériumokkal szemben, ráadásul nem képesek vele szemben keresztrezisztanciát kialakítani. Tuberkolózis gyógyszer Az DNS dependens RNS polimeráz inhibítora, így gátolva meg a baktériumok szaporodását nem specifikusan. A Nocardia mediterranii tenyészetei termeli 4.8 Tetraciklinek és antraciklinek A penicillin után legismertebb antibiotikumok. A tetraciklint a Streptomyces aurofciens, majd a klórtetraciklint Str. viridifaciens kultúrájából izolálták Három különböző tetraciklint ismerünk: tetraciklin (TC), oxitetraciklin (OTC), 7-klór-tetraciklin (CTC). Félszintetikus származékai közül igen népszerű a doxiciklin. Széles spektrumú fehérjeszintézis inhibítor (a riboszóma 70S alegységéhez kötődve) antibiotikumok, jól hatnak a Gram–pozitív és Gram–negatív baktériumok, rickettsiák, mikoplazmák, leptospirák és spirochéták ellen Tetraciklin és doxiciklin Jellemző példa a Str. aurefaciensszel végzett törzsnemesítés,

ahol különféle - az antibiotikum termelő törzsek szelekciójában megszokott - termelési hozamot fokozó mutációs módszereket alkalmazva, elsősorban UV besugárzások után a fermentléből kinyerhető tetraciklint 600 mg/literről 15 g/literre fokozták. A klórtetraciklin képzés mutációinak termelési mutatói és a megnövelt termelésű törzsek gyakorisága a kiindulási törzs 100%-os termeléséhez viszonyítva. Szintén az antibiotikumoknál tipikus üzemi előállítási folyamata: 4.9 Aromás antibiotikumok A kloramfenikol, bár toxikus csontvelő-károsító hatású, a legerősebb fertőzések esetén használatos igen széles spektrumú Gram-pozitív, Gram-negatív baktériumokat, sugárgombákat, ricketsiákat, sőt egyes vírusokat elpusztító molekula. Hatásmechanizmusuk ismét a fehérjeszintézis gátlására vezethető vissza a riboszómákon. Ma a kémiai szintézis lehetősége és olcsósága miatt fermentációja nem elterjedt.

Klóramfenikol szerkezet A Penicillium patulum termelte grizeofulvin a kitintartalmú gombasejtfalak összetapadását és csomósodását okozza, így gátolva szaporodásukat, fungisztatikus antibiotikumok. A növényvédelemben is alkalmazzák lisztharmat ellen Grizeofulvin szerkezete A Str. spheroides, niveus griseus vagy griseofalvus tenyészeteiből iolálták a novobiocin kumarin glikozidot. Gram-pozitív Stpahylococcusok és Gram negatív Meningococcusok (meningitis-agyhártyagyulladás) és Ghonococcusok (gonorrea) és Haemophylus influanse és Proteusellen hatásos gyors rezisztencia kialakulás mellett. Novobiocin szerkezete Fermentációja 25-28 °C-on prekurzorként p-amino-szalicilsav adagolásával 90 órán át tart. 4.10 Antibiotikus citosztatikumok Kevésbé ismertek, de ma már nagy fontosságúak a tumorgátló és immunszupresszív antibiotikumok is. Citosztatikumnak nevezünk minden olyan vegyületet, amely gátolja a rákos megbetegedés folyamatát és

egyes esetekben teljes gyógyuláshoz vezet, de általában önmagában, tehát sugárterápia és sebészeti beavatkozás nélkül alkalmazva, nem tudja véglegesen megállítani a rosszindulatú daganatok fejlődési folyamatait. A rákellenes hatású anyagok kutatásának nehézségei már magának a betegségnek a meghatározásával kezdődnek. A rákos megbetegedés ui egy gyűjtőfogalom, amely alatt sejtburjánzással járó folyamatokat értünk, a rosszindulatú daganatoktól kezdve a vérképző vagy nyirokrendszer megbetegedéséig. Jellemző a rákos sejtekre, hogy elárasztják a környező szöveteket - kicsi a tapadóképességük - és az élő test különböző részeibe jutva áttéteket (úgynevezett: metasztázisokat) képeznek. A citosztatikumok előállítása és vizsgálata az 1940-es évek végén kezdődött az un. nitrogén mustár felfedezésével, amikor is a második világháború alatt harci méregként alkalmazható anyagok után kutatva,

felfedezték a Mechlorethamine-t. A szintetikus citosztatikumok ezen csoportjába soroljuk mindazokat a vegyületeket, amelyek RCH2CH2Cl vagy R-CH2CL csoportokat tartalmaznak, és amelyek biológiai (fiziológiai) körülmények között, tehát vizes oldatban, közel semleges pH viszonyok mellett és 37 oCon alkilezni képesek. A biológiai alkilezőszerek támadási pontjaként elvben minden, a szervezetben előforduló és nukleofil csoportokkal rendelkező vegyület szóba jöhet. (pirimidin és purinbázisok, amelyek a dezoxi-, illetve a ribonukleinsavakban fordulnak elő). A későbbi évek során Haddow és Ross valamint munkatársaik további, vízben jobban oldódó biológiai aromás alkilezőszereket állítottak elő. Ilyenek például a Chlorambucil vagy a Melphalan, ezek ma már általános klinikai alkalmazást nyertek. Az ötvenes években terjedt ki a kutatás az antibiotikus citosztakiumokra és folyik azóta is. A citosztatikumokat szintetizált és izolált

vegyületet, a kémiai szerkezet és a hatásmechanizmus alapján a következő csoportokba lehet besorolni: I. Biológia alkilezők II. Antimetabolitok III. Antibiotikumok IV. Hormonhatású anyagok A citosztatikumok a sejtszaporodást gátolják, de hatásukat nem csak a malignus, hanem a normál sejtekre is kifejtik, éppen ezért fokozott veszélyt jelentenek mind a terápiába bevont betegek, mind a terápia végrehajtását végző egészségügyi személyzet számára. DNS-károsító anyagot tartalmaznak, így potenciálisan veszélyes mutagén, teratogén, karcinogén hatással rendelkeznek. Gyakorlati szempontból alapvető fontosságú, hogy a genotoxikus anyagok legkisebb adagja is káros lehet az egészségre. Az antibiotikus citosztatikumokat elsősorban Streptomyces (sugárgombák) fajok törzseinek tenyésztésével állítják elő: aktinomicin, adriamicin, daunomicin, kromomicin, mitramicin, mitomicin, bleomicin, neokarcinosztatin, cyclophosphamid.

4.101 Kromopeptid antibiotikumok Ebbe a csoportba sorolják az aminósav-peptid típusú antibiotikum aktinomicineket, melyek jó tumorellenes hatásúak. Nagyon toxikusak, máj és vesekárosodást okoznak Fő hatása hogy a szaporodó sejtekben blokkolják a nukleinsav szintézisért felelős DNS dependens RNS-polimerázok működését. A S. antibioticus és S chrysomallus képes aktinomicin A,B, C, D és Z vegyületek előállítására. E vegyületek közös sajátsága, hogy mindegyik tartalmazza a fenoxazonkromofor szerkezetet (aktinocin) A fermentáció során aminosavak adagolásával 30 különböző akinomicin előállítása lehetséges. A szintézis kulcsenzime a fenoxizanon – szintáz. 4.102 Antraciklinek Az antraciklinek az egyik legtoxikusabb glükozid típusú antibiotikumok közé tartoznak. Közvetlenül gátolják a DNS polimeráz működését, beékelődve a DNS nukleinsav egységei közé. Közéjük tartozik a S. peucetius által termelt daunomicin és

adriamicin A leukémia egyik hatásos kemoterapikuma volt. Antraciklinek 4.103 Immunomodulátorok A Tolypocladium inflatum gombatörzs ciklosporin-A vegyületet termel, amely a szervátültetéseknél az egyes átültetett szerv kilökődését okozó T limfocita sejtek aktiválódását akadályozza. K Fermentációja az antibiotikumoknál megszokottaknál hosszabb mintegy 10-12 nap glükóz szénforráson és kazein-pepton nitrogénforráson. 4.11 Takarmány és növényvédelmi antibiotikumok A biotechnológia hajnalán (1950-es, 60-as évek) a gyógyászatban használt antibiotikumokat széles körben és nagy mennyiségben keverték a takarmányokhoz. Magyarországon a gyógyszergyárakban az antibiotikum fermentáció melléktermékeként képződött nagy antibiotikum koncentrációjú sugárgombák leszűrt micéliumait (pl. gentamicin, oxitetraciklin) tonnaszám szállították az állami gazdaságok baromfi és sertés állattartó telepeire. Az antibiotikummal

kevert takarmány a gyomor – bélrendszer mikroflóráját átalakítja és jobb lesz az állatok takarmányértékesítése és gyorsabb a tömeggyarapodása (hozamfokozó). Ez a gyakorlat, bár gazdasági szempontból jó eredményeket produkált, óriási hiba volt. Az antibiotikumokkal tömött állatok bélflórájában az antibiotikumokhoz hozzászokott-rezisztens-baktériumfajok alakultak ki, melyeket a már meglévő antibiotikumokkal nem lehet elpusztítani, ráadásul az állatok tejében, húsában is antibiotikus vegyületek halmozódtak fel, amelyek az emberi szervezetbe kerülhettek. Éppen ezért, bár alaposan megkésve és csak fokozatosan tiltották meg az antibiotukumok takarmányként való felhasználását. Az 1970-80-as évektől jogszabályok tiltották a humán gyógyászatban alkalmazott szerek takarmányadalékként való felhasználását. A megkésett intézkedés miatt többféle antibiotikum is hatástalanná vált a gyógyászatban, pl. maga a

klasszikus penicillinnek ma már csak egyes származékai hatásosak, az oxitetraciklint drága eljárással doxiciklinné kellett szintetikusan alakítani. Azonban néhány új generációs antibiotikum használatát továbbra is engedélyezték, nyílván a gazdasági érdekkörök nyomására. Ezeket csak takarmányozási célra lehetett felhasználni: pl. monenzin, higromicin, bacitracin, tilozin Végre 2006 januárjától az Európai Unióban betiltották az antibiotikumok hozamfokozóként való használatát. A nagy állattartó telepeken a tömeges állattartás miatt gyakoriak a légúti és bélfertőzések, ezért terápiásan továbbra is alkalmaznak takarmányba keverve antibiotikumokat, sokszor feleslegesen és nagy gyakorisággal. Mindezek miatt még továbbra sem beszélhetünk antibiotikum-mentes állattartásról. Ki tudja, az elmúlt évtizedek, milyen patogén rezisztens baktériumok megjelenésének kedveztek? Sajnos a növényvédelemben is hasonló helyzet

állt elő, így kezdetben a gyógyászatban használt antibiotikumokat egyidejűleg a növényvédelemben is felhasználták - pl. sztreptomicint -, ezt persze hasonlóan az állattakarmányozáshoz fokozatosan megszüntették (késve). A növényvédőszerekkel szemben az antibiotikumoknak az az előnyük, hogy igen kis koncentrációban és szelektíven csak az egyes kórokozó baktériumra vagy akár gombára (fungicid) hatnak. Ma kórokozókkal fertőzött területeken (pl. üvegházi termesztésben) az egyes készítményeket továbbra is alkalmazzák 5. Anyarozs alkaloidok Az anyarozs alkaloidokat a Claviceps purpurea gomba állíja elő. A gomba hatóanyagainak egy része simaizom-összehúzó hatású. Ezeket elsősorban a centrális és periferiális vérzések csillapítására és a szülészeti gyakorlatban méhösszehúzó hatása miatt alkalmazzák. További jelentősége van a migrén és a Parkinson-kór kezelésében is Terápiás jelentősége miatt az

anyarozst mesterségesen fertőzött rozstáblákon termesztették, mert mint obligát parazita, táptalajon nem volt tenyészthető, de ma már fermentációval és szintetikus módon ezek az alkaloidok előállíthatók. 5.1 Előfordulásuk, jelentőségük Az anyarozs nevű tömlősgomba (Claviceps purpurea) példája jól illusztrálja, hogy egy gomba egyszerre lehet veszélyes megbetegedéseket okozó és ugyanakkor a modern gyógyászat egyik legfontosabb farmakológiailag hasznosított gombafaja is. Az anyarozs növényi kórokozó (fitopatogén) gomba, amely a gabonafélék (elsősorban a rozs) virágait fertőzi meg, elpusztítva a termőt. Ősszel a kalászban a fertőzött virágok helyén a 2–5 cm hosszú, görbült, fekete "varjúköröm" alakul ki, amely a gomba vegetatív kitartó képlete, ún. szkleróciuma (ábra) A szklerócium több mint száz biológiailag aktív vegyületet, elsősorban alkaloidokat tartalmaz, amelyek között toxikusak is vannak.

Az anyarozs egyes hatóanyagai a) ergolin b) lizergsav c) ergotamin Már a középkorban ismertek voltak azok a tömeges megbetegedések, amelyeket a fertőzött, varjúkörmöket tartalmazó rozsból őrölt liszt fogyasztása okozott. Ez az ergotizmusnak nevezett betegség (valójában mérgezés) egyes vidékeken olyan gyakori volt, hogy járványosnak tekintették és külön szerzetesrend foglalkozott a gyógyításával. Először Adam Lonitzer 1582-ben kiadott Füvészkönyve említi, hogy a gombának gyógyító hatása is van. A gyógyszerkönyvekben azóta mint Secale cornutum szerepel Csak a század elején sikerült azonban az egyik anyarozs-alkaloidot tiszta formában is kinyerni. A gomba fő hatóanyagai, az indol-alkaloidok közé tartoznak. Alapvázuk a tertaciklusos ergolin. A vegyületek két fő csoportba oszthatók: a lizergsav-származékokéba (pl ergopeptin, ergotamin, ergopeptámok) és a clavin-alkaloidokéba (pl. clavin, agroclavin, elymoclavin). Az

alkaloidokon kívül az anyarozs még egy sor, különböző szerkezetű hatóanyagot tartalmaz, mint pl. kéntartalmú hisztidinszármazékokat (pl ergithionein), különleges zsírsavakat, indolditerpéneket, antrakinon-karbonsavakat és pigmenteket, amelyeket ergochromoknak neveznek. A gomba hatóanyagainak egy része vajúdást elősegítő, simaizom-összehúzó hatású. Ezeket elsősorban a centrális és periferiális vérzések csillapítására és a szülészeti gyakorlatban méhösszehúzó hatása miatt alkalmazzák. További jelentősége van a migrén és a Parkinson-kór kezelésében is Anyarozs alkaloidok és hatásaik: ERGOMETRIN: az amin-csoport miatt sóképzésre hajlamos, tartarát (ERGAM), vagy maleát formájában hozzák forgalomba. A szabad bázis vízben rosszul oldódik, etilacetáttal extrahálható, CCl4-dal együtt kristályosodik. Hatása: oxitocin jellegű, a méhizomzat összehúzódását okozza. A szülés megindítására, gyorsítására és a

kapcsolatos vérzések csökkentésére használják. Érösszehúzó hatása miatt migrénes rohamok kezelésére is jó. Adagja: 0,3 mg (picike) Ellenjavallat: terhesség Az Ergometrin önmagában is gyógyszer, de a lizergsav és más származékok kiindulási anyaga is lehet. ERGOTAMIN: másik típus, itt az alapvázon több-gyűrűs tripeptid lóg A különböző aminosavak beépülése révén több hasonló molekula. Apoláros aminosav oldalláncok - rosszabb vízoldhatóság. Erős érösszehúzó hatású, ezzel a vérnyomást emeli Elimoklavin, lizergol, lizergsav, LSD (kábítószer). 5.2 Szaprofita Claviceps törzsek fermentációs tenyésztése Terápiás jelentősége miatt az anyarozst mesterségesen fertőzött rozstáblákon termesztik, mert mint obligát parazita, fermentációs tenyésztése nehézkes. Az alfa-hidroxi-etil-lizergamid (D-lizergsav) előállítását szaprofita Claviceps paspali, C fusiforms, C purpurea fajjal végzik, az előállított terméket

félszintetikus alkaloidok előállítására használják (pl. lizergsav-dietil-amid, LSD). A scale up problémái: a főfermentáció 8-12 napos, így nagy sterilitási és stabilitási körülményeket kell biztosítani a tenyészetnek, mint fonalas gombák igen érzékenyek a keverés miatt fellépő nyíró erőkre (a gombafonalak elszakadnak), ugyanakkor átlagos oxigénigényűek. alfa-hidroxi-etil-lizerg-amid A lizergsav előállításhoz a táptalajnak tartalmaznia kell mannitot vagy szukcinátot, az ergotaminhoz szacharózt vagy citrátot. A glükóz represszálja az alkaloid előállítást, ugyanakkor triptofán adagolással a gombatenyészet szekunder metabolizmusa, így az alkaloid szintézis indukálható. A szubmerz fermentáció kezdetén a trikarbonsav ciklus uralkodó szerepű, ezért is fontos a ciklus valamilyen szerves savát adagolni. A Claviceps törzsek fenntartása szintén problematikus, mivel az egyes átoltások, passzálások során a törzsek

termelőképessége gyorsan csökken. Itt nagy fontosságú az egyes termőképes izolátumok fagyasztással vagy liofilizálással való tartósítása. 6. Szerves savak A trikarbonsav ciklus szinte minden sava előállítható mikrobiológiai úton. A trikarbonsavak biológiai előállításával kapcsolatban már mintegy 50 éve több laboratóriumi és ipari kísérletet folytattak már, de előállításuknak – a citromsav kivételével - erős konkurenciája a kémiai szintézis (tejsav, ecetsav, almasav, alfa-ketoglutársav). Ipari mennyiségben biológiai úton citromsavat és a speciális itakonsavat, kojisavat (Japán) állítanak elő. Biológiai úton többféle módon lehet előállítani ezeket a savakat, egyrészt lehet klasszikus fermentációs utakon szubmerz és felületi tenyésztéssel fonalasgombákból (Aspergillus fajok,) de immobilizált sejteket is felhasználnak, többek közt baktériumokat (Brevibacillus, Rhizopus, Propionibacterium, Leuconostoc,

Acetobacter fajok) és élesztőgombákat. 6.1 Almasav Almasav Az almasav a citrát kör egyik lépésekor fumársavból keletkezik. Eddigi kutatások során kétfelől próbálták megközelíteni az almasav termelését: egyrészt a citromsav-ciklus során létrejövő almasav termelődéséért felelős enzimet kódoló gént vizsgálták, ami a fumársavból hoz létre almasavat. A másik esetben pedig a reduktív citromsav ciklus során termelődött almasav termelődéséért felelős enzim génjét, ami az oxálacetátból állít elő almasavat. Az előbbi esetben a fumaráz génjét (fum1), az utóbbi esetben a malátdehidrogenáz génjét (mdh2) vizsgálták (lásd a Rekombináns termékek fejezetben) 6.11 Citrát kör-alapú termeltetés Egy Saccharomyces bayanus törzs képes ipari mennyiségű almasav termelésére, amennyiben a sejteket permeabilizálják. A sör, bor és bioalkohol gyártásnál valamint az állattakarmányozásban probiotikumként is

alkalmas Saccharomyces cerevisiae élesztőgomba kompakt fehér telepei agarlemezen. Először szuszpendálni kell pufferben 7,0 pH-on egy órán át, mosás desztillált vízzel, majd újra 0,1 M H2PO4/K2PO4-pufferrel. Ezután a mosott sejteket szuszpendálni kell különböző detergensekkel, majd centrifugálni. Ezután a szuszpenzióból 35 g/l töménységgel lehet enzimatikus vizsgálatot végezni. Az almasavat spektrofotometriásan vagy HPLC-vel lehet ezután vizsgálni. A citrát kör Magyarázat: AC: ecetsav, Cit: citromsav, ICIT: izocitromsav, αKG: alfa-ketoglutársav, SOCCOA szukcinil oxalát, SUCC: szukcinilsav, FUM: fumársav, MAL: almasav, OAA: oxálacetát 6.12 Reduktív citrát kör-alapú termeltetés A második megközelítési módon végeztek olyan kísérletet, amikor a malát-dehidrogenáz génjét (mdh2) többszörös kópiában vitték be a sejtbe. A malát-dehidrogenáz a citromsavciklus esetében az almasavból oxálacetátot alakít, míg a reduktív

citrát kör esetében fordítva. Olyan kondíciót kell létrehozni, ami ez utóbbi anyagcsere-útnak kedvez Ilyenkor a citoplazmában termelődik az almasav. Reduktív citrát kör A reduktív citrát kör egy ősi anyagcsere út, ami a szén-dioxid asszimilációjához szolgál, és a citoplazmában megy végbe. Ez az anyagcsere-út nem megy végbe minden szervezetben, a bíbor-kén baktériumok esetében tanulmányozták ezt az anyagcsere utat és élesztőkben is működik. Ha a közegben a C:N arány nagy, vagyis alacsony a nitrogéntartalom, valamint magas a karbonát, az élesztőben végbemegy a reduktív citrát ciklus. A citromsav ciklus esetén az almasavból a malát–dehidrogenáz enzim oxálacetátot hoz létre. Ez a reakció reverzibilis. Ilyenkor az almasav a fumársavból jön létre fumaráz enzim segítségével Ez a reakció viszont irreverzibilis, vagyis a fumaráznak jóval nagyobb az affinitása az enzimhez, mint az almasavnak, így inkább az almasav

képződés irányába megy a reakció. Tehát a reduktív citrát kör esetében az almasav jobban halmozódik fel, mint a citrát kör esetében. Mivel így nincs szükség az almasav továbbalakulásáért felelős enzim génjének inaktíválására, kiütésére, kevesebb molekuláris beavatkozást igényel. 6.13 Immobilizált élesztősejtek fermentációja Az eddigi kísérletek során immobilizált élesztősejteket tartalmazó bioreaktor segítségével végezték a leghatékonyabb almasav-termeltetést. Ez egy olyan kamra, ami három részből áll, és az egyes részek speciális folyadékmembránnal (SLMs) vannak elválasztva. Az első rész a tápláló rész, ahol a prekurzort adagoljuk, ami a citrát kör alapú termeltetés esetén a fumársav, reduktív citrát kör esetében pedig az oxálecetsav. A második rész a reakciótér, ami összeköttetésben áll az immobilizált élesztősejteket tartalmazó oszloppal. A reakciófolyadék folyamatosan áramlik

reakciótér és az oszlop közt. A harmadik rész pedig a terméktér, innen kell elvezetni az almasavat. A membrán szeletíven engedi át az anyagokat. Az első a prekurzor anyagot engedi át, a második pedig a terméket A reakciótér és a terméktér közti membrán már kizárólag az almasavat engedi át. Az anyag antiport-elven áramlik úgy, hogy a szervetlen komponensek vándorolnának az ellentétes irányba. A terméket HPLC segítségével analizálták, vizsgálva hogy a prekurzor hány százaléka alakult át almasavvá. A bioreaktor sematikus ábrája 6.2 Citromsav Citromsav Immáron több mint 100 éve ismert, hogy a penészgombák citromsavat termelnek. Az 1920-as évektől felületi tenyésztéssel megkezdték fermentációs gyártását, ma elsősorban szubmerz rendszerben fermentálnak. A citromsavat óriási mennyiségben az élelmiszeripar és gyógyszeripar használja ízesítésre, konzerválásra. Citromsav gyártás 6.21 Eljárások Elsősorban

Aspergillus niger fonalas gombával állítják elő felületi és szubmerz tenyésztéssel egyaránt. Az enzimtermelő fonalas gomba Aspergillus niger fehér szálas telepei jól látszódnak fekete háttérrel. Aspergillus niger gombafonalak. citromsavnak mint primer anyagcsereterméknek a legfontosabb prekurzora, szénforrása a glükóz. A piruvát acetil-CoA képződés közben dekarboxileződik és az acetátmaradék belép a trikarbonsavciklusba (lásd citrát-kör ábrája). Kulcsenzim a citrát szintetáz, de mivel a sejtek növekedése a trikarbonsav ciklusból köztes termékeket von el, az így keletkezett hiányokat anaplerotikus reakciók pótolják. Ezek az acetil-CoA akceptorát az oxálacetátot pótolják, ilyenek pl.: piruvát – karboxiláz, foszfo-enol-piruvát-karboxikináz, izocitrát-liáz A felületi(SSF) eljárást A niger spórák tenyésztésével búzakorpán végzik, csökkentett pH-án sterilezve, majd 28 °C-on 5-8 napig tálcákon inkubálva. A

kész penészes búzakorpából forró vizes extrakcióval vonják ki a citromsavat. Folyékony tápoldatokkal is végeznek felületi tenyésztést. Hátránya a nagy befertőződési veszély, viszont túlmelegedésre kevésbé képes a rendszer, így egyszerűbb technika elegendő. A szubmerz eljárások 10-15%-os cukor konverzióját elsősorban melasz alapanyagokból biztosítják, de burgonyakeményítőt és izocukrot is alkalmaznak. A citromsavképzés érzékeny az egyes nyomelemek jelenlétére, ezeket a melaszok megfelelő mennyiségben tartalmazzák, ugyanakkor a ppm (mg/kg) mennyiség túllépése már káros. A melaszokat, ezért a fémek kicsapására, kálium-hexaciano–ferráttal kezelik A túlzott elsavanyosodás ellen kálcium-karbonát adagolással helyesbítik a pH-át. Az A. niger oltóanyagot un blake üvegekben szaporítják el és spóráztatják szilárd agar táptalajon, majd ezeket a spórákat oltják szubmerz kultúrába, ahol 32 C- on csíráznak,

és 24 óra alatt a fonalak pelleteket képezve elszaporodnak. Ezekkel a pelletekkel közvetlenül olthatók a nagyobb térfogatok. A termelő fermentációt alacsony pH-án (2,03,0) folytatják, ezért a savak elleni védelem miatt a rozsdamentes acél fermentorokat műanyagokkal kell borítani. (Magas vastartalom kioldódása esetén oxálsav képződik, és sárga pigment jelzi a fermentáció rossz irányát.) A tenyészetek bár kis oxigénigényűek, a szén-dioxid tartalom növekedésével a citromsavképzési ráta csökken. A feldolgozás során a melléktermékként keletkező kis mennyiségű oxálsavat kálium-oxalátként kicsapatják, miközben a citromsav monokalcium-citrátot képez. Végül a citromsavat a micéliumtól leválasztva forró (70-90 C) vízben kicsapatják és megszárítják. 6.3 Itakonsav Itakonsav szerkezeti képlet Az itakonsav előállítására az Aspergillus itaconicus és A. terreus törzsek képesek Az itakonsav saját észtereivel és más

monomerekkel kopolimereket képez, melyeket a tapéta, papír és ragasztóanyag gyártás egyaránt felhasznál. Szintén a trikarbonsav ciklusban a cisz–akonitsavból dekarboxilálással keletkezik. Az itakonsav szintéziséhez a citromsavhoz hasonlóan fontos egyes nyomelemek jelenléte (réz, cink ppm. koncentrációban), valamint érzékeny vas jelenlétére, amennyiben a ppm mennyiséget a vas koncentrációja meghaladja, a termelés lecsökken. 6.4 Ecetsav Az ecetsav baktériumok. Acetobacter aceti (A peroxidans, A pasteurianus) befejezetlen oxidáció során az etanolt ecetsavvá oxidálják. Egyes fajok teljesen vízzé és szén-dioxiddá is képesek túloxidálni az etanolt, ez a termelés során káros. A Gluconobacter csoportjai az ecetet nem képesek tovább bontani. Etanol oxidációja ecetsavvá A törzsek az oxidációhoz nagy mennyiségű oxigént igényelnek. Ez azért is fontos, mert levegőztetés hiányában az 5-12% etanol koncentráción a sejtek

gyorsan elpusztulnak, míg megfelelő oxigénellátás mellett 12% etanolból 12,4% ecetsavat képesek előállítani. A legősibb eljárás szerint felszíni fermentáció során a bor felületén növesztették a tenyészeteket, kis hatásfokkal. Továbblépés volt a szilárd felületi tenyésztés ahol bükkfaforgácsra permetezték a cefrét, ez volt az u.n ecetgenerátor A forgács felületén szaporodtak el az ecetbaktériumok és alulról levegőztetve a rendszert, értek el a szubmerz tenyésztéshez hasonló hatásfokot. A szubmerz eljárások óriási 3-4 vvm levegőt igényelnek, ezért ezeket elsősorban kis etanolkoncentrációjú cefrékre dolgozták ki, itt nem kritikus a levegőztetés megszakadása. Az elkészült ecetes tenyészet a baktériumoktól zavaros, ezért steril szűrést hajtanak végre. 6.5 Tejsav Tejsavképzés glükózból A tejsav neve az állni hagyott tejsavbaktériumok hatására megsavanyodott tejből ered. Tejsavas erjedés játszódik le

káposzta és uborkasavanyításnál, takarmányok silózásánál. Lactobacillusok (L. delbrückii, L bulgaricus, L pentosus) képesek homofermentatív melléktermék nélküli - tejsavas erjesztésre Itt a lehető legtöbb glükóz metabolizálódik tejsavvá. A fementációt 12-13% glükózkoncentráción 45-50 °C-on anaerob végzik 48-72 órán át B vitaminok adagolása mellett. Erős konkurenciája a kémiai szintézis 6.51 Élelmiszeripari fermentációval előállított tejsavas erjesztésű termékek A termékek előállításában résztvevő mikroorganizmusok döntően meghatározzák a termékek külső megjelenését, texturáját, ízét, illatát, biológiai értékét. Ha a tejipari termékeket az alkalmazott fermentációs műveletek alapján osztályozzuk, akkor a következő termékcsoportokat különböztetjük meg:  savanyító kultúra: túrók, fehér sajt, savanyú krém és aludttej  savanyító és aromaképző szintenyészet kultúra:

kefir,(kumisz), joghurt, tejföl  savanyító, oltóenzimes, érlelő szintenyészet kultúrák: sajtféleségek (700- nál több féleség) A fermentációk során: tejsav, citromsav, illó aldehidek és ketonok, acetilmetilkarbinol, diacetil adják a termékek jellegét. A sajtok esetében fehérjebontó (proteázok, peptidázok) zsírbontó (lipázok), aminosavak katabolizis (dekarboxiláz, deamináz) tevékenység is zajlik az érlelés hosszú fázisa alatt. Ezeknek az ízanyagoknak a forrásai maguk a baktérium vagy penész kultúrák és az egyes organizmus törzsek tulajdonságai meghatározzák sajtok ízét, zamatát. A biológiailag tartósított zöldségfélék esetében 2,5 – 6,0%-os sóoldatban tenyésző tejsavtermelő mikroorganizmusok (pl. Lactobacillus plantarum) és néha Saccharomyces cerevisiae-vel keverten végzik a savanyítást. Kovászos uborka, savanyú káposzta, és más spontán vagy színtenyészettel előállított termékek készülnek ezzel a

művelettel. Kukorica és cassava savanyú készítmények: Európában kevéssé ismert, de trópusi országokban elterjedt savanyított készítmények. Afrikai országokban 1-3 napig vízben áztatott kukorizát aprítanak, majd tésztaszerű képződménnyé gyúrják. Induláskor Corynebacterium oltótörzs hidrolizálja a keményítőt és bizonyos mennyiségű tejsavat is képeznek. Ezután Aerobacter fajták fokozzák a tejsavtermelést Saccharomyces cerevisiae hozzáadásával az íz- és aroma anyagok mennyisége nő. Végül Candida mycoderma és a S. cerevisiae-vel kialakítják a végső íz és aroma tartalmat Ezután főzéssel adják meg a végső jelleget. A cassavából reszeléssel puplpot készítenek és fermentálják Corynebacterium törzsekkel. A megnőtt tejsav mennyiség okozta savanyú közegben beindul a Geotrichum fajták szaporodása is, amely törzs a HCN -glükozidok hidrolízisét végzi, ezenkívül aldehidek és észterek képzésével jellegzetes

íz- és aroma anyag kialakulás is bekövetkezik. Szárítás és aprítás után néhány hónapig felhasználható önállóan, vagy egyéb lisztekkel keverve. 3. fejezet - Speciális fermentációs termékek és eljárások Tartalom 1. Egysejt fehérjék(SCP) 1.1 Gombák és baktériumok SCP-i 2. Egysejt olajok 2.1 Az esszenciális SCO olajok élettani hatásai a humán szervezetre és jelentőségük. 2.2 Az esszenciális olajok előfordulása 2.3 A politelítetlen zsírsavak (PUFA egysejtolajok) bioszintézise mikroszervezetekben. 2.4 EPS és DHS forrás egysejtolaj termelő algák fejlesztése 2.5 A politelítetlen esszenciális ω-3 zsírsavak nagy tömegű felhasználása takarmányadalékként 3. Rekombináns génmódosított termékek 3.1 Gyógyászati célú termékek rekombinációs előállítása 4. Immunológiai termékek 4.1 Az emlőssejtek speciális tenyésztése 5. Koleszterinszint csökkentő mevinin savak 6. Növényi és emlős növekedési hormonok 7.

Biológiailag lebomló poliszacharid műanyagok 8. Élelmiszeripari termékek rekombinációja (pl Almasav előállítás) 9. Bioenergia előállítás rekombináns módszerekkel 1. Egysejt fehérjék(SCP) Az egysejt fehérjék (Single Cell Protein, SCP) széles körben fordulnak elő takarmányok fehérjetartalmának kiegészítésére és élelmiszer-kiegészítők előállítására. Elsősorban élesztőgombák és baktériumok fehérjéit hasznosítják, melyeket fermentációval tenyésztenek (probiotikumok). Az SCP takarmányok bevezetése az egyetlen biztonságos út az állatok megfelelő fehérje ellátásának biztosítására. Szennyeződések, fertőzés és toxikus anyagok az előállítás ellenőrzött volta miatt a nyerstermékekben (biomasszában) nem lehetnek jelen. Alkalmazásukkal a takarmányokból és élelmiszerekből a vágóhídi hulladékból származó fertőző (BSE) húsliszt vagy a sokszor allergén reakciókat okozó szójafehérjék elhagyhatók.

1.1 Gombák és baktériumok SCP-i Az állattenyésztésben az élesztők (Saccharomyces cerevisiae pék, sör és Candida utilis takarmányélesztők) és fonalas gombák (Aspergillus niger különböző törzsei) alkalmazása már több mint egy évtizedes múltra tekint vissza. Az élesztők fermentációja viszonylag egyszerű feladat, nagy kérdés, hogy milyen áron állítható elő. A 70-80-as években az akkor olcsónak számító alkánokon (gázolajeljárás) próbáltak a szójánál olcsóbb élesztő biomasszát előállítani, de csak egyes Candida és Saccharomyces lipolytica törzsek voltak képesek szubsztrátként hasznosítani. Ma már a klasszikus sörgyári vagy élesztőgyári fermentáció egyaránt versenyképes megfelelő takarmányélesztő vagy akár humán táplálék-kiegészítő előállítására. Fonalas gombákat a kérődző állatok bendőfermentációjának javítására adagolnak a takarmányba, elsősorban az Aspergillus niger különböző

törzseit. Lactobacillus és Bacillus törzseket egyaránt alkalmaznak szárnyasok és sertések takarmány-kiegészítésére. A Lactobacillusok bélflórára gyakorolt kedvező hatása már régóta ismert, és humán felhasználása is elterjedt (előállításuk: lásd tejsavgyártás), míg a takarmánnyal az állatokba jutó Bacillus spórák az emésztőcsatorna nedvességének hatására kicsírázva, eluralva a bélcsatornát, növelik a mikrobiális tevékenységet. Proteázrendszerük segítségével a fehérjéket peptidekké, illetve aminosavakká degradálják, így az állatok fehérjehasznosítása jobb lesz. Kevesebb kén és nitrogén kerül a trágyába, ami által annak kellemetlen szaga jelentősen csökken. Jól láthatók a vegetatív sejtekből kiszabadult fénylő Bacillus spórák és a sötét nem spórázó vegetatív sejtek. Sötét vegetatív Bacillus sejtek. Spórás Bacillus tenyészet bemutatása. 1.11 A Saccharomyces cerevisiae élesztők,

mint takarmány- és élelmiszer-kiegészítők Az akridinnaranccsal festett élő élesztősejtek megfelelő gerjesztési hullámhosszon zölden fluoreszkálnak. Amennyiben nem megfelelő élesztőtörzseket alkalmazunk a bendő környezetében elpusztulnak és megfestve, gerjesztési hullámhosszon piros fényt bocsájtanak ki. Kérődzők és azon belül tejhasznú tehenek és húsmarhák takarmányának Saccharomyces cerevisiae élesztőkultúrával történő kiegészítése széles körben elterjedt. Ezen élesztőkultúrák előtérbe kerülését egyrészt elősegítette a hozamfokozó antibiotikumok háttérbe szorítására irányuló fogyasztói igény, másrészt az alkalmazásukkal kapcsolatos számos, általában kedvező tapasztalat. Az élesztő készítmények hatása sokrétű. Élesztő adagolás hatására növekszik a tejelő tehenek tejtermelése és javul a termelt tej beltartalma. Az ellés után az élesztővel etetett tejelő tehenek hamarabb érik el a

laktációs csúcstermelést, mint a kontroll állatok. Az eredmények ellentmondásosak, mert több kutatócsoport publikálta, hogy az élesztő etetésének nincs hatása a tejtermelésre vagy a tej beltartalmára. Élesztő készítmények alkalmazása kedvezően befolyásolja a bendőfermentációt. Megfigyelték, hogy az élesztő serkenti a bendőbaktériumok szaporodását és növeli a rostemésztés kezdeti szakaszának hatékonyságát. Ezek a folyamatok a bendőbe jutó takarmány egészének vagy rosttartalmának emészthetőségét növelik, ami a bendőmikrobák jobb energiaellátását eredményezi. S cerevisiae alkalmazása serkenti a legfontosabb laktát felhasználó bendőbaktériumok (Selenomonas ruminantium, Megasphera elsdenii) szaporodását és tejsav felhasználását, ez a bendőfolyadék pH értékének a stabilizálását jelenti. Akut tejsav acodozis A kutatók a bendőfermentáció kedvező irányú befolyásolásának az okát az élesztősejtek

bendőbeli viselkedésének sajátosságaiban látják. Az élesztő a bendőfolyadékban nem szaporodik, de megőrzi metabolikus aktivitását és életképességét. Az élesztő néhány metabolikus karaktere befolyásolhatja a bendőfermentációt. Az élesztő vitaminforrás (elsősorban tiamin) a bendőbaktériumok számára, de jelentős malát tartalma is fontos tényező. Az eddigieket összefoglalva az élesztőnek a bendőfolyadékban kifejtett feltételezett hatását sematikusan az ábra illusztrálja. Bendőfermentáció Régebben élesztőt csak különleges hatásai miatt adtak sertéseknek. Az élesztő kiváló fehérje tartalma miatt alkalmas kiegészítője a sertésekkel etetett gabonaféléknek. Sok esetben a takarmányok mikroelemek ellátását mikroelemes élesztőkultúra bekeverésével biztosítják. Az élesztők közismerten jól akkumulálják a mikroelemeket, így a fermentáció során pl. az adagolt szelén a sejtekben feldúsul

és jelentős része szerves formában jelenik meg. A mikroelem dúsított élesztők szerves komplexek formájában tartalmazzák a szelén, cink, króm elemeket. A mikroelem tartalmú vegyületek, aminosavak kémiai szintézise túl drága ahhoz, hogy alkalmazni lehessen, ezért így a takarmányozásban és az élelmiszer-kiegészítő iparban egyaránt felhasználható, könnyen emészthető mikroelem forrásokhoz jutunk. 2. Egysejt olajok Az egysejt olajok (single cell oil, SCO) a mikroorganizmusokban felhalmozódó telítetlen zsírsavak összefoglaló jelentése. Nagy mennyiségben fonalas gombák és algák képesek olajcseppek formájában vagy a sejtmembránban felhalmozni. Esszenciális, többszörösen telítetlen (PUFA polyunsaturated fatty acid) ω-3 és ω-6 zsírsavaikat a koleszterinszint csökkentésére, hiánybetegségek gyógyítására és immunstimulálásra alkalmazzák. 2.1 Az esszenciális SCO olajok élettani hatásai a humán szervezetre és

jelentőségük. Az ω-3 eikoza-pentaénsav (EPA) és dokoza-hexaénsav (DHA) elsősorban a szív és érrendszeri betegségekben, mint koleszterinszintet-csökkentő és trombózist gátló alkalmazható, így az már ismert, hogy megelőzni vagy kezelni lehet vele érelmeszesedést, trombózist, hypertrigliceridemiát és magas vérnyomást. Az ω-3 zsírsavak csökkentik a vér viszkozitását, akár 15%-kal is, valamint csökkentik a vér koleszterin-szintjét, főleg az LDL (low density lipoprotein) típusút. A gyulladási folyamatokra gyakorolt kedvező hatásukat valószínűleg a prosztaglandinok és leukotriének közötti kiegyensúlyozó szerepük okozza, így kezelhetők velük allergiás betegségek és prosztaglandin, izületi gyulladások. lipoxigenáz és Kimutathatóan leukotrién B4 csökkentik szintézisét. a makrofágok Ugyanakkor immunmodulánsként is alkalmazhatók, mivel serkentik a cytokinek termelődését, sőt daganatos sejtek urokináz

enzimaktivitásának gátlásávál egyes tumorsejtek burjánzását is megakadályozzák. A DHA miután bekerül a szervezetbe, néhány óra múlva EPA-vá alakul és így fejti ki hatását. A DHA a humán szövetekben (pl idegszövetben) sokkal nagyobb százalékban található meg, mint az EPA, de pontos élettani funkciója nem ismert. A legújabb kutatások szerint a DHA a magzat illetve a csecsemők szellemi fejlődéséhez nélkülözhetetlen, így bébitápszerek kiegészítését javasolják DHS-sel. Sőt az idegsejtmembrán fluiditásának növelésével az agy öregedési folyamataira is jótékony hatással van. Az EPS és a DHS molekulákban a láncvégtől három szénatomnyira helyezkedik el az utolsó kettős kötés, ezért nevezik ezeket ω-3 vagy n-3 zsírsavaknak. Az EPS és a DHS kémiai szerkezete csupa-cis-5,8,11,14,17-eikoza-pentaénsav Az EPS és a DHS kémiai szerkezete csupa-cis-4,7,10,13,16,19-dokoza-hexaénsav Az ω-6 esszenciális zsírsav, az

arachidonsav (ARA) szintén részt vesz a prosztaglandinok szintézisében, továbbá gyulladásszabályozó, vérzésgátló hatása van, valamint szintén részt vesz a sejthártyák felépítésében. Az AA biológiai aktivitása nem tisztázott, de sok esetben az EPA-val együtt alkalmazzák gyógyszer és gyógyhatású termékek kombinációjában. Az ω-6 zsírsavak kinyerése olíva vagy napraforgóolajokból is lehetséges, ezért biotechnológiai jelentőségük kisebb. A mikroalgák (egysejtű moszatok) és kisebb koncentrációban a nem termőtestképző, imperfect fonalas gombák - mint egyedüli szervezetek a természetben -, 16 - 18 szénatomszámú telített zsírsavakból képesek többszörösen telítetlen ω-3 EPA és DHA zsírsavakat előállítani. E két zsírsavat az állati és emberi szervezet megfelelő deszaturáz enzimek hiánya miatt csak a 18 szénatomszámú 2 és 3 telítetlen kötéssel rendelkező linolsavból és linolénsavból, mint prekurzorból

képes csak szintetizálni. A magasabb rendű növények alacsonyabb szénatomszámú telített zsírsavakból (16 - 18) képesek PUFA-kat előállítani, azonban EPS és DHS szintézisre nem képesek. Ugyanakkor a szinte korlátlan mennyiségben rendelkezésre álló tengeri halak olajából az ω-3 zsírsavak kinyerése ma még olcsóbb, mint az algakultúrákból előállítható EPS-ben és DHS-ben gazdag algaolaj kinyerése. Így gazdaságossági szempontból az algaolaj konkurenciát egyelőre nem jelent a halolaj számára. A mikroalgákból kinyerhető ω-3 zsírsavak jelentősége abban áll, hogy különleges enzimrendszerüknek köszönhetően, mint növényi szervezetek egyedüli forrásai ezeknek a zsírsavaknak és különleges hatású zsírsavszármazékaiknak. 2.2 Az esszenciális olajok előfordulása Az esszenciális politelítetlen zsírsavakat nagyobb mennyiségben először északi-tengeri halak olajában fedezték fel, majd a későbbiekben más tengeri

állatokban is kimutatták. Kiterjesztették a vizsgálatokat a halak beleiben élő baktériumokra, gombákra és végül a fitoplanktonra is. Organizmusok Teljes zsírsavtartalom (%-ban) 25 Ԩ Organizmusok 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 ARA EPA DHA 20:4 20:5 22:6 Baktériumok Sevanella sp. ? ? ? ? ? ? ? ? 10 12 Vibrio sp. 22 8 Gombák Mortierella alpina (20-17) 16 8 21 14 28 L1 M. alpina+;α-linolinsav 6 3 9 9 28 34 5 Élesztők Candida curvatum 28 1 14 44 10 2 C. curvatum mutant R22102 26 41 16 8 4 Mikroalgák Cyclotella cryptica 12 19 42 3 2 6 Phaeodactylum tricornutum 6 22 31 16 3 3 20,7 Chlorella minutissima 21,1 7,4 0,7 7,3 6,1 14,7 3,2 4,6 3,6 Halolaj 7 14 13 3 12 2 2 2 17 9 3.1 táblázat - Különböző mikroorganizmusok és tengeri halak olajának zsírsav összetétele (KYLE és GLADUE 1992, Tocher és mtsi.1998) Régóta ismert, hogy egyes algák sejtjeiben, mint anyagcsere termékek, lipidek halmozódnak fel. A 70-es években már felfedezték a Botryococcus

braunii a zsírsavakat lipidcseppek formájában kiválasztó teleptestű zöldalga fajt, igaz esszenciális lipideket nem termel. A 70-es években már felfedezték a Botryococcus braunii a zsírsavakat lipidcseppek formájában ( a képen jól láthatók a kiszabadult olajcseppek) a sejtekből kiválasztó teleptestű zöldalga fajt. Igaz esszenciális lipideket nem termel, viszont mint alternatív üzemanyagtermelő algát tartják számon A tengeri egysejtű mikroalgákban jelentős mennyiségben van jelen EPA és DHA a kovamoszatokban (Bacillariophyta), egyes zöldmoszatokban (Chlorophyta), és a vörösmoszatokban (Rhodophyta). Édesvízi algafajok közül a kovaalgák (Bacillariophyta) és a dinoflagelláták (Dinoflagellata) képesek számottevő mértékben telítetlen zsírsavszintézisre és felhalmozásra. A Centralesekhez tartozó Cyclotella cryptica biomassza szárazanyagának mintegy 22,0% politelítetlen zsírsav, amiből 80-90% eikoza- pentaénsav, a

szárazanyagtartalom 17,4 %-a, ami a tengeri fajok EPA termelésének mintegy 3-4 szerese. A waterlooi (Canada) egyetem munkatársai több tengeri és édesvízi algatörzs lipidtartalmát vizsgálták meg. Az eredményeket a két táblázat mutatja be Biomassza EPA tartalom (%) zsírsavtartalma (%) Lipidben Biomasszában Mikroalgák Cylindrotheca fusiformis 24,4 Navicula pelliculosa 25,4 Nitzschia angularis 7,7 Porphrydium cruentum 6,8 Pavlova gyrans 21,0 Prymnesium parvum 12,0 MK8620a 40,1 Halak Tőkehal 1,8 Baráthal 3,8 Lazac 19,0 7,2 9,0 24,7 3,7 8,3 23,3 12,6 1,8 2,3 2,2 0,3 1,7 2,8 5,1 11,0 0,1 9,6 0,2 0,1 1,8 aszabadalmaztatott tengeri kovaalgatörzs (Martek Bioscience) 3.2 táblázat - Mikroalgák zsírsav- és EPA összetétele rázott lombikos kultúrában néhány halfajjal összehasonlítva (KYLE és GLADUE 1989) Mikroalgák szárazanyag (mg/l) Chlorella minutissima UTEX 483 2219 Dunaliella primolecta 1386 MBAUK81 D. tertiolecta MBAUK 83 1247 Nannochloris oculata

UTEX 1463 LB Phaeodactylum tricornutum 2485 UTEX 640 P. tricornatum UTEX 646 1638 Porphyridium cruentum UTEX 1804 161 3.3 táblázat - Jól szaporodó (YANGMANITCHAI és WARD 1989) Lipidtartalom a szárazanyag %-ban 14,3 17,4 15,3 14,3 17,4 13,7 16,7 algák biomasszája és lipidtartalma 2.3 A politelítetlen mikroszervezetekben. zsírsavak (PUFA egysejtolajok) bioszintézise A telítetlen zsírsavak a sejtben egyrészt, mint tartalék tápanyagok halmozódnak fel, másrészt a sejtmembrán szerkezetének és a fotoszintetikus membránok működésének megőrzésében játszanak szerepet. A hidegtűrő algák membránlipidjeinek telítetlen zsírsavtartalma alacsony hőmérsékleten megemelkedik, így hárítva el a membrán dermedését, és a fotoszintetikus apparátus működésképtelenségét. Általában a mikroorganizmusok sejtmembránjában, illetve citoplazmájában megjelenő többszörösen telítetlen esszenciális egysejtolajok biológiai funkciója azonban

ismeretlen, sőt a mikroalgák EPA tartalma és a hőmérséklet változása között közvetlen összefüggés nem mutatható ki. Az EPA és DHA bioszintézisének útjára többféle, részben kapcsolódó feltételezés van. Az ω-3 zsírsavak szintézise azonos bioszintézis úton valósul meg, míg az ω-6 zsírsavak szintézise más úton valósul meg. A két eltérő szintézis út között azonban lehetséges kapcsolat, ennek eredményeként egyes deszaturáz enzimek közreműködésével az ω-6 zsírsavból az arachidonsavból (ARA) EPA szintetizálódhat. Telítetlen zsírsavak szintézise mikroorganizmusokban (YANGMANITCHAI és WARD 1989) abra 065-text Telítetlen zsírsavak feltételezett szintézise algákban (COHEN et. al 1993 és Pereira 2004) Az, hogy a többféle bioszintézis út közül melyik valósul meg, főleg a tenyésztési körülményektől (hőmérséklet, fény, tápanyagok) függ. A telítetlen kötések keletkezéséhez a deszaturáz enzimek

működése szükséges. Ezek az enzimek főleg alacsony hőmérsékleten és limitált körülmények között lépnek működésbe. Mikroalgáknál a nitrogén, foszfor hiánya és a fényintenzitás fokozása játszik lényeges szerepet. A táblázatokból jól látszik, hogy míg a gombáknál a hőmérséklet a telítetlen zsírsavszintézis indukálásának fő tényezője, a mikroalgánál a hőmérséklet nem befolyásolja jelentősen az EPA tartalmat. Sótűrő algáknál limitáló tényezőként jöhet még szóba a nátrium-klorid koncentráció növelése, valamint kovaalgáknál a nátrium-szilikát koncentráció csökkentése. Egyes telítetlen zsírsavak (pl. az olajsav), és egyes herbicidek a deszaturáz enzimeket kódoló gének működését szabályozó regulátor proteineket gátolni képesek, vagyis koncentrációjuktól függően megy végbe a deszaturáz enzim gének expressziója. Az összes lehetséges lánchosszabbító (elongációs) és

deszaturációs (Δ) lépéseket az ábra mutatja. Az ω-6 és ω-3 politelítetlen zsírsavak bioszintézise a lehetséges elágazási pontokkal. (n, ahol n jelzi a keletkezett kettőskötés helyét) (KYLE és GLADUE 1992) A tapasztalatok azt mutatják, hogy a fotoszintetizáló szervezeteknél a deszaturációs lépések az EPA-ig haladnak, és csak néha jut tovább a DHA-ig. Ha azonban ezeket a szervezeteket - pl. tengeri Nitzshiákat, Chlorellákat és Dinoflagellatakat - heterotróf (sötét, szerves szénforrás) körülmények között sikerrel tenyésztik, a megváltozott körülmények hatására a végtermék DHA lesz. 2.4 EPS és DHS forrás egysejtolaj termelő algák fejlesztése A tengeri halakból kinyert EPA és DHA tartalmú halolaj nagyon sok zavaró szennyeződést tartalmaz. Sokszor olyan anyagok vannak jelen, amelyek az oxidációra érzékeny telítetlen zsírsavakat oxidálják, esetleg élettanilag antagonista bioaktív zsírsavak (pl. arachidonsav,

koleszterin) vagy nem ritkán a halak szervezetében felhalmozódó mérgező anyagok [pl.poli- klór-benzoénsav (PCBA)] teszik lehetetlenné a halolaj felhasználását ráadásul a halolajból készült terméknek kellemetlen halszaga és halíze van. Az algák gazdaságossági szempontból megfelelő alternatív EPA, DHA forrásnak tekinthetők a többi mikroorganizmussal szemben. Szubmerz kultúrában tenyészthető fonalas gombák csak alacsonyabb hőmérsékleti viszonyok között (12-l7 Ԩ) adnak megfelelő (antagonista zsírsavaktól, pl. arachidonsavtól mentes) hozamot (20-112 mg EPA/1). Baktériumok tenyésztésénél az utóbbi időkig csak alacsony hozamot lehetett megfigyelni (10-26 mg EPA/1, azonban új kutatási adatok szerint hidegtűrő tengeri baktériumok többszörös hozamot is produkálhatnak. Szennyeződések és antagonista bioaktív zsírsavak az alga nyerstermékben (biomasszában) nem lehetnek jelen. Az algaolajban található EPS és DHS

oxidációval szembeni érzékenysége kisebb (stabilabb), mint a halolajban, a potenciális terméknek halszaga és halíze nincs. Míg a halolaj az EPS és DHS mellett igen sok telített, illetve alacsony telítettségű zsírsavakat is tartalmaz kb. 60-70 % mennyiségben, addig a hasonló mennyiségben EPS-t tartalmazó algaolaj csak kb. 30% alacsony telítettségű zsírsavat és kb. 40% arányban élettanilag aktív klorofillokat, karotinoidokat és xantofillokat - köztük különböző vitaminokat és vitamin előanyagokat (B l, B2, B6, B 12, biotin, béta-karotin) – tartalmaz. EMS (etil-metil-szulfonát, mutagén) kezelés hatására olyan un. olajszerű törzseket izolálhatunk, amelyek sejtjeiben nagyobb mennyiségben halmozódnak fel telítetlen zsírsavak. Tengeri és édesvízi Chlorella protoplasztok fúziójával létrejött regenerált hibrid törzstenyészet EPA termelésének növekedését regisztrálták. Prokarióta kékalgák esetében - közvetlenül a

genetikai állományba beavatkozva - vektorokkal zsírsavdeszaturáz enzim géneket a sejtekbe juttatva, olyan hidegtűrő transzformánsokat hozhatunk létre, amelyek sejtmembránjában telítetlen zsírsavak (pl. linolsav) halmozódnak fel. Szaporodásukhoz fényt nem igénylő heterotróf algatörzsekkel elsősorban magas DHA hozamot sikerült elérni. Amerikai kutatók egy Nitzshia alba törzs nagy tömegű tenyésztését oldották meg ahol a DHA arányaiban nagyobb mennyiségben termelődik, mint a fotoszintetikus viszonyok között az EPA. A Martek Corporation gyógyszergyártó cég a csecsemők agyi fejlődését elősegítő, egy Dinoflagellata heterotróf algából kinyert DHA hatóanyag tartalmú gyógytápszert szabadalmaztatott. A közlemény szerint a fototróf algáknál nagyságrendekkel nagyobb DHS hozamot sikerült elérni (4 g DHA /liter fermentlé). Irodalmi adatok szerint a heterotróf Dinoflagelláták DHS termelőképessége az 1960-as évek óta ismert,

ugyanakkor nagy tömegű tenyésztésük ez ideáig nem volt megoldott. Kínai kutatók egy Nitzshia levis kovaalga heterotróf perfúziós tenyésztése során 1112 mg/l EPA koncentrációt értek el. Természetesen nagy előny, hogy szaporodásuk fényt nem igényel, de a szénforrásként a kultúrához adagolt glükóz jelenléte nagymértékben megnehezíti a steril, fertőzésmentes fermentációt, és ezt nehezíti a heterotróf kultúra szerves-nitrogén igénye (élesztőkivonat) is. Mixotróf kultúrák létrehozása hasonló gondokat vet fel, kiegészítve a megfelelő fényviszonyok kialakításával. Továbbá a 4-6 napig tartó, 100-150 órás tenyészidő, valamint a speciális eszköz és készülék igény (pl. perfúziós technika) különösen bonyolulttá teszi az ilyen típusú fermentációk kivitelezését. Színtelen algakultúra lombikban Tengeri algakultúrákkal megfelelő megvilágítás mellett 20-25 ԨC-on 1 hét fermentálással 50-60 mg EPA/1

hozamot lehet elérni. Az Egyesült Államokban 0,5 m3-es fotobioreaktorban 2 hét tenyésztéssel 2 kg olajban gazdag - 5-6 % EPA / gramm - algaport (KYLE és GLADUE 1989), míg Portugáliában nyitott medencékben 74 nap folyamatos tenyésztés során 4 g/m2/nap - 3,9 % EPA / gramm - algaszárazanyagot állítottak elő (VELOSO et al. 1991) Akut tejsav acodozis Táblázat EPS, DHS és AA tartalmú olaj (SCO) fermentációs gyártása fotobioreaktorban, valamint SCO táplálék-kiegészítők és gyártóik 2.5 A politelítetlen esszenciális ω-3 zsírsavak nagy tömegű felhasználása takarmányadalékként Az emlősök és madarak szervezetében a PUFA-ak bioszintézisénél a zsírsavak telítetlensége (deszaturáció), illetve lánchossza (elongációval rövidülve) csak korlátozott mértékben változhat. A deszaturáció olyan szabályozottságú, amely nem teszi lehetővé az első hat szénatom között a kettős kötés kialakulását, ezért a

tápláléknak ezeket tartalmaznia kell. A tenyészállatok esetében a tojótyúkok esszenciális PUFA ellátottsága hatással van a tojások méretére és minőségére. A tojás nagysága csökken, ha az esszenciális zsírsavakból a takarmány nem tartalmaz eleget. Amikor a tojás nagysága csökken a tojás sárgája lesz kisebb, ami azzal jár, hogy kevesebb lesz a tojás zsírtartalma. Továbbá a megfelelő zsírsavellátás a tyúktojás minőségét kedvező irányban befolyásolja, mivel a tojás magas koleszterinszintjét a beépülő EPA és DHA ellensúlyozni képes (okostojás kép). Mindezek a hatások elérésére EPA-t és DHA-t tartalmazó tengeri halak (makréla, hering, lazac) olaját (spray formában) juttatják a tojótápokba átlagosan 1,0% EPA és DHA-t tartalommal. Ugyanakkor a megfigyelések azt mutatják, hogy az ilyen táppal való folyamatos etetés a tojók kiegyensúlyozatlan zsírsavellátását és a tojáshozam csökkenését okozza. További

probléma a folyékony formában kijuttatott EPA és DHA gyors oxidációja, valamint hogy a túlzott mennyiségben etetett - több más zsírsavat is tartalmazó - halolaj kellemetlen mellékízt ad a tojásnak. A mellékhatások és az oxidáció kivédésére a halolajat szárított formában és csökkentett mennyiségben (0,2% EPA és DHA tartalomig) próbálják adagolni. Ez utóbbi eljárásnak megfelelő versenytársa lehet a biotechnológiai úton fonalasgombák vagy algák (köztük fényt nem igénylő Dinoflagelláták) fermentációjával előállított EPA és/vagy DHA tartalmú biomassza. A fényt nem igénylő heterotróf algatörzsek a gombáknál és a fofototróf algáknál négyszer-ötször nagyobb DHA tartalmú (20% DHA az algaszárazanyagban lásd fent), és egy nagyságrenddel nagyobb mennyiségű biomasszát állítanak elő (20-25 g/liter). 3. Rekombináns génmódosított termékek Az élesztőgombák és baktériumok fermentációja során klónozó

rendszerek segítségével emberi és állati fehérjék egyaránt előállíthatók, ezek az r-proteinek, azaz rekombináns fehérjék. A géntechnológia rohamos fejlődésével hormonok (inzulin, kalcitonin), véralvadásgátlók (pl. hirudin, antikoaguláns peptidek), valamint oltóanyagként alkalmazható vírus- és baktériumfehérjék DNS szekvenciájának klónozása is lehetővé vált. Eukarióta géneket hasonló módon vektorokkal vagy közvetlenül a kromoszómába beépítve fehérjék halmozódnak fel (gyógyászati célú rekombináns fehérjék). A kisméretű fülke DNS mentes steril levegőárammal biztosítja a genetikai munkát. A DNS molekulák elválasztásához leggyakrabban olyan porózus gélt használnak, amellyel a molekulák nem reagálnak és amely egyben molekulaszűrőként is szolgál. A pórusok nagyságától függően a különböző méretű DNS-ek vándorlása befolyásolható: ha molekula mérete kicsi a pórusokhoz képest, gyorsan

mozog, ha nagy, a DNS szinte mozdulatlan marad a gélben (a pórus mérete változtatható). DNS polimeráz láncreakció (PCR) segítségével a fontos DNS szakaszt szintetizálhatjuk.A készülék megfelelő hőmérséklettel a DNS-t olvadáspontra hevíti, így a kettős hélix kinyílik, majd a polimeráz enzim a megfelelő DNS szakaszt optimális hőmérsékleten szintetizálja. A készülékben 5-10 mikroliter DNS oldatokkal dolgoznak,így a bepárlódás elkerülésére a kép felső részén látható fejfűtéssel biztosítják az oldatok térfogatának állandóságát. Sötétkamra bemutatása, UV fényben átvilágított DNS kimutatása gélben CCD kamera és LCD kijelzo segítségével . DNS mentes levegőt és környezetet biztosító steril fülke, eppendorf centrifugával és PCR készülékkel. 3.1 Gyógyászati célú termékek rekombinációs előállítása A fermentációs termelési célzattal a legsikeresebb az E. coli, Bacillus subtilis,

baktériumba, a Saccharomyces bayanus, S. cerevisiae és a Pichia pastoris élesztőgombákba klónozott génekről termelődött – a fermentlébe kiválasztott, expresszálódott vagy a baktériumban, gombában felhalmozódott (inclusion body) fehérjék. Az első iparszerűen termelt r-fehérje az E coli baktériumból termelődő rinzulin volt Addig sertések hasnyálmirigyéből vonták ki a sertés inzulint és alkalmazták az emberi cukorbetegség gyógyítására. A humán inzulin génről származó inzulin messenger RNS-ről (mRNS), amely az ember hasnyálmirigyéből nagy mennyiségben kinyerhető, elkészíthető az inzulin génjét kódoló c-DNS (komplementer DNS). Ezt a reakciót egy reverz transzkriptáz (fordítva átíró) enzim segítségével lehet végrehajtani. Bár a természetben éppen fordítva a DNS-ről képződik mRNS molekula a fehérjeszintézis során, a kutatók felfedezték, hogy egyes vírusok pl. RNS tumorvírusok (retrovírusok) termelnek ilyen RNS

minta alapján DNS-t készítő enzimet. cDNS készítés vázlata A reverz transzkriptáz működésének feltétele, hogy a DNS lánc meg legyen kezdve. A poli – Timidin (T) nukleotid láncból elindulva az RNS-ről teljes hosszában hibrid molekula képződik, amelynek egyik szála RNS, a másik DNS lánc. A hibrid molekula RNS részét lúggal elbontják, majd a ma már rutinszerűen használt DNS polimeráz láncreakció (PCR) segítségével a hiányzó DNS szakaszt szintetizálhatjuk. Így elkészült az mRNS-ről készített - kétfonalas c-DNS. Ezt a c-DNS-t un bakteriális E coli plazmidvektorba építették. A baktériumokban a kromoszómán kívül gyűrű alakú DNS molekulák találhatók, amelyek képesek átjutni más baktériumok sejtjeibe. Így képesek az antibiotikum rezisztencia képességet is átadni egymásnak, de így lehetséges idegen géneket bevinni baktériumok sejtjeibe, klónozni is. A cDNS klónozás vázlata Mivel az inzulinfehérje

előállítása csak két fehérjeláncból és proinzulinból lehetséges, az inzulin un. fúziós, összekapcsolt fehérjeként keletkezett a baktériumokban A fehérjeláncba beépítettek egy metionin aminosavat is, így brómciános hasítással elválaszthatók egymástól az egyes láncok, sőt az E. coli sejtekből a kinyerést is meg kellett oldani, hiszen szignál szekvencia – a fehérjének a sejtből a tápközegbe való jutását lehetővé tévő fehérje szekvencia - beépítése itt nem volt lehetséges. Az aktív emberi r-inzulin kinyerése A gyorsulást és lassulást automatikusan szabályozó centrifuga 15-30000 g nehézségi erővel képes a molekulákat elválasztani egymástól és ülepedési képesség szerint szeparálni egymástól. Laboratóriumi automatizált centrifuga muködése. Élesztőkkel, mint eukariótákkal bár bonyolultabb a biotechnológusok dolga, tízszer vagy százszor nagyobb mértékű az esetleges helyesen kifejeződő génről a

fehérjék expressziója. A Saccharomyces cerviceae és S bayanus a rekombináns fehérjeexpresszió legtöbbet alkalmazott szervezete, így a Magyarországon is kutatott rekombináns véralvadásgátló hirudin, illetve a rekombináns csontritkulást gátló kalcitonin hormon előállítása is ezekkel a mikrobákkal valósult meg (Gyógyszerkutató Intézet). Ugyanakkor a legújabb kutatások szerint a metilotróf Pichia pastoris a gyakorlatban rendelkezik az S. cerevisiae minden előnyével, de még nagyobb fermentációs hozamok valósíthatók meg velük. A TAP (tick anticoagulant peptide)-ot, mint specifikus inhibítorát egy kulcsfontosságú véralvadási faktornak rekombinánsan P. pastorisban sikerült előállítani és a gyógyászatban alkalmazni (1,7 g/l fermentlé). A biotechnológiai ipar csúcstermékei közé tartoznak a rekombináns antitestek (lásd még immunológiai termékek fejezet). Szignál szekvenciát alkalmazva ezek termeltethetők baktériumokkal,

de a termelés csak kis mennyiségű volt. Ezért P pastorist kezdtek alkalmazni és sikeresen használni a nyúlból származó, a humán leukémiát gátló faktort felismerő antitestek termeltetésére, expresszálására sikerrel. A fehérjék fúzióját ma már elterjedten végzik különböző expressziós rendszerekben pl. a nagy specifitású proteáz enzimek előállításában a mosószeriparban. Ilyen fúziós proteáz az eredetileg a szarvasmarhából nyert enterokináz, amelynek génjét E. coli baktériumból P pastorisba klónozták. A fermentáció 6,5 mg/liter enzimet eredményezett, de az r-enzim százszor reaktívabb, mint az eredeti natív molekula, mivel a Pastoris élesztő képes részben glikozilálni (cukorláncokat kötni) a termelt fehérjéket, és így az emlős sejtben előállított molekulához hasonlatossá tenni. 4. Immunológiai termékek Az immunológiában jól ismert antitesteket ma már nem csak állatok immunizálásával, hanem

emlőssejtek fermentációjával is előállítják. Ezek lehetnek immunglobulinok, monoklonális antitestek pl. speciális molekulákat vagy ráksejt receptorokat felismerő antitestek egyaránt. A technika fejlődésével az emlőssejtek irányított tenyésztésével hormonokat, citokineket, vírusfehérjéket, sőt interferonokat is képesek már előállítani. Az emlőssejtek tenyésztését a monoklonális ellenanyagtermelés különböző fázisainak ismertetésével kívánjuk bemutatni. 4.1 Az emlőssejtek speciális tenyésztése Az emlőssejtek tenyésztése a mikrobiológiában szokatlan új eszközök használatát tette indokolttá. Az emlős sejttenyészetek szaporítása nem lehetséges egyszerű üvegeszközökben, hanem csak a sejtek megtapadását segítő felülettel rendelkező sterilezett flaskákban (x. kép) Ezeket nem rázóasztalra, hanem az emlőssejtek életfunkcióihoz szükséges gázkeveréket tartalmazó szén-dioxid kamrákba kell helyezni.

Amennyiben nem megfelelő élesztőtörzseket alkalmazunk a bendő környezetében elpusztulnak és megfestve, gerjesztési hullámhosszon piros fényt bocsájtanak ki. Nagyobb mennyiségben (300-1000 ml) un. forgatható hengeres rollerüvegekben a sejteket folyadékban lebegő életmódhoz adaptálhatjuk. 1-40 liter térfogatban csak automatizált, air-lift kíméletes keverésű, gázkeveréket (N2, O2, CO2 és levegő) adagoló emlőssejt fermentorokban lehetséges nagyobb térfogatú emlőssejt kultúrák létrehozása. Az emlőssejt tenyésztés legspeciálisabb módszere a hollow fiber hordozóhoz kötött tenyésztés. A módszer lényege, hogy a sejtek kapilláris kötegekben rögzülve szaporodnak az extrakapilláris térben. Az intrakapilláris térben a táptalajt folyamatosan áramlás alatt tartva, az ultraszűrő hollow fiber membránon keresztül diffúzióval jutnak el a tápelemek a sejtekhez. A termelt fehérjék és ellenanyagok a sejteket tartalmazó térben

halmozódnak fel, ahonnan folyamatosan eltávolíthatók. A táptalajokat, mivel vitaminokat, hormonokat, antibiotikumokat és vérsejteket tartalmaznak, nem lehet autoklávban sterilezni. Minden táptalajkomponenst autoklávozott desztillált vízben kell oldani, majd 0,2 µm pórusméretű membránszűrőn sterilre szűrünk. Általában a szükséges steril vérszérumot FCS (Fetal Calf Serum) formában adagolják a tenyészetekhez. 4.11 A monoklonális ellenanyag termelés A molekulákat felismerő monoklonális ellenanyagot termelő hybridóma sejtvonalakat az adott anyagra immunizált egerek lépéből származó B limfocitáinak és halhatatlan, korlátlanul szaporodó (tumor) mieloma sejtek fúziójával nyerik. A fúziót általánosan PEG (polietilénglikol)–gel idézik elő, amely erősen dipólus jellegénél fogva megbontja a sejtek vízburkát, így elősegíti az egymás közelében lévő sejtek lipid membránja közötti kölcsönhatást és így a

membrán fúzió létrejöttét. Ma már általánosan elterjedt az elektromos, illetve mágneses tér létrehozásával indukált fúzió is. A továbbiakban a hibrideket elkülönítik a mieloma sejtektől és a megfelelő sejteket szövettenyésztő 96 vagy 24 lyukú plate-ken limitáló hígítás módszerével klónozzák (minden tenyésztő lyukba egyetlen, egyféle genetikai tulajdonsággal rendelkező sejt kerül). Az emlőssejtek speciális tulajdonsága, hogy egymaguk képtelenek az életben maradásra, ezért a klónozás során segítő feeder sejtekkel és/vagy interferonok, interleukinek adagolásával szaporítják őket. A mikrobiológiai gyakorlatban hosszúnak számító két-három héten belül a mikrokultúrák már elegendő számú sejtet tartalmaznak, ahhoz, hogy kellő mennyiségű ellenanyagot termeljenek a rögzült sejtek felülúszóiból történő kimutatáshoz. A kimutatás történhet ELISA, RIA vagy FACS speciális immunkimutatási módszerekkel

egyaránt. Ettől fogva a megfelelő monoklonális antitest termelő klónokból léptéknövelési kísérletek keretében flaska-, roller- és fermentor tenyészeteket állítanak elő, majd az ezekből kapott nagy mennyiségű felülúszókat affinitás kromatográfiának alávetve az antitesteket tisztított és koncentrált formában kinyerik. A tenyésztés során a konkrét sejtvonal 10-75 cm2-es flaskákban tenyésztett sejtjeivel rollertenyészeteket oltanak 40-60 ml induló térfogattal 1-2x105 sejt/ml kezdeti sejtszámmal. A sejttenyészethez naponta friss médiumot adva 4 nap alatt 300-1000 ml végtérfogatig lehet tenyészteni, a sejtszám a maximális 106 sejt/ml. A sejtek életképességét, nem a mikrobiológiában megszokott szélesztéssel, hanem fordított mikroszkóppal tripánkékkel megfestett tenyészetekben bürker kamrás eljárással vizsgálják (a halott sejtek citoplazmája festődik, az élő, ép sejthártyájúak nem) és a viabilitási százalék

megállapításával jellemzik. A fermentorban a sejteket alacsony oxigéntenzión (pl.OD=12), így oxigénigényük messze elmarad a baktériumok és gombák igényeitől. A sejtek mebránját a fellépő nyírófeszültségek könnyen károsítják, ezért csak a legalacsonyabb a sejtek kiülepedését még éppen megakadályozó alacsony fordulatszámon kell kevertetni (pl. 40 fordulat/perc) A pH –t semleges 7,0 - 7,2 tartományban tartja az automatika és kis mennyiségű gázbeáramlás mellett (0,5 l/perc, a fermentor vezérlőegysége az OD-nak és a pH-nak megfelelően adagolja szükség szerint a négyféle gázt) tenyészthetünk. A fermentáció során a pH csökken a sejtek laktáttermelése miatt, de ezt a sejtek jól tolerálják, jobban mint a pH növekedést. Az emlőssejtfermentorok legnagyobb mérete nem haladja meg a néhány száz litert, az emlőssejtek nagy érzékenysége miatt. A sejtek mebránját a fellépő nyírófeszültségek könnyen károsítják,

ezért csak a legalacsonyabb a sejtek kiülepedését még éppen megakadályozó alacsony fordulatszámon kell kevertetni (pl.40 fordulat/perc) A pH t semleges 7,0 - 7,2 tartományban tartja az automatika és kis mennyiségű gázbeáramlás mellett (0,5 l/perc, a fermentor vezérlőegysége az OD-nak és a pH-nak megfelelően adagolja szükség szerint a négyféle gázt) tenyészthetünk. A monoklonális antitest termelő tenyészetek termelését csak az immonológiai gyakorlatban már rutinszerűen alkalmazott ELISA módszerrel lehet nyomon követni. Az eljárás eredményeként spektrofotometriásan kimutatható az antitestek koncentrációja. Óra 0 24 48 72 Roller inokulum Extinkció E480 nm 0,030 0,095 0,227 0,255 E480 nm: 0,137 3.4 táblázat - Különböző mikroorganizmusok és tengeri halak olajának zsírsav összetétele (KYLE és GLADUE 1992, Tocher és mtsi.1998) A sejttenyészetek felülúszói ideális estben is csak 10-20 µg/ml koncentrációban tartalmazzák a

termelt antitesteket, így sokszor protein A/protein G affinitáskromatográfiás tisztításuk és koncentrálásuk is szükségessé válik. A világon négyféle terápiás monoklonális antitest készítményt hoztak forgalomba a fenti emlőssejt eljárás szerint, ezeket úttörő jelentőségük miatt felsoroljuk: Simulect (Basiliximab), Zenapax (Daclizumab), immunszupresszió indukálása renális allograftnál, Reopro (Abciximab) Percutan coronária intervencióhoz társuló cardiális ischaemiás szövődményekre, Herceptin (Trastuzumab) HER2-t overexpresszáló emlőrák ellen. 5. Koleszterinszint csökkentő mevinin savak A gomba másodlagos anyagcsere termék mevininsavak kis mennyiségben képesek gátolni a humán máj koleszterin bioszintézisének kulcsenzimét. Az érrendszeri betegségek egyik fő oka a magas koleszterinszint, ezért a mevininsavakból biokonverzióval nyerhető sztatinok az iparilag fejlett államok gyógyszergyártásában vezető helyet foglalnak

el. A Penicillium citrinum illetve az Aspergillus terreus törzsek mevasztatin (kompaktin) és lovasztatin (mevinolin) előállítására képes, majd a kompaktin pravasztatinná átalakítását Streptomyces törzsek végzik fermentációs transzformációval. 6. Növényi és emlős növekedési hormonok A növényi növekedési hormon gibberellineket (GA3 ) a Gibberella fujikuroi gombatörzs állítja elő. A gomba 25 Ԩ- on 5-6 napos fermentációs tenyésztést igényel Citrusfélék és szőlő termésnövelésére alkalmas, valamint a söriparban az árpa csírázásának elősegítésére. A söripar nagy menniségben alkalmazza, de egészségügyi kockázatot a növényi hormonhatású anyag nem jelent. A Gibberella zeae által termelt ösztrogén hatású anabolikus mikotoxin a zearalenon. Az állattenyésztésben az anabolikus szerekre a táplálkozási láncba kerülésük miatt szigorú szabályozások vonatkoznak, ennek ellenére a zeranolt az USA-ban jelenleg is

használják szarvasmarhák és juhok növekedésének gyorsítására, míg az EU-ban tiltott. 7. Biológiailag lebomló poliszacharid műanyagok Az Aureobasidium pullulans élesztőtörzs állítja elő a pullulans nagy molekulatömegű poliszacharidok keverékét alkotó viszkózus anyagot. A pullulánból filmfólia állítható elő, amely hasonló a celofánhoz, de biológiailag lebomlik. Japánban már élelmiszerek csomagolására használják. A Sclerotium glucanicum olyan szkleroglukánt állít elő, amely szintén egy vízoldható, nagy sűrűségű poliszacharid. Növényi magvak csávázásánal ragasztóanyagként és festékek tinták sűrítésénél használják. Az Alcaligenes faecalis var myxogenes vagy az Agrobacterium radiobacter mutáns törzsei képesek a különleges poliszacharid a curdlán előállítására. A curdlán igen sokféle vízoldható szerves makromolekulával (pektin, carboximetil-cellulóz, gumi arabikum, alginát stb.) keverve filmet képez,

ami kíméletesen megszárítható. A BSE és más állati betegségek miatt szennyezett veszélyes adalék anyagnak számító állati erdetű húskollagént, és más állati terméket helyettesítő ehető film és húsburkoló anyag állítható elő curdlánból. (kálium-trifoszfát oldatban kálcium-laktátttal / vagy tejsavval keverve is előállítható burkoló emulzió). 8. Élelmiszeripari termékek rekombinációja (pl Almasav előállítás) Citrát kör alapú előállítás: A fumaráz enzim termelődéséért felelős gén, a fum1 egy erős indukáló promóter mögött van, így nagy mennyiségben termelődik az almasav anélkül, hogy nem kívánatos fumársav termelődne. A Gal 10 expressziós rendszert kell használni induktornak, amikor a Gal 10 promóterét kell inzertálni a plazmidba a gén elé. Így majd galaktóz tartalmú táptalajon nevelt élesztőkultúra sok fumarázt fog majd termelni. A pG5/T2 vektor fum1 génjét a pUC18 vektor multilpe cloning

site-jába kell inzertálni, majd ennek a Sal1/Hind3 fragmentjét, ami tartalmazza a kívánt régiót, ki kell vágni a megfelelő enzimekkel, majd be kell inzertálni a YEp51 vektor GAL promótere mögé. Ez a pFT2 vektor. Ha ezt a vektort sikerül előállítani, majd élesztőbe bevinni, az így előállított élesztőt galaktóz és fumársav tartalmú tápoldaton kell nevelni. Reduktív citrát kör alapú előállítás: Az eddigi kísérletek során az RSA1 fragmentet, ami az mdh2 gént tartalmazza, az EcoRV vektorba klónozták, felszaporították, majd beépítették az Yep51 vektor Sal1 és BamH2 hasítóhelyek közé, valamint a PRS-420PGK vektor Sal1 és Sac1 hasítóhelyei közé. A további műveleteket az előző kísérlethez hasonlóan hajtották végre. Az így kapott élesztőt 2% galaktóz tartalmú SD tápoldaton kell nevelni stacionárius fázisig, majd 3000*10g-on centrifugálni kell 4 oC-on 5 percig, majd steril salin oldattal mosni kell. Ezután olyan

oldatban kell szuszpendálni, ami 1M fumársavat, 0,2% natrium-deoxklorátot tartalmaz. Ezt kell inkubálni 37 oC-on, meg kell savanyítani pH=2-re, fugával el kell távolítani a sejteket. A felülúszó tartalmazza a kívánt almasavat. 9. Bioenergia előállítás rekombináns módszerekkel Saccharomyces cerviceae élesztőgombákból már sikerült előállítani xilóz bontó, míg baktériumokból arabinóz bontó rekombináns törzseket. A xilóz bontó baktérium és az arabinóz bontó és etanolt fermentáló élesztő előállítása eddig problematikusnak bizonyult, mert egyik sem tudott olyan intenzíven növekedni, mint a vad típusú törzsek, ugyanakkor az etanol termelésük csak kismértékű. 4. fejezet - Bioenergia források Tartalom 1. Biogáz termelés 1.1 Biogáz alapanyagok 1.2 Metántermelés 2. Bioetanol előállítás 2.1 Az etanoltermelés bioszintézise 2.2 Bioetanol gyártás gabonából vagy melaszból 2.3 Bioetanol gyártás növényi rostokból és

faipari hulladékokból 1. Biogáz termelés Az első biogáz fermentor 1859-ben épült bombay-ben egy lepratelepen. Európában az első fermentor 1895-ben épült Angliában, Exterben, ahol a biogázt egy szennnyvízkezelő üzemben állították elő, és az utcai lámpákban használták világításra. A mikrobiológia fejlődése az 1930-as évekre lehetővé tette, hogy Buswell és munkatársai meghatározzák az anaerob baktériumokat és körülményeket, amelyek szükségesek a metán képződéséhez. A biogáz a szerves hulladékok (akár állati biomassza) metanogén baktériumok által nedves közegben véghezvitt anaerob rothadásának (fermentáció) eredménye. Összetételét tekintve 60-70%-ban metánt (CH4), és 30-40%-ban CO2-t tartalmaz. Ez a technológia több szempontból is előnyös: a metán jó hatásfokkal konvertálható energiává, ugyanakkor környezetkímélő. A biogáz-fejlesztés kapcsolható a szennyvízkezeléshez a szennyvizek vagy

hígtrágya felhasználásával. A szennyvíz és szerves hulladékok kezelésének környezetvédelmi szempontból és az energiatermelés miatt is kedvezőbb megoldása az, hogy a levegőtől elzárva tovább erjesztik a szennyvíziszapot, hulladékot, így olyan mikrobák szaporodnak el, amelyek biogázt termelnek. Az így keletkezett gázanyag megfelel egy gyengébb minőségű földgáznak, míg a kierjedt maradék szilárd anyag kórokozó mikroorganizmusokat nem tartalmaz, szaga a komposzthoz hasonló, így minden további nélkül a mezőgazdasági talajokra kijuttatható, trágyaként alkalmazható. 1.1 Biogáz alapanyagok Az ázsiai országokban főként állati trágya az alapanyag, de sokféle szerves anyagból lehet biogázt előállítani. Biogáz előállításra valamennyi szervesanyag (kivéve a szerves vegyipar termékeit) alkalmas, így a trágya, az élelmiszeripari melléktermékek és hulladékok, minden zöld növényi rész, háztartási zöldhulladékok,

lejárt szavatosságú élelmiszerek, éttermi hulladék, kommunális szennyvíziszapok, stb. Az eddigi gyakorlatnak megfelelően a nedves biogáz-gyártás alapanyaga általában hígtrágya, vagy élelmiszeripari szervesanyag-tartalmú folyadék. A keletkező gáz felhasználása a leghatékonyabb és leggazdaságosabb, ha az könnyen és szinte korlátlanul értékesíthető „zöld” villamosenergia termelésére fordítódik, de ún. kapcsolt rendszerben a keletkező hőt is hasznosítják. A legalkalmasabbnak látszik a hígtrágya-szerves hulladék keverékkel megvalósult (kofermentáció) biogáz előállítás. Európában Dánia és Németország rendelkezik a legnagyobb tapasztalattal a nagyléptékű biogáz fermentáció terén. Sok esetben kofermentáció zajlik, ahol a szerves trágya és a kommunális és ipari szennyvíz együtt kerül felhasználásra. Dániában 2000-re a 90-es évektől kezdve megduplázták az ország biogáz termelését, annak köszönhetően,

hogy bevezették a „zöld” áram rendszert, ami azt jelenti, hogy a megújuló energiaforrásból előállított áramot az áramszolgáltató a szokásos árnál magasabb összegért veszi meg. Ipari szennyvizeket is lehetséges anaerob fermentációba vonni, de a telepített anaerob fermentáló rendszerektöbbsége kisméretű farmergazdaságokban működő üzem. Ilyenek elterjedtek az USA-ban, Ausztriában, Franciaországban, az ázsiai országokban. A bioenergia az elsődleges termelő szervezetek (elsősorban növények) biomasszájából, anyagcsere termékeiből kinyerhető kémiai energia, amely a Nap sugárzó energiájából a fotoszintézis folyamatában (illetve kemoszintézis során) képződik. A növényi biomassza az élő növényi és növényi eredetű szerves anyag tömegegységben kifejezett mennyisége, amely a megkötött kémiai energia jelentős részét a sejtek falában elsősorban lignocellulóz formájában raktározza. A növényi biomassza

felhasználása energianyerésre világszerte az érdeklődés középpontjában áll. Több nemzetközi folyóirat elsősorban vagy kizárólag ezzel a kérdéskörrel foglalkozik. Ilyen folyóiratok pl a Biomass and Bioenergy, Bioresource Technology, Crop Science, Aspects of Applied Biology, Biomass and Energy Crops stb. A biomassza energetikai hasznosításának több lehetősége van:  legegyszerűbb esetben a biomasszát közvetlenül elégetik  más esetekben a biomassza fizikokémiai, biológiai transzformációjával alkoholt, metánt állítanak elő energetikai célú felhasználásra  a legutóbbi években pedig intenzív kutatás indult a biológiai H2 termelés hatékony megoldására Ismert, hogy a Földre jutó napenergia (évi 1,3 kW/m2) hasznosulása kémiai energia nyerésére fotoszintézissel csupán 5% (200 billió tonna széndioxid megkötése évente), a mezőgazdasági gyakorlatban ez csupán 0,5-1,0%. A közeljövő kutatásaival ennek növelése

a fő cél. Hosszútávon a földterületek szűkössége miatt új, magas biomasszahozamú növényfajták kifejlesztése a cél, valamint új biomassza-források, így vízinövények és mikroalgák hasznosítási lehetőségeinek kidolgozása. A mezőgazdasági (gabonaszalma, kukoricacsutka – és szár, gyümölcsnyesedék) és erdészeti melléktermékek és egyéb szerves hulladékok hőenergia termelésre (tüzelésre) hasznosíthatók. A biogáz-termelésre hasznosítható növényi alapanyagok több csoportra oszthatók. A jelenleg is élelmiszer és takarmány céljából termesztett növények közül a silókukorica és cukorrépa nagy nedvességtartalmuk miatt jól hasznosíthatók biogáz céljára, de csak a felhasználható növényi rész szeparálását vagy feldolgozását követően. A kifejezetten energia előállítás céljából termesztett lágyszárú növények közül a leghatékonyabb C4-es fotoszintézist folytató nádfélék és fűfélék

emelhetők ki, melyek betakarítási állapotban használhatók fel. Előnyük, hogy energiatartalmuk a legmagasabb a termesztett fajták közül (a fafajtákhoz viszonyítva is), egységnyi energiára eső termesztési költségük pedig a legalacsonyabb. Biomassza termeléséhez leginkább olyan növény alkalmas, amely igen gyorsan nő és sejtfal anyagai között az energiában gazdag lignocellulóz prominensen megjelenik. Speciálisan energetikai célra termesztett (magas energiatartalmú) fásszárú növények az akác, nyár, fűz, gyertyán vagy éger (energiaerdők). Magas energiatartalmú biomasszát képző lágyszárúak az energianád (Miscanthus sp.), a már hazánkban is nagy területen termelt energiafű (Agropyron elongatum), illetve egyes olajos magvú növények, így a repce vagy a napraforgó. Az energiafű embermagasságúra tud nőni és ugyanakkor kiemelkedő szárazság-, só- és fagytűrési képességgel rendelkezik. Nem érzékeny a talaj minőségére

és egy helyben 1015 évig is termeszthető Biogáz-termelési tulajdonságai kiválóak, erjedési ideje nagyon rövid, ugyanakkor gáztermelése is kiváló. Magas energiatartalmú biomasszát képző lágyszárúak a már hazánkban is nagy területen termelt energiafű. A rosszabb minőségű területeken (zagytér, meddőhányó, alacsonyabb termőképességű talajok) is termeszthetőek (pl. rekultivációs céllal), ezért jóval nagyobb terület hasznosítható általuk. Az eltüzelendő növényi anyagot brikettálással tömöríthetik (biobrikett előállítás). A cukor-, keményítő-, lipid- vagy cellulóz tartalmú növényi anyagokból (pl. cukorrépa, burgonya, kukorica, repce) fizikai előkezeléssel (aprítás, hidrolitikus enzimatikus előemésztés stb.) és fermentálással nyerhető bioetanol, amely tüzelésre és hajtóanyagként is hasznosítható. Az évelő nádfélék alkalmasak ültetvények létrehozására, de vízigényük általában magasabb. Hozamuk

250-400 GJ/ha/év Telepítést követően a betakarítás sokszor ismételhető, a téli mezőgazdasági holtidényben elvégezhető. Az egynyári vagy évelő fűfélék szintén alkalmasak ültetvények létrehozására, hozamuk 200-350 GJ/ha/év. Az évelő fűfélék előnyösebbek, mert nem igényelnek évenkénti talajelőkészítést. Legismertebb képviselőjük a „Szarvasi-1” energiafű (Agropyron elongatum), amely a Szarvasi Mezőgazdasági Kutatóintézet terméke, de említhető a szudánifű (Sorghum vulgare p.v sudanense), a nádképű csenkesz (Festuca arundinacea), az óriás keserűfű (Polygonum sachalinensis), a cukorcirok (Sorghum bicolor), az olasznád (Arundo donax) és a zöld pántlikafű (Phalaris arundinacea) is. Az energiafű kiemelkedő szárazság-, só- és fagytűrési képességgel rendelkezik, nem érzékeny a talaj minőségére és egy helyben 10-15 évig is termeszthető. Biogáz-termelési tulajdonságai kiválóak, erjedési ideje nagyon

rövid, ugyanakkor gáztermelése is kiváló. Hazánkban az állatlétszám csökkenésének következtében az utóbbi években az állati trágya mennyisége is visszaesett. Ezt a hiányt pótolhatja az energianövény termesztés Az itt megtermelt magas szénhidráttartalmú (és emellett alacsony lignocellulóz-tartalmú) növényi biomasszát kitűnően lehet hasznosítani biogázüzemekben. Ez a lágyszárú energianövényekre, fűre alapozott biogáztermelés. A biogáz-termelés során visszamaradt (kierjesztett) szerves anyag talajerő-visszapótlásra /biogáz-trágya/ felhasználható a szántóföldi növénytermesztésben. A fűfélék alkalmazásával fokozható a fajlagosan előállítható metángáz mennyisége (köbméter/ kg), így az energiatermelés foka meghaladja az általánosan alkalmazott szennyvíziszapokból és hígtrágyákból kinyerhetőt (I. Magyar Biogáz Konferencia, 2005) Előállítható metángáz mennyisége (m3/ kg) 1.2 Metántermelés A

metán keverékkultúrában való képződésének módja még nem teljesen ismert. A fakultatív anaerob baktériumok a zsírokat, fehérjéket, szénhidrátokat hidrolizálják és monomerek keletkeznek. Ezeknek a mikrobáknak a szaporodása és a biogáz képződése a természeben igen lassan megy végbe. Ott ahol nagy koncentrációban van jelen nedves szerves anyag oxigénmentes környezetben, pl. mocsarakban (lidércfény), tavak üledékében, állatok és ember bélrendszerében. A szarvasmarhák anaerob bendőjében kifejezetten nagy mennyiségben képződik metán, metántermelő állatok. Hidrolitikus baktériumok bontják a nagy molekulájú szerves vegyületeket, enzimeikkel, melynek eredményeként rövid szénláncú zsírsavak, szén-dioxid és hidrogéngáz keletkezik. A baktériumok második csoportja a zsírsavakat szerves savvá, ecetsavvá alakítja. Újabb szén-dioxid és hidrogéngáz keletkezik Végül a tulajdonképpeni metántermelés kiindulási

anyaga a hidrogén, szén-dioxid, ammónia, ecetsav és metanol. A lebontás során szerves savak, alkoholok és metán szén-dioxiddal együtt keletkezik. Sok esetben a jelenlévő szulfátredukáló baktériumok termékeként kén-hidrogén is képződik, így a biogázban kis mennyiségben hidrogén-szulfid is megtalálható. A biogáz üzemekben a szerves anyagokat nagy tárolómedencékbe gyűjtik, ezzel biztosítják a folyamatos üzemeltetést. A biogáz reaktor általában gázszigetelt betontartály, amelyeket a jobb hőmérséklettartás miatt a fölbe ásnak. Kisebb telepeken a beton hígtrágya siló célszerűen az istálló alatt van elhelyezve, ahonnan rövid úton pumpa juttatja - légmentesen és hőveszteség nélkül - a trágyalevet az erjesztőtérbe. A tartályban folyamatos lassú keveréssel akadályozzák meg a könnyen leülepedő anyagok rétegződését. Az erjedés és gázfejlődés időtartama hőmérsékletfüggő: 30-40 °C-on 15-25 nap, 50-55

°C-on ennél rövidebb, de csak fokozatosan lehet a rendszert melegíteni (a fermentorokat alulról talpfűtéssel fűtik). A metanogén baktériumok 20-25 °C-on is képesek metánt előállítani, de mivel széles hőmérsékleti tartományt is elviselnek, ezért 15 °C-tól 55 °C-ig 60-99% víztartalom esetén működőképesek. Szárazanyagból kiindulva 1,0 kg lebontott szerves szárazanyagból mezofil rothasztás esetén (Fair-Moore féle gázfejlődési diagram alapján) 0,75-0,8 m3/d gáz nyerhető. Termofil rothasztás esetén (55 C) a kinyerhető gáz mennyisége 20-25%-al növekszik, ám a rendszer fenntartása az előzőekhez képest ugyanennyivel többet kíván. A biogáz fermentáció során vizsgált paraméterek: oxigénmentes környezet (anaerob), 50 % feletti nedves közeg, semleges kémhatás, optimális szén/nitrogén arány (C/N), fénymentes környezet, megfelelő keverés, a rátáplálás biomassza mennyiségének és idejének megállapítása. A termelt

biogázt tartályokba gyűjtik, elvezetésük szűrőn át megy végbe, majd leggyakrabban gázmotorokban égetik el és termelnek vele villamos energiát. A biogázt természetesen épületek, üvegházak és maga a biogáz fermentor fűtésére is fel lehet használni elégetéssel. A biogáz levegővel keveredve robbanásveszélyes, ezért a földgázzal azonos biztonsági berendezéseket igényel, továbbá a korrozív kén-hidrogént a gázból el kell távolítani! 2. Bioetanol előállítás Bár a szénhidrátokból nyerhető etanolt már a belsőégésű motorok születésekor számon tartották mint lehetséges hajtóanyagot, de a kőolaj alapú nyersanyagok alacsony ára és nagy mennyisége miatt az etanol legfeljebb mint oktánszámnövelő motorhajtóanyagadalék fordult elő a motortechnika történetében. Hosszú időn keresztül csak akkor alkalmaztak etanolt a motorokban üzemanyagként, ha nyersanyaghiány lépett fel. A bioetanol előállítása mind nagyobb

fontosságú a benzin helyettesítésére, mivel 5-10%ban a benzinbe keverhető és a belső égésű motorban korlátlanul felhasználható. Előállítása keményítő tartalmú gabonák (pl. búza, kukorica), melaszok vagy cukoroldatok (pl. cukornád/cukorrépa) vagy akár fahidrolizátum cellulóz alapanyagokon (pl fa vagy fafeldolgozási hulladékok) élesztőgombák és Zymomonas baktériumok anaerob fermentációjával lehetséges. (Technikai célokra etanolt kémiai szintézissel az etiléngáz katalitikus hidrogénezésével állítanak elő.) 2.1 Az etanoltermelés bioszintézise A bioetanol-gyártás alapanyaga olyan szénhidrát, amelynek vagy a hexóz (glükóz) tartalma magas, vagy olyan poliszacharid, ami glükóz monomerekből épül fel, és enzim segítségével monomereire bontható. A glükózt a mikrobiális szervezetek az EmbdenMeyerhof erjedés (élesztőgombák), vagy a hexóz-monofoszfát söntre alapuló (baktériumok) fermentáció során alakítják

etanollá. A leggyakrabban használt mikrobiális szervezet a Saccharomyces cerevisiae élesztőgomba, bár az utóbbi évek kutatásai kimutatták, hogy Zymomonas mobilis baktérium oltóanyag használatával szintén lehet hexózból etanolt előállítani. Ez utóbbi számos előnnyel rendelkezik az élesztővel szemben. Ilyen a már megtermelt etanollal szembeni feed-back gátlás elmaradása, ami a baktérium tenyészeteiben sokkal kisebb mértékű, így a technológiai folyamat során még sokkal intenzívebben tud működni, mint az élesztő, ami a gátlás hatására már nem tud megfelelő mennyiségű etanolt termelni. 2.2 Bioetanol gyártás gabonából vagy melaszból A gabonák keményítő tartalmát enzimes hidrolízissel és főzéssel folyósítják el (lásd Enzimek fejezet). Az így elbontott keményítő már megfelelő alapanyaga fermentációnak Az általánosan alkalmazott élesztő fermentáció során aerob módon indítják a sejtosztódást és csak

megfelelően magas sejtszám elérése után állnak át anerob körülményekre és indulhat el az alkoholos erjesztés folyamata. Mindezek miatt a rendszer cukortartama veszteséget szenved. Az élesztővel előállítható alkohol koncentrációja maximálisan 5-6%, ugyanakkor mutáns alkoholtűrő törzsekkel ez az érték a 10%-ot is elérheti. Melasz vagy keményítő (10-12%) alapú fermentáció esetén 36-48 óra alatt 6% alkoholos fermentlé állítható elő. 2.3 Bioetanol gyártás növényi rostokból és faipari hulladékokból A bioetanol termeléshez a kézenfekvő, de korlátozott mennyiségben felhasználható cukorrépa vagy cukornád melasz helyett/mellett általában olyan anyagokat használnak, amelyek könnyen lebomló és termeszthető gabonaszármazékok, mint pl. a kukorica A XXI. század biotechnológiájának nagy kihívása, hogy olyan faipari vagy mezőgazdasági hulladékokból, mint pl. a faforgács és kukoricaszár - mint cellulóz alapanyagokból -,

üzemanyagként hasznosítható alkoholt állítson elő. A nagy probléma a kukoricarost és más cellulóz/xilán alapú rostok lebontása. A fák anyagának összetételéhez hasonlóan a különösen kemény kukoricarost pl. kukoricacsutka, nemcsak cellulózt tartalmaz, mint szénhidrátforrást, hanem hemicellulózt is, ami pentóz (arabinóz és xilóz) egységekből álló poliszaharidok (arabinán és xilán) elegye. A cellulóz gombák, valamint gombákból kivont enzimek segítségével lebontható glükózra, amiből etanol nyerhető, viszont a hemicellulózból származó pentóz átalakítása jelenleg problematikus. A hemicellulóz a cellulózzal ellentétben heteropolimer, nagyrészét arabinoglukán alkotja. Ennek 65%-a xilóz, 35% arabinóz A hemicellulóz fermentálható cukrokká való bontásáról (szaharifikáció) számos kutatás zajlott. Az arabinózt és a xilózt már tudják bontani az élesztősejtek, így alkohol (xilitol és arabitol) keletkezik, de a

xilánt és az arabinánt csak más fonalas gombák tudják megbontani. A faanyagok hemicellulóz rostjai nagyon komplex összetételűek, így enzimatikus bontás előtt némi savas, szulfátos, illetve hidrogén-peroxidos előkezelést igényelnek. A savas előkezelés magas hőmérsékleten a hemicellulózt egyszerű cukrokká bontja. A szulfátos kezelés az enzimek számára biztosítja a hozzáférhetőséget. Az ammónium-hidroxidos kezelés a lignint, az acetátot, valamint az egyéb extraktumokat eltávolítja. A nedves oxidációs módszer különválasztja a cellulózt a hemicellulóztól, és a lignintől. A ligninbontást Trichoderma reesei fonalas gomba esetében vizsgálták. A hemicellulóz szaharifikációja Az eddigi vizsgálatok azt mutatják, hogy a hemicellulózt preparált, tisztított enzimmel nem lehet bontani, savas előkezelés szükséges, hogy egyszerűbb, bontható cukorrá bomoljon. Enzim endo-xilanáz exo- xilanáz béta-xilozidáz

alfaarabinofuranozidáz alfa-arabinofuranózt alfa-glukoronidáz acetilxilán észteráz acetilxilán észteráz ferulic sav észteráz q-kumársav észteráz működési elv Hidrolizálja a b-1,4-xilózidos kötést a xilán gerincen Hidrolizálja b-1,4-xilózidos kötést és xilobiózt állít elő Xilózt állít elő a xilobiózból és a rövid láncú xilooligoszaharidokból Hidrolizálja a terminális, nem redukáló az arabinoxilánokból Előállít glukoronsavat glukoronoxilánból Acetil xilánban acetil kötést hidrolizál Acetil xilánban acetil kötést hidrolizál Ferluilészter kötést hidrolizál Xilánban qumaril észterközést hidrolizál Eddig az Aureobasidium pullunans imperfect fonalas gomba esetében sikerült olyan nem-tisztított enzimet előállítani, ami sikeresen bontotta a faanyagokból nyert hemicellulózt. A xliánt xilobiózzá, majd xilózzá bontja A pentózokból a fermentációs erjesztés során nem lehet közvetlenül alkoholt

erjeszteni, ezért ahhoz hogy a pentózokból etanolt tudjunk előállítani, és ne xilitolt és arabitolt, rekombináns mikroorganizmusokat kell előállítani (lásd Rekombináns termékek). A pentóz metabolizmus és a baktériumok, valamint az élesztők etil-alkoholos fermentációja, mint a két anyagcsereút összekapcsolása 5. fejezet - Galéria A kláv erős a túlnyomást elviselő fedéllel és leszorító záró szerkezettel rendelkezik. A gyógyszergyári tenyésztés folyamatosságát a nagyteljesítményű átadó autoklávok biztosítják. Az európai certokláv nyomásmérővel, hőmérővel biztonsági szeleppel( a kép előterében), nyomáskiengedő szeleppel (nagy szelep), gőzkiengedővel(fekete kerek) rendelkezik. A Micrococcus roseus piros telepei között nagy fehér Bacillus és kisebb sárga pseudomonas telepek láthatók az agarlemezen. A fermentorban létrán lehet a keverőlapáthoz vagy a fermentor fenékhez lejutni. 100 literes fermentor

rozsdamentes acél turbina keverőlapátjai, jól látszik a vízkőlerakódás. A sterilezéshez fermentor mindent lezárunk és lecsomagolunk, kivéve a kimenő levegő csonkját. Ezt bár lecsomagoljuk nem zárjuk, hogy a sterilezésnél fellépő nagy nyomáskülönbség össze ne roppantsa a fermentorüveget. Jól látszik a fermentor közepéből kiálló keverőtengely, amelynek szimeringgyűrűs, vízzáras tömítése,kék gyűrű) biztosítja a steril kapcsolatot a fermentorfejjel. A tárgyasztal alatt helyezkedik el a fáziskontraszt feltét, míg a fluorescens gerjesztő higanygőz lámpa hátul hűtőlamellák között található. Fluorescens feltét nélküli kutató mikroszkóp. A gélelektroforézis alapelve, hogy a töltéssel rendelkező molekulák elektromos térben, össztöltésüknek megfelelően, az ellentétes töltésű elektróda felé vándorolnak. A vándorlás sebessége (v) függ a molekula töltésétől (z), tömegétől és alakjától (f)

továbbá az elektromos térerőtől (E):V=(E*z)/f A kis térfogatok 1-1,500 mikroliter ülepítését eppendorf műanyag csövekben centrifugálják erre alkalmas készülékben. A modern digitális centrifuga viszonylag kis méretű, mégis hűtött viszonyok között 250 ml térfogatot 10000 r.pm fordulaton centrifugálhatunk, a nyitott ajtó mellett egy centrifugapohár látható. Az oltatlan agrferde felülete sima, nem látszik rajta semmi. A képen egy 6,44 pH-jú vegetatív fázisú Bacillus subtilis tenyészetet mérnek. Az ilyen, még szaporodő fázisú tenyészet pH-ja, amíg elegendő szénforrás áll rendelkezésre, a termelődő szerves savak hatására folyamatosan csökken, majd annak elfogyásával a pH a lúgos tartomány felé mozdul el. A pH mérők szenzora egy üvegelektród, melyen egy diafragma biztosítja az ionok átjutását az elektródhoz. Bradyrhizóbium japonicum a szója gyökérbaktériumának tenyészetei.350-400 rpm fordulaton kell

gondoskodni a sejtek levegőellátásáról. Többféle baktériumkultúra gézdugós nátronpapiros, steril csomagolással. A 48 órás Humicola insolens celluláz termelő gombatenyészet fonalai részben kiültek a lombik falára, de jól láthatók a folyadékban lebegő gombapelyhek is. A gézdugóval és nátronpapírral csomagolt steril lombikok gomatenyészetek ferdéivel lesznek oltva (jobbra). GLP helyiség Sokszor steril box helyett egy egész szobát steril levegővel látnak el. A szobában fermentorok oltására is sor kerülhetett. Gyógyszerkutató Intézet A lamellák a 0.5 mikréternél nagyobb részecskéket nem engedik a boxba Steril box steril felső szűrő lamellákkal(vertikális box). Steril szoba márvány asztallal. A régi típusokon jól látszódnak az óriási hőálló csavarok, amelyek a fedél megfelelő lezárását biztosították. Az előtérben a a köpeny vízfeltöltésére szolgáló tölcsér látható A nyomásmérő és hőmérő a

készülékbe beépítve található (a köpenynek külön nyomásmérővel). A kapcsolószerkezet félautomata, működését az operátor biztosítja A nyomástűrő még forró fedél leemelése mindig embert próbáló feladat.Fermentia Kft engedélyével. Az amerikai típusú certokláv csavarokkal szorítja le a fedelet. A fedél két oldalán a nyomásmérő és a gőzkiengedő szelep látható. A mikrobiológiai táptalajkonyha főző edényei. A táptalajok előfőzésére szolgálnak A megtisztított tenyésztő üvegedényeket gőzzel fűtött polcos szárítón utószárítják.A polctartó csövekben kering a gőz, amely a megfelelő hőt biztosítja. A helyes rozsdamentes mosogató az egész mikrobiológiai és fermentációs üzemet képes ellátni tiszta és steril edényekkel. Gyógyszerkutató Intézet A tenyésztő kamrában egymásra pakolt ládák közé steril gőzt vezetnek, a megfelelő nedvesítés eléréséhez. A felületi gombatenyésztést 95-98 %

páratartalmon lehet csak biztonsággal végezni. A tálca szélén(szürke bevonat) láthatóan kinőtt a penészgomba, míg a korpán még nem! A liofilizátumból ampullába zárva szivattyúzzák ki a levegőt. Az ampullában lévő vákuum erősen redukálja a kíméletesen megszárított tenyészet raktározás (tárolás) alatti hőpusztulását. Az automata pipettákkal 0,1- 5000 mikroliter folyadék térfogatot egyaránt pontosan kimérhetünk, sterilizált műanyag pipettahegyekkel sterilen is dolgozhatunk. Sok esetben maguk a pipetták is autoklávozhatók. Régen a gyártó cégről finnpipetának nevezték őket, ma már igen sokféle cég gyárt, forgalmaz és használatuk általánosan elterjedt (Gibson, Socorex, Jencons). A mikroorganizmus kultúrákat 500, 1000, 3000 és 5000 ml -es erlenmeyer lombikokban tenyésztik. A tenyészeteket sterilezni kell steril zárással, úgy, hogy megfelelő levegő is jusson a lombikokba. A steril levegőzésren képes zárást

papírvattagézdugóval vagy régi típusú pelenkával oldják meg, nátronpapír fedéssel A laboratóriumi munkában a táptalaj készítéséhez legtöbbször tiszta, ellenőrzött baktérium, gomba ill. emlőssejt táptalajokat, vegyszereket használnak A világon jó néhány gyártó van, amely ilyen táptalajok előállítására szakosodott, pl.: Difco, BBL, Oxoid stb. Ezekből az anyagokból elsősorban un inokulum tenyészetek táplevesei és tápagarai készülnek. Az inokulumok a technológiai folyamat első lépcsőinek tekinthetők, ahol speciális ideális összetételű tápanyagok biztosítják a maximális szaporodást és termelést. A képen a speciális gombák vagy baktériumok tenyésztésére alkalmas malátakivonat látható. A mikrobiológiai aszisztens baktériumtelepeket számlál agarlemezeken. (Tanay Károlyné engedélyével). A baktériumtelepeket a petricsésze alján filctollal megjelölve számláljuk. Talajbaktériumok vegyes tenyészete egy

agarlemezre kiszélesztve Az átlátszó Pseudomonas telepek (teaszínű) között kisebb piros Micrococcus és drapp színű Azospirillum baktériumtelepk találhatók. Talajizolátum Döntően Bacillus circulans (nagy fehér)telepek, kisebb piros Micrococus és kisebb fehér Azotobacter telepekkel. Talajizolátum Pigmenttermelő Pseudomonas telepek agarlemezen. A fermentor belsejében a forgatott tengelyen kettő turbina keverőlapát biztosítja a megfelelő levegőellátást a tenyészeteknek. A köbméteres fermentorok emeleten átnyúló felépítésűek, a fermentor fejet megközelíteni csak az emeleten lehet. Jól láthatók a keverőtengely motorjai és a régi típusú fermentortest szigetelés. A fermentorfejen helyezkedik el a bebújónyílás, ahol a tápanyagokat beadagolják, illetve ahol szükség esetén a fermentorkezelő bemászik javítás esetén. A nyíláson épp, hogy befér egy ember. Régi fermentoroknál a gyakori meghibásodás miatt erre gyakran

szükség volt. 100 literes fermentor steril levegoadagoló lantja(keverő nélkül). A BIOSTAT B-DCU egy sokoldalú, teljesen integrált asztali fermentor rendszer mikrobiológiai és sejt-tenyésztési alkalmazásokhoz. Moduláris szerkezete révén egy-, két-, három vagy négyedényes rendszer-ként is összeállítható.A csupasz fermentor még nincs sterilre csomagolva, ezért jól látszik a fej és a hűtő és adagaló csövezés. 100 literes fermentorfej adagolócsővel, kémlelő nyílással. 100 literes fermentor műszerei. A fermentortengely motorja és a nyomásmérő jól látszik. A fekete szigetelt csöveken gőz áramlik a fermentorba, sterilezésnél (direkt gőz fűtés). A fermentorfej sokféle adagoló és szonda bemenetet tartalmaz a megfelelő nyomásmérő és hőmérő mellett. A modern 1 köbméteres fermentor feje bonyolult csövezéssel és szenzorparkkal rendelkezik. A genetikus (Rév Ambrus biológus) DNS-t vizsgál. A készülék tetején a

nagy érzékenységű CCD kamera a kamra lelke. A centrifugálás során 3000-10000 r.pm(perc/fordulat) fordulaton szükséges a tenyészeteket ülepíteni és így az organizmusok elválaszthatók a tenyészlevüktől. A szögrotor nagyobb fordulatszámra, de csak kisebb térfogatra képes.Itt a pohár nem áll a centrifugális erő irányába, így a fugált anyagok ferdén tapadnak le a pohár aljára. Vastag vegetatív pálcák. A közelképen jól kivehető az ampulla tartalma: kis csőben foglal helyet a tenyészet, amely a liofilizálón a gumicsonkra csatlakoztatva éppen vákuum alatt van. A liofilizálás első lépése, hogy a nagy víztartalmú tenyészetet, megfelelő védőanyag mellett alacsony hőmérsékleten, centrifugálás közben vákuum alatt tartva(vákuum centrifugában) a víztartalom nagy részétől (a sejtekben nem kötött víztől) megszabadítják. 6. fejezet - Videótár A nagyteljesítményű autokláv és hőlégsterilező vastag nyomásálló

ajtóval és zárószerkezettel rendelkezik. Ipari autoklávok és hőlégsterilezők bemutatása. A digitális labormérleg önkalibráló automatikával rendelkezik. Látható, hogy a ráhelyezett lombik súlyát 0,00 g-ra beállítva, pontosan és gyorsan lemérhető a bemért anyag mennyisége. Digitális analitikai labormérleg működése. A malomszita rázógépek több száz lombikot képesek egyszerre 400-450 r.pm fordulaton rázatni. A gyógyszergyártásban több gépet egyszerre működtetnek a több ezer izolátum megfelelő szelektálásához(screening). Rázószoba több malomszita rázógéppel. Az üzem tápanyagellátása, ellenőrzése számítógépen nyomonkövethető és automatikusan szabályozható.A fejlett program stilizált ábrákon mutatja a motorok és csövezetékek állapotát. A működő fermentor metszetén mutatja a keverés folyamatosságát és a rendszer paramétereit. Fermentorüzem számítógépes irányító programmja. A

rengeteg törzs és tenyészet hidegen tartásához a gyárak és intézmények szobányi méretű hidegszobákat tartanak fenn. Hűtőszoba törzsek, tenyészetek tárolására. Az oltókacs ferdék és agarlemezek baktérium vagy gomatenyészeteinek oltására szolgál. A lánggal égetéssel a kacson maradéktalanul elpusztulnak a mikrooganizmusok, így folyamatosan akár több száz izolátummal is dolgozhatunk, átolthatunk, persze mindig leégetve oltókacsunkat. Platina oltókacs izzítása. A steril szobában óriási lamella felület biztosítja a steril levegő áramlását. A jól fertőtleníthető márvány asztal elengedhetetlen és szép kelléke a steril szobának. Steril szoba működése. A kisterilezett még forró folyékony agart 50-60 C-ra kell hűteni és óvatosan petricsészékbe öntjük, steril boxban. a lehülő agartartalmú folyadék megdermed és szilárd felületet biztosít a mikrobiológiai munkához. Agarlemez öntése steril boxban. élesztő

fermentlé szélesztési eljárása: Szélesztés agarlemezen . A Bradyrhizobium japonicum 24 órás tenyészete híg fehér folyadék. Szubmerz baktérium tenyészet. A Thermomyces lanuginosus gomba 72 órás tenyészete sűrű barna folyadék. A gombatenyészetek kíméletesebb rázást (150-200 r.pm) igényelnek gombafonalaik összetöredezése miatt, de ezért is lassúb a szaporodásuk, több napig is eltarthat tenyésztésük. Szubmerz gombatenyészet. videok/video 104.avi Steril szoba, zsilipfüggönnyel, steril boxal, kacsizzítóval, személyzettel. Steril szoba, zsilipfüggönnyel, steril boxal, kacsizzítóval, személyzettel. Sterilezés Sterilezés A még forró eszközöket védőkesztyűben kell kiemelni az autoklávból, majd újabb sterilezési ciklus indításakor az autokláv vízszintjét(fedeles tölcsér) és vastag gumitömítését ellenőrizni kell. Automata autokláv nyitása és zárása. Az átadó autokláv egyik oldalán behelyezhető a sterilezendő

anyag és sterilezés után a tiszta helységben a másik oldalon vehető ki.Az autokláv mindkét oldalán egyforma kiképzésű ajtó van, a nyitó szerkezetek eltérő színe jelzi a berakási és a kivételi oldalt. Ipari átadó autokláv bemutatása. 1,2 bar túlnyomásnál a szelep automatikusan kinyílik és a felesleges gőz eltávozik.A túlnyomást hevítéssel 20 percig folyamatosan tartjuk, ez a sterilezési idő. A certokláv túlnyomásra hevítése A certoklávot 1,2 atm túlnyomásra fűtöttük. Látszik a túlnyomáskiengedő szelepen eltávozó gőz is. Túlnyomáson tartott certokláv Tálcákon nagyobb mennyiségű anyagokat is liofilizálhatunk. A kívánt baktérium vagy gombatömeget előzőleg lefagyasztjuk, majd fagyott állapotban kell a liofilizálóba tennünk. fontos, hogy addig míg a teljes vákuum ki nem alakul az anyagnak nem szabad kiengednie, ellenkező esetben a rendkívül légritka térben akár 0 C-on is fellfor az anyag. A gép belesejében

-55-60 C van a megfelelően alacsony hőmérsékelet eléréséhez. A mikroorganizmusban és környezetében lévő víz eltávolítása kíméletes módon történik, alacsony hőmérsékleten (-30 -40 C), nagy vákuum mellett. A jégkristályok szublimálásán alapszik tulajdonképpen a módszer. Nagyteljesítményű félüzemi tálcás liofilizáló. A nagyméretű petricsészékben tálcákra helyezett fagyasztott gombatenyészeteket üvegbúra alá helyezzük, majd beindítjuk a vákuumot. A fedőbúrát a vákuum rászívja a tömítésre, így rövid idő alatt szinte a teljes levegőmennyiséget kiszivattyúzza, mintegy légüres tér keletkezik a petricsészék körül. Tálcás liofilizáló működése. Ajánlott védőkesztyűben folyékony nitrogénnel dolgozni, de a gyakorlottak akár bele is nyúlnak a -200 C-os tartályba, sőt néhány cseppet a szerző lábára is szórtak. A folyékony nitrogén súlyos égési sérüléséeket okozhat! Törzsek tartósítása

folyékony nitrogénben. A csövekben nagyrészt beszárított tenyészeteket ampullákba helyezik, jelöléssel látják el őket, majd ezek után kerülnek a liofilizálóra. Liofilizátumok ampullázása A vákuum centrifugában a 3000-4000 r.pm fordulaton hűtve és vákuum alatt szabadítják meg a sejteket a víztől, ezért vastag plexi lap szigeteli és tartja vákuum alatt a centrifuga belső terét. Liofilizátumok vákuum centrifugában Az ampullákat liofilizálás előtt 1400 C-os lánggal az üveget megolvasztva beszűkítik, hogy a liofilizálóról már a vákuumban lánggal lezárt ampullákat tudják levenni. Ampullák szűkítése A köbméteres üzem emeletes, alul a fermentor kivezető nyílásai,míg fölül a fermentorok adagoló csövezései is kiszolgáló eszközei láthatók. A bal oldali 100 literes oltófermentorban elkészülő tenyészeteket felváltva oltják a három ötköbméteres főfermentorba. Régi 5 köbméteres üzem bemutatása. A 100 literes

fermentor belseje és a köbméteres fermentorok csövezései, csapjai, nyomásmérője. Régi típusú 100 literes oltó és 5 köbméteres fermentorok bemutatása A teljes laborfermentort az adagoló üvegekkel együtt autoklávban sterilezzük. Az autokláv lezárása a légmentes nyomásálló zárás miatt a tengeralattjárókhoz hasonlóan történik. A videón látszik az autokláv köpennyomása, amelyet a telített gőz okoz Ez a gőz áramlik a karok eltekerése után a fermentor köré és sterilezi azt.a fermentációs standard 121 C, idő 25 perc 1,2 atm túlnyomáson, de nehezen sterilzhető anyagoknál ez akár 135 C, 50 perc és 1,5 atm is lehet. 5 literes fermentor sterilezése. A fermentor oltása az egyik legfontosabb művelete a technológiának. A fonalas gombatenyészet 200 ml-ét steril csővezetéken keresztül a fermentorba kell juttatni.Az oltócsonkot láng alatt kell csatlakoztatni a fermentor oltócsövéhez, majd perisztaltikus pumpa nyomja, oltja a

tenyészetet a táplevesbe. Jól látszik a fermentorban levegőztetett keveredő tápleves, amely 24 óra után sűrű gombatenyészetté válik. 5 literes fermentor oltása. A percenként 9000 fordulatra képes centrifuga maradéktalanul ülepíti a legkisebb DNS molekulákat is. Eppendorf centrifuga működtetése, centrifugálás alacsony(300 r.pm) és magas fordulatszámon(9000 r.pm) Az Azospirillum talajbaktériumok jellegzetes mozgásukról kapták nevüket. Nitogénkötésre képesek, talajoltóanyagként hasznosítják őket. A nitrogénkötésnek kevésbé efficiens, de a növények számára más szempontokból kedvező formája az Azospirillum baktériumok és egyszikű növények asszociációjában valósul meg. A gazdanövények gyökérrendszerében a pillangósoknál megszokott gyökérgümők nélkül is lehetséges nitrogénkötés. Nagy előnyt jelent, hogy az Azospirillum növényi növekedést serkentő fitohormonokat szintetizál és ad át a növénynek.

Így a kukorica, búza, rizs és egyéb gabonafélék szántóföldi Azospirillum oltása 10-30%-kal kevesebb nitrogén műtrágya felhasználás mellett is átlagosan 5-30% termésnövekményt eredményez. Az Azospirillum baktériumnemzetség tagjai növényi növekedést serkentő és nitrogénkötő rhizobaktériumok, melyek túlnyomórészt gabonafélékkel és pázsitfűfélékkel élnek asszociációban, azok gyökerén megtelepedve. Azospirillum spirillum mozgású talajbaktériumok. Jellegzetes vastag vegetatív sötét nem mozgó Bacillus thuringiensis pálcák. A B thuringiensis talajlakó, spóraképző baktérium, amely toxint termel. Az elmúlt évtizedekben a baktérium számos alfaját (subspecies) izolálták rovarokból vagy a talajból (pl. a B thuringiensis subsp kurstaki, a B thuringiensis subsp israelensis és a B thuringiensis subsp. tenebrionis alfajok) A baktérium hatékonysága a növényvédelemben toxinokhoz kötött. Három toxin, az -exotoxin, a

-exotoxin és a -endotoxin ismeretes: - Az -exotoxin egy vízoldékony, fehérje természetű, hőre érzékeny toxin, amelyet egyes B. thuringiensis és B cereus alfajok termelnek Igen toxikus bizonyos rovarokra, de hasonlóképpen mérgező egerekre és más gerincesekre is. - A -exotoxin vagy thuringiensin, egy hőstabil toxin, amely a baktérium életszakasza során alakul ki, és a táptalajban választódik ki. A thuringiensin számos ízeltlábút képes megmérgezni (pl legyek, lepkék, hártyásszárnyúak, bogarak, atkák). A toxin táplálkozásgátló és rákkeltő hatásai révén kiváló hatékonysággal pusztítja el a rovarokat. B. thuringiensis 7. fejezet - Szószedet szó a-provitamin abciximab abszorbeálódot acetil-coa acetobacter acremonium aerobacter adaptáció adriamicin aerob aflatoxin affinitás- leírás legismertebb provitamin a béta- k a r o t i n előanyaga az Avitaminnak terápiás monoklonális antitest készítmény Az

adszorpció a fluid-szilárd fázisérintkeztetés azon művelete, melynek során a szilárd anyag felületén gázok, illetve folyadékok komponenseit kötjük meg. A citrátkör legfontosabb funkciója, hogy az acetil-COA nagy energiájú elektronjait NAD és FAD koenzimek közvetítésével a légzési láncra juttatja. Az ecetsav baktériumok Acetobacter aceti (A. peroxidans, A pasteurianus) befejezetlen oxidáció során az etanolt ecetsavvá oxidálják. Az Acetobacter suboxidans törzsei a D szorbitot képesek régioszelektív oxidációval L-Szorbózzá alakítani A penicillin után a Cephalosporium acremonium nev? penészgombából a cephalosporint izolálták, amely az el?bbihez hasonlóan a laktámvázas, kéntartalmú peptidvegyületek közé tartozik Aerobacter aerogenes pullulanáz termelő baktérium, lásd enzimfejezet A fermentációs tenyésztés során az oltott baktériumoknak hozzászoknia, adaptálódnia kell a tápközeghez Az antibiotikus citosztatikumokat

elsősorban Streptomyces (sugárgombák) fajok törzseinek tenyésztésével állítják elő: aktinomicin, adriamicin, daunomicin, kromomicin, mitramicin, mitomicin, bleomicin, neokarcinosztatin, cyclophosphamid. levegőt, oxigént ígénylő tenyészet ˇ Az adszorpciós műveletek mindegyike legalább kétfázisú heterogén rendszerben zajlik le, ahol a fázisok minőségén kívül a fázisok határfelületének nagysága és szerkezete játszik kitüntetett szerepet. monoklonális antitesteket kötnek kromatográfiás oszlopra, szó kromatográfia agar-agar agrobacterium agroclavin agropyron air-lift akceptorát akkumulálják aknázott leírás majd olyan ellenanyagot tartalmazó folyadékot adagolnak rá, amelyből képesek az antitestek a keresett ellenanyagot megkötni az oszlopon. Mélytengeri vörösalgák poliszacharidja, kocsonyásodásra hajlamos. Szilárdító anyagként használják mikrobiológiai táptalajokban Az Alcaligenes faecalis var myxogenes vagy

az Agrobacterium radiobacter mutáns törzsei képesek a különleges poliszacharid a curdlán előállítására A Claviceps gomba fő hatóanyagai, az indol-alkaloidok közé tartoznak. Alapvázuk a tertaciklusos ergolin (49 ábra) A vegyületek két f? csoportba oszthatók: a lizergsav származékokéba (pl. ergopeptin, ergotamin, ergopeptámok) és a clavin-alkaloidokéba (pl. clavin, agroclavin, elymoclavin). deres búzafű (Agropyron intermedium [Host.] Pa >pázsitfüvek család tagja. Rostos, durva szálú, magasra növő szálfű ( >fűfélék). Száraz, köves cserjés területeken fordul elő. Olyan fermentor amelyben a mikroorganizmusok oxigénellátását és egyidejűleg a fermentlé mozgatását levegő segítségével oldják meg. Az intermolekuláris er?k forrása lényegében a molekulák, illetve fragmenseiknek Coulomb-kölcsönhatása. Az intermolekuláris kölcsönhatások három fontos típusa : a van der Waals kohézió, a hidrogénkötés, az elektronpár

donorakceptor kötés közül talán a két utóbbi specifikus kölcsönhatás jellemz?i között ismerhet? fel legjobban a kémiai kötés két markáns attribútuma, az irányítottság és a sztöchiometrikus jelleg. a mikroorganizmusok gyakran sejtjeikben gyűjtik össze, akkumulálják értékes hatóanyagaikat A vadgesztenye-aknázómolyt harminc évvel ezel?tt fedezte fel egy német kutató Skopje környékén, Macedóniában. Aztán pár évvel ezel?tt egy másik kutató Linzben sétálva megdöbbenve látta, már ott is megjelent a vadgesztenyék levelén. Rögtön írt nekem, találtam-e Magyarországon, hiszen Linz és Macedónia között fekszünk. Csak jóval kés?bb fedeztük fel, de akkor már rengeteg volt bel?le egyegy fán. Az aknázómolynak a hernyója a vadgesztenyelevél szövetében él, azaz aknázik , ezeken a helyeken átlátszóbbá válik a levél. Ha sok hernyó él a levélen, a fotoszintetikus terület csökken (esetleg aknával a hernyó nagy

levélfelületet izolál), ami a fa pusztulását okozhatja, szó leírás persze csak akkor, ha nagy tömegben lepik el a fát. Az itakonsav előállítására az Aspergillus itaconicus és A. akonitsavból terreus törzsek képesek. A trikarbonsav ciklusban a cisz akonitsavból dekarboxilálással keletkezik. Az antibiotikus citosztatikumokat elsősorban Streptomyces (sugárgombák) fajok törzseinek tenyésztésével állítják elő: aktinomicin aktinomicin, adriamicin, daunomicin, kromomicin, mitramicin, mitomicin, bleomicin, neokarcinosztatin, cyclophosphamid. alanin aminósav A mikroorganizmus táptalajoknak mindazokat az elemeket tartalmazni kell, amelyek a sejt saját anyagainak alapanyag felépítéséhez és anyagcseretermékek előállításához szükséges.Ezeket a fermentáció során a táptalajba adagolt anyagokat alapanyagoknak nevezzük. Az Alcaligenes faecalis var myxogenes vagy az alcaligenes Agrobacterium radiobacter mutáns törzsei képesek a különleges

poliszacharid a curdlán előállítására Az oxovegyületeket két csoportra oszthatjuk aszerint, hogy a kettős kötésű oxigénatom - vagyis az OXOCSOPORT láncvégi vagy láncközi szénatomhoz kapcsolódik-e. A aldehidek láncvégi szénatomhoz kapcsolódó oxocsoportot tartalmazó vegyületek az ALDEHIDEK, a láncközi vagy gyűrűs szénatomhoz kapcsolódó oxocsoportot tartalmazók pedig a KETONOK. Keményítőbontó enzim. A keményítő glükóz egységekből álló poliszacharid, amelyben 1,4 és 1,6 glükozidos kötések alfa-amilázok váltakoznak. Az alfa-amilázok a keményítő 1,4 glükozidos kötéseit bontják és mind Bacillus, Micrococcus baktériumok és mind Aspergillus, Trichoderma fonalas gombák termelik. alfaA béta -glükozidázzal közösen hidrolizálja a glükózarabinofuranozidáz aromavegyületek közötti glikozidos kötések A megfelelő takarmányhasznosulás eléréséhez a speciális alfa-galaktozidáz alfa- galaktozidáznak, mint galaktomannán

bontó enzimnek jelentős szerepe van alfa-keto-glutársav a citromsavciklus egyik résztvevője alfa-tokoferol e-vitamin növényi és bakteriális fotoszintetizáló egysejtű és telepes alga élőlények A Haematococcus pluvialis spórás sejtjeinek karotinoid tartalmának fő komponenense szintén az astaxanthin, amely alga-astaxanthin a festékanyagainak mintegy 95%-át teszi ki. Ez az organizmus a legnagyobb mennyiségben termeli az astaxanthint a természetben. Az alga sikeresen alkalmazható, szó leírás mint hús és tojás színjavító, illetve gyökfogó. algakultúra algasejtek tenyészete Az egysejt olajok (single cell oil, SCO) a mikroorganizmusokban felhalmozódó telítetlen zsírsavak összefoglaló jelentése. Nagy mennyiségben fonalas gombák és algák képesek olajcseppek formájában vagy a algaolaj sejtmembránban felhalmozni. Esszenciális, többszörösen telítetlen (PUFA polyunsaturated fatty acid) *-3 és -6 zsírsavaikat a koleszterinszint

csökkentésére, hiánybetegségek gyógyítására és immunstimulálásra alkalmazzák. algaport Szárítot algatenyészet algaspórák algasejtek kitartó képletei algaszárazanyagot A nedves algatömeg száraz súlya algatörzs Egy algasejtből izolált algatenyészet d-mannuron és l-glükoronsav-egységekből álló poliszacharid(alginsav)CaMg sója. Azotobacter vinelandii és alginát a Pseudomonas aureginosa, vagy barna algák termelik, stabil emulziót képes alkotni. egyes növényfajokban szekunder anyagként keletkező alkaloid nitrogéntartalmú bázisok, erős élettani hatású, mérgező anyagok, egézségügyi felhasználásuk jelentős Alkilezésnek azt a reakciótípust nevezzük, amelynek során valamely molekula egyik hidrogénatomját alkilcsoportra cseréljük ki.Ennek a sokféle változatban ismert reakciónak itt alkilezni csak azt a megoldását tárgyaljuk, melyben az alkilezett molekula alkán, az alkilezőszer pedig alkén. Példa erre az izobután

alkilezése buténnel "Az alkoholok olyan -OH hidroxilcsoportot tartalmazó vegyületek (hidroxivegyületek), amelyekben az -OH-csoport telített szénatomhoz kapcsolódik. Ipari úton, és biológiai alkohol erjedéssel is előállítható. A természetben szabad állapotban, valamint észterek és glükozidok formájában található.Ha az OH-csoport elsőrendű szénatomhoz kapcsolódik, az alkohol primer alkohol, pl. CH3-CH2-OH A trikarbonsav ciklus szinte minden sava előállítható mikrobiológiai úton. A trikarbonsavak biológiai előállításával kapcsolatban már mintegy 50 éve több almasav laboratóriumi és ipari kísérletet folytattak már, de előállításuknak a citromsav kivételével - erős konkurenciája a kémiai szintézis (tejsav,ecetsav,almasav,alfa-keto-glutársav). A mikroorganizmus törzsizolátumból nyert új tulajdonsággal altörzsek bíró törzs szó leírás Az Amfotericin B (INN: Amphotericin B) egy szisztémás amfotericin

gombaellenes gyógyszer. Gükoamiláz (amiloglükozidáz): cukrosító enzim, exoenzim, amiloglükozidáz- a nemredukáló láncvégről bont, glükózt csinál, mikróbákban készítményt (A. niger) magasabb rendű élőlények bélflórájában ez a gamma amiláz. Az aminosavak olyan szerves vegyületek, melyben egy alfa helyzetű szénatomhoz karboxil- és amin csoport kapcsolódik. amin-csoport Az aminosavak széles skáláját az adja, hogy a szén másik két kötőhelyeire különböző funkciós csoport kapcsolódhat (pl. H-,R-,Ar,stb.) Homoszerin vagy metionin-szerin kettős auxotróf mutánsok alkalmasak hatékony lizintermelő törzseknek, ennek magyarázata a lizin bioszintézise: a lizin baktériumokban az amino-adipinsav diamino-pimelinsav(DAP), a fonalas gombákban, élesztőkben és algákban amino-adipinsav úton szintetizálódik. Az aminoglükozidok az antibiotikumok azon típusa, mely jelenleg igen hatékonyan alkalmazható súlyos humán bakteriális fertőzések

megelőzésében és gyógyításában, amino-glükozid ellentétben azokkal az antibiotikumokkal, melyekkel szemben egyre több kórokozó baktérium (pl. tuberkulózist okozó baktérium) válik rezisztenssé. Élesztőgombákkal (pl.Crptococcus laurentii) a L aminokaprolaktám enzimes átalakítása lehetséges lizinné Az amino-kaprolaktám 10 %-os oldatát élő vagy szárított amino-kaprolaktám sejtekkel keverik össze, így 24 óra alatt az amino-adipinsav út amino kaprolaktám hidroláza szinte maradék nélkül Llizint konvertál aminoA penicillin mag, a 6-amino-penicillinsav előállítása 1959penicillinsav-aps- ben tette lehetővé számos új penicillin-származék hoz létrehozását szemiszintetikus úton. antibiotikum, a felső légúti infekciók kezelését - kivéve a Streptococcus pyogenes által okozott kórképeket amoxicillinnel kezdhetjük amoxicillinnel, amelytől a hazai rezisztencia viszonyok mellett a legtöbb esetben megfelelő antíbakteriális hatás

várható. Az ampicillin, félszintetikus penicillin (béta-laktám antibiotikum), amely az antibiotikum koncentrációtól, illetve az egyes baktériumfajtától függően baktericid, illetve ampicillin bakteriosztatikus hatást fejt ki. Mint béta-laktám antibiotikum, penicillinkötő fehérjékhez kapcsolódva inaktiválja a baktériumpsejtfal felépítésében szerepet játszó peptidázokat. Szerkezetében, mint aminopenicillin egy szó leírás aminocsoport kapcsolódik a penicillins lapstruktúrához, így néhány Gram-negatív baktérium fehérjeburokkal védett membránján is át tud hatolni. Ezzel hatásspektruma szélesebb, mint a penicilliné. anabolikus a sejtanyagok szintézisében résztvevő enzim anaerob levegőmentes, oxigéntől elzárt , az a reakció amely az intermedier anyagcsere során több anaplerotikus irányban felhasználódó, éppen ezért köznapi szerepet betöltő metabolitok pótlását biztosítja. antheraxanthin astaxanthinnal rokon

karotinoid vegyület antibakteriális baktériumokat egátló vagy elpusztító mikrorganizmusok által termelt kémiai termék, amelyek antibiotikumok képesek gátolni vagy elpusztítani egyéb mikróbákat. Az összes olyan anyag, amely képes megindítani a szervezet antitest termelését vagy sejtes immunválaszát, azaz immunreakciót vált ki a szervezetben. Kóros esetben antigén lehet a szervezet saját anyaga is, például a sejtek felületéhez kötött fehérjék, de a legtöbb antigén testidegen anyag (gyógyszerek, vírus vagy baktériumfehérjék, mérgek stb.) A antigén védőoltások tulajdonképpen szándékosan a szervezetbe juttatott antigének, amelyeknek az a feladata, hogy megtanítsák az immunrendszert az adott antigén elleni reakcióra. Később, amikor az ugyanezzel az antigénnel rendelkező kórokozó behatol a szervezetbe, az immunrendszer képes az azonnali és hatékony fellépésre. antikoaguláns véralvadásgátló Az antimetabolitok olyan

vegyületek, amelyek szinte megszólalásig hasonlítanak a DNS természetes építőköveire, a dezoxinukleozid-trifoszfátokra, bizonyos apró szerkezeti különbségekből adódóan viszont a nukleotidok és/vagy a antimetabolitok DNS szintézisének enzimrendszerét bénítva a sejt pusztulását okozzák. (A nukleotidok vagy nukleozid-trifoszfátok bázist, cukort és foszfátcsoportot tartalmaznak. A nukleozidok foszfátcsoport nélküli nukleotidok.) antimikróbás baktériumellenes Számos természetes antioxidáns, amely bogyós gyümölcsökben, fűfélékben, gyümölcsökben és antioxidativ zöldségekben található, előnyös élelmiszer komponens, amely védi az élelmiszert az öregedéstől és csökkenti az oxidációs károkat az embereknél. antiport-elven Aktív tubularis transzport folyamatok: (szimport és antiport ) antiszeptikumként csíramentesítő a plazmafehérjék gamma globulin csoportjába tartozó antitest fehérjéje, immunglobulin. A kiváltó

antigénjével kapcsolódni szó antituberkulum antraciklinek antrakinonkarbonsavakat antranilsav anyalúg arabinoglukán arabinoxilán arabinóz arachidonsav arundinacea leírás képes tuberkolózis baktéiumokat gátló Az antraciklinek továbbfejlesztésével az epirubicint és az idarubicint a liposomába csomagolt doxorubicin követte (Doxyl, Caelyx). E készítmény nem tekinthetô új citosztatikumnak, de kiszerelése folytán egyenletesebb hatást biztosít. Jelenleg III fázisú vizsgálatok folynak annak megállapítása céljából, hogy vajon toxicitása mérsékeltebb-e, mint az anyavegyületé.A citosztatikumok közül az emlôrák kezelésében ezeket is tekinthetjük az utóbbi évek új, hatékony készítményeinek Az alkaloidokon kívül az anyarozs még egy sor, különböz? szerkezet? hatóanyagot tartalmaz, mint pl. kéntartalmú hisztidinszármazékokat (pl. ergithionein), különleges zsírsavakat, indolditerpéneket, antrakinon-karbonsavakat és

pigmenteket, amelyeket ergochromoknak neveznek Anthranilsav, orto-aminobenzoesav H2N. C6H4 COOH Szintelen édes izű kristálylemezkék. Óvatosan hevítve szállasztható, 145°-on megolvad, erősebb hevítéskor anilinre és szénsavra bomlik. Az iparban az indoxilsav előállítására használják, amelyet indophor néven az indigónyomásnál alkalmaznak. Salétromossav az A -at szalicilsavvá alakjtja Az antranilsavmetileszter-t kellemes illatánál fogva a parfümeriában különféle illatok készítésére használják. olyan oldat, melyből az oldott anyag egy részét bepárologtatás útján kiválasztottuk (kikristályosítottuk). Az A. a kiválasztott anyagra nézve telítve van Ha az eredeti oldatban idegen (pl. szennyező) hemicellulóz, amely, mint a faanyagok alkotórészei fordulnak elő elsősorban puhafák hemicellulóz alkotórésze pektinóz, mézgacoukor, C5H10O5 v. C4H5(OH)4 CHO össszetételű aldopentóz. Keletkezik a cseresznyefából kiszívárgó

gummiból, tov. a tengeri és a bodzabélből, úgyszintén az arab mézgából higított kénsavval. Több telítetlen kötést tartalmazó karbonsav (többszörösen telítetlen zsírsav). Elsősorban a hús és halételek zsíros részében (főleg a vörös húsokban) található esszenciális zsírsav. a >pázsitfüvek családjába tartozó, a >réti csenkeszhez hasonló bojtos gyokerű, szétterülő, bokros növésű szálfű ( >füfélék). Levelei szélesek, nádhoz hasonló tapintatúak Nedves és száraz fekvésben, lúgos és savanyú talajon egyaránt megél. Tűri a tiprást, bőven terem Hátránya, hogy szó astaxanthin aszpartokináz autoklávok auxotrófia leírás elvénülten az állatok nem szívesen eszik meg. Trágyázással, legeltetéssel értéke növelhető. Főkeverékek hasznos eleme ( >gyep) Az Astaxanthin antioxidáns hatása 100-500-szorosa az E vitaminénak.Az Astaxanthin a szabadgyökök eltávolításával és megkötésével

csökkenti az allergiás reakciók során felszabaduló káros anyagok felszaporodását a bőrben. Gyulladáscsökkentő, fényvédő, bőr öregedést megelőző hatású. A lizingyártás CoA reguláló enzim az aszpartokináz, ez két alfa és két ß alegységet tartalmaz. Két promóter indukálja az alfa és a 2 ß mRNS szintézisét. A ß-alegységhez köthető a reguláció.A Corynebacterium és Breribacterium törzsekkel fermentálnak. Ezen törzseknek a bioszintézis útvonala és regulációk ismertek. Lizinfermentációhoz Hom- illetve Homleaky, Met-, Thr- auxotróf törzseket alkalmaznak, amik AECr (5(2amino-etil)-L-cisztein)) rezisztens törzsek, illetve még regulációs mutánsok. Lizint lehet még termelni Candida periculosa, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycosis lipolytica fajokkal, ezek nagy előnye, hogy intracelluláris lizint termelnek. Alkalmasak minden - a mikrobiológiai laboratóriumban előforduló gőzsterilizálási feladat elvégzésére. A

készülékcsalád két fő csoportra osztható: szabadon álló (vertikális) és asztali autoklávok. Működtetésük szerint az autoklávok lehetnek félautomatikus (ML, MLV), vagy teljesen automatikus (ELV, EL, V és D) működésűek. Ez utóbbi csoport azonban tovább bontható elektromos fűtésű (ELV, EL) és beépített gőzgenerátoros készülékekre. Auxotrófiának nevezzük azt a jelenséget, amikor egy élőlény, a növekedéséhez szükséges egyik szerves vegyületet (pl. aminosavat, bázist, vitamint) nem tudja előállítani. Auxotróf az az élőlény, amelyik esetében ez a jelenség megfigyelhető. Az auxotrófia a prototrófia ellentéte.A genetikában akkor nevezünk egy törzser autotrófnak, ha olyan mutációt hordoz, mely lehetetlenné teszi egy életfontosságú vegyület szintézisét. Például az a mutáns élesztő típus, amelyiknél az uracil szintézis útjai inaktív, uracil auxotróf. Ez a típus képtelen uracil előállítására, és csak

akkor képes növekedni, ha a környezetében uracil található. Ez az uracil prototróf ellentéte, ami a normális (vad) törzset jelenti, amely képes uracil nélkül is növekedni. Az auxotróf genetikai markereket gyakran használják a a molekuláris genetikában.Kutatók például az E. coli baktériumnak egy bizonyos aminosavra auxotróf változatát használták arra, hogy fehérjékbe az szó bacillopeptidázok baktériumtörzset leírás aminosavhoz hasonló, de természetesen nem előforduló aminoavat építsenek be. Például a fenilalanin auxotróf sejteket a fenilalaninhoz hasonló para-azido fenilalaninnal kiegészített táptalajon lehet növeszteni. Az aminoacil rRNS szintetáz felismeri ezt a hasonló molekulát, és beépíti a természetestől eltérő aminosavat a polipeptid láncba a transzláció során. Az élő szervezetbe kerülő fehérjék a citoplazmában először proteázok (peptidázok) segítségével aminosavakká hidrolizálódnak. Az

exo-peptidázok közül az aminopeptidázok a hidrolízist az N-terminálison kezdik, a Cterminálist a karboxi-peptidázok hasítják A karboxipeptidáz-B a láncvégi bázisos aminosavakat (Lys, Arg) hasítja le, a karboxi-peptidáz-A mindegyik láncvégi aminosavat lehasítja, kivéve a bázisos oldalláncúakat. Az endo-peptidázok meghatározott aminosavak közötti peptidkötéseket hidrolizálnak. Az emberiség évezredek óta használja a baktériumokat (az élesztőkkel és penészgombákkal együtt) olyan alapvető élelmiszerek készítésére, mint a bor, sajtok, savanyúság, ecet, szójaszósz, savanyú káposzta vagy joghurt.Figyelemreméltó a baktériumoknak azon képessége, ahogy szerves anyagokat képesek lebontani. Emiatt az iparban hulladékfeldolgozásra, szennyvíztisztításra hasznosítják őket, de speciális szerves alapanyagú üveget is kristályosíttatnak baktériumokkal. A kőolajban levő szénhidrogéneket lebontó baktériumokat olajfoltok

megszüntetésére használják.[120] Sikeresen alkalmazták ezt a módszert az 1989-es Exxon Valdez-i olajszennyezésnél is, amikor műtrágyát szórtak ki a Prince William öbölben, hogy elősegítsék a természetesen is jelenlevő baktériumok szaporodását. Ipari szennyezőanyagok lebontására is használnak baktériumokat.[121] A vegyiparban gyógyszerek és mezőgazdasági termékek előállításában szintén baktériumok működnek közre.[122]A biológiai védekezés során a növényvédőszerek helyett is használhatóak baktériumok. Leggyakrabban a Bacillus thuringiensis nevű Gram-pozitív talajlakó baktérium valamelyik alfaja jut szerephez, mivel ezek a Lepidoptera rendre (lepkék, molyok) specifikus rovarirtók .[123] Mivel az emberre, az élővilágra és a hasznos rovarokra kicsi vagy semmilyen káros hatással nincsenek, környezetbarát rovarirtónak tekinthetőek.A gyors növekedésük és a könnyű manipulálhatóságuk miatt a baktériumok a

molekuláris biológia, a genetika és a biokémia igáslovai . A bakteriális DNS módosításával, és az ennek eredményeként megváltozó szó leírás fenotípus tanulmányozásával a tudósok képesek a gének, enzimek funkcióját és az anyagcsere útjait meghatározni, és ezeket az eredményeket a magasabb rendű szervezetekre is alkalmazni. A biotechnológiában a bakteriális anyagcsere és genetika megértése teszi lehetővé, hogy olyan módosított baktériumokat állítsanak elő, melyek terápiás célból képesek inzulin, növekedési faktorok vagy antitestek előállítására.[ basiliximab terápiás monoklonális antitest készítmény A batch- fermentáció a folyadék fermentációk szakaszos batch üzemmódja. A batch tenyészetekben a mikrobák szaporodásában négy fázist lehet megkülönböztetni Saccharomyces bayanus törzs képes ipari mennyiségű bayanus almasav termelésére beef-extract húskivonat, mikrobiológiai alaptáptalaj A bendő

mikroorganizmusainak fő tömegét a baktériumok bendőbaktériumok adják, amelyekből 109-1011 db sejt van a bendőtartalom minden grammjában. A bendőbeli szénhidrátemésztés, amely pH5,5 és 7,0 között a legaktívabb.A baktériumok növényi felülethez tapadása több lépésben jön létre. A baktériumok először nem specifikus, később specifikus adhézió útján kapcsolódnak a növényi rostok felületéhez, majd elszaporodnak a felületen. A bendőfermentáció baktériumok felületi tapadását befolyásolja a baktériumok kora, a sejtfal állapota, a hőmérséklet, a pH, kationk és oldható szénhidrátok jelenléte. A bendőbaktériumok teljes felületi adhéziója kb. 30 percet vesz igénybe, 55 és 7 pH között a legintenzívebb, elengedhetetlen hozzá Ca, Mg és Na ionok jelenléte bendőfolyadék Kérődző állatok bendőtartalma A mikrobiológiában a a baktériumtörzsek mutagén kezelést besugárzás leggyakrabban UV besugárzással hajtják végre,

de lehet gamma vagy röntgen sugárzással isa végezni. a fiatal ->cukorrépalevélben, a ->melaszban levő, az egyik betain fehérjeképző ->aminosavból, a glicinből keletkező vegyület, amely az állati szervezet növekedését serkenti. Brikettnek nevezzük a 40 mm vagy ennél nagyobb átmérőjű kör, négyszög, sokszög, vagy egyéb profilú tömörítvényeket, melyeket mező- és erdőgazdasági melléktermékekből állítanak elő. Brikettet hidraulikus, dugattyús és csigás biobrikett préseken gyártanak. Legjellemzőbb általános tulajdonságai: természetes alapanyagokból (faporok, faforgács, faapríték, energianád, energiafű, mezőés erdőgazdasági melléktermék) készül - idegen kötőanyagot nem tartalmaz nedvességtartalma kicsi (10% körüli), ezért könnyebben és szó bioetanol biogáz biomassza biotin blake blakeslea bleomicin leírás jobb hatásfokkal ég, mint a hagyományos tűzifa - fűtőértéke nagy, kétszerese az

átlagos tűzifának kb. 17-19MJ/kg hamutartalma kicsi (07-1,5%), hamuja környezetbarát, a kiskertek trágyázásához alkalmazható - a fában kén gyakorlatilag nincs, ezért füstje a környezetre káros kéndioxidot nem tartalmaz - a tűzifával szemben 2-3 szor nagyobb sűrűségű, és mintegy 50%-kal nagyobb fűtőértékű, ezért ugyanolyan fűtőhatás eléréséhez a tüzelőberendezés tűzterében kisebb mennyiséget kell elégetni. - nagy sűrűségű (1000-1400 kg / m3), vízben elsüllyed. A bioetanol gyártásának alapanyaga általában vagy magas cukortartalmú növény (pl. cukorrépa, cukornád) vagy olyan anyagot tartalmazó növény, melyet kémiai-biológiai reakciók sorozatával cukorrá lehet alakítani (pl. keményítőtartalmú növények: kukorica, búza, burgonya stb., vagy cellulóz tartalmú növények: fa, fűfélék, gabonaszárak, szalma). A biogáz szerves anyagok baktériumok által anaerob körülmények között történő lebontása során

képződő termék. Körülelül 45-70% metánt (CH4), 30-55% szén-dioxidot (CO2), nitrogént (N2), hidrogént (H2), kénhidrogént (H2S) és egyéb maradványgázokat tartalmaz. "Biomassza: biológiai eredet? szervesanyag-tömeg, egy biocönózisban vagy biomban, a szárazföldön és vízben található él? és nemrég elhalt szervezetek (növények, állatok, mikroorganizmusok) testtömege A biotin (H-vitamin) kéntartalmú vitamin, négy karboxiláló enzim koenzime. A zsírsavak előállításában, a szénhidrátfelhasználásban, aminosavanyagcserében lényeges. A biotin jelenlegi ismereteink szerint a DNS replikációban és a transzkripcióban is részt vesz. Vízoldékony, nem hőérzékeny vitamin. Szabad és kötött formában lehet jelen ételeinkben. A nyers tojásfehérje avidin glikoproteinje meggátolja a felszívódást, hiánytüneteket hozhat létre. Az avidin ellenáll a fehérjebontó enzimeknek, csak a denaturálás (így főzés) után emésztjük meg.

fonalas gombák spóráinak nagy tömegű előáálítására szolgáló hőálló üvegpalack, amelyben agartáptalajon szaporítják,majd spóráztatják a gombatörzseket. Béta karotin termelő fonalas gomba A Streptomyces verticillus fermentlevében előforduló citosztatikus hatású glikopeptid keverékben a hexózok és a peptidszerkezetű alapváz, a bleomycin sav minden esetben azonos. Eltérést csak a savamid oldallánc szerkezetében észlelhető. Az A 2 variánsban 3-amino-propil- szó leírás dimetilszulfonium oldalláncot, a B2 komponensben pedig guani-dino-butilamin oldalláncot találunk. A gyógyszerként forgalmazott készítmény 50-60% A 2 komponenst és 25-32% B 2 kompo-nenst tartalmaz. A cukorrész diszacharid, 2-O-(3O-karbamoil-?-D-mannozil)-L-glükóz A peptidlánc felépítésében a természetes aminosavakon kívül (L-szerin, Laszparaginsav, L-treonin, L-?-alanin, L-cisztein) néhány különleges aminosav is részt vesz, például

L-eritro-?-hidroxihisztidin, 4-amino-3-hidroxi-2-metil-valeriánsav és a 2-metil2-karbimino-alanin. A különleges aminosavak jelenléte nehezíti a proteolitikus enzimek hidrolitikus hatását. A láncvégi savamid hidrolízise azonban zavartalanul folyhat. Ez a hidrolízis (bleomicin hidroláz) inaktiválja az antibiotikumot. A rákellenes gyógyszerként forgalmazott antibiotikum rézII-komplexe ellenáll a bleomicin-hidroláz inaktíváló hatásának. A bleomycinnek ilyen hatása nem jelentkezik, mert a lépben és a limfoid szövetekben viszonylag gyorsan lebomlik. botryococcus Botryococcus braaunii olajtermelő alga Az oligonukleotidok 20-30 bázispárból álló DNS-darabkák, bázissorrend melyek bázissorrendje komplementer a megsokszorozandó DNS-szakasz végén lévő bázissorrenddel. bélflóra bélbaktériumok közössége többféle van, szubsztrát specifitásuk, affinitásuk, kinetikai jellemzőik eltérőek. A közös bennük, hogy a hatásért felelős béta

laktám gyűrűt bontják. Az egyes béta laktám béta-laktamázokkal antibiotikumok ellenállása a különféle béta laktamázokkal eltérő. Pl az imipenem jól ellenáll a legtöbb béta laktamáznak, az ampicillin nem. mikroszkópos számlálókamra, melynek segítségével bürker meghatározható a milliterenkénti sejtszám élesztőgomba, amelyek egy csoportja felelős az emberi candida gombás betegségek előfordulásáért carboximetilkristályos cellulóz, a celluláz enzimek szubsztrátja cellulóz enzimmérésnél A cellulázok elsődleges funkciója a cellulóz béta-1,4glikozidos kötéseinek hidrolízise. Szubsztrát specifitásuk szerint három féle aktivitást mutatnak: endo-b-glükanáz (a glükán láncban random hasítja a glükozidos kötéseket), cellobiohidroláz cellobiohidroláz (cellobióz dimereket hasít le a láncvégekről), b-glükozidáz (a cellobiózt glükózzá hasítja). A teljes aktivitás az egyedi aktivitások egymást erősítő

hatásából (szinergizmus) áll össze. celluláz A cellulázok elsődleges funkciója a cellulóz béta-1,4- szó certoklávok citokinek citoplazma citosztatikum citromsav-ciklus citrát-kör claviceps csírátlanított cukoralkoholok cukorcirok curdlán d-lizergsav daclizumab daunomicin deamináz leírás glikozidos kötéseinek hidrolízise. Szubsztrát specifitásuk szerint három féle aktivitást mutatnak: endo-b-glükanáz (a glükán láncban random hasítja a glükozidos kötéseket), cellobiohidroláz (cellobióz dimereket hasít le a láncvégekről), b-glükozidáz (a cellobiózt glükózzá hasítja). A teljes aktivitás az egyedi aktivitások egymást erősítő hatásából (szinergizmus) áll össze. kisméretű autokláv, kémcsövek, lombikok sterilezésére alkalmas "Citokinek - az immunrendszer sejtjei által (de más sejtek által is) termelt, nem ellenanyag-természetű molekulák, melyek az adott citokint termelő vagy más sejt membránján

lévő receptorhoz kötődve fejtik ki hatásukat. Számos citokin az ""immunrendszer hormonjának"" tekinthető." - a sejtmembránon belüli anyag, amely a sejtmagot veszi körül. Citosztatikus/kemoterápiás gyógyszer. Kifejezetten a gyorsan növekvő és sűrűn osztódó sejteket veszi célba (pontosan ilyenek a daganatos sejtek), ezeket pusztítja el. "Az egyik legelemibb biokémiai folyamat. Biokémiai reakciók sorozata a biológiai rendszerekben, amely nagy energiaadagok felszabadulásához vezet. A szénhidrátok, zsírok és fehérjék oxidálásának utolsó fázisa. lásd citromsavciklus Claviceps purpurea az anyarozs gomba és baktériummentesített Cukoralkoholok: mono- és diszacharidok redukált termékei glükóz >szorbit, mannóz > mannit, laktóz > laktitol, xilóz > xilit (édesítőszer A cukorcirok nagy zöldtömeget terem, szára lédús és a lé nem kristályosítható cukrot tartalmaz, ezért a cukorcirok silózásra

kiválóan alkalmas takarmánynövény. De termeszthetô magnak is, mert szemtermése értékes abraktakarmány. lásd Alcaligenes Az LSD-t lizergsav-amidból állítják elő, melyet a Claviceps purpurea és a Claviceps paspali gombából vonnak ki. terápiás monoklonális antitest készítmény citosztatikum Alloszterikusnak azt a gátlástípust nevezzük, amikor a gátlószer az összetett enzimmolekula más alegységéhez kötődik, mint a szubsztrát. Az előbbi az enzimmolekula alloszterikus alegységéhez, míg az utóbbi a katalitikus alegységéhez (az aktív helyhez) illeszkedik. A gátlószer szó defektesek deszaturáció dezoxiadenozilkobalamin dha dimetilszulfoxid elimoklavin elisa leírás kapcsolódásakor úgy módosul az aktív hely térbeli szerkezete, hogy a szubsztrát képtelen kötődni hozzá. Ennek a gátlástípusnak sajátos formája a termék általi feedback (visszacsatolásos) gátlás, amikor is a szubsztrátból létrejövő termék gátolja az

enzim működését. Erre a treonin-deamináz enzimet szokták példaként említeni, amely a treonin nevű aminosavból izoleucin nevű aminosavat hoz létre, s az gátolja az enzimet. enzimműködésükben hiányos törzsek zsírsavak telítetlenítése, B 12 vitamin, a szukcinil koenzim A képződéséhez elengedhetetlen lásd dokoza-hexaénsav DMSO, mutagén ágens, de setek fagyasztásánál krioprotektív anyagként is felhasználják anyarozs alkaloidja Az ELISA mozaikszó, a vizsgálat angol elnevezésének kezdőbetűiből tevődik össze (Enzyme-linked immunosorbent assay, enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálat). Avrameas (1969) alkalmazta először növényvírusok kimutatására.Az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA) olyan, szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol a reagensek műanyag felülethez vannak kötve, és a reakciót enzimmel kapcsolt antitest segítségével követjük nyomon. Mivel az ELISA-módszer igen érzékeny és a reagenseket

gazdaságosan lehet tömegvizsgálatokra felhasználni, az ELISA a precipitációs és az immunodiffúziós tesztek helyébe lépett, és a növényvírusok diagnosztizálásában a legnépszerűbb szerológiai módszerré vált (Clark és BarJoseph, 1984). Direkt és indirekt ELISA-eljárásokat különböztetünk meg. A direkt eljárásnál az enzimet az antitesthez kapcsolják, míg az indirekt eljárásnál az enzim olyan molekulához kapcsolódik, amely az IgG-t felismeri. Mindkét csoporton belül többféle változat lehetséges (82A F ábra). Az antitest enzimmel történő konjugálása csökkenti az antitest affinitását, ezért az enzimmel konjugált antitest nem mutat olyan erős reakciót a rokon vírus szerotípusokkal, mint a konjugálatlan antitest. A direkt eljárás (pl. DAS ELISA, vagy kettősszendvics-módszer ) igen specifikus, pontos és érzékeny módszer. Fél nanogramm vírus is kimutatható vele. Az indirekt módszer, ahol az enzim nem az antitesthez

kötődik, nem annyira specifikus. A konjugált antitest specifikusabb a homológ szerotípusokkal szemben. szó ellenanyagok elongációs elymoclavin előanyagok, prekurzorok leírás lásd antitestek lánchosszabbító lizergsav származék a fermentációban a termelni kívánt aktív hatóanyagok előanyagai,melyeket a fermentléhez adagolnak a fermentor táptalajokat előfőzéssel készítik elő a előfőzéssel mikrobiológiai munkára fcs Fetal calf serum fleming Alexander Fleming az antibiotikum felfedezője rpm=rotary per minute, centrifugák és rázógépek fordulat/perc fordulatszámának mértékegysége. A rázatott lombikok falán a percenkénti 300-450-es rázatási fordulat miatt (r.pm rotary per minute) folyadékfilm alakul gázcsere ki, amelyben a gyors gázcsere lehetővé teszi a mikroszervezetek intenzív légzését. A fermentáció során igen fontos a jó oxigénellátás biztosítása. tuberkolózis tüdő gümőkór utex amerikai törzskatalógus,

texaszi xantofillok algák gyakori pigmentanyagai a fanyagok és növényi szár a cellulóz mellett az egyik xilán legfontosabb építő poliszacharidja xilóz az arabinoxilánok építő alapköve xylanáz xilánokat bontó enzim a többszörösen telítetlen esszenciális zsírok telítetlen kötései zsírsav-deszaturáz deszaturáz enzimek segítségével keletkeznek az utóbbi évek kutatásai kimutatták, hogy Zymomonas mobilis baktérium oltóanyag használatával szintén lehet hexózból etanolt előállítani. Ez utóbbi számos előnnyel rendelkezik az élesztővel szemben. Ilyen a már megtermelt zymomonas etanollal szembeni feed-back gátlás elmaradása, ami a baktérium tenyészeteiben sokkal kisebb mértékű, így a technológiai folyamat során még sokkal intenzívebben tud működni, mint az élesztő, ami a gátlás hatására már nem tud megfelelő mennyiségű etanolt termelni. egysejtű vagy többsejtű eukarióta vizi fotoszintetizáló zöldmoszatok

szervezetek 7.1 táblázat - Szószedet