Medical knowledge | Biophysics » Vereb György - Geometriai optika, mikroszkópia

Geometriai optika, mikroszkópia Transzmissziós mikroszkópia Fluoreszcenciás mikroszkópia Lézerpásztázó /konfokális/ mikroszkópia (Speciális és nagyfeloldású mikroszkópiák) Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Melyik az igazi? Vereb György – Mikroszkópia, 2004 A GEOMETRIAI OPTIKA ALAPJAI Snellius - Descartes sin i nab = sin r Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Vékony gyujtolencsék képalkotása 1 1 1 = + f k t 1 D (dioptria) = f 1 1 1  = ( n − 1)  +  f R R  1 2 Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Vastag gyujtolencsék képalkotása  1 1 1  ( n − 1) 2 d = ( n − 1)  + +  f R2  n R1 R2  R1 Vereb György – Mikroszkópia, 2004 LENCSEHIBÁK • Monokromatikus Aberrációk – Gömbi eltérés (szférikus aberráció) – Kóma (üstökös hiba) – Asztigmatizmus – Képmezogörbület – Torzítás • Kromatikus Aberráció – Longitudinális kromatikus aberráció – Laterális

kromatikus aberrációk Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Gömbi eltérés •Tengellyel párhuzamos fénysugarak •Minél távolabb van a sugár a tengelytol, annál közelebb esik a képe a lencséhez Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Kóma •Az objektum távol van az optikai tengelytol •A sugárnyaláb nyílása nagy •A pont képe üstökös-csóvára hasonlít Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Kóma Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Asztigmatizmus •A szimmetrikus objektum távol van az optikai tengelytol •A fénysugarak nyílásszöge kicsi •A tárgy képe – az ernyo helyétol függoen – tangenciálisan vagy szaggitálisan megnyúlik •Ha a gömbi lencse vertikális és függoleges fókusztávolsága nem azonos, az optikai tengellyel párhuzamos sugárnyaláb esetén is asztigmatizmus jön létre. Általános esete, mikor a legrövidebb és leghosszabb fókuszú tengely tetszoleges, de nem 0 fokos szöget zár be. Vereb György

– Mikroszkópia, 2004 Asztigmatizmus Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Képmezogörbület •Az asztigmatizmussal összefüggo jelenség •Nagyobb méretu sík tárgy kép nem sík, hanem görbe felület mentén keletkezik •Minél távolabb van a tárgypont a tengelytol, annál távolabb esik a képe az ideális (Gauss-féle) képsíktól Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Torzítás •Nem a kép élességére vonatkozó hiba •A nagyítás nem azonos a széleken és középen Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Kromatikus aberráció diszperzió •A fénysugár elhajlik •A fénytörés hullámhossz függo •A vörös fény hajlik el legkevésbé, az ultraibolya a legjobban •A fehér fényt alkotó színek elválnak (diszperzió) Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Longitudinális kromatikus aberráció Longitudinális színkép Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Laterális kromatikus aberráció Vereb György –

Mikroszkópia, 2004 Képalkotás a hagyományos fénymikroszkópban összetett mikroszkóp objektív és okulár nagyított, fordított, látszólagos kép F1 2F1 F2 2F1 Nagyítás: az egyes optikák nagyításának szorzata Ni= K / T = k / t Felbontás határa: d=0.61 λ / NA (NA=n sinφ) Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Képalkotási módok I. Teljes látótér Megvilágítás: teljes látótér (Köhler optika) Detektálás: szemmel, fényképezogéppel, elektronikus kamerával II. Pásztázó Megvilágítás: pontszeru (lézer fényforrás) Detektálás: nincs tekintettel a beérkezo foton pontos lokalizációjára a detektor felszínén pl. Fotoelektron sokszorozó (PMT) lavina fotodióda (APD) Pásztázás: tárgyasztal lézer (mozgó tükör) Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Képrögzítés a hagyományos fénymikroszkópban F1 2F1 F2 2F1 Film CCD kamera chip Variációk kontraszt fokozására: sötét látóteres fáziskontraszt polarizációs

Vereb György – Mikroszkópia, 2004 A fluoreszcencia alkalmazása a mikroszkópban kontrasztfokozó hatás •Sötét háttérrel szemben minden foton 100%-os intenzitásnövekedést jelent •A fluoreszcens jelzést tetszoleges megfigyelendo sejtalkotóhoz vagy molekulához kapcsolhatjuk •A legtöbb fluoreszcens jelzés a sejtek számára csekély károsodást jelent, a sejtmuködéssel összeegyeztetheto Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Molekulák in situ detektálása fluoreszcenciával Jelölt antitest, Fab, ScFv (intracelluláris epitóp esetén permeabilizálás) Jelölt molekula vagy antitest mikroinjektálása GFP-fúziós fehérje Vereb György – Mikroszkópia, 2004 A fluoreszcenciás mikroszkóp felépítése megfigyelo szemlencse (okulár) emissziós szuro gerjesztési szuro lámpa dikroikus tükör tárgylencse (objektív) kondenzor lencse minta Vereb György – Mikroszkópia, 2004 LP SZUROK: Dikroikus Sáv (BP = bandpass) Hosszú

átereszto (LP=longpass) Rövid átereszto (SP=shortpass) BP Vereb György – Mikroszkópia, 2004 GAP JUNCTION KOMMUNIKÁCIÓ A172 GLIOBLASZTÓMÁBAN Töltés: karcolás szikével Jelzo anyag: 1 mg/ml Lucifer Yellow Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Kalcium tranziens A172 glioblasztómában FURA-2 fluoreszcens kalcium indikátorral mérve Magas [Ca2+]i Alacsony [Ca2+]i Vereb György – Mikroszkópia, 2004 F340 / F380 *100 90 PDGF 80 ng/ml 50 0 200 400 Ido (s) 600 800 Vereb György – Mikroszkópia, 2004 PÁSZTÁZÁS PMT x y Vereb György – Mikroszkópia, 2004 A konfokális elv PMT x y Pinhole = tuszúrásnyi lyuk Feloldás: konfokális térfogatelem mérete Megszabja: pinhole, NA (,PSF =point spread function) Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Konfokális képek (0.6 µm) konvencionális fluoreszcens kép Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Az LSM 510 felépítése száloptika kollimátorok szurok Okulár Tubus lencse

Monitor dióda Pásztázó egység Pinhole optika AOTF x y Hg lámpa PH LSM pásztázó fej HeNe Laser Mikroszkóp Axiovert 200 HeNe Laser PMT 1 Minta Ar-/ArKr Laser PMT 2 Objektív META Spectral PMT Vagy PMT4 PMT 3 szurováltó Lézer modul Lézer modul UV tartomány Látható (VIS) Ar vagy Ti-Sa tartomány 488/514, 543, 633 PH = pinhole AOTF = akuszto optikai hangolható szuro Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Az LSM 510 Axiovert 200M-en Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Cy3 – α-MHCI Cy5 – α-Tac Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) Fluoreszcencia ingadozás 0,3 µm F (t ) t Femtoliteres (konfokális) térfogat 1,5 µm G (τ ) Autokorrelációs függvény G(τ ) = δF ( t ) ⋅ δF ( t + τ ) F 2 δF ( t ) = F ( t ) − F τ 1 1 1 G(τ ) = ⋅ τ ⋅ N

1 + τ D 1+ S 2τ⋅τ G(0) = 1 N D Vereb György – Mikroszkópia, 2004 2 Foton mikroszkópia • A 2 foton egyideju elnyelése a 2 foton együttes energiájával történo gerjesztést eredményezheti • pl. két 750 nm-es vörös foton elnyelése egy 375 nm-es UV foton elnyeléséhez hasonló hatást vált ki Feltételek • p(2 foton abs együtt) = p(foton abs) * p(foton abs) • /független események/ • p(foton abs) ~ Fluxus • Nagy energia suruségu laser gerjesztés (impulzus jobb) Vereb György – Mikroszkópia, 2004 2 lis diá Ra 0 ág ols táv m) (µ -2 0 lság o v á t s i l á i -3 Ax Energia ^ 2 Energia 3 ) m (µ Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Sugárosztó Ti-Zafír fs lézer AOM X/Y Argon ion lézer Synthesizer A blende PM T AMP Synthesizer B 10 MHz Szinkronjel generátor minta PMT Computer Z mozgató Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Vereb György – Mikroszkópia, 2004 TPLSM Kromoszóma Pollenszem Stefan W.

Hell felvételei Vereb György – Mikroszkópia, 2004 4 π konfokális mikroszkópia d=0.61 λ / NA NA növelése javítja a feloldóképességet, csökken a megfigyelt térfogatelem Detektor Minta Vereb György – Mikroszkópia, 2004 4 π konfokális mikroszkópia A térfogatelem alakulása Konfokális 4pi Konfokális Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Aktin filamentumok konfokális és dekonvolvált 4 pi konfokális képen Stefan W. Hell felvételei Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Konfokális θ (theta) mikroszkópia Megvilágított térfogatelem Detektált térfogatelem Vereb György – Mikroszkópia, 2004 Hogyan lesz a konfokális térfogatelembol kisebb a Teta mikroszkópiában? Vereb György – Mikroszkópia, 2004