Medical knowledge | Higher education » Balla Bernadett - A csontanyagcsere többszintű molekuláris biológiai vizsgálata

A csontanyagcsere többszintű molekuláris biológiai vizsgálata Doktori értekezés Balla Bernadett Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Takács István egyetemi docens Hivatalos bírálók: Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Cseh Károly tanszékvezető egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kiss Csaba főorvos Dr. Szücs Nikolette egyetemi tanársegéd Budapest 2010 TARTALOM 1. Rövidítések jegyzéke 5 2. Bevezetés 8 2.1 A csontszövet élettana, a remodelling folyamata és szabályozása 8 2.2 A csont homeosztázisának megváltozása, anyagcsere-csontbetegségek kialakulása 12 2.21 A csontritkulás patogenezise, epidemiológiája és jellemzői 12 2.22 Genetikai tényezők a primer, korral járó csontvesztésben 14 2.23 A csontanyagcsere mechanizmusok módosulását befolyásoló gének változása a menopausát követően 15 2.3 Rendszerbiológiai szemlélet a csontmetabolizmus és az osteoporosis

kutatásában 2.31 A rendszerbiológia (Systems Biology) 17 17 2.32 Különböző rendszerbiológiai szintek az osteoporosis és a postmenopausás csontvesztés vizsgálatában 17 2.4 A szarvas, mint újfajta kísérleti állatmodell a metabolikus csontbetegségek szolgálatában 19 2.5 Az osteoporosis és a postmenopausás csontvesztés immunológiai vonatkozásai – osteoimmunológia 20 3. Célkitűzések 22 I. Különböző metabolikus csontbetegekből izolált humán csontszövet minták komplex transzkriptomikai profil meghatározása 23 II. A csontritkulás genomikai szintű elemzésének elvégzése 23 III. A csontritkulás és a menopausa hatása a humán csontszövet in vivo transzkripciós mintázatára - immunológiai szempontú megközelítés 24 4. Anyagok és módszerek 27 4.1 A transzkriptomikai analízisek vizsgálati csoportjai 27 4.11 Postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus nők vizsgálati csoportja 27 4.12 Post- és

premenopausás nem osteoporoticus nők vizsgálati csoportja 28 4.2 Az SNP analízisek vizsgálati csoportja 29 4.3 Denzitometria 30 4.4 Humán csontszövet minták izolálása 30 4.5 Direkt messengerRNS szeparálás csontból 31 4.6 DNS szeparálás perifériás vérből 31 4.7 A vizsgált gének kiválasztása transzkriptomikai analízisekhez 32 2 4.8 Kvantitatív valós idejű RT-PCR és a vizsgálati csoportok statisztikai összehasonlítása 32 4.9 Gének és SNP-k kiválasztása a genomikai analízisekhez, genotipizálás 34 4.10 Többváltozós transzkriptomikai adatelemzések 36 4.101 Diszkriminancia analízis (DFA) 36 4.102 Főkomponens analízis (PCA) 37 4.103 Hierarchikus clusteranalízis (HCL) 37 4.11 A genomikai vizsgálatokhoz felhasznált statisztikai módszerek 38 4.111 Leíró statisztikai módszerek 38 4.112 Elemző statisztikai módszerek 38 5. Eredmények 40 5.1 Postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus nők

csontszöveti génexpressziós mintázatának komplex vizsgálata 40 5.11 A csontszöveti transzkriptom Mann-Whitney U teszt alapú összehasonlítása 40 5.12 Szarvas microarray eredmények validálása humán csontszövetben 46 5.13 A humán csontszövet transzkriptomikai adatainak főkomponens analízise (PCA) 49 5.14 A vizsgált nők csontszöveti génexpressziós mintázatának többváltozós diszkriminancia analízise (DFA) 53 5.15 A szarvasmodell-gének humán csontszöveti kifejeződésének diszkriminancia 55 analízise 5.16 A vizsgált csoportok mRNS expressziós profil meghatározásának hierarchikus clusteranalízise 56 5.2 Post- és premenopausás nem osteoporoticus nők csontszöveti génexpressziós mintázatának vizsgálata 58 5.3 Új génpolimorfizmusok összefüggése a postmenopausás csonttömeggel 62 5.31 A vizsgálatok egyes paramétereit leíró statisztikai analízisek eredményei 62 5.32 Asszociációs vizsgálatok 62 5.4 Immunológiailag

releváns gének expressziós változásainak vizsgálata humán csontszövetben 66 5.41 A génexpressziós adatok összehasonlítása osteoporoticus és nem osteoporoticus nők csontszövetében 70 5.42 A génexpressziós értékek összehasonlítása postmenopausás és premenopausás nők csontszövetében 72 3 6. Megbeszélés 73 6.1 A postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus csont eltérő transzkriptomikai mintázata 73 6.11 Az immunrendszerben szerepet játszó gének expressziós változásainak vizsgálata osteoporoticus humán csontszövetben 76 6.2 A menopausa hatása a csontszövet génexpressziós profiljára postmenopausás vs premenopausás nőkben 78 6.21 Az immunkompetens gének eltérő csontszöveti kifejeződésének azonosítása postmenopausás nőkben 79 6.3 Az osteoporosis genomikai szintű vizsgálata, új kandidáns gének összefüggése a csontdenzitással 80 7. Következtetések 83 8. Összefoglalás 85 9. Summary 86

10. Irodalomjegyzék 87 11. Saját publikációk 101 12. Köszönetnyílvánítás 106 4 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ABI Applied Biosystems ALPL alkalikus foszfatáz AR androgén receptor BGLAP bone gamma-carboxyglutamate protein, osteocalcin BGN biglikán BMD bone mineral density, csontsűrűség BMI body mass index, testtömeg index BMP csont morfogenetikus fehérje BMU basic multicellular unit CASR kalcium szenzor COL1A1 I. típusú kollagén alfa 1 lánc DC dendritikus sejt DCN dekorin DER durva felszínű endoplazmás retikulum DFA diszkriminancia analízis (discriminant function analysis) E2 17béta-ösztradiol ECM extracelluláris mátrix EDTA etilén-diamin-tetraecetsav EGF epidermális növekedési faktor ER ösztrogén receptor ERK extracellular signal-regulated kinase FABP zsírsavkötő fehérje FGF fibroblast növekedési faktor FSH tüszőserkentő hormon GM-CSF granulocita, makrofág kolónia-stimuláló faktor

GR glükokortikoid receptor HCL hierarchikus cluster analízis HRT hormonpótló terápia IFNγ interferon gamma IGF inzulin-szerű növekedési faktor IL interleukin IPA ingenuity pathway analysis LPS lipopoliszacharid 5 MAF minimal allele frequency MAPK mitogénaktivált protein kináz M-CSF makrofág kolónia-stimuláló faktor MGP matrix gamma-carboxyglutamate protein MMP mátrix metalloproteináz NK T sejt natural killer T sejt OB osteoblast OC osteoclast OPG osteoprotegerin OVX ovariectomia P progeszteron PBS phosphate buffered saline PCA főkomponens analízis (principal components analysis) PDGF trombocitákból származó növekedési faktor PICP I. típusú kollagén C-terminális propeptid PINP I. típusú kollagén N-terminális propeptid PPARγ peroxisoma proliferátor aktivált receptor gamma PTH parathormon PTHR parathormon receptor PTHrP parathyroid hormone-related protein RANK receptor activator of nuclear

factor kappa B RANKL receptor activator of nuclear factor kappa B ligand RT reverz transzkripció SNP egypontos nukleotid polimorfizmus SPARC osteonectin TGFβ transzformáló növekedési faktor béta TIMP mátrix metalloproteinázok szöveti inhibitora TLR4, 5 toll-like receptor 4, 5 TNFα tumor necrosis faktor alfa TNFR tumor necrosis faktor receptor TRAP tartarát rezisztens savi foszfatáz TSH thyreoidea stimuláló hormon UTR untranslated region VDR D3-vitamin receptor 6 VEGF vaszkuláris endotheliális növekedési faktor WNT wingless jelátviteli út 7 2. BEVEZETÉS A molekuláris biológia fejlődése nagyban hozzájárult ahhoz, hogy mélyebben megértsük a csontanyagcsere, illetve az anyagcsere-csontbetegségek patomechanizmusát. A genetikai vizsgálatok számos előnnyel járnak a klinikumban, mivel a specifikus génmutációk azonosítása befolyásolhatja a betegek kezelését. Az utóbbi néhány évben nagyszámú kandidáns gént

(CASR, COL1A1, ER, LRP5, PTH, VDR) azonosítottak, amelyek egypontos nukleotid polimorfizmusai és a BMD között szoros összefüggés mutatható ki (1). A genetikai különbségek bizonyítottan befolyásolják a csontanyagcsere-betegségek megjelenését, súlyosságát és hatnak a kezelés eredményére is. A molekuláris genetikai vizsgálatok közül néhány mára már diagnosztikus eszközzé vált a klinikai gyakorlatban. A genetikai eredmények betekintést nyújtanak a patogenezisbe és ezáltal újfajta kezelési módszerek kidolgozását teszik lehetővé. 2.1 A csontszövet élettana, a remodelling folyamata és szabályozása Az emberi test szilárd vázát a különböző típusú csontokból felépülő csontváz alkotja, amely meghatározza az emberi test alakját, ez szolgál a legtöbb izom eredésére, illetve tapadására, végső soron lehetővé teszi a mozgást. A csontszövet a különböző szervek számára védőburkot képez és emellett helyet ad a

vérképzésnek, valamint számos ion fontos raktára (2). A csontszövet sejtekből és sejt közötti állományból áll Jellegzetes sejtjei a csontképző osteoblastok, a belőlük kialakuló osteocyták és a csontbontó osteoclastok. A mezenchymális őssejtekből származó osteoblastok egy sejtmaggal rendelkező (mononucleáris) sejtek. A csontszövet kollagénben gazdag osteoid állományát termelik, ezért fejlett DER-mal és Golgiapparátussal rendelkeznek. Az osteoblastok számos szabályozó és növekedési faktort is szintetizálnak, melyek közül fontosak a csont morfogenetikus proteinek (BMP). Az osteocyta az érett csontban legnagyobb mennyiségben előforduló sejttípus, amely a mineralizálódott csontszövettel körbezárt osteoblastból fejlődik. A csontsejtek neuronhálózatra emlékeztető hosszú nyúlványok segítségével kapcsolatban állnak egymással, közöttük a kommunikáció gap junctionok segítségével valósul meg. Az osteocyták

meghatározzák a csontátépülés helyét, valamint fontos feladatot látnal el a csontra ható mechanikai erők közvetítésében. Az osteoclastok fuzionált, többmagvú (multinucleáris) óriás sejtek, melyek a közös hemopoetikus progenitor sejtekből fejlődnek ki. Lizoszomális enzimek szekréciójával (pl tartarát rezisztens savi foszfatáz, kollagenázok, mátrix metalloproteinázok) és H+-ionok kipumpálásával elősegítik a csont alapállományának lebontását. A csontszövet szerves extracelluláris 8 mátrixának fő alkotórészei a kollagén rostok (elsősorban I. típusú kollagén) és emellett egyéb, nem kollagén típusú molekulák; a proteoglikánok (kondroitin-szulfát, heparin-szulfát, biglikán, dekorin), γ-karboxilált fehérjék (osteocalcin), sejteket összetartó kötőfehérjék (fibronectin, integrinek, osteopontin) és glikoproteinek (osteonectin, alkalikus foszfatáz). A szervetlen állomány Ca2+- és PO42--ionokból álló

hidroxi-apatit kristályok formájában rakódik le a kollagén rostok által létrehozott térhálóban (3). A csontszövet az élet során nemcsak épül, növekszik (modelling), hanem a csúcscsonttömeg elérése után is szakaszosan és folyamatosan átépül (remodelling). Kiegyensúlyozott körülmények között egy év alatt az összcsonttömeg 5-10%-a újul meg. A csontbontás és csontépítés folyamatai egymással szorosan összekapcsolódnak (coupling), fenntartva ezzel a csont anatómiai és strukturális integritását. A remodelling soksejtű elemi egységekben (BMU) zajlik, ahol a nyugalomban lévő csontállomány felszínét borító lapos osteoblast sejtek helyére osteoclastok kúsznak, és proteolítikus enzimeik segítségével megkezdik a csont feloldását (1. ábra) A kialakult reszorpciós üregbe (Howship-lacuna) aktív osteoblastok érkeznek és először szerves alapállománnyal (főként I. típusú kollagénnel) töltik ki azt, majd később ebbe

építik be az ásványi anyagokat. Nyugvó csontfelszín Csontbontás (reszorpciós fázis) Osteoblastok toborzása, aktivációja Csontépítés (formációs fázis) Mineralizáció Átépült csontszövet 1. ábra A csontátépülés, remodelling ciklusa (Mosekilde nyomán (4)) 9 Vázrendszerünkben megközelítőleg 35 millió BMU található, amelyből a szisztémás és lokális szabályozó mechanizmusoknak köszönhetően 3-4 millió aktiválódik évente. A csontanyagcserét szisztémás hormonok is befolyáloják, így a parathormon, az aktív D3vitamin (kalcitriol) a kalcitonin és az FGF23. A parathormon a csontreszorpció egyik fő aktivátora. Hatására nő az érett osteoclastok száma és aktivitása, gyorsul a csontturnover A kalcitriol nélkülözhetetlen a csontrendszer normális növekedéséhez és megfelelő mineralizációjához. Direkt csonthatása kettős, egyrészt a reszorpciót fokozza, másrészt elősegíti az érett osteoblastok

kialakulását és kollagén szintézisét. A kalcitonin csontprotektív hatása az osteoclastok tartós, de reverzibilis bénításán keresztül valósul meg. Az FGF23 a foszfát anyagcserét befolyásolja. Ezen kívül további számos endokrin faktor játszik alapvető szerepet a csontátépülés szabályozásában. A csontvédő tulajdonsággal rendelkező nemi hormonok, amelyek gátolják a csontbontást és hozzájárulnak csontképzés fokozódásához. A pajzsmirigy- és növekedési hormonok, melyek elengedhetetlenek a csont növekedési folyamataiban és ásványanyag-tartalmának megtartásában (3). Végül a csontsejtek által termelt parakrin és autokrin hatású különböző lokális mediátorok is részt vesznek a csontszöveti metabolizmus regulációjában (5) (1. táblázat) 10 1. táblázat A csontanyagcserét szabályozó lokális faktorok Lokális faktorok Hatások Gyulladásos citokinek A csontreszorpciót serkentik, kiváltképp ösztrogén hiány

(IL-6, IL-1, TNFα) esetén. Fokozzák az osteoclastok érését, aktivitását A RANKL, mely az osteoblastok, limfociták és csontvelői sejtek terméke az osteoclastogenezis legerőteljesebb serkentője. Hatását az osteoclastok sejtfelszíni receptorán a RANK/RANKL/OPG rendszer RANK szignálmolekulán keresztül fejti ki. Az OPG egy szolubilis RANKL kötő fehérje, így a csontbontás fiziológiás regulátora. Hatása a RANK-al ellentétes, az osteoclast stimulációt gátolja. Alapvető sejtfunkciókat szabályoznak, mint a növekedés, Növekedési faktorok differenciálódás és proliferáció. Általános anabolikus (IGF, EGF, FGF, PDGF, VEGF) hatással bírnak. Serkentik az osteoblastok osztódását, valamint kollagén és ECM szintézisét. Stimulálja az osteoblastok érését, differenciálódását. Transzformáló növekedési faktor (TGFβ) Fokozza a csontépítést. Szabályozza a csont alapállományának szintézisét és a mátrixbontó proteáz

enzimeket. Gátolja az osteoclastok kialakulását és érését Csontosodást indukálnak és fontos szerepük van az Csont morfogenetikus fehérjék (BMP) osteogenezisben. A legerősebb osteoblast differenciációt előidéző faktorok. Szerepet játszanak a csonttörések gyógyulásban. Prosztaglandinok Kolóniastimuláló faktorok (CSF) Interleukinek (IL-4, IL-11, IL-17) A csontbontás fokozói. Elsősorban az őssejtek osteoclast irányba történő differenciálódását szabályozzák. Az IL-4 mind az osteoblastokra, mind az osteoclastokra nézve gátló hatású. Gátolja a csontreszorpciót Az IL-17 és az IL-11 fokozza az osteoclastogenezist. A felsorolt lokális faktorok közül az egyik legfontosabb a RANK/RANKL/OPG citokin hálózat. Az NF-κB receptor aktivátor molekula liganduma (RANKL) specifikus receptorát, a RANK-ot (NF-κB receptor aktivátor molekula) stimulálva elősegíti az osteoclast képzést, fúziót, differenciációt, aktivációt és

túlélést, ezzel a csontreszorpció, és a csontvesztés irányába hatva (2. ábra) A RANK aktiváció a c-Jun, NF-κB, Akt/PKB útvonalakat is magába foglaló intracelluláris kaszkád beindulásához vezet. Az osteoprotegerin (OPG) RANKL szolubilis, a jelátvitelben szerepet nem játszó receptora, mely a RANK-kal versengve fejti ki hatását. Kiemelt jelentősége van a szöveti RANKL/OPG hányadosnak 11 Amennyiben az OPG szint csökken, vagy a RANKL expresszió megnő, a csontbontás fokozódik, a remodelling egyensúlya reszorpció irányába billen. Ellentétes hatású az OPG termelés megnövekedése, vagy a RANK mennyiségének csökkenése. Osteoblast OPG RANKL Gátlás Stimuláció RANK Osteoclast 2. ábra A RANK/RANKL/OPG rendszer csontsejteket szabályozó hatása (http://www.clinsciorg) A Wingless (WNT) jelátviteli rendszer szintén kulcsfontosságú a csont élettani folyamatainak szabályozásában. A WNT fehérjék fokozzák a közös mesenchymális

őssejtek osteoblast irányú elköteleződését, ezzel szemben gátolják az adipogenesist. Hatásukra nő az alkalikus foszfatáz expresszió, valamint serkentik az osteoblastok differenciálódási és érési folyamatait. Génkiütött (knock out) egér modellekben, amelyekben a WNT jelátviteli kaszkád bizonyos tagjainak vagy a koreceptorainak (LRP5, 6) kifejeződését megszüntették csökkent a csonttömeg az osteoblastok száma, különböző embrionális csontfejlődési rendellenességek jelentek meg, illetve alacsonyabb szérum osteocalcin szinetket mértek (6-8). 2.2 A csont homeosztázisának megváltozása, anyagcsere-csontbetegségek kialakulása 2.21 A csontritkulás patogenezise, epidemiológiája és jellemzői Látszólagos állandóság ellenére a csontszövet folyamatos átépülésben, megújulásban van. Az átépülés két folyamata - a reszorpció és formáció - pontosan szabályozott és 12 egymáshoz szorosan kapcsolt jelenség. Azonban az élet

előrehaladtával illetve más osteoprogén tényezők hatására az egyensúly megbomlik és a csontbontás túlsúlyba kerül. A nagyfokú csontreszorpció mellett a csontépítés elégtelen marad, amely a csont ásványanyagtarlamának egyre nagyobb mértékű megfogyatkozásához és végül a csontritkulás (osteoporosis) kialakulásához vezet (2). A csontritkulás a jelentősen csökkent BMD mellett fokozott csonttörési kockázattal és a csontszerkezet minőségibeli romlásával is jár. Megváltozik a csont mikroarchitekturája, kollagénstruktúrája és gyengül az organikus mátrix mineralizációja (3. ábra) a, b, 3. ábra A saját vizsgálatokban felhasznált a) kontroll, nem osteoporoticus és b) osteoporoticus nőktől származó csontminták scanning elektronmikroszkóppal készített felvételei. A lappangó járványként is emlegetett csontritkulás a fejlett társadalmak egyik legjelentősebb egészségügyi problémája, amely a népesség kb. 10%-át

érinti világszerte Az északi országokban a lakosság számaránya valamivel magasabb, míg dél felé haladva előfordulása csökkenést mutat. Felmérések szerint ma Magyarországon mintegy 600 ezer nő és 300 ezer férfi él osteoporosissal (9). Számos kockázati tényező jelent meg a civilizált életmóddal, amely maga után vonja a népbetegségnek számító csontritkulás tömeges megjelenését. Ezek közé tartozik többek között a mozgásszegény életmód, a kis kalcium bevitel, a D-vitamin hiánya, bizonyos gyógyszerek szedése (szteroidok, pajzsmirigy hormonok, véralvadás gátlók), a stresszes életvitel, a dohányzás és az egyoldalú táplálkozás (2. táblázat) (3, 10). A csontritkulásos gyengült szerkezetű csont már kisebb erőhatásra is töréssel reagál. Az osteoporoticus csonttörések többnyire jellegzetes helyeken jönnek létre, a csigolyatesteken, a csípőtájon (combnyak) és a csuklón. 13 2. táblázat Az osteoporosis és az

osteoporoticus törések kialakulásának rizikófaktorai Genetika faktorok Hormonális okok Életmód Gyógyszerek Nem Etnikai, földrajzi tényezők; kaukázusi vagy ázsiai származás Pozitív családi anamnézis Vékony testalkat, alacsony testtömeg index (BMI) Csúcscsonttömeg Hypogonadizmus Hyperthyreosis Hyperparathyreosis Fokozott glükokortikoid képzés Alkohol- és kávéfogyaztás Dohányzás Mozgászsegény életvitel Csökkent kalcium és D-vitamin bevitel Fokozott fehérjefogyasztás Pszichés státusz Szteroidok (kortikoszteroidok, gyulladás csökkentők, immunszuppresszánsok, nemi hormonok) Pajzsmirigy hormonok Antibiotikumok Diuretikumok Véralvadás gátlók 2.22 Genetikai tényezők a primer, korral járó csontvesztésben A nőkben jelentős csontfogyás a menopausa táján következik be. Ezt követően a csonttömeg tovább fogy, de már lassabban és kisebb mértékben. Az időskori csontvesztés a trabeculáris és a corticalis csontrendszert

egyaránt érinti. Jellegzetes töréstípusa a csípőtáji törések. A senilis osteoporosis kialakulásában az időskori D-vitamin hiány, a vesében leromlott 1α-hidroxiláz aktivitás és a secunder hyperparathyreosis mellett az ösztrogén hiány is jellemző. Az életkorral járó csontritkulás során gyengül az osteoblastok csontképző aktivitása főként a növekedési faktorok (IGF, TGFβ) hiánya következében, és ezzel együtt csökken a csont metabolikus folyamatainak mértéke, sebessége is. Cao és mtsai (11) kimutatták, hogy az osteoblastok csontformáló képessége, valamint az extracelluláris mátrix felépítését és mineralizációját végző kulcsgének (COL1A1, ALPL) kifejeződése egyaránt redukálódik az öregedő, alacsony csontdenzitással rendelkező egerekben. Az osteoporoticus nőkből származó osteoblast prekurzor sejtek kevésbé képesek I. típusú kollagénben gazdag szerves csontállomány kialakítására és fenntartására,

összehasonlítva azonos korcsoportú egészgéges társaikkal (12, 13). Továbbá, a közös csontvelői progenitor sejtek száma és csontképző (osteogenikus) kapacitása jelentősen csökken az időskori csontrikulás során (14, 15). Napjainkban már elfogadott tény, hogy a vázrendszer öregedése a csonttömeg 14 megfogyatkozásához vezet, többek között a fokozott adipogenezis és a zsírszövet akkumulációjának eredményeként (16). Justesen és mtsai (17) a zsírszövet megnövekedett térfogat arányát mutatták ki osteoporoticus paciensek csontvelőmintáiban. A megfigyelt és leírt változások együttesen okozzák a csont ásványi és organikus komponenseinek életkorral összefüggő mennyiségbeli, illetve minőségbeli leromlását (4. ábra) adipocita mezenchymális progenitor sejt nem osteoporotikus osteoporotikus PPARγ ↑ csont adipocita hemopoetikus csontvelő osteoblast ALPL ↓ COL1A1 ↓ 4. ábra: A korral járó csontvesztés celluláris

mechanizmusainak egyszerűsített vázlata 2.23 A csontanyagcsere mechanizmusok módosulását befolyásoló gének változása a menopausát követően A menopausának jelentős hatása van a csontszövet mennyiségének alakulására. A reproduktív életszakaszt követően a csonttömeg hirtelen és gyors fogyását elsősorban a kiteljesedő ösztrogénhiány hozza létre. Az ösztrogén multifunkcionális protektív szerepet tölt be a csontszövet homeosztázisában, valamint a csontsűrűség megtartásában (5. ábra) (18-20) Az ösztrogén hormonok megváltoztatják a csontanyagcserében legfontosabb szerepet betöltő csontsejt specifikus gének transzkripciós aktivitását. E gének közé sorolható a receptor activator of NF-κB (RANK), a receptor activator of NF-κB ligand (RANKL), az osteoprotegerin, a D-vitamin receptor, az alkalikus foszfatáz, növekedési faktorok (IGF1, FGFR, PDGFA, TGFβ1, VEGF), különböző citokinek (IL-1β, IL-6, GM-CSF, TNF), illetve több

kollagén és nem kollagén típusú extracelluláris mátrix alkotó fehérje is (19, 21). 15 Hiányában kialakuló változások igen szerteágazóak és sok részlet a mai napig tisztázatlan. A legfontosabb kórfolyamat azonban az osteoblastok és osteoclastok működési egységének egyensúlymegbomlása, a csontturnover fokozódása, elsősorban az osteoclastokat serkentő gyulladásos citokinek (IL-1, IL-6, TNFα), az M-CSF, és a RANKL megemelkedett expressziójának következtében (18, 22-24). Továbbá, ösztrogén hiányában redukálódik a csontképzést elősegítő növekedési faktorok termelődése, nő az osteoclastok érése, aktivitása, valamint lizoszómális enzimeik (lizozim, katepszin-B, -D) szintézise (3). Mindemellett, a gyulladásos citokinek gátolják az osteoblastok csontépítő funkcióját (25). Számos vizsgálat igazolta, hogy az osteoblastok differenciálódásának és osztódásának mértéke csillapodik, gyengül ösztrogén

jelenlétében, ezzel egészséges csont-remodelling rátát biztosítva (5. ábra) (23). RANKL expresszió gátlása, OPG expresszió fokozása csökkent osteoclastogenezis csökkenti az osteoclastok lizoszómális enzimszekrécióját (lizozim, katepszin B, D) a csontbontó gyulladásos mediátorok (IL-1, IL-6, TNFα) kifejeződésének szuppresszálása stimulálja az anabolikus csontképző TGFβ és IGF1 keletkezését, serkenti a csontformációt ösztrogén anti-apoptotikus hatás osteoblastokon és osteocytákon (hsp 27 szintézis fokozása) befolyásolja az ECM komponensek (ALPL, COL1) transzkripcióját a csontsejt proliferáció és differenciáció szabályozása egyensúlyban tartott remodelling pro-apoptotikus hatás osteoclastokon (elnyújtott ERK foszforiláció) 5. ábra Az ösztrogén csontvédő hatásainak összefoglalása Postmenopausás stádiumban az ösztrogénhiány mellett sok egyéb változás is bekövetkezik a női szervezetben. Nagymértékben

lecsökken az osteoblast sejtek differenciálódását stimuláló és számos gén (osteocalcin, c-jun, c-fos) kifejeződését befolyásoló progeszteron szintje (26-28). Az ovarium funkciók megszűnését követően módosul az activin/inhibin/follistatin rendszer, mely szintén több különböző ponton szabályozza a csontsejtek biológiai folyamatait. Irányítja az osteoid állomány mineralizációját és az ECM komponensek metabolizmusát, egyúttal hatással van néhány osteoblast marker gén (osteonectin, osteopontin, alkalikus foszfatáz, I. típusú kollagén, mátrix metalloproteináz) átíródására (29, 30). 16 A postmenopausás női nemihormon-hiány évente 0.5-2%-os csontvesztést okozhat a trabeculáris és corticális csontokon és 25%-al emeli az osteoporoticus csonttörések kockázatát a klimakteriumban lévő nőkben. 2.3 Rendszerbiológiai szemlélet a csontmetabolizmus és az osteoporosis kutatásában 2.31 A rendszerbiológia (Systems Biology) A

rendszerbiológia a komplex, környezeti és genetikai faktorok együttes közreműködésével kialakuló multifaktoriális betegségek vizsgálatára alkalmas új multidiszciplináris tudományos irányzat. A biológiai rendszer egészét elemzi hierarchikusan egymásra épülő molekuláris szinteken (genomika, transzkriptomika, proteomika, metabolomika, interaktomika) (31, 32). Alkalmas a ’high-throughput’ technológiák (pl: DNS szekvencia analízisek, összetett SNP meghatározások, microarray és real-time PCR vizsgálatok, protein chip módszerekstb) által többféle szinten prezentált hatalmas adattömegek feldolgozására és értelmezésére (33). A klinikai kutatásokban képes egyidejűleg több biokémiai marker, komponens kapcsolatának feltérképezésére. A különböző multiparaméteres betegségek elemzése során azonosított változásokat az egyedi varianciák figyelembe vételével viszonyítja a klinikai adatokhoz, a fiziológiai

funkciókhoz és patológiai folyamatokhoz, illetve a betegség státuszaihoz. Segítségével lehetőség nyílik molekuláris interakciók, szabályozási mechanizmusok és szignalizációs jelátviteli hálózatok létrehozására, és ezáltal a betegségek kórfolyamatainak mélyebb, valamint részletesebb megértésére (31, 34). A rendszerbiológiai szemlélet bevezetésével új markerek azonosíthatók különféle molekuláris genetikai szinteken, továbbá utat nyithat új gyógyszercélpontok megismerése, és biotechnológiai alapú differenciáldiagnosztikai módszerek fejlesztése felé. 2.32 Különböző rendszerbiológiai szintek az osteoporosis és a postmenopausás csontvesztés vizsgálatában Az osteoporosis multifaktoriális komplex megbetegedés. Az osteogenezisben és az osteoporoticus állapot kialakulásában számos környezeti tényező (pl.: fizikai aktivitás, dohányzás, alkoholfogyasztás, étrend) mellett erős genetikai hatás is érvényesül.

Kimutatható továbbá, hogy a BMD, a combnyak geometriája, a trabeculáris és corticális vastagság, a csontanyagcsere különböző biokémiai markerei nagy százalékban genetikai kontroll alatt 17 állnak (10, 35, 36). Az osteoporosis és a csontvesztés patomechanizmusa poligénes eredetű, amelynek hátterében álló genetikai variációk kimutatása bonyolult feladat. A rendszerbiológia segítségével azonban több szinten is gyűjthetünk információt a csontfogyás patogenetikai folyamataival kapcsolatban. Az osteoporosissal összefüggésben leginkább széles körben kutatott rendszerbiológiai terület a genomika szintje, ahol a legtöbb adat az egyedi génpolimorfizmusok és a csontásványanyag-tartalom, illetve csonttörési kockázat kapcsolatából származik. Az egypontos nukleotid polimorfizmusok (SNP) esetében a vizsgálatok egy része funkcionális SNP-ket tanulmányozott, ahol a báziscsere a gén funkciójának (transzkripció, splicingstb)

megváltozását eredményezi és a kódolt mRNS, illetve fehérje mennyiségében vagy minőségében kerül a genetikai hatás kifejeződésre. A genomikai vizsgálatok segítségével számos kandidáns gén elsődleges szerepére derült fény, amelyek befolyásolják a csúcsvalamint a csökkent csonttömeg kialakulását; ezek a kalciotróp hormonok és receptorok génjei (AR, CASR, ER, GR, PTHR, VDR, kalcitonin receptor), a csont szerves mátrixának komponensei (BGLAP, COL1A1, MGP, osteonectin, osteopontin), és lokálisan ható citokineket kódoló gének (BMP4, IGF1, IL-1, IL-6, TNFR, TGFβ, RANKL, OPG) voltak (1, 37-39). Proteomikai elemzések során a szérum fehérje szintek és a BMD közötti asszociációkat térképezték fel. Elsősorban az osteoblastok és osteoclastok sejtanyagcsere termékeinek eltérő szérum szintjét vizsgálták a csonttömeg csökkenés függvényében. Összefüggést találtak a csontszöveti reszorpció (IL-6, TRAP) és formáció (ALPL,

BGLAP, IGF1, TGFβ) markereinek szérum szintjei és az osteoporosis között (40-43). A metabolomika eredményei az osteoporosis vonatkozásában a kollagén képződési és bomlási metabolitjai (PINP, PICP, kollagén keresztkötők), amelyet a mai klinikai diagnosztika rutinszerűen használ a csontanyagcsere laboratóriumi vizsgálatakor (44, 45). A rendszerbiológia transzkriptomikai szintjén napjainkig nem vagy csak nagyon kevés vizsgálat történt. A humán csontszöveti génexpresszióról, illetve annak az osteoporosis során bekövetkező változásáról limitált adat áll rendelkezésre, főleg a gyulladásos citokinek átíródására vonatkozóan (22, 46, 47). Csontszöveti fehérje kifejeződési analízis (csontproteom meghatározás), továbbá SNP kombinációk azonosítása és gén illetve géntermék interakciók felderítése a humán csontrendszerben ezidáig nem történt. Azonban nagyszámú csontsejt specifikus kandidáns gén kifejeződésének

megváltozása kimutatható ösztrogén hormonok jelenlétében in vitro és in vivo sejtkultúrákban. Ezek a transzkriptomikai szintű változások az ALPL, RANK, RANKL, VDR, gyulladásos citokinek, 18 katepszin B, katepszin D, BGLAP, BGN, COL1A1, DCN, SPARC molekulákat kódoló géneket érintik elsősorban (19, 21). 2.4 A szarvas, mint újfajta kísérleti állatmodell a metabolikus csontbetegségek szolgálatában A molekuláris genetikai kutatási gyakorlatban az osteoporosis leginkább preferált és általánosan használt állatmodell szervezetei a rágcsálók, alkalmanként, kutyák, sertések, juhok (48, 49). A közös ezekben a modell rendszerekben, hogy az osteoporosis vizsgálatához a betegség kísérletes előidézésére van szükség, ezzel megbontva a biológiai rendszer egészét. A gímszarvasban (Cervus elaphus) azonban az éveként ismétlődő agancsfejlődés következtében a ciklikus fiziológiás osteoporosis jelensége figyelhető meg (6. ábra)

Május és július között, amikor az agancsfejlődés zajlik 100-120 g új csontszövet képződik naponta, amely az állatvilág legrobosztusabb csontépítését mutatja (50, 51). A szarvas ezt a rövid idő alatt bekövetkező 25-30%-os csonttömeg növekedést nem képes csupán a táplálék bevitellel biztosítani, ezért ásványianyagot szabadít fel a vázcsontozatából, ahol ennek következtében időlegesen osteoporoticus állapot alakul ki. A szarvasokban évenként lezajló ciklikus fiziológiás osteoporosis visszafordítható, élettani folyamat, ahol a csontszövet egészséges denzitását a szervezet képes helyreállítani. A vázelemek teljes regenerációja augusztus környékére fejeződik be (6. ábra) Ezért a gímszarvas, mint újfajta kísérleti állatmodell különösen alkalmas a primer csontvesztés illetve csontritkulás komparatív vizsgálatára. Összehasonlító genetikai elemzések során olyan új géncsoportok és jelátviteli útvonalak

azonosíthatók, amelyek a csontváz regenerációjában valamint csontépítési, képzési folyamatokban fontos szerepet tölthetnek be. 19 Téli nyugalmi időszak Stady-state BMD Bőgés Nov. Dec. Jan. Okt. Febr. Szept. Döhérség Márc. Aug. Júl. Ápr. Jún. Regeneráció Agancs hullatás Máj. Agancsfejlődés Osteoporosis 6. ábra Vázcsontozat sűrűségének változásai az agancsciklus során gímszarvasban (Borsy A. és mtsai nyomán) 2.5 Az osteoporosis és a postmenopusás csontvesztés immunológiai vonatkozásai - osteoimmunológia Mára már közismert, hogy az immunrendszer és a csont molekuláris és sejt szinten is számos ponton funkcionális kapcsolatban áll egymással. A közös csontvelői mikrokörnyezetben sejtalkotóik azonos progenitorokból fejlődnek, átfedő jelátviteli hálózatokat használnak és mindkét rendszer szabályozásában ugyanaz a citokin panel vesz részt (5, 52). Az immunrendszer szinte valamennyi

sejttípusán és a csontsejtekben egyaránt megtalálhatóak a nemi hormonok receptorai (ösztrogén, progeszteron, androgén receptorok) (53, 54). Az osteoimmunológia leginkább kutatott területe a T-limfociták és osteoclastok kölcsönhatása. Az aktivált T sejtek képesek RANKL molekulát kifejezni, amely az osteoclastok RANK receptorán keresztül fokozza az osteoclastogenezist és stimulálja a csontbontást. Menopausa után szignifikánsan fokozódik a gyulladáskeltő mediátorok kifejeződése, amely serkenti az aktivált T-limfociták RANKL expresszióját és ezáltal a csontbontó osteoclastok érését (55). Emellett a T és B sejtek további, az osteoclastok 20 differenciálódását serkentő (gyulladásos citokinek) vagy gátló (IL-4, IL-10, IFNγ, TGFβ) citokineket expresszálnak (52, 55-58). Az osteoblastok szintén interakcióba lépnek az immunrendszer sejtjeivel. Sejtfelszíni MHC II és kostimulátor (CD80, CD86, CD54) molekulák expressziója révén

az antigén prezentáció és a T-limfocita mediált immunválasz folyamatában játszanak fontos szerepet (59-62). Továbbá, az osteoblastok membrán-kötött toll-like receptorai (TLR4, 5) a mikrobiális struktúrák felismerését végzik és szolubilis faktoraik a B-limfociták ellenanyag termelését idézik elő. A felsorolt adatok alapján egyre több szempontból bebizonyosodik, hogy az immunrendszer nagymértékben befolyásolja a csontszövet metabolikus folyamatait. Több tanulmány is bizonyította, hogy számos immunológiai betegség (pl.: gyulladásos bélbetegségek, autoimmun cukorbetegség, allergia, néhány áttétet adó tumor) társul csökkent csonttömeggel (49, 55). A csontritkulás a vázrendszer szisztémás megbetegedése, amely nem elhanyagolható hatással bír a csontszövetben zajló lokális immunológiai reakcióira. Azonban limitált számú irodalmi adat áll rendelkezésre az osteoporosis és a csontvesztés immunológiai aspektusaival

kapcsolatban. Osteoporosisban megváltozik a CD4+ / CD8+ T sejtek aránya, valamint az NK T sejt szubpopuláció emelkedett rátát mutat a csökkent BMD-vel korrelálva. A menopausát követő nemihormon hiány egyaránt befolyásolja a csontszövet és az immunrendszer homeosztatikus folyamatait, megváltoztatva ezzel komplex kölcsönhatásukat. Az intenzív pro-inflammatorikus citokin produkció fontos szerepet játszik - az osteoclastokkal közös hemopoetikus őssejtekből származó - granulociták és monociták számának postmenopausás nőkben ismert emelkedésében (63). Számos citokin szintézise változik ösztrogéndeficiens állapotban, pl: az interleukin-7 és interleukin-2 szekréciója egyformán erősödik, amely a T és B sejt vonalak proliferációját stimulálja, továbbá fokozza az osteoclast differenciációt és a csontvesztést (5, 54). A citokin mintázat eltéréseinek okán a CD4+/Th limfociták számának redukciója, míg ezzel ellentétben a korai

pre-B sejtek expanziója következik be (56, 64). Postmenopausában magasabb interferon gamma (IFNγ) szintet mutattak ki (65, 66), amely kulcsfontosságú szerepet tölt be az aktivált TNF termelő T sejtek arányának kiterjedésében. Állatkísérletekben az ovariectomiát követően nő a T-limfociták aktivációja és élettartama, illetve fokozódik a dendritikus sejtek, makrofágok antigén prezentációja (56, 58, 67-69). 21 3. CÉLKITŰZÉSEK Együttműködés keretein belül a Gödöllői Biotechnológiai Kutatóközpont elkészítette a szarvas ciklikus fiziológiás osteoporosis mRNS expressziós analízisét. A szarvasokon történt microarray vizsgálatok rámutattak számos, szignifikánsan eltérő expressziós profillal rendelkező génre, amelyek többek között szerepet játszanak a lipid körforgalomban (APOD, FABP3, FABP4), az extracelluláris mátrix felépítésében (COL1A1, COL3A1, COL5A2, FN1, MGP, TIMP2, TNC) az osteogenezisben (BMPR2, SOX4, TMSB4X,

TMSB10) és a Wnt szignalizációs kaszkádban (CTNNB1, LRP4, NLK, TCF7L2, WIF1) (7. ábra) 7. ábra Szarvas gének vizsgálata humán ortholog microrarray chipen (40000 gén) A metabolikus csontbetegségek korai, tünetekkel még nem járó felismerése és előre jelzése nem megoldott. A kialakult állapotot a mai gyógykezelés visszafordítani nem tudja, ezért a csontképzési zavar genetikai alapokon történő helyreállítása kulcsfontosságú lehet a betegségek gyógyításában. Ezen felül a csontritkulás rendkívül súlyos következményei a combnyaktörés, vagy a csigolya testek összeroppanása. Ezért célunk volt egy összehasonlító tarnszkriptomikai analízis elkészítése a szarvasokban az agancsfejlődés következtében évenként ismétlődő ciklikus fiziológiás osteoporosis és a humán patológiás osteoporosis vizsgálatával 22 I. Különböző izolált humán csontszövet minták komplex transzkriptomikai profil meghatározása Célunk a

csontanyagcserében az osteogenezisben és a csont homeosztázisában nélkülözhetetlen szerepet játszó, irodalmi adatok (89 gén) és a szarvas eredmények validálása (31 gén) alapján előre kiválogatott kandidáns gének (3. táblázat) csontszöveti teljes mRNS expressziós mintázati rendszerének összehasonlítása különböző vizsgálati csoportokban ABI 7500 kvantitatív valós-idejű RT-PCR rendszerben TaqMan Assay felhasználásával. - A humán csontszövet eltérő génkifejeződési mintázatának azonosítása postmenopausás osteoporosisban szenvedő és nem osteoporoticus nőbetegek csontmintáinak összehasonlító elemzésével. - A menopausát követően fellépő csontszöveti génexpressziós változások komparatív meghatározása premenopausás és postmenopausás korú nem osteoporoticus nőkben. A vizsgálat célja a pattern analízisek mellett olyan egyedi releváns gének meghatározása az expressziós adatok alapján, amelyek

megváltozott kifejeződése szignifikáns összefüggést mutat a korral járó osteoporosis és a csökkent csontdenzitás kialakulásával, illetve multiparaméteres statisztikai adatelemzések segítségével (diszkriminancia analízis, főkomponens analízis, hierarchikus cluster analízis) a betegségek patomechanizmusában érintett funkcionális géncsoportok és szignalizációs jelpályák leválogatása. A transzkriptomikai információk alapján a patológiás és fiziológiás fenotípusok elkülönítése. Genetikai útvonal analízisek segítségével (Ingenuity Pathway Analysis) gén-gén interakciók, RNS szintű regulációs kapcsolatok valamint interaktomikai hálózatok felépítése. II. A csontritkulás genomikai szintű elemzésének elvégzése Célunk a transzkriptomikai kutatások során kapott új kandidáns gének (ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2, TIMP2, OPG, RANKL) egypontos nukleotid polimorfizmusainak feltérképezése 353 magyar postmenopausás nő genetikai

mintájában a Semmelweis Egyetem SNP Core Facility keretein belül. Az SNP asszociációk és kombinációk (haplotípusok) feldolgozását követően olyan egyedi markerek definiálása, amelyek erős statisztikai összefüggést mutatnak a csonttömeg csökkenésével és a csontritkulás kialakulásával. 23 III. A csontritkulás és a menopausa hatása a humán csontszövet in vivo transzkripciós mintázatára - immunológiai szempontú megközelítés Célunk további, a különböző immunológiai mechanizmusok (antigén prezentáció, adaptív immunválasz, komplementrendszer, fagocitózis) szabályozásában szerepet játszó további 27 gén (3. táblázat) eltérő csontszöveti kifejeződésének azonosítása Annak vizsgálata, hogy az osteoporoticus, illetve a menopausa következtében módosult csontszöveti mikrokörnyezetben a csontsejtek megváltozott génexpressziós aktivitása miként befolyásolhatja a lokális immunológiai homeosztázist. Emellett

olyan géncsoportok azonosítása, melyek immunológiai szempontból képesek elkülöníteni a humán csont patológiás és fiziológiás állapotait, valamint különböző menopausás stádiumait. 3. táblázat A vizsgálatokhoz összegyűjtött 147 gén listája ABI Assay ID Gén szimbólumok Gén nevek Hs00356261 m1 Hs99999903 m1 Hs00153836 m1 Hs00155658 m1 Hs00609608 m1 Hs00758162 m1 Hs00167549 m1 Hs00743063 s1 Hs00155794 m1 Hs00171168 m1 Hs00155939 m1 Hs01587813 g1 Hs00156076 m1 Hs00196183 m1 Hs00154192 m1 Hs00609638 m1 Hs00370078 m1 Hs01629138 s1 Hs00236942 m1 Hs00831730 s1 Hs00176148 m1 Hs00381122 m1 Hs00163811 m1 Hs00383718 m1 Hs00173436 m1 Hs02621496 s1 Hs00169627 m1 Hs00374176 m1 Hs00175478 m1 Hs00199349 m1 Hs00176484 m1 Hs00166657 m1 Hs00266273 m1 Hs00189184 m1 Hs00385388 m1 Hs00266332 m1 ACP5 ACTB ACVR1 ACVR2 ALOX15 ALPL ANXA1 ANXA2 APOD APOE ATP2A2 BGLAP BGN BMP1 BMP2 BMP3 BMP4 BMP8A BMP8B BMPR1A BMPR2 C1QA C3 C5AR1 CASR CD14 CD36 CD40 CD80 CD86 CKB COL10A1 COL11A1

COL12A1 COL14A1 COL15A1 acid phosphatase 5, tartrate resistant actin, beta activin A receptor, type I activin A receptor, type II arachidonate 15-lipoxygenase alkaline phosphatase, liver/bone/kidney annexin A1 annexin A2 apolipoprotein D apolipoprotein E ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, slow twitch 2 bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein, osteocalcin biglycan bone morphogenetic protein 1 bone morphogenetic protein 2 bone morphogenetic protein 3 bone morphogenetic protein 4 bone morphogenetic protein 8a bone morphogenetic protein 8b bone morphogenetic protein receptor type IA bone morphogenetic protein receptor, type II complement component 1, q subcomponent, A chain complement component 3 complement component 5a receptor 1 calcium-sensing receptor CD14 molecule CD36 antigen (thrombospondin receptor) CD40 molecule, TNF receptor superfamily member 5 CD80 molecule, B-lymphocyte activation antigen B7-1 CD86 molecule, B-lymphocyte activation antigen B7-2 creatine kinase,

brain collagen, type X, alpha 1 collagen, type XI, alpha 1 collagen type XII alpha 1 collagen, type XIV, alpha 1 collagen type XV alpha 1 24 Hs00164004 m1 Hs00164099 m1 Hs00156568 m1 Hs00164103 m1 Hs00164150 m1 Hs00609088 m1 Hs00169768 m1 Hs00164310 m1 Hs00156680 m1 Hs00171266 m1 Hs00236884 m1 Hs00170025 m1 Hs00166156 m1 Hs00266491 m1 Hs00171962 m1 Hs00154830 m1 Hs00153181 m1 Hs00193306 m1 Hs00186772 m1 Hs00361415 m1 Hs00174860 m1 Hs00230957 m1 Hs00269758 m1 Hs00609791 m1 Hs00181225 m1 Hs00234969 m1 Hs00265254 m1 Hs00266645 m1 Hs00234404 m1 Hs00277509 m1 Hs99999905 m1 Hs00740413 g1 Hs00734212 m1 Hs00164932 m1 Hs00174143 m1 Hs00153126 m1 Hs00181385 m1 Hs00204937 m1 Hs00174086 m1 Hs00168405 m1 Hs00233688 m1 Hs00174106 m1 Hs00174092 m1 Hs00174097 m1 Hs00158057 m1 Hs00173950 m1 Hs00166237 m1 Hs00174131 m1 Hs00174202 m1 Hs00233682 m1 Hs00174103 m1 Hs00171410 m1 Hs00170103 m1 Hs00235006 m1 Hs00158127 m1 Hs00355885 m1 Hs00174217 m1 Hs00164957 m1 Hs00241497 m1 Hs00183100 m1 Hs00391006 m1

Hs00182031 m1 COL1A1 COL1A2 COL2A1 COL3A1 COL4A4 COL5A1 COL5A2 COL7A1 COL9A1 CSF2 CSF3 CTNNB1 CTSK DCN DSPP DUSP9 EGF EGFR EIF3S4 ENO1 / MBP1 ESR1 ESR2 FABP3 FABP4 FASLG FCGR2A FGF1 FGF2 FKBP2 FN1 GAPDH HLA-A HLA-DRB1, -DRB3 ICAM1 IFNG IGF1 IGF1R IGSF4 IL10 IL12A IL12B IL15 IL-1A IL-1B IL-1RAP IL2RG IL4RA IL-6 IL7 IL7RA IL8 INHA INHBA ITGA1 ITGA2 ITGAM ITGAX ITGB2 KITLG KL LPR4 LRP5 collagen, type I, alpha 1 collagen, type I, alpha 2 collagen type II alpha 1 collagen type III alpha 1 collagen, type IV, alpha 4 collagen type V alpha 1 collagen type V alpha 2 collagen, type VII, alpha 1 collagen type IX alpha 1 colony stimulating factor 2 (granulocyte-macrophage) colony stimulating factor 3 (granulocyte) catenin (cadherin-associated protein), beta 1 cathepsin K decorin dentin sialophosphoprotein dual specificity phosphatase 9 epidermal growth factor epidermal growth factor receptor eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 4 delta enolase 1 / C-myc promoter-binding protein

estrogen receptor 1 (ER alpha) estrogen receptor 2 (ER beta) fatty acid binding protein 3, muscle and heart fatty acid binding protein 4, adipocyte Fas ligand, CD95 ligand (TNF superfamily, member 6) Fc fragment of IgG, low affinity IIa, receptor (CD32) fibroblast growth factor 1 (acidic) fibroblast growth factor 2 (basic) FK506 binding protein 2 fibronectin 1 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase major histocompatibility complex, class I, A major histocompatibility complex, class II, DR beta 1, DR beta 3 intercellular adhesion molecule 1 (CD54) interferon, gamma insulin-like growth factor 1 (somatomedin C) insulin-like growth factor 1 receptor Immunoglobulin superfamily member 4 interleukin 10 interleukin 12A (natural killer cell stimulatory factor 1) interleukin 12B (natural killer cell stimulatory factor 2) interleukin 15 interleukin 1, alpha interleukin 1, beta interleukin 1 receptor accessory protein interleukin 2 receptor, gamma interleukin 4 receptor alpha chain interleukin 6

(interferon, beta 2) interleukin 7 interleukin 7 receptor alpha chain interleukin 8, chemokine (C-X-C motif) ligand 8 inhibin, alpha inhibin, beta A integrin, alpha 1 (CD49A) integrin, alpha 2 (CD49B) integrin, alpha M (CD11b, complement component 3 receptor 3 subunit) integrin, alpha X (CD11c, complement component 3 receptor 4 subunit) integrin, beta 2 (CD18, complement component 3 receptor 3 and 4 subunit) c-kit ligand, stem cell factor klotho low density lipoprotein receptor-related protein 4 low density lipoprotein receptor-related protein 5 25 Hs00179899 m1 Hs00233987 m1 Hs00233992 m1 Hs00234422 m1 Hs00233972 m1 Hs00234579 m1 Hs00427183 m1 Hs00751239 s1 Hs00231653 m1 Hs00212076 m1 Hs00273458 m1 Hs00231692 m1 Hs00212206 m1 Hs00428481 m1 Hs00196708 m1 Hs00195432 m1 Hs00183425 m1 Hs00232219 m1 Hs00232068 m1 Hs00228830 m1 Hs00268388 s1 Hs00165814 m1 Hs00541729 m1 Hs00234160 m1 Hs00167093 m1 Hs00181036 m1 Hs00171257 m1 Hs00234244 m1 Hs00234245 m1 Hs00610319 m1 Hs00234253 m1

Hs00234278 m1 Hs00152939 m1 Hs00363670 m1 Hs00864161 g1 Hs00233648 m1 Hs00174128 m1 Hs00200178 m1 Hs00243519 m1 Hs00171068 m1 Hs00222224 m1 Hs00361186 m1 Hs02379973 s1 Hs00174239 m1 Hs00172113 m1 Hs00173626 m1 Hs00183662 m1 MGP MMP10 MMP13 MMP2 MMP8 MMP9 MSX1 MSX2 NFKB1 NLK OSTF1 RUNX2 SCARA3 SERF2 SFRS7 SMAD1 SMAD2 SMAD3 SMAD4 SOST SOX4 SOX9 SP7 SPARC SPP1 TCF7L2 TGFB1 TGFB2 TGFB3 TGFBR1 TGFBR2 TIMP2 TLR4 TMSB10 TMSB4X TNC TNF TNFAIP6 TNFSF11 TNFRSF11 TRIB2 TWIST1 TWIST2 VCAM1 VDR VEGF WIF1 matrix gamma-carboxyglutamate (gla) protein matrix metalloproteinase 10 (stromelysin 2) matrix metalloproteinase 13 (collagenase 3) matrix metalloproteinase 2 (gelatinase A) matrix metalloproteinase 8 (neutrophil collagenase) matrix metalloproteinase 9 (gelatinase B) msh homeo box homolog 1 msh homeo box homolog 2 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 nemo like kinase osteoclast stimulating factor 1 runt-related transcription factor 2 scavenger receptor class A,

member 3 small EDRK-rich factor 2 splicing factor, arginine/serine-rich 7 SMAD, mothers against DPP homolog 1 SMAD, mothers against DPP homolog 2 SMAD, mothers against DPP homolog 3 SMAD, mothers against DPP homolog 4 (Drosophila) sclerostin SRY (sex determining region Y)-box 4 SRY (sex determining region Y)-box 9 Sp7 transcription factor (osterix) secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin) secreted phosphoprotein 1 (osteopontin, bone sialoprotein I) transcription factor 7-like 2 (T-cell specific) transforming growth factor, beta 1 transforming growth factor beta 2 transforming growth factor beta 3 transforming growth factor, beta receptor I transforming growth factor beta receptor II tissue inhibitor of metalloproteinase 2 toll-like receptor 4 thymosin, beta 10 thymosin, beta 4, X chromosome tenascin C tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2) tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6 tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 11 (RANKL) tumor necrosis

factor receptor superfamily, member 11b (OPG) tribbles homolog 2 (Drosophila) twist homolog 1 twist homolog 2 vascular cell adhesion molecule 1 vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) receptor vascular endothelial growth factor WNT inhibitory factor 1 26 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1 A transzkriptomikai analízisek vizsgálati csoportjai 4.11 Postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus nők vizsgálati csoportja A génexpressziós vizsgálatokat postmenopausás osteoporoticus, illetve postmenopausás stádiumban lévő, nem osteoporoticus, független mintaválasztásból származó magyar nők csontmintáin végeztük. A kísérlethez beválogatott postmenopausás korú nők nem részesültek semmilyenfajta hormonpótló vagy szteroid terápiában. A postmenopausás állapot definiálása a jelenleg érvényes WHO kritériumok szerint történt: legalább 1 éve elmaradt menstruáció, illetve a szérum ösztradiol koncentrációja kisebb, mint 30 pg/ml. A

postmenopausás osteoporoticus csoportban (OP csoport) 7 csontszövet mintát értékeltünk, míg a kontroll nem osteoporoticus csoport (NOP csoport) 10 nő csontmintájából állt. A postmenopausás OP nők életkorának medián értéke 69.00 év (tartomány: 56-75) A kontroll postmenopausás NOP nők életkorának medián értéke 60.50 év (tartomány: 55-77) A vizsgálatba bevont személyek klinikai és labor paramétereit a 4. táblázatban mutatjuk be Nem volt szignifikáns különbség a vizsgálatban szereplő postmenopausás OP és NOP csoportok átlag életkorában, dohányzását illetően, bevitt kalcium mennyiségében, alkohol és kávé fogyasztásában, fizikai aktivitásában. Kifejezett különbségek figyelhetők meg elsősorban a teljes femuron és a lumbális csigolyákon mért T-score és BMD értékekben az OP és NOP egyének között. 27 4. táblázat A vizsgálatban szereplő postmenopausás OP és NOP nők klinikai és biokémiai adatai. Kor (év)

T-score L1-L4 (SD) Z-score L1-L4 (SD) BMD L1-L4 (g/cm2) T-score teljes femur (SD) Z-score teljes femur (SD) BMD teljes femur (g/cm2) Súly (kg) Magasság (cm) BMI (kg/m2) Sys. vérnyomás (Hgmm) Dia. vérnyomás (Hgmm) Pulzus (/perc) Beta-CrossLaps (pg/ml) Osteocalcin (ng/ml) PTH (pg/ml) TSH (mIU/l) Vércukor (mmol/l) Medián (Tartomány) Postmenopausás OP (n=7) Postmenopausás NOP (n = 10) 69.00 (56 - 75) 60.50 (55 - 77) -2.5 (-32 - -08) -0.8 (-15 - 39) -0.7 (-09 - 08) -0.2 (-13 - 35) 0.882 (0612 - 1099) 1.089 (1016 - 1652) -2.5 (-40 - -13) 0.1 (-18 - 18) -0.8 (-33 - 05) 0.7 (-10 - 33) 0.695 (0524 - 0838) 1.008 (0760 - 1221) 65.00 (60 - 70) 68.50 (64 - 82) 157.00 (151 - 176) 162.00 (150 - 170) 26.37 (2130 - 2895) 26.42 (2353 - 3369) 140.00 (120 - 140) 130.00 (110 - 140) 80.00 (70 - 90) 80.00 (70 - 90) 76.00 (60 - 80) 68.00 (60 - 76) 424.80 (18300 - 70700) 335.00 (12600 - 62600) 22.29 (1289 - 3677) 16.70 (612 - 2996) 33.80 (2300 - 4700) 26.50 (1500 - 7400) 1.04 (043 - 192) 1.35 (037

- 964) 5.52 (48 - 68) 5.2 (44 - 65) p értékek 0.31 0.002 0.81 0.002 0.0004 0.02 0.0004 0.07 0.27 0.47 0.54 0.60 0.23 0.19 0.31 0.07 0.47 0.11 A valószínűségi adatok (p értékek) a jobb oldali oszlopban a két mintacsoport Mann-Whitney U teszt alapú összehasonlításának eredményei. 4.12 Post- és premenopausás nem osteoporoticus nők vizsgálati csoportja A postmenopausás nem osteoporoticus csoportban (POST csoport) 10 csontmintát elemeztünk, míg a kontrollként használt premenopausás nem osteoporoticus csoport (PRE csoport) 7 nő csontmintáját tartalmazta. A postmenopausás nők életkorának medián értéke 55.00 év (tartomány: 47-57) A kontroll premenopausás nők életkorának medián értéke 5200 év (tartomány: 50-57). A vizsgált személyek klinikai és labordiagnosztika paramétereit az 5 táblázatban tüntettük fel. Nem találtunk szignifikáns különbségeket a vizsgált POST és PRE csoportok átlag életkorában,

csontásványanyag-tartalmában, dohányzását illetően, bevitt kalcium mennyiségében, alkohol és kávé fogyasztásában, fizikai aktivitásában, illetve nem részesültek semmilyen biológiai terápiában. Azonban erőteljes szignifikáns eltéréseket észleltünk a szérum ösztradiol szintekben (p = 0.0006) és a csontanyagcsere markereinek koncentrációiban, azaz; osteocalcin (p = 0.002), beta-crosslaps (p = 001) a két vizsgálati csoportot alkotó nők tekintetében. 28 5. táblázat A vizsgálatba bevont postmenopausás és permenopausás nem osteoporoticus nők klinikai és biokémiai adatai. Kor (év) T-score L1-L4 (SD) Z-score L1-L4 (SD) BMD L1-L4 (g/cm2) T-score teljes femur (SD) Z-score teljes femur (SD) BMD teljes femur (g/cm2) Súly (kg) Magasság (cm) BMI (kg/m2) Sys. vérnyomás (Hgmm) Dia. vérnyomás (Hgmm) Pulzus (/perc) Ösztradiol (pg/ml) Beta-CrossLaps (pg/ml) Osteocalcin (ng/ml) PTH (pg/ml) TSH (mIU/l) Medián (Tartomány) POST PRE nem

osteoporoticus nem osteoporoticus (n = 10) (n = 7) 55.00 (47 - 57) 52.00 (50 - 57) -0.6 (-15 - 39) 0.2 (-09 - 17) 0.5 (-13 - 35) 0.0 (-11 - 20) 1.113 (1025 - 1652) 1.298 (1073 - 1380) 0.05 (-15 - 18) 0.0 (-10 - 08) 0.7 (-10 - 33) 0.4 (-07 - 09) 1.052 (0760 - 1221) 0.952 (0788 - 1208) 72.50 (65 - 82) 65.00 (58 - 88) 162.00 (150 - 165) 160.00 (151 - 164) 28.29 (2477 - 3203) 26.03 (2214 - 3859) 130.00 (110 - 140) 120.00 (110 - 130) 80.00 (70 - 90) 80.00 (80 - 80) 68.00 (60 - 76) 68.00 (64 - 72) 9.55 (50 - 243) 67.10 (472 - 2451) 335.00 (16600 - 62600) 218.20 (14900 - 29500) 17.15 (1243 - 2996) 11.94 (799 - 1521) 26.50 (1900 - 5500) 32.40 (1500 - 5100) 1.35 (040 - 650) 2.02 (064 - 422) p értékek 0.13 0.47 0.81 0.23 0.74 0.42 0.54 0.06 0.36 0.07 0.07 0.74 0.89 0.0006 0.01 0.002 0.54 0.81 A valószínűségi adatok (p értékek) a jobb oldali oszlopban a két mintacsoport Mann-Whitney U teszt alapú összehasonlításának eredményei. 4.2 Az SNP analízisek vizsgálati csoportja A

polimorfizmus vizsgálatokhoz 353 magyar, független mintaválasztásból származó postmenopausás stádiumú nő vérmintáját gyűjtöttük össze (6. táblázat) A vizsgálatból kizártuk azokat a résztvevőket, akiknél endokrinológiai vagy egyéb krónikus betegségek gyanúja merült fel, illetve akik hormonpótló terápiában vagy egyéb olyan gyógyszeres kezelésben részesültek, amely befolyásolhatja a csontanyagcserét. Továbbá, nem kerültek bevonásra azok a személyek, akik szérum ALPL, TSH, PTH, 25-OH D-vitamin szintjében a normálértékektől eltérés volt tapasztalható. 29 6. táblázat A vizsgálatba bevont nők klinikai, denzitometriás és életmódbeli jellemzői Változók Életkor (év) Menopausális kor (év) Testmagasság (cm) Testsúly (kg) Testtömeg index (kg/m2) Dohányzás (%) Alkohol fogyasztás (%) Kalcium bevitel (mg/nap) BMD lumbális csigolya (g/cm2) BMD teljes csípő (g/cm2) BMD csukló (g/cm2) A vizsgálati populációban

diagnosztizált osteoporosisos betegek (%) átlag ± szórás (tartomány) 61.6 ± 79 13.5 (1-42) 158.1 (139-176) 68.9 ± 121 27.6 ± 45 45 (12.5%) 16 (4.44%) 642 (350-2000) 0.887 ± 0176 0.785 ± 0168 0.689 ± 0161 198 (55%) 4.3 Denzitometria A transzkriptomikai vizsgálatokhoz beválogatott betegeken a csontsűrűség mérése a teljes femuron és a lumbális csigolyákon (L1-L4) kettős energiájú röntgensugár abszorpciometria (DEXA) (DPX-L, Lunar Corp. Madison, WI, USA) segítségével történt, néhány nappal az operációt megelőzően. Az osteoporosis definíciója a WHO munkacsoportjának világszerte elfogadott ajánlása szerint: T-score < -2.5 SD, bármely mért ponton. Az SNP analízisekhez kiválasztott nőkön a Semmelweis Egyetem I. sz Belgyógyászati Klinikáján csontsűrűség mérés történt kettős energiájú röntgensugár abszorpciometria (DEXA) segítségével. A BMD értékeket a lumbalis gerinc (L2-L4) és a teljes csípő

vonatkozásában Lunar Prodigy DXA készülékkel (GE Medical Systems, Diegem, Belgium), a radiust tekintve Norland pDEXA denzitométerrel (CooperSurgical Inc, Trumbull, CT, USA) határoztuk meg. 4.4 Humán csontszövet minták izolálása Az osteoporoticus és nem osteoporoticus csontminták a diagnosztizált III. stádiumú primer osteoarthritist gyógyító műtétet szolgáló csípőizületi totál endoprotézis beépítésekor leforgácsolódott csontszövet darabok összegyűjtéséből származtak. A primer osteoarthritis minősítése az Amerikai Ortopédsebészeti Társaság (AAOS) ajánlásával a Kellgren-Lawrence- 30 féle rendszer alapján történt (70). A betegség a combfejben a mintavételi helyként is szolgáló spongiózus csontállományt nem érintette. Továbbá, radiológiai vizsgálatokkal alátámasztva az arthrosis mértékében nem volt különbség kimutatható. A gyűjtést követően a friss mintákat azonnal alaposan megtisztítottuk a

csontvelőtől, illetve egyéb vérszennyeződésektől PBS felhasználásával, majd folyékony nitrogénben tároltuk. A vizsgálat a Semmelweis Egyetem Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága által jóváhagyva készült (SOTE-TUKEB 6392-1/2004-1018EKU, SOTE-TUKEB 33/2008). Minden betegtől – részletes felvilágosítás után – írásos beleegyező nyilatkozatot is kértünk. 4.5 Direkt messengerRNS szeparálás csontból A humán csontmintákat (átlagosan 500 mg) folyékony nitrogén alatt elporítottuk freezer-mill 6750 készülék segítségével (SPEX Certiprep Inc., NJ, USA) Az RNS izolálást Dynabeads Oligo (dt)25 kit (Dynal Biotech ASA, Oslo, Norvégia) felhasználásával végeztük. Az elporított mintához 5 ml lysis/binding puffer adtunk és centrifugáltuk 9000 rpm-el, 15 percig szobahőmérsékleten. A szeparálódott, nukleinsavakat tartalmazó középső réteget 1 ml oligo-dt-vel borított paramagnetikus partikulumokat tartalmazó oldathoz adtuk. Ezután

az mRNS-t 2 µl DN-áz I. enzimmel (Promega, Madison, WI, USA) kezeltük 20 percig, 37ºC-on 80 U RN-asin RN-áz inhibitor (Promega) jelenlétében. Az mRNS tisztítását a NucleoSpin RNA Clean-up kit-ben (Macherey-Nagel, Düren, German) található puffer szett segítségével a gyártók előírása szerint végeztük. A tisztított mRNS eluálásához 40 µl RN-áz mentes vizet használtunk. A tiszta mRNS minőségét és mennyiségét NanoDrop spektrofotométerrel (Nanodrop Technologies, Montchanin, DE, USA) ellenőriztük 260/280 nm hullámhossztartományon. 15 µl humán mRNS-t cDNS-re fordítunk át reverz transzkripció (RT-PCR) során, melyhez 200 U SuperScriptIII RN-áz H reverz transzkriptázt (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA), 125 ng random primert (Promega), és 40 U RNaseOUT Ribonukleáz inhibitort (Invitrogen Life Technologies) használtunk 30 µl végtérfogatban. 4.6 DNS szeparálás perifériás vérből A polimorfizmus

meghatározásokhoz összegyűjtött 353 résztvevő EDTA-s vérmintájából genomiális DNS-t izoláltunk High Pure PCR Template Purification kit (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany) felhasználásával. A tisztított DNS minőségét és 31 mennyiségét NanoDrop spektrofotométerrel (Nanodrop Technologies, Montchanin, DE, USA) határoztuk meg. Minden mintát 10 ng/µl DNS végkoncentrációra higítottunk 4.7 A vizsgált gének kiválasztása transzkriptomikai analízisekhez Kvantitatív valós idejű RT-PCR módszer alkalmazásával olyan kandidáns géneket vizsgáltunk melyek eltérő génexpressziós aktivitása szerepet játszhat a menopausát követően megváltozott csontszöveti anyagcsere-folyamatok és az osteoporosis kialakulásában. Előzetes genetikai útvonal analízisek, irodalmi adatok és online adatbázisok (www.pubmedcom, http://www.ncbinlmnihgov/OMIM) alapján kiválasztottunk 147 gént a transzkripciós vizsgálatokhoz. Ezek a gének a

TGFβ/BMP jelátviteli útvonalat alkotják, a WNT szignál tarnszdukciós útvonalhoz tartoznak. Továbbá extracelluláris mátrix molekulákat, extracelluláris mátrix bontó enzimeket, növekedési faktorokat, sejtadhéziós molekulákat, valamint transzkripciós faktorokat kódolnak. Néhány gén kifejeződése az ösztrogén szabályozása alatt áll, illetve génpolimorfizmusaik és a csont ásványanyag-tartalom között összefüggés található. Több gént lehetséges szerepére a szarvason végzett előzetes genetikai analízisek világítottak rá. Valamint, további néhány gén az alapvető immunológiai mechanizmusok szabályozásában vesz részt. A PCR mérésekhez 2 kontroll gént használtunk 4.8 Kvantitatív valós idejű RT-PCR és a vizsgálati csoportok statisztikai összehasonlítása Előre megtervezett és validált gén-specifikus TaqMan próba alapú génexpressziós Assayt használtunk az Applied Biosystemstől (Applied Biosystems, Foster City,

CA, USA), ahol minden gén-specifikus TaqMan szett tartalmazott egy 5’ irányú és egy 3’ irányú primert, valamint egy fluoreszcens jelölő molekulával ellátott próbát. A PCR reakció 20 µl végtérfogatban zajlott, amely tartalma volt 1 µl cDNS, 10 µl TaqMan 2x Universal PCR Master Mix NoAmpErase UNG (Applied Biosystems), 1 µl validált gén specifikus TaqMan próba 20x (Applied Biosystems) és 8 µl víz. A kiválasztott 147 gén amplifikálásához ABI Prism 7500 valós idejű PCR (Applied Biosystems) rendszert használtunk (8. ábra, a) Minden gént 3-3 párhuzamos méréssel vizsgáltunk 96 lyukú lemezeken a következő protokoll szerint: első lépésként 10 perc denaturálás 95ºC-on, majd 70 cikluson keresztül 15 másodperc denaturálás 95ºC-on, 1 perc szintézis 60ºC-on. Általános „house-keeping” géneket (GAPDH, 32 ACTB) alkalmaztunk belső kontrollként. A további statisztikai analízisek során a GAPDH szinteket használtuk a normalizált

értékek megadásához, mert irodalmi adatok utalnak arra, hogy osteoblast sejtekben az ösztrogén befolyásolja az ACTB gén kifejeződését (71). A relatív kvantifikáció kiértékelése az összegyűjtött adatokból (küszöb ciklus számok, Ct) 7500 System SDS software 1.3 (Applied Biosystems) felhasználásával készült A gén-specifikus mRNS relatív mennyiségét (RQ) a gyártó előírása szerint (Applied Biosystems) az átlag ∆Ct értékekből (cél gén Ct értéke - endogén kontroll gén Ct értéke) számítottuk mind a 147 gén esetén a vizsgált mintacsoportokban. (8 ábra, b) A génexpressziós arányokat az egyes vizsgálati csoportokat alkotó személyek RQ értékeiből kalkuláltuk. (azaz: (i) a postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus csoportban az expressziós változás mértékét RQ OP/RQ NOP képletből számoltuk; (ii) a postmenopausás és premenopausás nem osteoporoticus csoportban RQ POST/RQ PRE összefüggés adta meg). GAPDH MMP

13 ∆Ct a, b, 8. ábra a, Az Applied Biosystems Prism 7500 valós idejű PCR készüléke b, ABI Prism 7500 valós idejű PCR amplifikációs görbék. A kontroll gén (GAPDH) és a célgén (MMP13) fluoreszcencia intenzitásának függvényében detektált ciklusszámok különbségéből (∆Ct) kalkulálható az adott gén mRNS-ének relatív mennyisége az összehasonlított mintacsoportokban. Az adatok analíziséhez Windows SPSS 13.01 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) programot használtunk. A statisztikai analízist egyparaméteres Mann-Whitney U teszt segítségével végeztük. Statisztikailag szignifikánsnak tekintettük azt, ahol a valószínűségi adatok: p ≤ 0.05 33 4.9 Gének és SNP-k kiválasztása a genomikai analízisekhez, genotipizálás Az SNP analízisekhez öt olyan, humán csontszövetben expresszálódó gént (ALPL, MMP2, TIMP2, FGFR1, FABP3) választottunk, amelyek esetén az in vivo transzkriptomikai vizsgálatok realt time PCR

eredményei alapján elsőként mutattuk ki, hogy meghatározó szerepet tölthetnek be a csontanyagcserében, illetve a csontritkulás kialakulásában. Két szelektált gén (RANKL, OPG) azonos szignalizációs rendszerhez tartozik és szerepük már jól ismert a csontátépülési folyamatok szabályozása kapcsán (7. táblázat) Az NCBI dbSNP adatbázis (http://www.ncbinlmnihgov/SNP) segítségével optimális GC aránnyal (40-65%) rendelkező 26 SNP-t szelektáltunk a következő kritériumok szerint: a) az automatizált nagy teljesítményű genotipizáló módszer (GenomeLab SNPstream Genotyping System) követelménye, hogy a polimorf allélok esetén C/T vagy G/A nukleotid csere történhet; b) a ritkább allél előfordulási gyakorisága (MAF) > 5%; c) a kaukázusi populációban már validáltak; d) a polimorfizmusok elsősorban a gének funkcionális szakaszaiban (promoter, exon, 3’-UTR vég) forduljanak elő (72). A még nem vizsgált SNP-k kiválasztásának

alapja az volt, hogy a már leírt és a csontanyagcserével összefüggésbe hozott más SNP közelében helyezkednek el. Ez alapján feltételeztük, hogy meghatározhatunk olyan új haplotípusokat, amelyek kapcsolatban állnak a BMD-vel. Az „in silico” kapcsoltsági adatok alapján a genotipizált SNP-k 29%, 80%, 64%, 41% illetve 55%-os mértékben reprezentálják az ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2 és TIMP2 gének (és upstream illetve downstream nem kódoló régióik) összes allelikus variánsát r2>0.8 valószínűséggel 34 7. táblázat A genotipizált egypontos nukleotid polimorfizmusok (SNP) leíró statisztikai elemzései. GÉN ALPL alkalikus foszfatáz FABP3 zsírsav-kötő fehérje 3 FGFR1 fibroblast növekedési faktor receptor 1 MMP2 mátrix metalloproteináz 2 TIMP2 mátrix metalloproteinázok szöveti inhibitora 2 OPG osteoprotegerin RANKL receptor activator of nuclear factor-kB ligand SNP azonosítási szám rs871132 rs1256341 rs3738099 rs951545 rs10914367

rs13317 rs3925 rs2280846 rs6996321 rs7825208 rs12677355 rs243866 rs1030868 rs243847 rs1384364 rs931227 rs9894295 rs9900972 rs4796812 rs4789939 rs8066116 rs1564858 rs3102735 rs9533156 rs9525641 rs3742257 Allél SNP pozíció G/A G/A G/A C/T G/A C/T G/A G/A G/A G/A C/T G/A C/T C/T C/T G/A G/A G/A C/T G/A C/T A/G C/T C/T C/T C/T chr1:21607931 chr1:21612135 chr1:21640041 chr1:31513758 chr1:31515299 chr8:38388671 chr8:38400815 chr8:38401451 chr8:38441503 chr8:38446444 chr8:38449100 chr16:54069038 chr16:54074268 chr16:54081499 chr17:74364423 chr17:74370134 chr17:74373700 chr17:74380209 chr17:74386781 chr17:74393298 chr17:74441474 chr8:120014347 chr8:120034251 chr13:42045671 chr13:42046024 chr13:42071198 SNP lokalizáció intron intron exon 263Y/H intron promoter 3’ UTR intron intron intron promoter promoter promoter intron intron intron intron intron intron intron intron promoter intron promoter promoter promoter intron Sikerességi ráta (%) HW p érték MAF 97.4 100 100 99.1 100

99.1 97.4 100 98 99.1 100 100 97.7 99.7 99.7 98.8 100 99.7 99.7 100 98.8 99.7 100 99.4 99.4 99.4 0.509 0.822 0.086 1.0 0.716 0.646 0.942 1.0 0.506 0.362 0.921 0.701 0.747 0.919 1.0 0.697 0.063 0.720 0.656 1.0 0.064 0.069 0.954 0.396 0.453 0.215 0.116 0.305 0.113 0.119 0.166 0.212 0.204 0.082 0.322 0.137 0.350 0.262 0.390 0.317 0.195 0.173 0.122 0.184 0.058 0.133 0.119 0.140 0.146 0.460 0.459 0.486 A sikerességi ráta a genotípusok százalékát jelöli. A HW p érték a Hardy-Weinberg equilibrium megállapítására alkalmazott χ2-teszt szignifikancia szintje. A robosztus genotipizálás a Semmelweis Egyetem SNP Core Facility keretein belül a nagy áteresztőképességű GenomeLab SNPstream Genotyping System (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) rendszerben történt. Az automatizált genotipizáló rendszer multiplex polimeráz láncreakcióval (PCR) kapcsolt fluoreszcens jelölésen alapuló, array-rendszerű egybázisos primer extenzió elvén működik (73). A

genotipizálás lépései a következők voltak: 1) Multiplex PCR a kiválasztott SNPrégiók amplifikálására. 2) Tisztítás (a feleslegben maradt primerek és dNTP emésztése exonukleáz I és shrimp ALPL speciális keverékével). 3) Allél-specifikus, fluoreszcens egybázisú primer extenzió. 4) Az extenziós primerek 5’-ragadós végének segítségével a termékeket az ún. SNPware Tag Array plate-hez hibridizáltuk 5) Az array leolvasása kétszínű floreszcens detektálással, a SNPstream Imager szoftverrel 6) Adatelemzés és genotípus 35 meghatározás a SNPstream szoftverrel. Minden, a multiplex genotipzáláshoz szükséges PCR primert és extenziós primert a Beckman Coulter web-alapú primer tervező alkalmazásával (http://www.autoprimercom) terveztünk A genotipizáló munkafolyamat Biomek FX Dual Arm system (Beckman Coulter) pipettázó robotok segítségével 384-lyukú plateken zajlott. 4.10 Többváltozós transzkriptomikai adatelemzések Az

univariáns Mann-Whitney U teszt a gének egyedi szerepét vizsgálja, ezért az expressziós adatokban rejlő számos információ több szempontból is észrevétlen maradhat. Többváltozós eljárások alkalmazásával további összefüggésekre is fény derülhet. Ezek a statisztikai módszerek lehetőséget nyújtanak nagyszámú adat egyidejű komplex elemzésére, illetve génexpressziós mintázatbeli különbségek meghatározására az egyedi varianciák figyelembe vételével. A betegségek kialakulásában funkcionálisan érintett több gén és géncsoport együttes hatásaira hívják fel a figyelmet. Mivel a csontanyagcsere folyamatok módosulása a környezeti tényezők mellett számos gén aktivitásában bekövetkező kismértékű additív változás következménye, ezért ezeknek a géneknek az azonosítása multiparaméteres adatelemzésekkel megvalósítható feladat. 4.101 Diszkriminancia analízis (DFA) A diszkriminancia elemzés (Discriminant Function

Analysis) segítségével egyes eleve megadott géncsoportok közötti elválások maximalizálhatók. Az elemzés eredményei a kanonikus értékek, amelyek koordinátaként használhatók a térbeli ábrázolás során. Két mintacsoport esetén nem rajzolható fel koordinátarendszer, de a csoportok elválása a kanonikus változók alapján így is felmérhető. Ha a megfigyelések random mintavételezésből származnak, és teljesül a többváltozós normalitás feltétele is, akkor a betegcsoportok elválásának szignifikanciája is értékelhető. Ha ezek a feltételek nem teljesülnek, a betegcsoportok szeparálódásának mértéke akkor is informatív az adatok szerkezetére vonatkozóan. A DFA igen értékes információt szolgáltat arról, hogy a vizsgálati csoportok egymástól való elkülönülését mely gének magyarázzák elsősorban. A módszer problémája azonban, hogy a változók (gének) száma nem haladhatja meg a vizsgált betegek számát. A kritérium

alapján a géneket részhalmazokra osztottuk, és az egyes génszettek diszkriminációs erejét külön-külön vizsgáltuk. Így számos géncsoportot definiáltunk különböző osztályozási feltételek alapján. A klasszifikáció szempontjai elsősorban a következők voltak: a Mann36 Whitney U teszt és a PCA elemzés eredményi, a gének különböző regulációs útvonalakban (TGFβ, BMP, MAPK, WNT) betöltött szerepe, illetve biológiai funkcióik, lásd bővebben az eredmények c. fejezetben. A számításokat a SYN-TAX 2000 programcsomag felhasználásával készítettük (74). 4.102 Főkomponens analízis (PCA) A főkomponens analízis (Principal Components Analysis) egy standard technika, amely széles körben alkalmazható az orvosbiológiai kutatásokban, különösen microarray és egyéb génexpressziós adattömegek statisztikai kiértékelésében (75-77). A módszer összegzi a multivariációs adatrendszereket néhány fontos, egymástól

független és az eredeti adatstruktúrát jól tükröző dimenzióba, mely dimenziókat komponenseknek nevezünk (78, 79). Minden komponens az összvariancia egy töredéke. A kvantitatív RT-PCR adatok feldolgozása során standardizált PCA metodikát használtunk, vagyis minden változót (gént) egyforma súllyal szerepeltettünk az elemzésben. Az eredmények grafikus ábrázolása ordinációs diagramon, illetve kettős szórásdiagramon (biplot) történt. A biplot diagramon a vizsgálati személyeket pontokként, míg a géneket nyilakként egyszerre tüntettük fel. A személyek koordinátáit az eigenvektorokból kapjuk meg, ugyanakkor a gének koordinátáit a változók komponensekkel való korrelációjából számolt értékei adják. Ez az ábrázolásmód megengedi a beteg vs. kontroll mintacsoportok és a gének kórfolyamati jelentőségének egyidejű értékelését. Az egy csoportba tartozó személyek konvex sokszögekbe zárhatók, amely vizualizációs

technika alkalmazása egyértelműbbé teszi a csoportok elkülönülését a diagramon (78). A PCA szelektálja azokat a géneket, amelyek a leginkább felelőssé tehetők a beteg és kontroll csoportok közötti különbségekért. Scree diagram segítségével döntöttük el, hogy egy komponens valóban hasznos információkat foglal magában vagy az csupán véletlenszerű eltérés az adatokban (80). Így meghatároztuk azt a töréspontot, ahol az eigenértékek nagyon lassan csökkenni kezdenek. A számításokat a SYN-TAX 2000 programcsomag felhasználásával készítettük (74, 80). 4.103 Hierarchikus clusteranalízis (HCL) A hierarchikus clusteranalízis egy standard statisztikai algoritmus, amely a génexpressziós adathalmazok feldolgozásának eredményes és hatékony módszere (81). A nagyon hasonló vagy homológ expressziós mintázattal rendelkező géneket hierarchikus 37 csoportokba rendezi. A hierarchikus osztályozás során minden objektumot (gént)

külön osztálynak tekintettünk, és az egyes lépésekben ezeket az osztályokat páronként vontuk össze növekvő tagszámú csoportokba a közöttük mért távolság figyelembevételével. Az eljárás nemcsak az objektumok között, hanem a folyamat során képződő osztályok között is távolságokat mér. Az osztályozás egyes lépéseiben a távolság minimalizálása volt a cél, amely során megkerestük az egymáshoz legközelebbi objektumpárokat s ezeket egy csoportba helyeztük. Az alkalmazott Sokal-Michener féle csoportátlag eljárás (avarage linkage clustering method) két osztály távolságát az összes osztályközi, páronkénti távolság aritmetikai átlagával definiálja. A gének közötti kapcsolatokat dendrogamon ábrázoltuk, ahol a fák egyes ágainak hossza a hasonlóság mértékével arányos. A transzkripciós változások számszerű arányának vizualizálásához piros-zöld színskálát használtunk. A zöld szín az adott gén

átíródásának csökkenését mutatja, míg piros színnel a gén transzkripciós aktivitásának fokozódását jelöltük. Az eredmények grafikus megjelenítéséhez az RQ értékek maximumát 10-re normalizáltuk. Az elemzéseket TM4 program segítségével végeztük (82) 4.11 A genomikai vizsgálatokhoz felhasznált statisztikai módszerek 4.111 Leíró statisztikai módszerek Az adatbázisban a hiányzó genotípusokat a „10-legközlebbi szomszéd módszer” (10nearest neighbour method) segítségével determináltuk a genotipizálási hibákból eredő fals eredmények elkerülése érdekben (83). A „Haploview 30” (Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA) szoftver segítségével végeztük a genotipizálás leíró elemzését (84) (7. táblázat) Az SNP-k közötti kapcsoltsági viszonyt (LD) szintén a „Haploview” szoftverrel határoztuk meg. A vizsgálati populációt klinikai és denzitometriás adatok alapján jellemeztük (6. táblázat) A

csontdenzitás (BMD) értékre szignifikáns kovariánsokat regressziós analízis segítségével szűrtük ki. 4.112 Elemző statisztikai módszerek A humán genetikai asszociációs vizsgálatokat a „PedGenie” szoftver felhasználásával végeztük (85). A statisztikai szoftver ANOVA-val ekvivalens elemzést végez három genetikai modellben (additív, domináns, recesszív). Az alkalmazás „Quantitativ” és „OddsRatio” opcióját alkalmaztuk vizsgálatunkban és empirikus p értéket generáltunk 10000 Monte-Carlo permutációs próba futtatásával. Statisztikailag szignifikánsnak a permutált p érték 005-nál 38 kisebb értékét tekintettük. Az individuális SNP-analízis statisztikai erejét (power of the study) a Quanto szoftver 1.1 verziójával számoltuk ki (University of Southern California, Los Angeles, CA, USA). A genetikai eredményekből haplotípus analízist is végeztünk az Rstatisztikai környezetbe épülő „haplostats” szoftver

felhasználásával Csúszó-ablak analízis segítségével konstruáltuk a 2, 3 és 4 SNP-ből álló haplotípusokat az egyes géneken belül, majd score-statisztika alkalmazásával határoztuk meg az egyes haplotípusok és a fenotípusok kapcsolatát (86). A score-statisztika permutált p értéket számít a globális összefüggés és az egyes haplotípusok szerepének jellemzésére. A haplotípusok egyedi hatását regressziós modellben a szoftverbe épített „haplo.glm” funkcióval határoztuk meg A regressziós analíziseket az „SPSS 15.0 for Windows” (SPSS Inc, Chicago, USA) statisztikai szoftverkörnyezetben végeztük. 39 5. EREDMÉNYEK 5.1 Postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus nők csontszöveti génexpressziós mintázatának komplex vizsgálata 5.11 A csontszöveti transzkriptom Mann-Whitney U teszt alapú összehasonlítása A 8. táblázatban az irodalmi adatok és online adatbázisok alapján szelektált, a csontanyagcserében és a

csontritkulás kialakulásában szerepet játszó 89 gén kvantitatív valós idejű RT-PCR adatait foglaltuk össze. A géneket biológiai funkciójuk szerint osztályozva tüntettük fel. A Mann-Whitney U teszt 9 gén tekintetében mutatott szignifikáns (p ≤ 005) expressziós különbséget a két minatcsoportban, név szerint: alkalikus foszfatáz (ALPL), I. típusú kollagén alfa 1 lánca (COL1A1), mátrix metalloproteináz 2 (MMP2), mátrix metalloproteináz 13 (MMP13), mátrix metalloproteináz 9 (MMP9), trombocitákból származó növekedési faktor alfa polipeptid (PDGFA), nukleáris faktor kappa könnyű lánc (NFKB1), thrombospondin receptor (CD36) és twist homolog 2 (TWIST2). Ebből 7 gén kifejeződése represszálódott osteoporoticus nőkben. Az expressziós változás mértéke az osteoporoticus csontban a nem osteoporoticus csontszövethez viszonyítva az ALPL esetén 0.41-szoros, a COL1A1 esetén 0.39-szoros, az MMP2 esetén 040-szoros, az MMP13 esetén

021-szoros, az MMP9 esetén 0.34-szoros, a PDGFA esetén 047-szoros és az NFKB1 esetén 044-szoros volt (9. ábra) Ezzel ellentétben 2 gén kifejeződése szignifikánsan megnövekedett az osteoporoticus betegekben. A megfigyelt transzkripciós aktivitás fokozódása 400-szoros volt a TWIST2 gén tekintetében és a CD36 gén relatív expressziója 3.22-szor magasabbnak bizonyult osteoporoticus csontban (9. ábra) 40 GAPDH-hoz viszonyított relatív mRNS expresszió 1000,00 NOP OP 100,00 10,00 1,00 0,10 CO 36 L1 A 1 M M P1 3 M M P2 M M P9 N FK B PD 1 G FA TW IS T2 CD AL PL 0,01 9. ábra Szignifikánsan megváltozott expressziós mintázatot mutató 9 gén mRNS-ének relatív mennyisége 7 osteoporoticus (fehér oszlop) vs. 10 nem osteoporoticus (fekete oszlop) nő csontszövetében Lg skálán feltüntetve. 41 8. táblázat 89 gén kvantitatív valós idejű RT-PCR vizsgálatának eredményei 17 postmenopausás nő csontszövetében GÉN SZIMBÓLUMOKa

Génelnevezéseka TGFB/BMP/WNT jelpálya ABI Assay azonosítási számokb c Gén illetve géntermék relevanciák és annotációk Hs00171257 m1 TGFB receptorok ligandumai. Általános csont anabolikus citokinek Fokozzák az osteoblastok számát és érését. Gátolják az osteoclastokat Növelik a PDGF kifejeződést. TGFB1 gén mutációja osteosclerosist eredményez. transforming growth factor, beta 3 Hs00234245 m1 Szerin/threonin típusú kináz receptorok, melyek egymással dimereket transforming growth factor, beta receptor I Hs00610319 m1 képeznek a sejtmembránban. transforming growth factor, beta receptor II Hs00234253 m1 TGFB receptorokhoz kapcsolódó jelátvivő molekula (R-Smad). WNT SMAD, mothers against DPP homolog 2 Hs00183425 m1 útvonal szabályozásában is részt vesz. TGFB receptorokhoz kapcsolódó jelátvivő molekula (R-Smad) Emeli a βSMAD, mothers against DPP homolog 3 Hs00232219 m1 catenin szintjét és fokozza sejtmagba történő áthelyeződését.

Komplexet formál a receptor típusú Smad molekulákkal (R-Smad) és a magba vándorol (Co-Smad). Kapcsolatot biztosít a TGFB/BMP és WNT SMAD, mothers against DPP homolog 4 Hs00232068 m1 jelpályák között. BMP receptorok ligandumai. Szarapük van az embrionális mezoderma bone morphogenetic protein 2 Hs00154192 m1 fejlődésében és az osteogenezisben. Szükségesek az osteoblast éréshez és bone morphogenetic protein 4 Hs00370078 m1 a csontképződéshez. bone morphogenetic protein 3 Hs00609638 m1 BMP receptorok liganduma. Gátolja a csontfejlődést bone morphogenetic protein 8a Hs01629138 s1 BMP receptorok liganduma. Szerepük van az embrionális csontformációban bone morphogenetic protein 8b Hs00236942 m1 és az embriogenezisben. bone morphogenetic protein receptor, type IA Hs00831730 s1 A szerin/threonin kináz típusú dimer BMP receptorok egyik komponense. BMP receptorhoz asszociált jelátvivő molekula (R-Smad). Kapcsolódik a WNT kaszkád elemeivel és korlátozza

a β-catenin aktivációt. SMAD, mothers against DPP homolog 1 Hs00195432 m1 activin A receptor, type I Hs00153836 m1 Szerepet töltenek be a dezmális és chondrális csontosodásban. Serkentik az osteoblastok és osteoclastok fejlődését. activin A receptor, type II Hs00155658 m1 inhibin, alpha Hs00171410 m1 Gátolják az osteoblastok és osteoclastok kialakulását. inhibin, beta A Hs00170103 m1 Az osteoblastok által termelt BMP antagonista. Gátolja az LRP5/6 aktivitását és a WNT útvonalat. Mutációja Van Buchem betegséget és sclerosteosist sclerostin Hs00228830 m1 okoz. WNT jelátviteli út ko-receptora. Mutációja osteoporosis-pseudoglioma low density lipoprotein receptor-related szindrómát (OPPG) okoz. protein 5 Hs00182031 m1 1 TGFB1 transforming growth factor, beta 1 2 TGFB2 transforming growth factor, beta 2 3 4 5 TGFB3 TGFBR1 TGFBR2 6 SMAD2 7 SMAD3 8 SMAD4 9 BMP2 10 11 12 13 14 BMP4 BMP3 BMP8A BMP8B BMPR1A 15 16 17 18 19 SMAD1 ACVR1 ACVR2 INHA

INHBA 20 SOST 21 LRP5 ECM komponensek 22 COL1A1 collagen, type I, alpha 1 23 COL1A2 collagen, type I, alpha 2 Hs00234244 m1 A legfontosabb fibrilláris típusú kollagén molekula és a csontban legnagyobb mennyiségben előforduló extracelluláris mátrix (ECM) komponens. α2β1 integrineken keresztül kapcsolódik az osteoblast Hs00164004 m1 sejtekhez. Mutációja osteogenesis imperfectat eredményezhet A legfontosabb fibrilláris típusú kollagén molekula. Mutációja EhlersHs00164099 m1 Danlos szindrómát okoz. 42 Humán kromoszóma lokalizációk RQ OP / RQ NOPd p értékeke 19q13.2 0.52 0.11 1q41 0.71 0.47 14q24 3p22 0.62 1.18 0.90 0.07 0.81 0.81 18q21.1 0.94 0.96 15q22.33 0.98 0.81 18q21.1 0.76 0.23 20p12 0.34 0.60 14q22-q23 0.62 0.63 ND 0.64 1.37 0.60 0.54 0.16 0.60 7p15-p13 0.88 0.89 1.80 0.85 0.81 0.81 0.60 0.13 0.27 0.36 17q12-q21 0.31 0.27 11q13.4 1.03 0.81 17q21.3q221 0.39 0.05 7q22.1 0.38 0.60 9q22 4p14-q21

1p34.3 1p35-p32 10q22.3 4q31 2q23-q24 2q22.2-q233 2q33-q36 24 25 COL2A1 COL3A1 collagen, type II, alpha 1 collagen, type III, alpha 1 26 COL4A4 collagen, type IV, alpha 4 27 COL5A1 collagen, type V, alpha 1 28 COL7A1 collagen, type VII, alpha 1 29 COL9A1 collagen, type IX, alpha 1 30 31 32 COL10A1 COL11A1 COL12A1 collagen, type X, alpha 1 collagen, type XI, alpha 1 collagen, type XII, alpha 1 33 34 COL14A1 COL15A1 collagen, type XIV, alpha 1 collagen, type XV, alpha 1 35 FN1 fibronectin 1 Fibrilláris típusú kollagén. Szerepe van az osteoarthritis kialakulásában A génkiütött egerekben abnormális a chondrális csontosodás. Hs00156568 m1 Hs00164103 m1 Fibrilláris típusú kollagén. Mutációja Ehlers-Danlos szindrómát okoz Hálózat formáló kollagén, adhéziós szerepet tölt be. Megtalálható a glomerulusokban. Hs00164150 m1 Mutációja Ehlers-Danlos szindrómát okoz. Osteoblastokban történő kifejeződését a TGFB szabályozza.

Hs00609088 m1 Hálózat formáló kollagén. Az epidermisben található Érését a BMP1 Hs00164310 m1 elősegíti. A fibrilláris típusú kollagénekhez kapcsolódik. Hiánya osteoarthritishez vezet. Hs00156680 m1 RUNX2 transzkripciós faktor célgénje. A chondrális csontosodás során a Hs00166657 m1 BMP2 fokozza expresszióját. Hs00266273 m1 Fontos szerepe van a csont morphogenezisében. Hs00189184 m1 Keresztkötő minor kollagén, COL1 molekulához kapcsolódik. Adhezív tulajdonságokkal rendelkező molekula, mely csontvelői őssejtekben termelődik. Hs00385388 m1 Hs00266332 m1 Szerepe van a vázizom kialakulásában és az angiogenezisben. ECM minor glikoprotein, amely elősegíti a csontsejtek proliferációját. A Hs00277509 m1 csontsejtekhez integrinekkel kötődik (osteoblasts β1, osteoclasts β3). 36 DCN decorin Hs00266491 m1 37 BGN Hs00156076 m1 38 MGP biglycan matrix gamma-carboxyglutamate (gla) protein 39 BGLAP 40 SPARC bone gamma-carboxyglutamate

(gla) protein (osteocalcin) secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin) 41 DSPP dentin sialophosphoprotein Hs00171962 m1 42 SPP1 ECM bontó enzimek secreted phosphoprotein 1 (osteopontin) Hs00167093 m1 43 MMP2 44 Hs00179899 m1 Hs01587813 g1 Hs00234160 m1 MMP8 matrix metalloproteinase 2 (gelatinase A) matrix metalloproteinase 8 (neutrophil collagenase) Hs00234422 m1 Hs00233972 m1 45 MMP9 matrix metalloproteinase 9 (gelatinase B) Hs00234579 m1 46 47 MMP13 MMP10 matrix metalloproteinase 13 (collagenase 3) matrix metalloproteinase 10 (stromelysin 2) Hs00233992 m1 Hs00233987 m1 Kis molekulatömegű leucin gazdag proteoglikánok. Segítik a kollagén rostok és a hidroxi-apatit kristályok képződését, valamint azok párhuzamos elrendeződését. A gamma-karboxilált fehérje család tagja. Mutációja Keutel szindrómát okoz, amely az ECM kalcifikáció zavarához vezet. A gamma-karboxilált fehérje család tagja. A legfontosabb nem-kollagén típusú

ECM fehérje. A szérum szintje emelkedik ösztrogén hiányos állapotokban és fokozott csontátépülés során. Megakadályozza a sejtosztódást. Az éretlen osteoblastok termelik nagy mennyiségben. Szabályozza a sejt-ECM kapcsolatokat Fontos a csontképződési folyamatok során. Fokozza az ECM mineralizációt Befolyásolja a hidroxi-apatit kristályok méretét. Szekretált glikofoszfoprotein, amely stimulálja a sejtaktivitást és szabályozza a csontátépülést. β3 integrinek segítségével osteoclastokhoz kapcsolódik Expresszióját a csontépítő citokinek növelik. Osteoblastok által termelődik. Szükséges a normális ECM képződéshez Mutációja Winchester szindrómát és multicentrikus osteolysist okoz. Működését MMP13 aktiválja. Fokozott aktivitása osteoarhtritishoz vezet és növeli a kalcim pirofoszfát dihidrát kristályok szintjét. Az osteoclast sejtek termelik és ezek migrációját szabályozza. Fontos szerepet tölt be a csont

remodellingben és az osteoblast differenciációban. Az osteoblastok termelik. Szükséges a normális ECM képződéshez Szerepe van az osteoarthritis kialakulásában. Működését MMP2 aktiválja A fibronectin és a III-as, IV-es, V-ös típusú kollagének emésztését végzi. 43 12q13.11q132 2q31 0.73 0.39 0.42 0.47 2q35-q37 0.29 0.36 9q34.2-q343 0.40 0.89 3p21.1 0.35 0.31 6q12-q14 0.05 0.09 6q21-q22 1p21 6q12-q13 0.14 0.62 0.38 0.42 0.81 0.08 8q23 9q21-q22 0.96 0.85 0.54 0.81 2q34 1.10 0.36 12q13.2 0.68 0.19 Xq28 12p13.1p123 0.52 0.09 0.86 0.54 1q25-q31 1.05 0.96 5q31.3-q32 0.56 0.19 4q21.3 ND - 4q21-q25 0.58 0.23 16q13-q21 0.40 0.05 11q22.3 20q11.2q131 0.89 0.47 0.34 0.03 11q22.3 11q22.3 0.21 ND 0.04 - 48 BMP1 bone morphogenetic protein 1 49 CTSK Növekedési faktorok cathepsin K Az ECM bontó enzimek csoportjába tartozik. Ca-függő metalloproteináz Az I-es, II-es, III-as, VII-es típusú prokollagén és a

probiglikán érését segíti. Osteoclastokban termelődik. Szérum szintje növekedik osteoporosisban Kapcsolatot mutattak ki az osteoporoticus csonttörések, a BMD és a Hs00166156 m1 CTSK szérum szintje között. Hs00196183 m1 Növeli a csontbontást és emeli az ECM molekulák szitézisét. Fokozza a csontsejtek érését. Ligand-független módon képes az ösztrogén receptorok aktiválására. Az EGF molekulák tirozin kináz típusú receptora. Összefüggést mutattak ki az IGF1 szérum szintje és az osteoporosis között. Növeli az osteoblastok proliferációját, az ECM és kollagén szintézist. Gátolja az MMP13 aktivitást és a kollagén degradációt. Képes az ösztrogén receptorok ligand-független aktiválására. Az IGF molekulák tirozin kináz típusú receptora. Fokozzák a sejt osztódást és ECM szintézist. Az FGF2 növeli az MMP13 expressziót. Nincs hatásuk az érett csontsejteken Szerepük van az osteoblastok elköteleződésében. Az FGF

molekulák tirozin kináz típusú receptora. Az osteoblastok szekretálják. Stimulálja a sejtproliferációt, DNS replikációt és ECM szintézist. A mezenchymális progenitor sejtek migrációját segíti Szerepe van a chondrális csontformációban. 8p21 0.67 0.96 1q21 0.54 0.09 4q25 7p12 ND 0.79 1.00 12q22-q23 15q26.3 0.35 0.74 0.11 0.31 5q31 0.79 0.81 4q26-q27 0.94 0.52 0.81 0.09 0.47 0.59 0.05 0.42 50 51 EGF EGFR epidermal growth factor epidermal growth factor receptor Hs00153181 m1 Hs00193306 m1 52 53 IGF1 IGF1R insulin-like growth factor 1 (somatomedin C) insulin-like growth factor 1 receptor Hs00153126 m1 Hs00181385 m1 54 FGF1 fibroblast growth factor 1 (acidic) Hs00265254 m1 55 56 FGF2 FGFR1 Hs00266645 m1 Hs00241111 m1 57 58 PDGFA VEGF Sejtadhéziós molekulák fibroblast growth factor 2 (basic) fibroblast growth factor receptor 1 platelet-derived growth factor alpha polypeptide vascular endothelial growth factor 59 ICAM1

intercellular adhesion molecule 1 (CD54) Hs00164932 m1 Elősegíti az osteoclastgenezist. Liganduma LFA1 60 61 62 VCAM1 ITGA1 ITGA2 64 65 66 67 68 CD36/SCARB3 Ösztrogén regulált gének TNF IL1A IL1B IL1RAP IL6 Hs00174239 m1 Elősegíti az osteoclastgenezist. Liganduma VLA4 Hs00235006 m1 Szerepük van a sejt-sejt és sejt-ECM interakciókban. Hs00158127 m1 Elsősorban zsírsejtekben expresszálódik, csak kis mértékben fejeződik ki csontsejteken. Ligandumai zsírsavak és lipoproteinek Kifejeződését a PPAR gamma szabályozza. Hs00169627 m1 1p32-p31 5q11.2 63 vascular cell adhesion molecule 1 integrin, alpha 1 integrin, alpha 2 (CD49B) CD36 antigen (collagen type I receptor, thrombospondin receptor, scavenger receptor class B, member 3) tumor necrosis factor alpha interleukin 1, alpha interleukin 1, beta interleukin 1 receptor accessory protein interleukin 6 (interferon, beta 2) 69 TNFSFR11/OPG 70 TNFSF11/RANKL 71 CSF2 osteoprotegerin receptor activator of

nuclear factor kappa B ligand colony stimulating factor 2 (granulocytemacrophage) Hs00234994 m1 Hs00173626 m1 8p11.2-p111 7p22 6p12 19p13.3p132 0.51 0.13 5q23-q31 0.63 1.62 0.97 0.96 0.47 0.89 7q11.2 3.22 0.03 Hs00174128 m1 Hs00174092 m1 Gyulladásos citokinek. Fokozzák az osteoclastok aktivitását Fontos szerepet Hs00174097 m1 töltenek be a menopausát követő gyors csontvesztésben. Hs00158057 m1 Hs00174131 m1 RANKL ”csapda” receptora. Gátolja a RANK-RANKL interakciót, továbbá Hs00171068 m1 az osteoclastok érését, aktivációját. 6p21.3 7p21 0.86 ND 0.19 0.54 0.25 0.67 0.16 0.11 0.09 8q24 1.51 0.31 Hs00243519 m1 Fokozza az osteoclastok differenciálódását, aktivációját. Szükségesek az osteoclastok hemopoetikus őssejtekből történő Hs00171266 m1 differenciálódásához. 13q14 0.86 0.74 5q31.1 ND - 44 2q14 2q14 3q28 72 73 74 CSF3 ESR1 ESR2 Egyéb kandidáns gének colony stimulating factor 3 (granulocyte) estrogen receptor

1 (alpha) estrogen receptor 2 (beta) 75 76 CASR KL calcium-sensing receptor klotho 77 78 ALPL APOE alkaline phosphatase, liver/bone/kidney apolipoprotein E 79 ALOX15 80 VDR Transzkripciós faktorok arachidonate 15-lipoxygenase vitamin D (1,25- dihydroxyvitamin D3) receptor Kapcsolatot mutattak ki a csökkent csonttömeg és a gén polimorfizmusa között. Hs00173436 m1 Hs00183100 m1 Összefüggést mutat a szérum osteocalcin szintje és a gén polimorfizmusa. Mineralizáló enzim, melyet az osteoblastok termelnek. Osteoporosisban Hs00758162 m1 csökken a szérum szintje. Hs00171168 m1 Asszociációt találtak a gén genotípusai és a csökkent BMD között. Lipid peroxidáz enzim. Összefüggés mutatható ki a gén egypontos nukleotid Hs00609608 m1 polimorfizmusa és a BMD között. Számos osteoblast specifikus gén tartalmaz VDR responsive elemet. Kapcsolatot találtak a gén polimorfizmusa és a BMD között. Hs00172113 m1 81 TWIST1 twist homolog 1 Hs00361186 m1

82 83 TWIST2 MSX1 twist homolog 2 msh homeo box homolog 1 84 MSX2 msh homeo box homolog 2 Hs02379973 s1 Általános transzkripciós inhibitor. Csökkenti az osteoblastok aktivitását Hs00427183 m1 Szerepe van a csont morphogenezisében. Szerepe van az osteogenezisben. Fokozza az osteoblastok, míg gátolja a zsírsejtek differenciálódását a közös mezenchymális őssejtekből. Hs00751239 s1 Kifejeződését a BMP2 serkenti. 85 SOX9 86 NFKB1 SRY (sex determining region Y)-box 9 nuclear factor of kappa light polypeptide gene 87 RUNX2 Endogén kontrollok ACTB GAPDH 88 89 Hs00236884 m1 Hs00174860 m1 Kapcsolatot találtak az ösztrogén receptor gének polimorfizmusai és a BMD között. Szerepük van a postmenonauzális osteoporosis kialakulásában Hs00230957 m1 Fontos szerepe van az osteoprogenitor sejtek elköteleződésében. Mutációja Saethre-Chotzen szindrómát okoz. runt-related transcription factor 2 Hs00165814 m1 Szükséges a csontvelői őssejtek

porcsejt irányba történő elköteleződésében. A növekedési faktor/MAPK jelpálya és a RANKL rendszer transzkripciós Hs00231653 m1 faktora. A legfontosabb osteoblat specifikus transzkripciós faktor. Szabályozza az osteoblast specifikus gének kifejeződését. Szükséges az osteoblast differenciálódáshoz. Indirekt módon, az osteoblastokon keresztül befolyásolja az osteoclastok működését. Hiánya cleidocranialis dysplasiat Hs00231692 m1 okoz. actin, beta glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Hs99999903 m1 Az actin család tagja, citoszkeletális fehérje. Hs99999905 m1 Szerepe van a szénhidrát anyagcserében és a glikolízisben. 45 ND 0.58 0.63 0.54 0.42 13q12 ND 0.68 1.00 1p36.1-p34 19q13.2 0.41 1.27 0.02 0.74 17p13.3 0.32 0.09 12q12-q14 1.18 0.67 7p21.2 0.65 0.47 2q37.3 4p16.3-p161 3.86 ND 0.02 - 5q34-q35 17q24.3q251 0.11 0.27 0.83 0.81 4q24 0.44 0.02 6p21 0.76 0.42 17q11.2-q12 6q25.1 14q 3q21-q24 7p15-p12 12p13 A

táblázatban szereplő géneket jelátviteli mechanizmusok, valamint funkcionális és fiziológiás szerepük szerint csoportosítva tüntettük fel. a , A gének általánosan elfogadott és használt szimbólumai, illetve nevei a standard ”GeneCards” alapján (www.genecardsorg) b , A real time RT-PCR reakciók során használt génspecifikus TaqMan alapú ABI expressziós kitek gyártási/azonosítási számai. c , Kommentár: a vizsgált gének szerepe a csont élettanában, a csontszövet fejlődésében, az osteoporosis kialakulásában. d , Relatív génexpressziós arányok osteoporoticus vs. nem osteoporoticus csontszövetben (ND: a PCR reakció során fluoreszcens jelet nem detektáltunk). e , Mann-Witney U teszt szignifikancia értékei. Dőlt betűvel jelöltük azon géneket, amelyek esetén az expressziós változás mértéke szignifikáns különbséget mutatott (p ≤ 0.05) 5.12 Szarvas microarray eredmények validálása humán

csontszövetben A 9. táblázat a szarvas ciklikus fiziológiás osteoporosis transzkriptomikai vizsgálata során megismert 31 gén humán osteoporoticus és nem osteoporoticus csontszövet mintán elvégzett, illetve validált kvantitatív valós idejű RT-PCR adatait foglalja össze. Univariáns Mann-Whitney U teszt segítségével azonosítottunk két szignifikánsan eltérő mértékben kifejeződő gént; a tartarát rezisztens savi foszfatáz 5 (ACP5) és az immunoglobulin szupercsalád 4. tagja (IGSF4) Mindkét gén expressziós aktivitása több, mint a felére csökkent az osteoporoticus humán csontban. Azaz, az ACP5 génspecifikus mRNS szintje 043-szor alacsonyabb volt, míg IGSF4 esetén 0.36-szoros expresszió csökkenést tapasztaltunk 46 9. táblázat A szarvasmodellben fellelt gének kvantitatív valós idejű RT-PCR adatai osteoporoticus és nem osteoporoticus humán csontban Gímszarvas gének humán validálása GÉN SZIMBÓLUMOKa Gén neveka ABI Assay

azonosítási számokb 1 ACP5 acid phosphatase 5, tartrate resistant Hs00356261 m1 2 ANXA1 annexin A1 Hs00167549 m1 3 ANXA2 annexin A2 Hs00743063 s1 4 APOD 5 ATP2A2 apolipoprotein D Hs00155794 m1 ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle, slow twitch 2 Hs00155939 m1 6 BMPR2 bone morphogenetic protein receptor, type II Hs00176148 m1 (serine/threonine kinase) 7 CKB creatine kinase, brain 8 COL5A2 9 CTNNB1 10 DUSP9 11 EIF3S4 12 ENO1/MBP1 13 FABP3 14 FABP4 15 FKBP2 16 IGSF4 17 LRP4 collagen, type V, alpha 2 Hs00169768 m1 catenin (cadherin-associated protein), beta 1, 88kDa Hs00170025 m1 WNT hálózat központi jelátvívő komponense. Kettős specificitású: szerin/threonin és tirozin foszfatáz. Gátolja a MAPK útvonalat. Expresszióját a glükokortikoidok befolyásolják dual specificity phosphatase 9 Hs00154830 m1 eukaryotic translation initiation factor 3, Riboszómához kapcsolódva segíti a tRNS és mRNS kapcsolódást, valamint a

subunit 4 delta, 44kDa Hs00186772 m1 fehérje átíródást. Multifunkcionális enzim, részt vesz a glikolízisben, a szénhidrát és energia enolase 1, (alpha) / c-myc promoter-binding homeosztázis, továbbá a sejtnövekedés szabályozásában. C-myc Hs00361415 m1 protein protoonkogén promoteréhez kapcsolódva a transzkripciót gátolja. fatty acid binding protein 3, muscle and heart Szerepet játszik a zsírsavak intracelluláris transzportjában, (mammary-derived growth inhibitor) Hs00269758 m1 metabolizmusában. Befolyásolja a sejtproliferációt Zsírsejtekben található izoforma. Részt vesz a hosszú láncú zsírsavak felvételében és szállításában. fatty acid binding protein 4, adipocyte Hs00609791 m1 Alapvető celluláris folyamatokat befolyásol, továbbá ”chaperon” funkciót FK506 binding protein 2, 13kDa Hs00234404 m1 tölt be, mint fehérje feltekerés, vezikula transzport. Immunglobulin-szerű intracelluláris adheziós molekula. Aktin filamentumokhoz

kapcsolódva a citoszkeletális jeltovábbításban vesz immunoglobulin superfamily, member 4 Hs00204937 m1 részt. Az ösztrogén-receptorok egyik célgénje low density lipoprotein receptor-related A WNT jelátviteli kaszkád feltételezett negatív regulátora. / Génkiütött protein 4 Hs00391006 m1 egerekben romlik a csontképződés és a kalcifikáció. Hs00176484 m1 c Biológiai funkciók, hatások Az osteoclastok által termelt Fe tartalmú glikoprotein. Fokozott csontturnover során szérum szintje megemelkedik. Génhiányos egerekben gyenge osteopetrosis alakul ki. 2+ Ca -függő és foszfolipid kötő protein. A migrációban és az exocitózis folyamatában is érinett. Gátolja a prosztaglandinok és a leukotriének képződését, ezáltal a gyulladás kialakulását. / A csont mineralizációs folyamatait befolyásolja. Génkiütött egerekben károsodik a csontosodás Ca-függő és foszfolipid kötő protein. / Autokrin módon fokozza az osteoclast képződést és

a csontbontást. Az α2 microglobulin szupercsalád tagja. HDL komplex része Részt vesz a lipid metabolizmusban és a zsírsav transzportban. ATP hidrolízis terhére Ca2+-t pumpál a citoplazmából az ER lumenébe. Szerepe van az intracelluláris Ca2+ jelátvitelben. Transzmembrán, szerin/threonin kináz típusú BMP receptor. A dimer BMP receptor komplex ligandkötő tagja. / Jeltovábbító szerepe van a csontosodási folyamatokban. Szabályozza az energia homeosztázist. ATP-ről történő foszfát áthelyezésben vesz részt. / Kifejeződését a D3 vitamin és az ösztrogén is szabályozza Osteopetrosisban ill. magas BMD esetén szérum szintje megemelkedik Szabályozza az I. típusú kollagén rostok elrendeződését, szerveződését Mutációja Ehlers-Danlos szindrómát okoz. 47 Humán kromoszóma lokalizációk RQ OP / RQ NOPd p értékeke 19p13.3p132 0.43 0.02 9q12-q21.2 0.61 0.06 15q21-q22 0.52 0.81 3q26.2-qter 1.53 0.31 12q23-q24.1 1.51 0.81

2q33-q34 2.11 0.07 14q32 0.68 0.81 2q14-q32 0.70 0.54 3p21 1.02 0.38 Xq28 ND - 19p13.2 0.72 0.27 1p36.3-p362 0.98 0.96 1p33-p32 0.46 0.07 8q21 11q13.1q133 2.57 0.06 0.58 0.16 11q23.2 0.36 0.03 11p11.2-p12 0.88 0.96 a NLK nemo like kinase 17q11.2 1.10 0.96 19 OSTF1 osteoclast stimulating factor 1 Hs00273458 m1 Az osteoclastok által termelt faktor, mely a csontbontást fokozza. 9q13-q21.2 1.18 0.42 20 SERF2 small EDRK-rich factor 2 Hs00428481 m1 Nincs elérhető adat. 15q15.3 0.75 0.54 21 SFRS7 splicing factor, arginine/serine-rich 7, 35kDa 2p22.1 0.90 0.96 22 SOX4 6p22.3 3.29 0.89 23 SP7 12q13.13 0.71 0.54 24 TCF7L2 10q25.3 0.98 1.00 25 TIMP2 Hs00196708 m1 Irányítja a pre-mRNS érését és az alternativ splicing folyamatát. Szabályozza az embrionális fejlődést és az apoptózist. / A PTH és a PTHrP SRY (sex determining region Y)-box 4 Hs00268388 s1 hatását közvetíti a csontképződés során.

Osteoblast specifikus transzkripciós faktor. Az osteoblastgenezist Sp7 transcription factor Hs00541729 m1 szabályozza. A WNT útvonal transzkripciós faktora. CTNNB1 hiányában gátolja a WNT jelátvitelt, jelenlétében azonban pozitívan szabályozza. Kifejeződését transcription factor 7-like 2 (T-cell specific, BMP-k és az ösztrogén is szabályozzák. HMG-box) Hs00181036 m1 A csontosodási területeken gátolja a metalloproteinázok működését és szabályozza az ECM átépülést. tissue inhibitor of metalloproteinase 2 Hs00234278 m1 17q25 0.65 0.07 26 TMSB10 thymosin, beta 10 2p11.2 0.67 0.36 27 TMSB4X Xq21.3-q22 0.18 0.19 28 TNC 9q33 0.56 0.23 29 TNFAIP6 2q23.3 1.06 0.31 30 TRIB2 Hs00363670 m1 Fontos szerepet játszik a citoszkeleton szerveződésében. Szabályozza az actin polimerizációját, továbbá a sejtosztódási, migrációs és thymosin, beta 4, X chromosome Hs00864161 g1 differenciációs folyamatokat. ECM komponens.

Integrinekhez kapcsolódik Kifejeződését a TGFB szabályozza. tenascin C (hexabrachion) Hs00233648 m1 tumor necrosis factor, alpha-induced protein Szerepe van az ECM stabilizálásában és a sejtmigrációban. Expressziójára 6 Hs00200178 m1 hatást gyakorol a TNF és az IL-1. Befolyásolja a gyulladási folyamatokat Protein kináz, amely befolyásolja a MAPK jelátvitelt és a gyulladási tribbles homolog 2 (Drosophila) Hs00222224 m1 folyamatokat. 2p24.3 0.51 0.07 31 WIF1 WNT inhibitory factor 1 12q14.3 0.86 0.96 Hs00183662 m1 Gátolja a WNT jelátviteli hálózatot. Hatással van a mezoderma fejlődésére , A gének általánosan elfogadott és használt szimbólumai, illetve nevei a standard ”GeneCards” alapján (www.genecardsorg) b c 18 Szerin/threonin típusú protein kináz. Negatívan szabályozza a WNT útvonalat. / Génkiütött egerekben abnormláis csontvelő fejlődik Szerepe Hs00212076 m1 van a csontvelői őssejtek differenciálódásában. , A

real time RT-PCR reakciók során használt génspecifikus TaqMan alapú expressziós kitek gyártási/azonosítási számai. , Kommentár: a vizsgált gének biológiai funkciói. Dőlt betűvel emeltük ki a gének csontsejtekkel, csontszöveti anyagcsere folyamatokkal kapcsolatos összefüggéseit. d , Relatív génexpressziós arányok osteoporoticus vs. nem osteoporoticus csontszövetben (ND: a PCR reakció során jelet nem detektáltunk) e , Mann-Witney U teszt szignifikancia értékei. Vastag betűvel szedve jelöltük azon géneket, amelyek esetén az expressziós változás mértéke szignifikáns különbséget mutatott (p ≤ 0.05) 48 5.13 A humán csontszövet transzkriptomikai adatainak főkomponens analízise (PCA) A PCA vizsgálat során az irodalmi adatok és online adatbázisok alapján szelektált, a csontanyagcserében és a csontvesztésben szerepet játszó 89 gén expressziós adatait elemeztük. A standardizált PCA első két komponense 30.4% és

284%-át képviseli a teljes variációnak A további komponenseket (9.8%-tól kezdődően) kizártuk az értékelésből, mert a scree teszt eredményei alapján ezek csak a véletlenszerű változásokért felelősek (10. ábra) A postmenopusás osteoporoticus nők mérsékelt génexpressziós aktivitással jellemezhetők, ezért egy relatív kompakt csoportot képeznek közel az origohoz. A nem osteoporoticus személyek ettől pozitív irányban helyezkednek el a fokozottabb csontszöveti génműködésük következtében (10. ábra) Az 1-es főkomponens mentén a NOP12, míg a 2-es főkomponens mentén a NOP07 személy elkülönül a postmenopausás nem osteoporoticus csoporttól az erősen emelkedett transzkripciós aktivitása alapján. Emellett a NOP11 és NOP13 személyek erősen csökkent génexpressziós értékeket mutatnak mindkét komponens mentén, míg a Component 2 NOP02 és NOP15 nők az osteoporoticus minták közé keverednek. 16 15 14 13 NOP07 12 11 10 9 8 7 6 5

NOP01 4 NOP04 3 2 OP01 OP03 1 NOP14 OP02 0 NOP02 -1 NOP10 OP07OP04NOP15 -2 NOP11 OP05 OP10 -3 -4 NOP13 -5 -6 -7 -8 -9 -6 -4 -2 0 2 4 6 Component 1 NOP12 8 10 12 14 16 10. ábra A PCA diagramon a 17 vizsgált nő pozíciója látható a két főkomponens mentén A csontszöveti komplex génexpressziós mintázat alapján a postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus fenotípusok elkülönülnek egymástól. A nagyon hasonló 49 transzkripciós aktivitással rendelkező osteoporoticus nők (fehér OP) egy diszkrét csoportot képezve elválnak a nem osteoporoticus (fekete NOP) nőket magában foglaló halmaztól. A biplot diagramon a személyek és a gének pozícióját egyszerre tüntettük fel, ahol a gének felé mutató nyilak iránya és hossza a génexpresszió mértékével arányos (11. ábra) Megmutatja, hogy a szignifikánsan (p ≤ 0.05) megváltozott expressziós mintázattal rendelkező géneken kívül mely géneknek lehet még fontos szerepe a

csontszövet osteoporoticus és nem osteoporoticus állapotainak éles elkülönítésében. A szignifikánsan eltérő kifejeződésű ALPL, MMP9, NFKB1, PDGFA gének mellett további 20 gén (elsősorban adheziós molekulák, pl: ICAM1, ITGA1, VCAM1; növekedési faktorok és receptorok, pl: FGF2, IGF1, VEGF, EGFR, FGFR1, IGF1R) felelős a NOP12, NOP14 és NOP10 személyek elválásáért. A COL1A1, MMP13, MMP2 és számos kollagén típusú extracelluláris mátrix molekula határolja el a NOP07, NOP01 és NOP04 nőket a csoport többi tagjátol (11. ábra) A TWIST2 és CD36 gének az osteoporoticus csoport felé mutatnak, kifejeződésük pedig negatívan korrelál szinte az összes génnel. A VDR és SMAD3 gének hasonló viselkedése az OP05 személy pozícióját jellemzi legjobban. 50 Component 2 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 COL1A2 COL5A1 COL12A1 COL7A1 ACVR1 COL11A1 COL3A1 ALOX15 COL14A1 BMP1BMP2 TWIST1 NOP07 MMP2 MMP13 COL15A1

BMPR1A BMP8B ACVR2 TGFB3 CTSK ITGA2 COL1A1 TGFBR1 FN1COL10A1BGLAP APOE COL9A1 NOP01 TNFSF11 IL-1RAP INHBA SOX9 TNFRSF11 NOP04 SMAD2 TWIST2 BGN MGP COL2A1 RUNX2 SPARC OP01 PDGFA OP03 BMP3 NOP14 SPP1 TGFB2 ICAM1 IGF1 OP02 ITGA1 DCN NOP02 EGFR FGFR1 FGF1 IL-6 TGFBR2 MSX2 NOP10 NOP15 KL COL4A4 NFKB1 OP07OP04 CD36 BMP4 SMAD1SMAD4 INHA VEGF IL-1B OP05 ALPL NOP11 SOST NOP12 OP10 MMP9 TGFB1 FGF2 VCAM1 SMAD3 NOP13 VDR ESR1 LRP5 IGF1RESR2 TNF MMP8 -6 -4 -2 0 2 4 6 Component 1 8 10 12 14 16 11. ábra A PCA biplot ábra a vizsgált személyek és a gének pozícióját egyszerre jeleníti meg Az osteoporoticus csontminták (fehér OP) globálisan alacsonyabb génaktivitással jellemezhetők szinte minden analizált gén tekintetében. Kivételt képeznek a CD36 és TWIST2 gének, amelyek szigifikánsan fokozott expressziót mutatnak a korral járó osteoporoticus állapot irányában. A postmenopausás stádiumban lévő nem osteoporoticus csontszövet (fekete NOP) különböző

mértékben emelkedett transzkripciós profillal rendelkezik. Számos minor kollagén molekulát kódoló gén (COL5A1, COL7A1, COL11A1, COL12A1, COL14A1) a 2-es főkomponens mentén, illetve néhány növekedési faktor génje (EGFR, IGF1, FGFR1, PDGFA, TGFB1, VEGF) az 1-es főkomponens mentén mutat nagyon jelentős génátíródási aktivitást. Míg az ITGA1, KL, SOX9, TNFRSF11/OPG szintje rendkívül alacsony marad a nem osteoporoticus nőkben. 51 Erős korrelációt találtunk az 1-es főkomponens mentén pozitív irányban elhelyezkedő nem kollagén mátrix proteineket (BGN, DCN, MGP, SPARC) és növekedési faktorokat kódoló gének, valamint a különféle kollagén molekulák (COL1A2, COL3A1, COL5A1, COL7A1, COL11A1, COL12A1) között a 2-es főkomponens mentén (12. ábra) Összefoglalva, az 1-es főkomponens (PC1) meghatározza a nem kollagén ECM struktúr fehérjéket és növekedési faktorokat, míg a 2-es főkomponens (PC2) a kollagéneket tükrözi. Mindkét

géncsoport (PC1 és PC2) hasonlóan emelkedett expressziós mintázattal rendelkezik a nem osteoporoticus nők csontszövetében. Az említett két csoportokba tartozó szorosan kapcsolt géneknek alul szabályozódása külön-külön is osteoporoticus állapot kialakulásához Component 2 vezethet (12. ábra) 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 COL1A2 COL5A1 COL12A1 COL7A1 COL3A1COL11A1 COL14A1 COL15A1 COL1A1 BGLAP FN1COL10A1 COL9A1 MGP BGN COL2A1 SPARC SPP1 FGF1 COL4A4 PDGFA IGF1 DCN EGFRFGFR1 NFKB1 VEGF FGF2 IGF1R -6 -4 -2 0 2 4 6 Component 1 8 10 12 14 16 12. ábra A szoros korreláció alapján két géncsoportot különböztettünk meg az 1-es és 2-es főkomponensek mentén. A PC2 csoportot (fekete) kollagén molekulák alkotják, míg a PC1 csoportba (fehér) nem kollagén típusú mátrix proteinek és növekedési faktorok tartoznak. 52 5.14 A vizsgált nők csontszöveti génexpressziós mintázatának

többváltozós diszkriminancia analízise (DFA) Diszkriminancia adatelemzést alkalmaztunk, hogy az osteoporoticus és nem osteoporoticus csoportokat multidimenzionális térben elkülönítsük a csontszöveti génexpressziós adataik alapján, illetve, hogy a vizsgált 89 génből meghatározzuk azokat a géncsoportokat, amelyek a legnagyobb diszkriminációs képességgel rendelkeznek. Nyolc génhalmazt jellemeztünk különböző csoportosítási szempontok alapján (13. ábra) Vizsgáltunk egy diagnosztikus markereket tartalmazó gén szettet (8 gén). A géncsoportba olyan komponenseket soroltunk, amelyek szérum szintje, expressziós változásai, vagy genetikai polimorfizmusai kapcsolatot mutatnak a csontsűrűséggel és a fokozott csontturnover-rel (1, 37, 44, 87). Egy 9 génből álló halmazt a Mann-Whitney teszt eredményei alapján válogattuk. A PCA elemzés 1-es és 2-es főkomponensei mentén elhelyezkedő gének; PC1 (16 gén) és PC2 (13 gén) két csoportot

alkottak. Számos csoportot a különböző jelátviteli útvonalak kategorizálásával alakítottunk ki, mint a kanonikus TGFB/activin/nodal útvonal (12 gén) (88), BMP kaszkád (9 gén) (89, 90), illetve olyan gének, melyek az ösztrogén jelátvitel szabályozása alatt állnak (8 gén) (19, 91). Végül, az elvégzett kvantitatív valósidejű PCR analízis alapján definiáltunk egy szettet, amely 3-szor, vagy annál nagyobb mértékben alul-expresszálódó géneket tartalmazott (9 gén). Az 1-es főkomponenst (PC1) alkotó, elsősorban növekedési faktorokat és receptoraikat, illetve nem kollagén típusú ECM molekulákat kódoló gének rendelkeztek a legnagyobb megkülönböztető erővel, amely egyértelműen szétválasztotta a postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus csoportokat. A TGFB/activin/nodal szabályozási útvonalhoz kapcsolódó gének és az osteoporoticus személyek csontszövetében 3-szor, illetve annál nagyobb mértékben csökkent

transzkripciót mutató gének szintén erős korrelációt mutattak a kanonikus változóval, és a vizsgált OP és NOP nők két csoportjának határozott szétválasztását tették lehetővé (13. ábra) 53 6 NOP OP 4 2 0 -2 -4 -6 -8 Diagnosztikus markerek Gének Korr. neve KV Mann-Whitney U teszt Korr. KV Főkomponens-1 0.782 ALPL 0.680 FGF2 -0.027 COL1A1 0.532 BMP2 0.531 ACVR2 0.292 TNFRSF11 0.747 MMP13 0.676 MGP -0.117 COL10A1 0.385 BMP4 0.504 TGFBR1 0.239 TNFSF11 ESR1 0.362 COL1A1 0.651 COL2A1 -0.119 COL12A1 0.342 SMAD4 0.462 SMAD3 ESR2 0.235 MMP2 0.646 FGF1 -0.120 COL1A2 0.334 BMP3 0.404 INHA TNFSF11 0.119 NFKB1 0.548 EGFR -0.123 COL9A1 0.333 BMP8B 0.328 ACVR1 -0.059 ESR1 -0.382 MSX2 -0.413 BGLAP -0.044 PDGFA 0.531 IGF1R -0.141 COL3A1 0.302 SMAD1 0.165 SMAD2 -0.063 IL-6 -0.428 IL-1B -0.425 VDR -0.131 MMP9 0.478 DCN -0.173 COL5A1 0.296 BMPR1A -0.086 IL-1B -0.536 COL10A1 -0.476 TNFRSF11 -0.186 TWIST2 -0.687

VEGF -0.267 COL7A1 0.281 INHBA -0.183 IL1-RAP -0.657 COL4A4 -0.499 -0.761 SPP1 -0.269 COL11A1 0.217 SMAD4 -0.275 BGN -0.384 COL15A1 0.101 TGFB2 -0.280 SPARC -0.391 COL14A1 0.014 TGFB1 -0.335 FGFR1 -0.392 BGLAP -0.031 TGFB3 -0.521 COL4A4 -0.394 FN1 -0.042 PDGFA -0.409 -0.414 -0.419 Gének neve Korr. KV 3x alulexpresszálódó gének Gének Korr. neve KV COL1A1 NFKB1 Korr. KV TGFB/activin/nodal Ösztrogén regulált jelpálya gének Gének Korr. Gének Korr. neve KV neve KV ALPL IGF1 Gének neve BMP jelpájya Gének neve CD36 Korr. KV Főkomponens-2 Gének neve -0.291 TGFBR2 0.197 ALOX15 -0.190 -0.125 SOST -0.321 -0.006 TNF -0.225 IL-6 -0.340 -0.055 ESR2 -0.248 COL9A1 -0.391 MMP13 -0.652 13. ábra Hét postmenopausás osteoporoticus (OP, fehér vonal) és tíz postmenopausás nem osteoporoticus (NOP, fekete vonal) nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise. A legtökéletesebb

szétválás a PC1 génhalmaz esetén állapítható meg. Szintén nagyon éles különbség tapasztalható a PC2 géncsoport és a kanonikus TGFB/activin/nodal szignalizációs jelpálya esetén is. A nyolc halmazt meghatározó humán gének ”Gene Cards” (www.genecardsorg) által elfogadott rövidített neveit a korrelációs értékekkel együtt (korreláció a kanonikus változóval, KV) táblázatban foglaltuk össze. 54 5.15 A szarvasmodell-gének humán csontszöveti kifejeződésének diszkriminancia analízise A szarvas vizsgálatok során megtalált további 31 gén felhasználásával újabb géncsoportok létrehozására nyílt lehetőségünk. A DFA elemzéshez ez esetben öt csoportot jellemeztünk (14. ábra) Az osteoporosis és regeneráció csoportokba olyan géneket tartoznak, melyek átíródása a szarvas ciklikus fiziológiás csontvesztésének (osteoporoticus fázis) majd visszapótlásának (regenerációs fázis) időszakában az állat bordájából

vett csontszövet mintákban markánsan megváltozott. Egy szett hét, a lipidkörforgalomban érintett gént tartalmazott. Két csoportot a különböző szignalizációs hálózatok kategorizálásával alakítottunk ki, mint a MAPK útvonalon szabályozó növekedési faktorok, illetve a WNT kaszkád (8, 92, 93). Az osteoporoticus és nem osteoporoticus csontfenotípusok egyértelműen éles elválását láttuk a szarvas fiziológiás osteoporosist leíró gének, illetve a MAPK jelátviteli rendszer esetén. 6 NOP OP 4 2 0 -2 -4 -6 -8 Osteoporosis Regeneráció Gének neve Korr. KV WNT útvonal COL1A1 0.552 COL1A1 0.718 CD36 0.785 FGF2 -0.030 LRP!4 0.273 IGSF4 0.534 TIMP2 0.591 FABP4 0.755 FGF1 -0.129 WIF1 0.213 FKBP2 0.362 FKBP2 0.470 APOD 0.328 EGFR -0.134 TCF7L2 TMSB4X 0.279 EIF3S4 0.430 APOE 0.198 IGF1R -0.152 LRP5 CKB 0.178 COL3A1 0.407 LRP5 COL5A2 0.147 COL5A2 0.190 ALOX15 -0.204 FGFR1 0.133 FABP3 -0.479 PDGFA 0.080 LRP4 Korr. KV

Növekedési faktorok/MAPK Gének Korr. neve KV Korr. KV WIF1 Gének neve Zsíranyagcsere Gének neve 0.028 VEGF Gének neve Korr. KV 0.070 -0.061 -0.286 CTNNB1 -0.065 -0.421 NLK -0.209 -0.436 CTNNB1 -0.025 SFRS7 0.109 IGF1 -0.444 FN1 -0.043 ENO1 0.046 NFKB1 -0.450 OSTF1 -0.223 FABP4 -0.621 14. ábra Postmenopausás osteoporoticus (OP, fehér vonal) és nem osteoporoticus (NOP, fekete vonal) nők csontszövetében mért szarvas specifikus gének expressziós mintázatának diszkriminancia analízise. 55 Az öt halmazt meghatározó humán gének ”Gene Cards” (www.genecardsorg) által elfogadott rövidített neveit a korrelációs értékekkel együtt (korreláció a kanonikus változóval, KV) táblázatban foglaltuk össze. 5.16 A vizsgált csoportok mRNS expressziós profil meghatározásának hierarchikus cluster analízise A HCL analízis segítségével a nagyon hasonló vagy homológ expressziós mintázattal rendelkező géneket

hierarchikus csoportokba rendeztük. Az elemzésbe bevontuk mind az irodalmi adatok alapján válogatott, mind pedig a szarvason végzett előzetes genetikai analízisek nyomán, humán mintákon tesztelt géneket. Így összesen 120 gént vizsgáltunk egyszerre (15. ábra) Az ábrán feltűntettük az osteoporoticus (n=7) és nem osteoporoticus (n=10) nők átlag RQ értékeit, valamint az osteoporoticus betegek egyedi értékeit külön-külön. Karakterizáltunk egy leágazási vonalhoz tartozó, 18 tagból álló géncsoportot, amely azonos mértékben csökkent mRNS expressziós profoillal rendelkezik az osteoporoticus csontban. A gének között találunk nagy számban minor kollagéneket (COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL7A1, COL9A1, COL10A1, COL12A1), mátrixbontó enzimeket (MMP9, MMP13) és lokális növekedési faktorokat (BMP2, IGF1, SOST). Továbbá egy, a mezenchymális őssejtek osteoblast vs. adipocita irányú differenciálódásának szabályozása szempontjából fontos

transzkripciós faktort (MSX2). 56 57 15. ábra A korábbi irodalmi adatok és a szarvas vizsgálatok által sugallt gének real time PCR adatainak hierarchikus cluster analízise. A gének közötti kapcsolatokat dendrogamon ábrázoltuk, ahol a fák egyes ágainak hossza a hasonlóság mértékével arányos. A transzkripciós változások számszerű arányának vizualizálásához piros-zöld színskálát használtunk. A zöld szín az adott gén átíródásának csökkenését mutatja, míg piros színnel a gén transzkripciós aktivitásának fokozódását jelöltük. Az ábra bal oldalán látható a hét osteoporoticus (Avg OP) és a tíz nem osteoporoticus (Avg NOP) nő RQ értékeinek átlaga, valamint az osteoporoticus betegek egyedi RQ értékei különkülön. 5.2 Post- és premenopausás nem osteoporoticus nők csontszöveti génexpressziós mintázatának vizsgálata A Mann-Whitney teszt alapján 29 szignifikánsan eltérő módon expresszálódó gént

találtunk (16. ábra) Funkcionális osztályozást követően ezek a gének a következők voltak: Hét kollagén molekula (COL2A1, COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL9A1, COL12A1, COL15A1), három nem-kollagén típusú extracelluláris mátrix protein (MGP, BGLAP, FN1) és két szerves mátrix bontó enzim (MMP13, BMP1) génkifejeződési mintázata szignifikánsan nagyobb volt a postmenopausás stádiumú nem osteoporoticus csontban. Postmenopausás nőkben a közös TGFB/BMP jelátviteli hálózatba tartozó öt gén (BMPR1A, TGFB2, TGFB3, TGFBR2, SMAD4) nagyobb transzkripciós aktivitását észleltük. Ugyanebben a csoportban két osteoblast specifikus transzkripciós faktor (RUNX2, SP7) és újabb kettő, amely a Wingless útvonalban (TCF7L2), illetve a porcsejtek érésében (SOX9) játszik szerepet, megnövekedett génexpressziós szintet mutatott. Két MAPK (mitogénaktivált protein kináz) kaszkád által szabályozott növekedési faktor génje (PDGFA, FGFR1), valamint két

osteoclast stimuláló faktor (TNFSF11/RANKL, IL6) és egy, a differenciálódott osteoblastokat jelző molekula (ALPL) génátíródása is felerősödött a postmenopausás csoportban. Az IGSF4 és a TRIB2 gének kifejeződését elsőként detektáltuk nem osteoporoticus humán csontszövetben. Azt találtuk, hogy ezek a gének nagymértékben expresszálódnak a postmenopausás csoportban. Az ENO1/MBP1 esetén szignifikánsan csökkent géntranszkripciós szintet figyeltünk meg. 58 Növekedési faktorok Growth Factors Extracellular Matrix Extracelluláris mátrixMolecules molekulák 100,00 1000,00 100,00 10,00 10,00 1,00 0,10 TGFB/BMP TGFB/BMPpathway útvonal Transcriptionfaktorok Factors Transzkripciós 100,00 100,00 10,00 10,00 1,00 1,00 FG FR 1 PD G FA BM P1 FN 1 M M P1 3 M G P BG L A P C O L2 A 1 C O L3 A 1 C O L5 A 1 C O L5 A 2 C O L9 A 1 C O L1 2A 1 C O L1 5A 1 1,00 Otherkandidáns Candidate gének Genes Egyéb 100,00 10,00 1,00 0,10 Gén

szimbólumok Expressziós arányok Gén szimbólumok p értékek COL2A1 COL3A1 8.07 5.62 COL5A1 COL5A2 COL9A1 COL12A1 9.60 4.82 5.63 5.30 0.02 BMPR1A 0.02 TGFB2 0.03 TGFB3 0.02 TGFBR2 0.04 SMAD4 0.02 COL15A1 MGP BGLAP FN1 6.59 3.28 5.52 4.02 0.01 0.02 0.01 0.01 MMP13 BMP1 3.70 3.12 PDGFA 2.81 FGFR1 3.85 Expressziós arányok T R IB 2 IG SF 4 IL -6 A L PL E N O 1 R U N X 2 0,00 T N FS F1 1 0,01 SP 7 T C F7 L2 0,01 0,01 SO X 9 0,10 BM PR 1A T G FB 2 T G FB 3 T G FB R 2 SM A D 4 0,10 p értékek 6.16 3.42 0.01 0.04 3.70 3.26 2.59 0.002 0.03 0.002 0.53 2.76 9.35 5.65 0.005 0.01 0.04 0.04 0.02 TCF7L2 0.04 3.02 0.01 TNFSF11 0.04 ALPL 0.005 IL6 21.57 2.48 0.01 0.02 7.28 3.94 2.10 0.02 0.02 0.02 ENO1 / MBP1 RUNX2 SOX9 SP7 IGSF4 TRIB2 16. ábra A szignifikánsan megváltozott expressziós mintázatot mutató 29 gén mRNS-ének relatív mennyisége 10 postmenopausás (fekete oszlop) és 7 premenopausás (fehér oszlop) nem osteoporoticus nő

csontszövetében Lg skálán feltüntetve. Táblázatban foglaltuk össze a génekhez tartozó relatív génexpressziós arányokat (RQ POST / RQ PRE) és a Mann-Witney U teszt szignifikancia értékeit. 59 Diszkriminancia adatelemzést alkalmaztunk, hogy a postmenopausás és premenopausás csoportot elkülönítsük a 120 gén csontszöveti génexpressziós adatai alapján, illetve meghatározzuk azokat a géncsoportokat, amelyek a legnagyobb szétválasztó erővel rendelkeznek. Kilenc génhalmazt válogattunk a többváltozós statisztikai analízishez (17 ábra) Az organikus ECM molekulákat (12 gén) és a közös TGFB/BMP útvonal elemeit (5 gén) tartalmazó két csoport szignifikánsan eltérően kifejeződő géneket tartalmazott (p ≤ 0.05); ezeket a Mann-Whitney teszt eredményei alapján válogattuk. Számos csoportot a különböző jelátviteli útvonalak kategorizálásával alakítottunk ki, mint a kanonikus TGFB/activin/nodal útvonal (12 gén) (88), BMP

kaszkád (9 gén) (89), WNT jelátviteli hálózat (6 gén) (8, 92, 93), növekedési faktorok, melyek MAPK típusú jeltovábbítás során szabályozódnak (9 gén), illetve olyan gének csoportjait, melyek az ösztrogén receptor-alfa (ER-alfa) (13 gén) (21, 94104) vagy az ösztrogén receptor-béta (ER-béta) (16 gén) (21, 96, 99, 100, 102, 105-107) ellenőrzése alatt állnak. A megmaradt csoport hét, a zsíranyagcserében érintett gént tartalmazott. Az ER-béta által szabályozott gének csoportja rendelkezett a legnagyobb megkülönböztető erővel, amely egyértelműen szétválasztotta a post- és premenopausás csoportokat. Az ER-alfa, a MAPK (mitogénaktivált protein kináz) és a TGFB/activin/nodal szabályozási útvonalakhoz kapcsolódó gének szintén erős korrelációt mutattak a kanonikus változóval és a vizsgált nem osteoporoticus nők két csoportjának határozott szétválasztását tették lehetővé (17. ábra) 60 12 - POST - PRE 10 8 6 4 2 0

-2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 -16 ECM (p <= 0.05) TGFB/BMP (p <= 0.05) Gének Korr. neve KV ER-alfa Gének neve ER-béta Gének neve Korr. KV Korr. KV Gének neve BGLAP 0.720 TGFB3 0.981 MMP9 0.250 COL7A1 MGP 0.624 TGFB2 0.723 IGF1 0.079 VEGF COL15A1 0.520 SMAD4 0.711 VEGF FN1 0.482 TGFBR2 COL2A1 0.476 BMPR1A Lipid anyagcsere Korr. KV Gének neve 0.041 FABP4 Korr. KV Növekedési faktorok/ MAPK Gének Korr. neve KV TGFB/activin/nodal Gének neve Korr. KV WNT útvonal Gének neve Korr. KV BMP útvonal Gének neve Korr. KV 0.384 IGF1 0.082 TGFB3 0.731 TCF7L2 0.878 SMAD4 0.717 -0.040 APOD 0.296 VEGF -0.044 SMAD4 0.638 LRP4 0.615 BMPR1A 0.570 -0.042 BMP4 -0.154 ALOX15 0.275 IGF1R -0.132 TGFB2 0.536 NLK 0.591 BMP3 0.481 0.702 BMP4 -0.162 TNF -0.175 LRP5 0.222 FGF2 -0.303 TGFBR2 0.523 WIF1 0.502 BMP2 0.425 0.678 TGFB1 -0.188 TGFB1 -0.179 FABP3 -0.183 NFKB1 -0.376 TGFBR1 0.383 CTNNB1 0.252 BMPR2 0.219 BMP4 0.292 MMP13 0.452

CTNNB1 -0.192 COL11A1 -0.309 APOE -0.377 EGFR -0.424 INHBA 0.375 LRP5 COL12A1 0.412 BMP2 -0.384 TWIST1 -0.371 CD36 -0.472 PDGFA -0.480 ACVR1 0.363 SMAD1 0.160 COL5A1 0.408 OPG -0.385 SPP1 -0.412 FGF1 -0.523 ACVR2 0.281 BMP8A 0.082 0.179 COL3A1 0.381 - MMP13 -0.459 BMP3 -0.426 FGFR1 -0.621 SMAD2 0.237 BMP8B -0.437 COL5A2 0.339 PDGFA -0.461 PDGFA -0.439 TGFB1 COL9A1 0.276 TGFB2 -0.545 SOX9 -0.448 INHA BMP1 0.238 RUNX2 -0.631 FGF1 -0.480 SMAD3 TGFB3 -0.740 TGFBR2 0.186 0.136 -0.044 -0.504 ALPL -0.513 TGFB2 -0.525 RUNX2 -0.601 17. ábra Tíz postmenopausás nem osteoporoticus (POST, fekete vonal) és hét premenopausás nem osteoporoticus (PRE, fehér vonal) nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia analízise. A legtökéletesebb szétválás az ER-béta által szabályozott gének esetén állapítható meg. Szintén nagyon éles különbség tapasztalható három géncsoport, az ER-alfa

jelátvitel, a TGFB/activin/nodal útvonal és a növekedési faktorok/MAPK kaszkád esetén is. A kilenc halmazt meghatározó humán gének ”Gene Cards” (www.genecardsorg) által elfogadott rövidített neveit a korrelációs értékekkel együtt (korreláció a kanonikus változóval, KV) táblázatban foglaltuk össze. 61 5.3 Új génpolimorfizmusok összefüggése a postmenopausás csonttömeggel 5.31 A vizsgálatok egyes paramétereit leíró statisztikai analízisek eredményei A SNPstream képességű genotipizálási módszer technikai pontossága 100%-os volt vizsgálatunkban, azaz a párhuzamosan genotipizált minták eredményeiben nem volt eltérés. A végső adatbázisunk tehát 26 SNP genotípuát és 353 személy adatait tartalmazta. Az életkor, a menopausális kor és a body mass index (BMI) bizonyultak a csontdenzitásra szignifikáns „környezeti” faktornak. A humán csontszöveti in vivo génexpressziós tanulmányok alapján újonnan megismert öt

gént (ALPL, MMP2, TIMP2, FGFR1, FABP3) elemző vizsgálatunkban csak azokat a statisztikailag szignifikáns összefüggéseket fogadtuk el és értelmeztük, ahol a vizsgálat statisztikai ereje 80%-ot meghaladónak bizonyult. A lumbális BMD-re (átlag±szórás = 0.887±0176 g/cm2) vonatkoztatva MAF = 0322 p<005 a 353 fős mintában 83%-os erősséggel detektálható 0.055 g/cm2-es domináns genetikai hatás A femur BMD-t (átlag±szórás = 0.785±0168 g/cm2) tekintve 82%-os erősséggel tudtunk 0157 g/cm2-es recesszív genetikai hatást kimutatni MAF = 0.166 esetén A RANKL és OPG gének individuális SNP analíziseinek statisztikai ereje nagyobb volt, mint 75% a csípő BMD esetén (átlag±szórás: 0.785±0168), p = 005, MAF = 0140, 353 fős mintában 0.054 g/cm2-es BMD különbséget képes kimutatni, domináns modellben A gerinc BMD-t (átlag±szórás: 0.887±0176) tekintve, 65%-os erősséggel tudtunk 0053 g/cm2es recesszív genetikai hatást kimutatni MAF = 0460

esetén 5.32 Asszociációs vizsgálatok Az FGFR1-ben található rs6996321 SNP szignifikáns kapcsolatot mutatott a lumbalis BMD-vel (az átlag BMD±S.EM 0858±0013; 0912±0015 és 0916±0029 a ’G/G’, ’A/G’ és ’A/A’ genotípusok esetén). A korrigált BMD értékek szignifikáns különbséget mutattak a domináns genetikai modellben (a korrigált BMD különbségek -0.031±0011 és 0031±0011 g/cm2 voltak a ’G/G’ és az ’A/G’+’A/A’ csoportok esetén. p=0002) (18 ábra) A FABP3-ban található rs10914367 polimorfizmus homozigóta recesszív genotípusa szignifikánsan magasabb BMD-t eredményezett a teljes csípő tekintetében (az átlag BMD±S.EM 0.783±0009; 0776±0028 és 0945±0029 volt a ’G/G’, ’A/G’ és ’A/A’ genotípusokban, míg a korrigált BMD különbségek a recesszív modellben -0.004±0008 és 0143±0037 voltak a ’G/G’+’A/G’ és az ’A/A’ csoportokban. p=0028) (18 ábra) 62 a, b, rs10914367 (p=0,028) rs6996321

(p=0,002) 0.050 0.15 Korrigált lumbális BMD Korigált femur BMD 0.20 0.10 0.05 0.00 -0.05 0.025 0.000 -0.025 -0.050 G/G + A/G n=342 A/A n=11 G/G n=166 A/G + A/A n=187 18. ábra Egyedi a, FGFR1 és b, FABP3 SNP-k összefüggése a csontdenzitással Az OPG polimorfizmusok összefüggést mutattak a lumbális gerinc és a csípő BMD értékekkel. Az rs1564858 SNP ’A’ allélját hordozóknak mind a gerincen, mind a combnyakon kisebb volt a BMD-je (a korrigált BMD különbségek 0.040±0133 g/cm2 volt az ‘A/A+A/G’ és 0.013±0155 g/cm2 volt a ‘G/G’ genotípusok esetén a csípőn, p=00001) Recesszív modellben az rs3102735 SNP és a csípő BMD között találtunk kapcsolatot (a korrigált BMD különbségek -0.129±0083 és 0003±0151 voltak a ‘C/C’ és a ‘C/T+T/T’ genotípusok esetén, p=0.004) A RANKL gén mindkét vizsgált polimorfizmusának hatása volt a gerinc BMD-re (a korrigált gerinc BMD különbségek 0.010±0163 és 0040±0154 voltak a

‘C/C+C/T’ és ‘T/T’ csoportokban a két szorosan kapcsolt rs9533156 és rs9525641 SNP esetén). A „haplo.stats” program segítségével azonosítottunk egy 4 lókuszból (rs13317, rs3925, rs2280846 és rs6996321) felépülő haplotípust az FGFR1 génben, amely szignifikánsan összefüggött a lumbális BMD-vel (a globális összefüggés permutált p-értéke 0.007 volt) A gyakori ’TCGG’ haplotípus a szignifikánsan alacsonyabb, míg egy ritkább (CTGA) haplotípus a szignifikánsan magasabb BMD prediktorának bizonyult (10. táblázat) Mivel a haplotípust felépítő egyik SNP (rs6996321) önállóan is szignifikáns kapcsolatot mutatott a lumbális csontdenzitással, ezért további elemzéseket végeztünk a haplotípusvizsgálat mélyebb rétegeinek feltárása érdekében. Log-likelihood (valószínűséghányados) analízissel az rs6996321 hatása konstansnak bizonyult az egyes haplotípusokban. Az rs6996321 hatása nem különbözött szignifikáns

mértékben a ’TCG’- (Ht1-Ht2) és a ’CTG’- (Ht4-Ht3) struktúrákat összehasonlítva (Khi2=2.38, df=2, p>025) Szintén összehasonlítottuk a két különböző 63 rs6996321 allél (aláhúzva) hatását az átfedő haplotípusokban, amelyek nem mutattak szignifikáns különbséget a Ht1 (TCGG) és a Ht2 (TCGA) (Khi2=1.48, df=2, p>025), illetve a Ht4 (CTGG) és Ht3 (CTGA) (Khi2=5.6, df=2, p>005) összevetésekben A fenti tesztek segítségével bizonyítottuk, hogy az elemzett FGFR1 haplotípus a lumbális BMD önálló genetikai prediktora és a szignifikáns összefüggés nem az rs6996321 egyedi hatását tükrözi. 10. táblázat Az FGFR1 haplotípus összefüggése a lumbális csontdenzitással Score teszt GLM modell p érték Koeficiens±SE p érték# - 2.934 0.003 - 0.032±0016 0.042 0.206 1.062 0.309 0.023±0017 0.167 CTGA 0.107 2.595 0.012 0.069±0022 0.002 Ht4 CTGG 0.083 - 1.121 0.269 - 0.016±0028 0.568 Ht5 TCAG 0.078

0.964 0.346 0.034±0026 0.189 Haplotípusok Szekvenciák Frekvenciák Ht1 TCGG 0.506 Ht2 TCGA Ht3 * Hap-Score Az 5%-nál gyakoribb haplotípusok és a korrigált lumbális BMD-re gyakorolt egyedi hatásuk láthatók a táblázatban, a globális összefüggést jellemző permutált p-érték 0.007 volt *A score teszt p-értékeit 10000 permutációs próba eredményezte. #A GLM-modelben szereplő p értékek a regressziós változókra vonatkozó t-statisztika szignifikanciáját jelölik. A haplotípusok egyedi hatását a regressziós koeficiensek demonstrálják. A RANKL haplotípusok szoros kapcsolatot mutattak a gerinc BMD-vel (a globális összefüggést jellemző permutált p-érték 0.022 domináns modellben) A gyakori ’CCT’ haplotípus kis BMD-vel, míg a ritkább ’TTC’ magasabb gerinc BMD-vel járt mind score teszt, mind GLM modell esetében (11. táblázat) 11. táblázat RANKL haplotípus analízis eredményei Score teszt Hap-Score GLM modell *

Frekvencia TTC 0.453 -0.398 0.711 0.037±0019 0.048 CCC 0.063 -0.428 0.679 -0.025±0028 0.423 CCT 0.471 -2.432 0.013 -0.049±0021 0.018 p érték Koefficiens±SE p érték# Haplotípus Az 5%-nál gyakoribb haplotípusok és a korrigált lumbális BMD-re gyakorolt egyedi hatásuk láthatók a táblázatban. *A globális összefüggést jellemző permutált p-érték 0.022 volt #’TTC’ haplotípust, mint referenciát GLM modellben vizsgáltuk. A GLM-modelben szereplő p 64 értékek a regressziós változókra vonatkozó t-statisztika szignifikanciáját jelölik. A haplotípusok egyedi hatását a regressziós koefficiensek demonstrálják. 65 5.4 Immunológiailag releváns gének expressziós változásainak vizsgálata humán csontszövetben 12. táblázat tartalmazza a csontanyagcsere változások immunológiai szempontú vizsgálataihoz összegyűjtött gének listáját Csontsejtekben bizonyítottan kifejeződő, meghatározó immunmoduláns

gének funkcionális, illetve fiziológiás szerepe a csont- és immunhomeosztázis fenntartásában. Továbbá, a menopausát követő hormonális változások hatása a táblázatban felsorolt gének és géntermékek funkciójára irodalmi adatok alapján. ABI Assay azonosítási számok Hs00381122 m1 Hs00163811 m1 Hs00383718 m1 Hs02621496 s1 Hs00374176 m1 Hs00175478 m1 Hs00199349 m1 Hs00181225 m1 Gén szimbólumok és nevek A gének és termékeik által betöltött biológiai funkciók az immunrendszerben A C1 molekulakomplex része. A komplementrendszer első komponense. IgG és IgM tartalmú C1QA complement component 1, immunkomplexek közreműködésével megindítja a q subcomponent, A chain kaszkád rendszer aktivációját. A C3 központi szerepet tölt be a komplementrendszer aktivációjában. Proteolitikus hasítása során keletkezik; 1) C3b fragment, amely kovalens módon kapcsolódik az immunkomplexek felszínéhez, és 2) C3a anafilatoxin, C3 complement

component 3 mely a lokális gyulladási folyamatok mediátora. A C5a anafilatoxin ill. kemotaktikus peptid receptora C5AR1 complement component 5a Stimulálja a granuláris enzimek felszabadulását és receptor 1 szuperoxid anionok képződését. A lipopoliszacharid (LPS) receptorok csoportjába tartozik. Makrofágokon és monocita sejteken expresszálódik. A TLR4 receptorral együttműködve szabályozza a bakteriális LPS komponensek által indukált természetes immunválaszt. Szerepet játszik az apoptotikus sejtek CD14 CD14 molecule eliminálásában. CD40 CD40 molecule, TNF A DC40 ligand (CD154) receptora. Elsősorban B sejteken receptor superfamily expresszálódik. Szerepet játszik a T- ill B-limfociták member 5 aktivációjában és kostimulációjában. CD80 CD80 molecule, BKostimulációs jelet közvetít a T sejtek számára. lymphocyte activation Ligandumaival (CD28, CTLA4) való kapcsolódás a T antigen B7-1 sejtek proliferációját és citokin produkcióját

váltja ki. Kostimulációs jelet biztosít a T-sejt proliferációhoz és IL2 CD86 CD86 molecule, Btermeléshez. A korai T-sejt aktivációban játszik lymphocyte activation szerepet. Főleg monocitákon, dendritikus sejteket és aktivált T ill. B sejteken expresszálódik antigen B7-2 Receptorához (TNFRSF6/FAS) kapcsolódva apoptotikus FASLG Fas ligand, CD95 ligand jelet indít a sejtben. Szerepet tölt be a citotoxikus T (TNF superfamily, sejtek által mediált apoptotikus folyamatokban, a T sejt 66 a csontszövetben Kifejeződik preosteoblast sejtekben. Osteobalstok (OB) termelik. Szerepet játszik a csontvelői sejtek differenciálódásában és az osteoclastok (OC) fejlődésében. Termelődése a D3-vitamin szabályozása alatt áll. Az OB sejtek kifejeznek sejtfelszíni C5aR receptorokat. A C5a peptid szabályozza az OB sejtek IL6 stimulusra adott válaszát. Postmenopausás és női nemihormon hatások E2 kezelést követően megnő a C1q tartalmú immunkomplexek

plazma szintje. A humán C3 gén ösztrogén-érzékeny szekvenciát (ERE) tartalmaz. HRT hatására postmenopausás nőkben fokozódik a C3 szérum szintje. Az OB-ok és az OC prekurzorok egyaránt kifejeznek Expressziója E2 kezelés hatására fokozódik, CD14 molekulát. OB sejteken IL6 szintézist azonban az LPS indukálta sejtaktivációt az indukál. E2 negatívan szabályozza. Az OB-ok és osteociták jelentős mennyiségben expresszálnak CD40 molekulát. Szerepet játszik az E2 és P nagymértékben fokozza a sejtfelszíni OB-ok differenciálódásában és előidézi azok kostimulátor CD40 expresszióját DC-n. metalloproteináz ill. OPG expresszióját Az OB sejtek kifejeznek CD80 és CD86 kostimulátor molekulákat egyaránt, amelyek érintettek az antigén prezentáció és a T sejt aktiváció folyamataiban. Fokozza az osteoclastogenezist. Apoptózit indukál OB-okban. Kifejeződését az E2 pozitívan szabályozza. Promótere ösztrogén-érzékeny szekvenciát

(ERE) tartalmaz. E2 hatására génkifejeződése erősödik. member 6) FCGR2A Fc fragment of IgG, low affinity IIa, receptor Hs00234969 m1 (CD32) HLA-A major histocompatibility Hs00740413 g1 complex, class I, A HLA-DRB1, -DRB3 major histocompatibility complex, class II, DR beta Hs00734212 m1 1, DR beta 3 fejlődésben és a perifériális tolerancia kialakításában. Elsősorban hivatásos antigén prezentáló sejteken fejeződik ki. Részt vesz az antigének feldolgozásában és prezentálásában. Mindig expresszálódik csontsejteken. Az OB-ok konstitutívan expresszálnak MHCII molekulákat. Ezáltal az OB-ok képesek T sejt stimulusra és antigén prezentációra. Kifejeződését az IFNG, a D3-vitamin és az IL1 is szabályozza. ICAM1 intercellular adhesion Hs00164932 m1 molecule 1 (CD54) LFA1 (CD11A/CD18) liganduma. Gátolja a naív T sejtek IL4 termelését. Konstitutívan expresszálódik OB sejteken. Szerepet játszik a T sejt aktivációban és

kostimulációban. Kis affinitású receptor, mely az immunkomplexekben található IgG Fc részéhez kapcsolódik. Elsősorban Blimfociták termelik Nincs elérhető adat. Mindig expresszálódó molekula, mely az endogén antigének bemutatásában játszik szerepet. IFNG Hs00174143 m1 interferon, gamma Főleg limfoiták termelik. Vírus és tumor ellenes hatással rendelkezik, gátolja a sejtek osztódását. Erős makrofág aktivátor. IGF1 insulin-like growth factor Hs00153126 m1 1 (somatomedin C) Általános anabolikus faktor. A sejtek növekedését és a sejtosztódást szabályozza. IL10 Hs00174086 m1 interleukin 10 IL12A interleukin 12A (natural killer cell stimulatory Hs00168405 m1 factor 1) IL12B interleukin 12B (natural killer cell stimulatory Hs00233688 m1 factor 2) IL15 Hs00174106 m1 interleukin 15 IL-1A Hs00174092 m1 interleukin 1, alpha IL-1B Hs00174097 m1 interleukin 1, beta Gátolja a makrofágok és helper T-sejtek IFNG, IL2, IL3, TNF és GM-CSF

szintézisét. Szabályozza a T és B sejtek differenciálódását. Dimereket képez az IL12B molekulával. Makrofágokban termelődik. Növekedési faktorként hat az aktivált T és NK sejteken. Fokozza az NK setjek litikus aktivitását és az IFNG produkciót. Dimereket képez az IL12A molekulával. Makrofágokban és dendritikus sejtekben termelődik. Kemotaktikus molekula a makrofágok számára. Stimulálja aT-limfociták osztódását. Részt vesz az NK sejtek diffrenciálódásában. Funkciójában és szerkezetében az IL2-vel rokon molekula, ezért képes annak receptoraihoz (IL2RB, IL2RG) kapcsolódni. Aktivált makrofágok által szekretálódik. Serkenti a timociták és B sejtek érését ill. a prosztaglandin felszabadulást. Endogén pirogén anyag lévén szabályozza a gyulladásos folyamatokat. 67 Gátolja az IL1 és TNF indukálta csontbontást és az OC képződés folyamatát. Gátolja az OB-ok kollagén ill. kollagenáz szintézisét és a sejtek

szaporodását. Emellett fokozza az OB-ok MHCII és NO-szintáz termelését. Serkenti az OB proliferációt ill. az extracelluláris mátrix és kollagén szintézist. Gátolja az MMP13 aktivációt és a kollagén bontást. Képes az ER-ok ligand-függetelen stimulálására. E2, P, activin A és inhibin A hatására egyaránt fokozódik az MHCII molekula kifejeződése DC-n. OVX egerekben magas expressziós rátát mutat. HRT alkalmazásával szérum szintje csökken postmenopausás nőkben. P hatására a sejtfelszínen alul-expresszálódik. A menopausát követő HRT kezelés után szérum koncentrációja csökken. Termelődését perifériás mononukleáris sejtekben az FSH és az LH indukálja. Produkcióját az inhibin A szuppresszálja, amelyet az activin A képes visszafordítani. OB sejtekben termelődik. Az OC-ok elköteleződését gátolja. A keringésben lévő mennyiségét az E2 növeli. Intracelluláris szintjét a P emeli. Postmenopausás állapotban szekretált

mennyisége kompenzatórikusan megemelkedik, amely HRT kezelést követően csökken. Kifejeződését az activin A negatívan szabályozza. OB sejtekben expresszálódik. Gátolja az OC képződést. Szekréciója E2 hatására erősödik. P azonban down-regulálja az IL12 expressziót. OB sejtekben termelődik. Szabályozza az osteoclastogenezist és fokozza a preosteoclastok számát. Gyulladásos mediátorok. Érintettek az OC aktivációban és érésben. Fokozzák a csontbontást Fokozott postmenopausás szintje E2 kezelés határára csillapodik. Előalakjából történő képződését az activin A gátolja és antagonizálja az IL1B inflammatórikus hatását. IL-1RAP interleukin 1 receptor Hs00158057 m1 accessory protein IL2RG interleukin 2 receptor, Hs00173950 m1 gamma IL4RA interleukin 4 receptor Hs00166237 m1 alpha chain IL-6 interleukin 6 (interferon, Hs00174131 m1 beta 2) IL7 Hs00174202 m1 interleukin 7 IL7RA interleukin 7 receptor Hs00233682 m1 alpha chain IL8

interleukin 8, chemokine Hs00174103 m1 (CXC motif) ligand 8 ITGA1 integrin, alpha 1 (CD49A, alpha 1 subunit of VLA1 Hs00235006 m1 receptor) Hs00158127 m1 Hs00355885 m1 Hs00174217 m1 Hs00164957 m1 ITGA2 integrin, alpha 2 (CD49B, alpha 2 subunit of VLA2 receptor) ITGAM integrin, alpha M (CD11b, complement component 3 receptor 3 subunit) ITGAX integrin, alpha X (CD11c, complement component 3 receptor 4 subunit) ITGB2 integrin, beta 2 (CD18, complement component 3 receptor 3 and 4 subunit) Az IL1 receptor részeként befolyásolja az NFKB aktivációt. Specifikusan gátolja az IL1 közvetítette jelátvitelt. A nagy affinitású IL2 receptor gamma lánca. Mieloid és limfoid eredetű sejteken is expresszálódik. Funkcionális eleme az IL2R,IL4R,IL7R,IL9R,IL15R receptoroknak. Elsősorban T-sejtekben expresszálódik. Az IL4 és IL13 közös receptora. Előidézi a Th2 sejtek differenciálódását. Elsősorban mononukleáris fagocita sejtek és aktivált T sejtek terméke. Szerepet

játszik a B-sejtek végső, Ig-t szekretáló plazmasejtekké történő differenciálódásában. Részt vesz a gyulladásos immunválasz, a hematopoezis és az akut fázis reakció szabályozásában. Hematopoetikus növekedési faktor. Serkenti a limfoid progenitorok proliferációját. Antiapoptotikus hatást közvetít a T és B sejtek érése során. IL7 citokin receptora. A neutrofil és bazofil granulociták, ill. a T-limfociták kemotaktikus faktora. Sejtfelszíni adhéziós receptor. Befolyásolja a sejt-sejt és sejt-extracelluláris mátrix kapcsolatokat. Asszociálódik a citoszkeletonhoz és jelátvivő molekulákhoz (pl:ITGB1). Befolyásolja a sejt-sejt és sejt-extracelluláris mátrix kapcsolatokat. Dimereket képez az ITGB2 molekulával. Szerepet játszik az adhéziós kapcsolatokban és a komplement fragmentekkel fedett részecskék felvételében. Az iC3b peptid és az ICAM1 receptora. Dimereket képez az ITGB2 molekulával. A C3d fragment és a fibrinogén

receptora. Szabályozza a sejt-sejt interakciókat a gyulladási folyamatok során. Az ICAM és az iC3b peptid sejtfelszíni adheziós receptora. Az LFA1 molekula komponense. 68 Nincs elérhető adat. Nincs elérhető adat. OB sejtekben expresszálódik. Serkenti a mezenchymális progenitor sejtek OB irányba történő differenciálódását. Fokozza a csontbontást és az OC képződést. Elősegíti az OB és OC sejtek interakcióját. Szérum koncentrációja postmenopausában emelkedett értéket mutat, amely HRT-t követően csökken. Biológiai aktivitását az activin A csökkenti, azonban az expresszióját képes fokozni. Szerepet játszik az OC-ok differenciálódásában és prekurzor sejtjeik képződésében. mRNS expresszióját az OVX növeli. Kifejeződését OB sejteken kimutatták. OB sejtek által termelődik. Érintett a sejtek mobilizációjában. Autokrin/parakrin módon ható növekedési faktor. Transzkripcióját az activin A és a P is serkenti. Kis

mennyiségben OB sejteken detektálható. Módosítja a kollagén és kollagenáz gének expresszióját. OB sejt differenciációt és mátrix mineralizációt eredményez. Befolyásolja az újonnan szintetizálódott mátrix elrendeződését. Kifejeződése a D3-vitamin szabályozása alatt áll. Mononukleáris OC sejtek expresszálnak egyaránt CR3 (CD11b + CD18) és CR4 (CD11c + CD18) komplement receptorokat. Hs00241497 m1 Hs00231653 m1 Hs00212206 m1 Hs00171257 m1 Hs00234244 m1 KITLG c-kit ligand, stem cell factor NFKB1 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (p105) SCARA3 scavenger receptor class A, member 3 TGFB1 transforming growth factor, beta 1 TGFB2 transforming growth factor, beta 2 TGFB3 transforming growth Hs00234245 m1 factor, beta 3 TLR4 Hs00152939 m1 toll-like receptor 4 TNF tumor necrosis factor (TNF superfamily, Hs00174128 m1 member 2) TNFAIP6 tumor necrosis factor, Hs00200178 m1 alpha-induced protein 6 TNFRSF11B tumor necrosis

factor receptor superfamily, member 11b Hs00171068 m1 (osteoprotegerin) TNFSF11 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, Hs00243519 m1 member 11 (RANKL) VCAM1 vascular cell adhesion Hs00174239 m1 molecule 1 Fokozza a mieloid és limfoid hematopoetikus progenitor sejtek proliferációját a csontvelőben. A hematopoezis korai szakaszát befolyásolja. Részt vesz a sejt-sejt adheziós folyamatok szabályozásában. Az OB sejtekben expresszálódik. Képződését a PTH növeli. Fokozza az OC-ok csontbontó aktivitását Részt vesz a különböző immunfolyamatokban, az akut fázis reakcióban és az apoptózis folyamatában szerepet játszó gének szabályozásában. Kollagén-szerű domének ismétlődéséből felépülő receptor, mely védi a sejteket az oxidatív molekuláktól. Szerepet játszik a bakteriális struktúrák felismerésében. Általános anabolikus citokin. Szabályozza a sejtek osztódását, differenciálódását és egyéb növekedési faktorok

aktivitását. A RANK/RANKL jelátviteli rendszer transzkripciós faktora. IL1 és IL6 szignaling hatására aktiválódik Kifejeződése fokozódik differenciálódó OB sejtekben. Érintett az OC fejlődésben és a csont növekedésében. Fontoson szerepet játszik a csont átépülésében. Stimulálja a csont képződését és az elkötelezett OB-ok szaporodását. Gátolja az OC-okat Gátolja az IL2 függő T sejt növekedést. Szerepet tölt be az embriogenezisben és a sejtek differenciálódásában. A CD14 molekulával együttműködve szabályozza az LPS indukálta természetes immunválaszt. NFKB aktiválódást és gyulladásos citokinek felszabadulását eredményezi. Elsősorban makrofágokban termelődik. A sejtek halálát eredményezi. Pirogén faktor, mely az IL1 szekréció stimulációján keresztül lázat okoz. Fokozza a sejtek differenciációját. Szerepet játszik a sejt-sejt és sejt-mátrix interakciókban a gyulladási folyamatok során és a

tumorgenezis alatt. Elősegíti az extracelluláris mátrix képződését. Gátolja a csontsejtek differenciálódását. Szerepet játszik a koponyacsontok morphogenezisében, gátolja fúziójukat. Csökkenti a DNS szintézis mértékét és a TGFB receptorok expresszióját OBokban. Fokozza az OC-ok túlélését. Konstitutívan expresszálódik OB sejtekben. Fokozza az OC-ok aktivitását. Stimulálja a csontbontást. Expressziója csökken az OB-ok differenciálódási folyamata során. Csökkenti a differenciálódás mértékét és gátolja a BMP2 jelátvitelt. Limfoid sejtekben expresszálódik és kifejeződését a CD40 A RANKL ún. ’csapda’ receptora Gátolja az OC fokozza. sejtek aktivációját. Serkenti a naiv T-sejtek proliferációját. Szabályozza a T sejtek és dendritikus sejtek kapcsolatát ill. a T sejt függő Az OC-ok differenciálódási és aktivációs mediátora. immunfolyamatokat. Szerepet játszik a nyirokcsomók Fokozza a csontbontást.

organogenezisében és a limfociták fejlődésében. A leukociták VLA4 receptorához kapcsolódik. Befolyásolja az adhéziós és jelátviteli mechanizmusokat. Szerepet tölt be a leukociták migrációjában. Fokozza az osteoclastogenezist. 69 P hatására expressziója visszaszorul. E2 szuprafiziológiás koncentrációban fokozza az aktivitását. OVX egerekben a csontvelői sejtek mRNS mennyisége alacsony. TGFB promóter tartalmaz ösztrogén-érzékeny egységet Csontvelői és szérum szintje is emelkedik E2 hatására, amely indukálja a TGFB szitézisét. Az E2 gátolja a TLR4 közvetített jelátvitelt. Expresszióját a P up-regulálja. Plazma szintje postmenopausás nőkben magas, E2 adagolást követően lecsökken. Szekrécióját az activin A és az FSH szignifikánsan növeli. Postmenopausás állapotban szérum szintje emelkedik. E2 hiányos állapotokban felül-expresszólódik. Génátiródása azonban E2 kezelésre downregulálódik. HRT alkalmazásával

szérum szintje csökken postmenopausás nőkben. E2 hatására felszíni expressziója gyengül. 5.41 A génexpressziós adatok összehasonlítása osteoporoticus és nem osteoporoticus nők csontszövetében A 17 vizsgált nőben szignifikáns (p ≤ 0.05) változást 3 gén mutatott Mindhárom gén (FCGR2A/CD32, NFKB1, SCARA3) kétszeres illetve annál nagyobb mértékben csökkent expressziós mintázattal rendelkezik az osteoporoticus csontban. A represszió mértéke az osteoporoticus csontban a nem osteoporoticus csontszövethez viszonyítva az FCGR2A esetén 2.06-szoros, az NFKB1 esetén 226-szoros, a SCARA3 esetén pedig 368-szoros volt Ezek az osteoporosisban alacsonyabban kifejeződő gének elsősorban a természetes immunitás részét képező biológiai mechanizmusokban játszanak fontos szerepet, mint pl.: a fagocitózis, az akut fázis reakció és a patogénnel asszociált molekuláris mintázatok, mikrobiális struktúrák felismerése. A diszkriminancia

elemzéshez öt génhalmazt válogattunk le, amelyek lefedik mind az adaptív, mind a természetes immunrendszer funkcióit (19. ábra) A T és B sejtek aktivációját eredményező immunológiai mechanizmusokhoz 14 illetve 5 gént soroltunk (108-110), az antigén preneztációs és kostimulációs folyamatokat 11 gén képviseli, a fagocitózist 9 génnel, míg a komplementrendszer működését 10 génnel jellemeztük (110-113). A legerőteljesebb diszkriminációs hatás a T-limfociták működésében, és annak szabályozásában szerepet játszó gének esetén volt azonosítható, mely géncsoport élesen elválasztotta az OP és NOP csoportokat. Emellett a veleszületett immunitásban (antigén bemutatás és fagocitózis) kulcsfontosságú szerepet betöltő gének expressziós mintázata is megváltozik az osteoporoticus csontban, mely a két csoport határozott elkülönülését teszi lehetővé (19. ábra) 70 4,0 3,0 2,0 1,0 NOP 0,0 OP -1,0 -2,0 -3,0 -4,0 T sejt

aktiváció Gének neve Korr. KV IL-10 -0.418 IL-1B -0.366 CD86 -0.358 TGFB1 -0.342 IL-6 -0.293 IL-7 -0.274 IFNG -0.210 HLA-A -0.153 TNFSF11 -0.086 IL-12A -0.041 CD40 -0.020 HLA-DRB1 0.115 CD80 0.124 TNFRSF11 0.135 B sejt aktiváció Gének neve Korr. KV IL-7 -0.434 IFNG 0.333 IL-6 0.464 TGFB1 0.542 IL-10 0.662 Antigén prezentáció Gének neve Korr. KV CD80 -0.149 HLA-DRB1 -0.138 CD40 0.024 IL-12A 0.049 HLA-A 0.183 IFNG 0.252 VCAM1 0.259 IL-6 0.351 CD86 0.429 IL-1B 0.439 ICAM1 0.499 Fagocitózis Gének neve Korr. KV TLR4 -0.113 ITGB2 0.209 VCAM1 0.231 ITGAM 0.232 CD14 0.266 ITGAX 0.428 ICAM1 0.446 FCGR2A 0.512 SCARA3 0.559 Komplementrendszer Gének neve Korr. KV ITGAX -0.431 IL-1B -0.395 C1QA -0.334 IL-6 -0.319 C3 -0.239 ITGAM -0.233 IFNG -0.224 ITGB2 -0.210 TNF -0.196 C5R1 0.024 19. ábra Hét postmenopausás osteoporoticus (OP, fehér vonal) és tíz postmenopausás nem osteoporoticus (NOP, fekete vonal) és nő csontszöveti génexpressziós mintázatának diszkriminancia

analízise. A legtökéletesebb szétválás a T sejt függő immunológiai válaszreakciókat kódoló gének esetén állapítható meg. Szintén egyértelmű különbségtétel tapasztalható két - a veleszületett immunfolyamatok közé sorolható - géncsoport; fagocitózis és antigén prezentáció, kostimuláció vizsgálatán alapulva. Az öt halmazt meghatározó humán gének ”Gene Cards” (www.genecardsorg) által elfogadott rövidített neveit a korrelációs értékekkel együtt (korreláció a kanonikus változóval, KV) táblázatban foglaltuk össze. 71 5.42 A génexpressziós értékek összehasonlítása postmenopausás és premenopausás nők csontszövetében Az 20. ábrán mutatjuk be a szignifikánsan eltérő kifejeződést mutató 9 gén expressziós változására vonatkozó adatait. Hat, különböző immunológiai mechanizmusok szabályozásában szerepet játszó gén ötszörös, illetve annál nagyobb mértékben megnövekedett

expressziós mintázattal rendelkezik a postmenopausás csontban. A transzkripció fokozódásának mértéke a postmenopausás csontban a premenopausás nem osteoporoticus csontszövethez viszonyítva a C3 esetén 5.15-szoros, a CD86 esetén 591szoros, az IL-10 esetén 697-szoros, az IL-6 esetén 643-szoros, a TGFB3 esetén 334-szoros, és a TNFSF11 esetén pedig 18.49-szoros volt (20 ábra) Három gén kifejeződése csökkent postmenopausás állapotban. A represszió mértéke a CD14 esetén 1832-szoros, a HLA-A esetén 8.69-szoros, végül az ITGAM esetén pedig 563-szoros volt A szignifikáns gének közül két csoportot tudtunk elkülöníteni. Az egyik csoport a komplementrendszer komponenseit kódoló géneket tartalmazza (C3, ITGAM/CD11b), míg a másik csoportba az endogén antigén prezentációs rendszer szabályozásában és a CD8+ T sejtek aktiválásában szerepet játszó gének tartoznak (CD86, HLA-A/MHCI, IL-6, TNFSF11/RANKL). 1000,00 GAPDH-hoz viszonyított

relatív génexpresszió 100,00 POST PRE 10,00 1,00 0,10 0,01 IL T N -6 FS F1 1 C IT 3 G A M C D1 4 IL -1 0 TG FB 3 C D8 6 H LA -A 0,00 20. ábra Szignifikánsan megváltozott expressziós mintázatot mutató 9 gén mRNS-ének relatív mennyisége 10 postmenopausás (fekete oszlop) vs. 6 premenopausás stádiumú nem osteoporoticus (szürke oszlop) nő csontszövetében Lg skálán feltüntetve. 72 6. MEGBESZÉLÉS 6.1 A postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus csont eltérő transzkriptomikai mintázata Munkánk során elsőként vizsgáltuk humán postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus nőkből származó csontszövetek multigénes transzkripciós profilját és mutattunk ki szignifikáns expressziós különbségeket a két állapot között. A vizsgálatainkkal nyert génexpressziós adatok lehetővé tették a primer osteoporoticus és nem osteoporoticus csontszöveti fenotípus elkülönítését. Továbbá, meghatároztunk olyan új

géneket (CD36/SCARB3, SCARA3, TWIST2, IGSF4), amelyek a humán csontmetabolizmus vonatkozásában eddig nem voltak ismertek. Kimutattuk, hogy a CD36/SCARB3 gén nagyobb mértékben expresszálódik osteoporoticus személyek csontszövetében. Ez a sejtfelszíni, B típusú scavenger receptor egyaránt szintetizálódik az osteoblast és az osteoclast sejtekben is (114). Azonban a molekula funkcionális szerepét a csont élettani folyamataiban még nem jellemezték. A CD36 a lipid felvétel és a lipoprotein körforgás meghatározó résztvevője (115). A peroxisoma proliferátor aktivált receptor gamma (PPARγ) transzkripciós faktor szintén a zsíranyagcsere fontos komponense. Fokozza a csontvelői zsírszövet felhalmozódását, és gátolja a csontsejtek fejlődését (116). A fent említettekkel összefüggésben a PPARγ gén megerősödött transzkripcióját figyelték meg a korral járó csontvesztés patomechanizmusában (116, 117). Ezt megelőzően több munkacsoport

is igazolta (118, 119), hogy a PPARγ képes a CD36 gén átíródását direkt módon pozitívan szabályozni. A megnövekedett CD36 expresszió hozzájárulhat a közös mezenchymális őssejtek osteogenikus potenciáljának csökkenéséhez, amely az osteogenezissel szemben hangsúlyozottabb adipogenezist és zsírszövet akkumulációt eredményez A megváltozott csontszöveti lipidmetabolikus folyamatok összessége pedig primer osteoporosis kialakulásához vezethet. A TWIST2 gén mRNS szintje jelentősen magasabb volt az osteoporoticus páciensek csontjában, mint a nem osteoporoticus kontroll csontszövetben. A TWIST2 egy nem specifikus, transzkripciót gátló molekula, amely túlnyomórészt mezodermális eredetű szövetekben, sejtekben (chondroblast, osteoblast) fejeződik ki (120). Hiszton deacetilációs mechanizmuson keresztül megakadályozza számos gén transzkripcióját (121), emellett blokkolja az osteoblastok differenciálódását (122). Az ALPL és a

COL1A1 gének represszióját találtuk osteoporoticus nőkben. A gének termékei a csont szerves állományának építésben, illetve mineralizációjában játszanak 73 elengedhetetlen szerepet. Cao és mtsai (11) kimutatták, hogy az osteoblastok ECM szintetizáló és kalcifikációs képessége, továbbá ezekben a csontformáló folyamatokban elsődlegesen érintett gének (COL1A1, ALPL) kifejeződése egyaránt redukálódik az öregedő, alacsony csontdenzitással rendelkező egerekben. Az osteoporoticus nőkből származó osteoblast prekurzor sejtek kevésbé képesek I. típusú kollagénben gazdag osteoid állomány kialakítására (13). Az ALPL és COL1A1 gének expressziós eredményei is alátámasztják, hogy a csontképző kapacitás jelentősen csökken az időskori csontrikulás során. Leírtuk az NFKB1 mérsékelt kifejezősését OP személyekben, amely transzkripciós faktor a csontanyagcsere vonatkozásában elsősorban a RANK/RANKL jelátviteli

hálózat részeként ismert. Azonban az NF-κB további szignalizációs útvonalakon keresztül is aktiválódhat. (i) A Fas/FasL rendszer, ahol osteoclastogenezist indukál (123), illetve az osteoblastok apoptózisát okozza (124). (ii) Ezzel szemben a TRAIL/TRAIL-receptor rendszerben ellentétes hatást vált ki, az ostseoblastokat megvédi az apoptotikus sejthaláltól (125), míg az osteoclastokban apoptózist idéz elő (126). Az NF-κB által közvetített és egyensúlyban tartott apoptotikus valamint anti-apoptotikus hatások következménye az egészséges mértékű csontátépülés, amely a gén megváltozott expressziójának következtében eltolódhat, és patológiás csontmetabolizmushoz vezethet. A szarvasmodellből kiinduló vizsgálatok egy további, ezidáig a csontszövetben nem detektált új gén szerepére világítottak rá a humán osteoporosissal kapcsolatban. Az IGSF4 egy Ca2+-tól független sejt-sejt kölcsönhatásokat közvetítő immunglobulin-szerű

intracelluláris adhéziós molekula, amely csökkent génaktivitást mutat az osteoporoticus csontban. Az aktin filamentumokhoz történő asszociációja révén a citoszkeletális jeltovábbításban és a sejtinvázió szabályozásban vesz részt (127). Lin és mtsai (128) az IGSF4 gént az ösztrogénreceptor alfa célpontjaként írták le emlőtumor sejtekben Az univariáns Mann-Whitney féle szignifikancia teszt segítségével a gének egyedi szerepét tudtuk vizsgálni, ezért az expressziós adatokban rejlő számos információ több szempontból is észrevétlen maradhat. Többváltozós eljárások alkalmazásával további összefüggésekre deríthettünk fényt. Ezek a statisztikai módszerek lehetőséget nyújtanak komplex elemzésekre, illetve a betegségek kialakulásában funkcionálisan érintett géncsoportok lehetséges szerepére hívják fel a figyelmet. Diszkriminancia analízis alkalmazásával megismertünk új géncsoportokat, amelyek élesen és

egyértelműen elkülönítik az osteoporoticus és nem osteoporoticus állapotokat. A szarvas ciklikus fiziológiás osteoporosis microarray vizsgálata során az osteoporoticus fázist jellemző gének megkülönböztetik a humán csontminták patológiás és fiziológiás stádiumait is. 74 A géncsoportban a csontszövet organikus mátrixát felépítő molekulák (COL1A1, COL5A2, FN1) mellett a WNT útvonal komponensei (CTNNB1, WIF) is megtalálhatók. Kiemelkedő jelentősége van az osteoporoticus és nem osteoporoticus személyek határozott elválásában a különböző növekedési faktoroknak és receptoraiknak: (i) PC1 géncsoportba tartozó tirozin kináz típusú növekedési faktorok/receptorok (EGF, EGFR, IGF1, IGF1R, FGF1, FGF2, FGFR, VEGF, PDGFA), (ii) transzformáló növekedési faktor-béta család tagjai (TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2), amelyek a MAPK, illetve a kanonikus TGFB/activin/nodal jelátviteli rendszereken keresztül szabályoznak. A

felsorolt génhalmazok rendelkeznek a legnagyobb diszkriminációs erővel, és ezek szeparálják el legtökéletesebben a vizsgált OP és NOP betegcsoportokat. Főkomponens analízis segítségével elemeztük a korral járó osteoporoticus csontszövet génexpressziós profilját. Megállapítottuk, hogy gyenge, visszaszorult transzkripciós aktivitással jellemezhető a korban egyeztetett postmenopausás nem osteoporoticus csoporthoz képest. Nagy számban azonosítottunk géneket, amelyeknek szerepe lehet a csontszövet osteoporoticus és nem osteoporoticus fenotípusainak megkülönböztetésében. A transzkripciós mintázat alapján ezek a gének elsősorban növekedési faktorok (PC1) és az extracelluláris mátrixot alkotó kollagén molekulák génjei (PC2). Az említett halmazokat alkotó gének kifejeződése szoros korrelációt mutatott és csökkent expressziójuk mind PC1, mind PC2 ’irányból’ osteoporoticus állapot kialakulásához vezethet. HCL módszerrel

karakterizáltunk egy 18 gént magában foglaló leágazási vonalat. A gének között találunk számos minor kollagént (COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL7A1, COL9A1, COL10A1, COL12A1), amelyek génaktivitása szignifikánsan csökken a humán postmenopausás osteoporoticus csontszövetben. A minor kollagének, mint a COL3A1, COL5A1 vagy a COL5A2 képezik a csont szerves mátrixának szerkezetét, illetve ezek alkotják azt a központi molekuláris struktúrát, amelyre az abundáns I. típusú kollagén polimerizálódik (129). A COL9A1 és a COL12A1 periodikusan kapcsolódik az elsődlegesen jelenlévő kollagén rostok (COL1 és COL2) felszínére. Elmondhatjuk, hogy az osteoporosis során megváltozott csontszöveti homeosztatikus állatpot gátolja a horizontális összeköttetéseket biztosító minor kollagének átíródását, aminek szerepe lehet a módosult csontmetabolizmusban. A leágazási vonal tagjai között protein, illetve RNS szintű regulációs kapcsolatokat

kerestünk IPA program segítségével (21. ábra) Azt találtuk, hogy a hierarchikus csoportot alkotó komponensek főleg a lokális gyulladásos citokineken (IL1B, IL6) és differenciálódást serkentő faktorokon interaktomikai hálózatot alakítanak ki. 75 (IGF1, BMP2) keresztül összetett ILIL-6 ANXA2 ALOX15 ILIL-1B COL1A2 IGF1 BMP2 COL10A1 MMP9 MMP13 SOST MSX2 21. ábra A HCL analízisben meghatározott leágazási vonal tagjai között létrejött interaktomikai hálózat. : aktiváló hatás, : gátló hatás 6.11 Az immunrendszerben szerepet játszó gének expressziós változásainak vizsgálata osteoporoticus humán csontszövetben Az osteoimmunológiai kutatások elsősorban az immunrendszer csontra kifejtett hatásaival foglalkoznak. Számos kutatócsoport bizonyította, hogy eltérő immunológiai betegségek (pl.: gyulladásos bélbetegségek, autoimmun cukorbetegség, allergia, néhány malignus tumor) társulhatnak csökkent csonttömeggel.

Munkánkban vizsgáltuk először az osteoporosis, mint a csontrendszer egészét érintő megbetegedés hatását a csontszövetben zajló lokális gyulladási és immunreakciókra, továbbá a differenciálódási és érési folyamatokra. Elsőként mutattuk ki egy új, eddig a csontanyagcsere-betegségekkel kapcsolatban nem ismert gén, a SCARA3 (SR-AIII, A típusú scavenger receptor) szignifikánsan csökkent expressziójat humán osteoporoticus csontszövetben. A gén elsősorban myeloid sejtekben fejeződik ki és a természetes immunrendszer részeként a mikrobiális sejtfelszíni struktúrák felismerésében vesz részt (130, 131). Emellett képes endogén ligandumok megkötésére is pl: szerves extracelluláris mátrix fehérjék (biglikán, dekorin, denaturált kollagén), valamint módosult LDL molekulák (AcLDL, OxLDL) (132). Ezt megelőzően már bemutattuk a B osztályba tartozó scavenger receptor gén, a CD36 fokozott átíródását osteoporoticus személyekben.

Mindkét említett receptor részt vesz a lipid homeosztázis szabályozásában, 76 továbbá, szerepük meghatározó lehet a közös mezenchymális őssejtektől származó osteoblast/adipocita sejtvonalak differenciációs egyensúlyának megtartásában. A csontszövetben megbomlott és a zsírszövet irányába eltolódott csontvelő/zsírszövet arány a csontásványanyag tartalom (BMD) csökkenéséhez vezet (16, 17). Eredményeink megerősítik annak a lehetőségét, hogy mind az A és B típusú scavenger receptorok (SR) érintettek a csontszövet ’elzsírosodásában’ és ennek következtében az osteoporosis kialakulásában (22. ábra). adipocita érett OC osteoclast prekurzor SR mesenchymalis őssejt lipidek lipoproteinek zsí zsírsavak SR osteoblast 22. ábra A scavenger receptorok (SR) és endogén ligandumaik feltételezett szerepe a csontsejtek és a zsírsejtek differenciálódásában. Elősegítik az érett osteoclastok kialakulását, ezzel

szemben gátolják az osteoblastok képződését. Többváltozós diszkriminancia analízis felhasználásával megismertünk néhány, az osteoporoticus csontban jellemző expressziós mintázattal rendelkező immunológiailag fontos géncsoportot. Az egészséges és patológiás csontfenotípusok legtökéletesebb elválását a T sejtes immunválaszt reprezentáló gének esetén figyelhetjük meg. Általánosan igazolt, hogy a T-limfociták és a csontsejtek működése több ponton is szorosan kapcsolódik egymáshoz pl.: az osteoblastok hivatásos antigén prezentáló sejtként működve naív T sejteket aktiválnak (59), valamint, az effektor T-limfociták képesek az osteoclastok érését a RANK/RANKL/OPG rendszeren keresztül szabályozni (52). Továbbá, kimutattuk az OP és NOP betegcsoportok egyértelmű szétválását a fagocitózis markereit kódoló gének expressziós mintázata alapján is. Ez a megfigyelés alátámasztja a szignifikancia teszt eredményeit,

amely segítségével meghatároztuk a fagocitózis folyamatához kapcsolható SCARA3, FCGR2A gének expressziójának kifejezett különbségét a két mintacsoportban. Ezen kívül, azt találtuk, hogy az antigén prezentációs rendszer több komponensének (adhéziós molekulák, kostimulátorok és citokinek) mRNS átíródása megváltozik OP nőkben. Adataink azt valószínűsítik, hogy az osteoporosis során átalakult csontanyagcsere változásokat indít a nem fajlagos védekező 77 mechanizmus regulációjában. A DFA felhasználásával kapott eredmények először hangsúlyozzák ki a természetes immunrendszer szerepét az osteoporosisban. 6.2 A menopausa hatása a csontszövet génexpressziós profiljára postmenopausás vs. premenopausás nőkben A csontszövet-specifikus gének (pl. BGLAP, ALPL, IL6, RANKL) kifejeződésének ösztrogén hiányában tapasztalt eltéréseire vonatkozó ismeretek mindezidáig főleg ovariectomizált állatmodelleken és

sejtkultúrákon végzett vizsgálatok eredményein alapultak (133-135). Vizsgálatunkban e gének jelentőségét humán csontszövet mintákon elsőként validáltuk és meghatároztunk olyan markánsan megváltozott génexpressziós mintázatokat, amelyek a menopausát követően végbemenő és a csontanyagcserét nagyban befolyásoló változásokkal kapcsolatban eddig ismeretlenek voltak. Az egyik meghatározó osteoblast-specifikus transzkripciós faktor, a RUNX2 (Cbfa1) kifejeződésének mértéke határozottan nagyobb volt a nem osteoporosisos csontszövetben a menopausát követően. A RUNX2 központi szerepet tölt be a csont homeosztázisában (136), jelenléte szükséges a közös mezenchymális őssejtek osteoblast irányba történő elköteleződéséhez (137). Emellett számos, az osteoblastokra és osteoclastokra jellemző gén (BGLAP, ALPL, RANKL, MMP13) működését irányítja (138, 139), amelyek szintén szignifikánsan megnövekedett expressziós

szintet mutattak az általunk vizsgált postmenopausás csontszövetben (lásd 16. ábra) A RUNX2 transzkripciós aktivitásának szabályozását összetett jelpályák segítik elő (140), amelyek tartalmazzák a növekedési faktorok (mint pl.: munkánkban a szignifikáns változást mutató PDGFA és FGFR1) jelátvitelét biztosító MAPK hálózatot, extracelluláris mátrix fehérjéket (a szignifikánsan változást mutató 10 gént a 16. ábra mutatja be) és a TGFB/BMP család komponenseit (a szignifikáns változást mutató 5 gént a 16. ábra sorolja fel) (23 ábra) Ezekben a jeltovábbító rendszerekben a RUNX2 komplex fokozza a célgének átíródását, ami a postmenopausában gyors turnoverrel járó csontátépüléshez vezet. Egy másik alapvető osteoblast-specifikus transzkripciós faktor, az SP7 (Osterix) expressziója az előzőekhez hasonlóan szintén nagyobb volt postmenopausás nőkben. Az SP7 kulcsfontosságú a funkcionális osteoblastok

kialakulásában és a RUNX2 korai differenciálódást szabályozó hatását követően lép az osteoblastogenezis folyamatába (141, 142). Postmenopausában az SP7 túlzott kifejeződése fokozhatja az osteoblastok érési és proliferációs tevékenységét. 78 23. ábra Az osteoblast specifikus RUNX2 transzkripciós faktor komplex szabályozásában részt vevő jelátviteli mechanizmusok összefoglalása. (Logothetis CJ és mtsai nyomán (167)) A diszkriminancia analízis felfedett olyan, az ösztrogén receptorok kétféle típusa (ER-béta, ER-alfa) által szabályozott eltérően expresszálódó géneket, melyek segítségével egyértelműen megállapítható a nem osteoporoticus humán csontszövet menopausás állapota. Az ösztrogén receptorok (elsősorban ER-béta) jelátviteli útjának sérülése, a géntranszkripció változásához, a csontbontás gyorsulásához vezethet. A különféle extacelluláris mátrix fehérjék és a TGFB/activin/nodal pálya

jelmolekulái szintén nagy szétválasztó erővel rendelkeznek a két vizsgált csoportot illetően, ami hasznos információ lehet a jövőben. 6.21 Az immunkompetens gének eltérő csontszöveti kifejeződésének azonosítása postmenopausás nőkben Napjainkban számos adatot találunk arra, hogy a postmenopausás nemihormon hiány alapvető változásokat okoz az immunrendszer működésében, többek között megemelkedik a gyulladásos citokinek szérum szintje, megváltozik a citokin mintázat és ezáltal a T sejtek polarizálódása, erősödik az NK sejtek citotoxikus funkciója, fokozódik az antigén prezentációs rendszer aktivitása (54, 55, 65, 68, 143). Azonban a vázrendszer közvetett szerepét a csontszövetben zajló, helyi védekező reakciók kialakulásában ezidáig nem 79 vizsgálták, menopausán átesett nőkben. Munkánkban határoztuk meg először a postmenopausás csontszövet lokális immunológiai mechanizmusait szabályozó gének

expressziós eltéréseit. Kimutattuk a komplement kaszkád két elemének (C3, ITGAM/CD11b) szignifikánsan különböző transzkripciós profilját postmenopausás nem osteoporoticus csontszövetben a premenopausas kontrollhoz képest. A C3 molekula a különböző komplement aktiválódási útvonalak közös komponense (144), valamint összeköti a természetes és az adaptív immunrendszer működését (145). Proteolítikus hasítása során keletkező degradációs termékei (C3b, iC3b, C3d) az idegen struktúrák opszonizálását végzik, és komplementreceptorok közvetítésével beindítják a fagocita sejtek hatékony bekebelező funkcióját (146). Emellett az antigén felszínéhez kapcsolódott C3 fragmentumok a B sejtek aktiválásához nélkülözhetetlen koreceptor szignált biztosítanak (147). Fan és mtsai (148) kimutatták, hogy a C3 gén promoter régiója több ERE (estrogen response elements) szekvenciát tartalmaz. Ez a megfigyelés közvetlen magyarázatot

adhat a C3 gén postmenopausás korban megváltozott csontszöveti expressziós aktivitására. Számos, az antigén prezentációs és kostimulációs folyamatokban illetve azok szabályozásában szerepet játszó gén (CD86, HLA-A/MHCI, IL-6, TNFSF11/RANKL) szignifikánsan eltérő kifejeződését tapasztaltuk. A felsorolt gének elsősorban a citolítikus CD8+ T sejtek aktiválásában és az általuk közvetített sejtpusztításban vesznek részt (144, 149, 150). Korábbi közlemények jelentek meg arra vonatkozóan, hogy ovariectomizált állatokban emelkedik az MHC II molekula expressziója, és ezen keresztül a dendritikus sejtek makrofágok és Th1 sejtek aktivitása (68, 69). Adataink először mutatnak rá az ösztrogén hiányában megváltozott csontszöveti endogén antigén prezentációs rendszer és a citotoxikus T sejtek szerepére. 6.3 Az osteoporosis genomikai szintű vizsgálata, új kandidáns gének összefüggése a csontdenzitással A csúcscsonttömeg

50-85%-ban genetikailag determinált. Család- és ikervizsgálatok eredményei a törési rizikót befolyásoló paraméterek (pl.: csontminőség, combnyak geometria, izomerő, csontturnover, BMI, menopausális életkor) genetikai meghatározottságát igazolták (151-153). Számos olyan monogénes eltérésről tudunk, amely ritka, csontrendszeri 80 eltérésekkel járó öröklődő betegséghez vezet, de a csontvesztés patogenezisének pontos genetikai hátterét nem ismerjük. Kutatásunkban hét új, kandidáns gén 26 polimorfizmusának összefüggését vizsgáltuk a postmenopausás csontvesztéssel. Az hét kiválasztott gén közül négy gén polimorfizmusainak szerepét nem közölték korábban a nemzetközi irodalomban. Három olyan individuális SNP-t találtunk, amelyek szignifikáns összefüggést mutattak a csontdenzitással. Az FGFR1 a tirozin-kináz receptor családba tartozó transzmembrán molekula, amely osteoblastokon és osteoclastokon is

megtalálható és a mesenchymális őssejt osteogén differenciálódásában játszik szerepet (154-156). Az FGFR molekulacsalád jelentőségét mutatja, hogy másik tagja, az FGFR3 mutációja okozza a domináns öröklődésű achondropláziát. Az FGFR3 mutációit kapcsolatba hozták a szkeletális deformitásokkal járó Pfeiffer és Kallmann szindrómákkal (157) és a gén haplotípusait a koponya normál variációival találták összefüggőnek (158). Jelen vizsgálatunkban az FGFR1 génben található rs6996321 polimorfizmus szignifikánsan befolyásolta a lumbális BMD-t. Valószínűleg ez egy intronikus SNP, így inkább genomikus markerként szerepelhet, mint a gén működését közvetlenül befolyásoló variáns. A génben található 4 SNP-ből konstruált FGFR1 haplotípus önálló befolyással bírt a lumbális csontdenzitásra, alátámasztva a feltételezést, hogy az FGFR1 génnek szoros kapcsolata lehet a csontmetabolizmussal és variánsai befolyással

bírnak a csökkent csonttömeg kialakulására. A FABP3 gén promóterében található rs10914367 SNP homozigóta recesszív genotípusa szignifkánsan korrelált a magasabb femur BMD-vel. Az SNP a gén promóter régióját, 1. exonját és 1 intronját taggeli és a szekvencia analízis során transzkripciós faktor (TF) kötő helyeket azonosítottunk a lókuszt tartalmazó génszakaszon. Az ’A’ allél esetén a következő négy TF képes a génszakaszhoz kötődni, több mint 90%-os homológiát feltételezve (az rs10914367 allél aláhúzásával); FOXP3 – forehead box protein P3 (GCCAAC), C/EBPbeta – CCAAT enhancer binding protein beta (CCAA), PR-A and PR-B – progeszteron receptor A és B izoforma (AACACCA). A ’G’ allél esetében ezek a TF kötő helyek „eltűnnek”, amely alapján feltételezhető, hogy a polimorfizmusnak transzkripció-regulátor szerepe lehet. A FABP3 a zsírsav-metabolizmusban játszik szerepet, a sejtek zsírsavfelvételét és a

zsírsavak intracelluláris transzportját regulálja (159) és korábban összefüggésbe hozták a diabetes mellitus és az elhízás patogenezisével (159, 160). A molekula expresszálódik a csontvelő eredetű mezenchymális őssejteken (161), és a gén expresszióját a PPARγ is befolyásolja, amely transzkripciós faktor összefüggését leírták a csontvesztés folyamatával. A PPARγ a mezenchymális őssejtek adipogén differenciálódását serkenti és gátolja az osteogén 81 fejlődési utat (115). Fenti eredményeink alátámasztják a korábban feltételezett kapcsolatot a csont és a lipid metabolizmus között (16, 162, 163). A RANKL és az OPG aránya jelentősen befolyásolja a csontbontás folyamatát. Az egyensúly eltolódását elsősorban a RANKL gén fokozott expressziója okozhatja. Napjainkig exonikus régióban lokalizálódó mutációkat nem hoztak összefüggésbe a csontanyagcsere folyamatokkal. Azonban promoter polimorfizmusokról

bebizonyosodott, hogy részt vesznek a csonttömeg genetikai szabályozásában. Mencej és mtsai a RANKL gén rs9533156 és rs9525641 polimorfizmusának hatását igazolták a csípő és a lumbális csigolya BMD-vel (164). Alátámasztottuk az eredményeket és azonosítottunk egy harmadik intronikus polimorfizmust a RANKL génben, amely befolyásolja a gerinc BMD-t, továbbá erős kapcsolatot mutat a másik két SNP-vel. Több irodalmi adat is alátámasztja, hogy az OPG gén promoter rs3102735 polimorfizmusa összefüggést mutat a csontanyagcserével. Jorgensen és mtsai (165) postmenopausás nőket vizsgáltak. A ’G’ allélt hordoznak kisebb volt a csonttömegük, mint az ’A’ allélt homozigóta formában hordozóknak. Langdahl és mtsai (166) igazolták, hogy a ’G’ allél nagyobb arányban fordul elő osteoporoticus nőkben. Befolyásolja a csonttömeget és az osteoporoticus törések kockázatát. Vizsgálatunkban megerősítettük az rs3102735 polimorfizmus

hatását a BMD-re. Az OPG gén második intronjában található rs1564858 SNP összefüggést mutat a csípő BMD-vel. Tekintettel a két molekula jól ismert biológiai kapcsolatára megvizsgáltuk az OPG és RANKL polimorfizmusainak interakcióit. Nem találtunk szignifikáns összefüggéseket Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy a két molekula kapcsolata posttranszkripciós szinten valósul meg illetve, hogy a valódi genetikai interakciók más régiókban alakulnak ki, amelyek feltérképezése további vizsgálatokat igényel. 82 7. KÖVETKEZTETÉSEK Az osteoporosis kialakulását és a postmenopausás csontanyagcserét befolyásoló genetikai faktorok és a genetikai tényezők egymással való kapcsolata jórészt nem ismert. Az egyes gének, génváltozatok egyedi hatása csekélynek bizonyult a korábbi vizsgálatokban. Az osteoporosis és a menopausát követő multifaktoriális metabolikus változások hátterében poligénes hatás és az egyes gének,

géncsoportok egymással való interakciója valószínűsíthető. Vizsgálatunkban tudomásunk szerint elsőként alkalmaztunk rendszerbiológia megközelítést a metabolikus csontbetegségek kutatásában. Több molekuláris szinten (transzkriptomika, genomika, interaktomika) elvégzett vizsgálat segítségével számos adatot gyűjtöttünk a csontszövet megváltozott metabolikus folyamataival kapcsolatban, amely genetikai információk (kvantitatív mRNS expresszió, SNP) nagyban hozzájárulhatnak a csont anyagcsere-betegségeinek megismeréséhez. • Vizsgálatunkban a postmenopausás osteoporoticus és nem osteoporoticus nők csontszövetében szignifikánsan eltérő génexpressziós mintázatot mutattunk ki. Az általunk elsőként használt megközelítési módokkal, ill. statisztikai rendszerekkel (DFA, PCA, HCL), az osteoporosissal és a csontmetabolizmussal eddig még összefüggésbe nem hozott géneket, illetve géncsoportokat azonosítottunk. Ezek a

transzkripciós hálózatban megfigyelt változások tovább segíthetik az osteoporosis során módosult csontanyagcsere folyamatok és ezáltal a betegség patogenezisének megértését. • Munkánkban vizsgáltuk először a csontrendszer egészét érintő megbetegedés az osteoporosis hatását a csontszövetben zajló lokális gyulladási és immunreakciókra, továbbá az immunrendszer differenciálódási és érési folyamataira. Megállapítottuk, hogy az immunrendszerhez szorosan kapcsolódó, elsősorban a veleszületett immunitás részeként megismert gének eltérő expressziós mintázata része lehet a csonthomeosztázis felborulásának. • Megvizsgáltuk humán post- illetve premenopausás nőkből származó csontszövetek multigénes transzkripciós profilját és kimutattunk szignifikáns expressziós különbségeket a két állapot között. A vizsgálatainkkal nyert transzkriptomikai adatok lehetővé tették a postmenopausás és premenopausás

csontszöveti fenotípus elkülönítését. 83 • Igazoltuk a postmenopausás transzkriptomikai eltéréseit csont és a immunológiai genetikai szempontból adatok alapján meghatározó egyértelműen megkülönböztettük a csont menopausás státuszait. Azonosítottunk olyan, az immunrendszer működéséhez szorosan kapcsolt géneket, amelyek markánsan megváltozott kifejeződése eddig nem volt ismert a postmenopausás csontvesztés vonatkozásában. • Az ortholog szarvas modell alapján hét új kandidáns gént azonosítottunk - ALPL, FABP3, FGFR1, MMP2, TIMP2, RANKL, OPG, - amelyek az osteoporosis kialakulásában kulcsszerepet játszhatnak és amelyek génexpressziós változásait humán csontszövetben is leírtuk. Kutatómunkánk során egypontos nukleotid polimorfizmusaik összefüggését vizsgáltuk a postmenopausás csontvesztéssel és kapcsolatot találtunk a gének polimorfizmus mintázata (haplotípusa) és a csontsűrűség között. 84

8. ÖSSZEFOGLALÁS A primer korral járó csontvesztés hátterében álló komplex genetikai hatások még teljes egészében nem tisztázottak. Tudjuk, hogy a menopausát követő hormon hiányos állapotban gyorsul a remodelling, fokozódik a gyulladást mediáló citokinek kifejeződése. Azonban a fent említett mechanizmusok pontos genomikai és transzkriptomikai okait nem ismerjük. Ezért célunk volt postmenopausás nemi hormonok hiányában és osteoporosisban szignifikánsan változó csontszöveti transzkripciós profilt mutató gének meghatározása, illetve az ortholog szarvas modell segítségével feltárt néhány új kandidáns génben található egypontos nukleotid polimorfizmus (SNP) azonosítása postmenopausás korú nőkben. Továbbá, az immunrendszer szabályozásában központi szerepet betöltő gének expressziós mintázatának analízise osteoporoticus és nem osteoporoticus, valamint különböző menopausális stádiumú humán csontszövetben. Több

gén - köztük a zsírmetabolizmusban érintett gének; transzkripciós faktorok, amelyek az osteoblast/adipocita differenciálódást befolyásolják; extracelluláris mátrix fehérjéket, elsősorban kollagén molekulákat kódoló gének, növekedési faktorok génjei esetén találtunk szignifikánsan változó expressziós mintázatot postmenopausás osteoporoticus nők csontszövetében a nem osteoporoticus kontroll mintákéhoz képest. Többváltozós statisztikai analízisek segítségével nagy számban azonosítottunk géneket, amelyeknek szerepe lehet a csontszövet osteoporoticus és nem osteoporoticus fenotípusainak megkülönböztetésében. Rámutattunk az ösztrogén receptorok kétféle típusa (ER-béta, ERalfa) által szabályozott géncsoportokra, melyek erőteljesen elválasztják a postmenopausás és premenopausás fázisban lévő csontszövetet. Immunológiai szempontú komplex transzkripciós profil vizsgálat alapján képesek voltunk jellemezni a

humán csontszövet eltérő menopausás állapotait. Adataink azt valószínűsítik, hogy az osteoporosis során átalakult csontanyagcsere változásokat indít a nem fajlagos védekező mechanizmus regulációjában. A genomikai (SNP) vizsgálatok összefüggést találtak a vizsgált gének polimorfizmusai és a csontsűrűség között. A csontszöveti multiplex transzkripciós profil elemzés segítségével azonosítottunk olyan géneket, melyek kiemelkedő szerepet játszhatnak a postmenopausás állapotú csontszövet anyagcsere folyamatainak megváltozásában és a primer csontritkulás kialakulásában. Emellett genetikai információink hozzájárulhatnak az immun- és csonthomeosztázis összefüggéseinek további értelmezéséhez, a módosult csontszöveti mikrokörnyezetben zajló immunológiai mechanizmusok mélyebb megértéséhez. 85 9. SUMMARY Sex hormone deficiency after menopause has multifunctional role by influencing growth, differentiation, metabolism

of the skeletal system and results in marked increases in bone resorption and formation, leading to rapid bone loss. However the complex genetic effects leads to osteoporosis are not exactly estbalished. Our aims were to determine genes characterized by significantly changed mRNA expression rates in postmenopausal osteoporotic and non-osteoporotic human bone tissue and to describe the relationships between these genes using multivariate data analysis. Messenger RNA was prepared from each sample and reverse transcribed to cDNA. The expression differences of 147 selected genes were analyzed in a TaqMan probe-based quantitativereal-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction system. Mann-Whitney U-test indicated significant (p ≤ 0.05) differences in the expression of numerous genes involved in extracellular matrix formation and degradation, lipid metabolism, osteoblast/adipocyte differentiation. Some genes belonging to the transforming growth factorβ/bone morphogenic protein

pathway, genes controlled via estrogen receptor-α Principal components analysis was used to evaluate data structure and the relationship between postmenopausal osteoporotic and non-osteoporotic phenotypes based on the multiple mRNA expression profiles of genes. According to the canonical variate analysis results, the groups of the examined women are separable by genes coding for cytokines, costimulator molecules, and cell surface receptors involved in antigen presentation and T cell stimulation processes which have high discriminatory power. Based on a complex gene expression pattern analysis of human bone tissue, we could distinguish menopausal states from an immunological aspect. Significant differences observed in gene expression profiles of osteoporotic and non-osteoporotic human bone tissues. Our data might provide further insight into the changes of the intersystem crosstalk between immune and skeletal homeostasis, as well as local immune response in the altered microenvironment

of postmenopausal bone. Characterization of the differences between osteoporotic and nonosteoporotic bones by expression profiling will contribute to the development of diagnostic tools in the future. 86 10. IRODALOMJEGYZÉK 1. Rizzoli R, Bonjour JP, Ferrari SL (2001) Osteoporosis, genetics and hormones. J Mol Endocrinol 26:79-94. 2. Lakatos P (1999) A kalciumháztartás és a csontszövet anyagcsere-betegségei. Medicina, Budapest. 3. Lakatos P, Takács I (2006) Metabolikus csontbetegségek. Medintel, Budapest 4. Mosekilde L (2000) Age-related changes in bone mass, structure, and strength--effects of loading. Z Rheumatol 59 S1:1-9 5. Lorenzo J, Horowitz M, Choi Y (2008) Osteoimmunology: interactions of the bone and immune system. Endocr Rev 29:403-440 6. Johnson ML, Kamel MA (2007) The Wnt signaling pathway and bone metabolism. Curr Opin Rheum 19:376-382. 7. Milat F, Ng KW (2009) Is Wnt signalling the final common pathway leading to bone formation? Mol Cell

Endocrinol 310:52-62. 8. Krishnan V, Bryant HU, Macdougald OA (2006) Regulation of bone mass by Wnt signaling. J Clin Invest 116:1202-1209 9. Poor G, Kiss C, Szilagyi M, Mituszova M, ONeill TW, Felsenberg D, Silman AJ (1997) [Prevalence of vertebral deformity in Hungary: the European Vertebral Osteoporosis Study]. Orv Hetil 138:2647-2652 10. Lane NE (2006) Epidemiology, etiology, and diagnosis of osteoporosis. Am J Obstet Gynecol 194:S3-11. 11. Cao J, Venton L, Sakata T, Halloran BP (2003) Expression of RANKL and OPG correlates with age-related bone loss in male C57BL/6 mice. J Bone Miner Res 18:270-277. 12. Rodriguez JP, Garat S, Gajardo H, Pino AM, Seitz G (1999) Abnormal osteogenesis in osteoporotic patients is reflected by altered mesenchymal stem cells dynamics. J Cell Biochem 75:414-423. 13. Rodriguez JP, Montecinos L, Rios S, Reyes P, Martinez J (2000) Mesenchymal stem cells from osteoporotic patients produce a type I collagen-deficient extracellular matrix favoring

adipogenic differentiation. J Cell Biochem 79:557-565 14. Roholl PJ, Blauw E, Zurcher C, Dormans JA, Theuns HM (1994) Evidence for a diminished maturation of preosteoblasts into osteoblasts during aging in rats: an ultrastructural analysis. J Bone Miner Res 9:355-366 87 15. DIppolito G, Schiller PC, Ricordi C, Roos BA, Howard GA (1999) Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow. J Bone Miner Res 14:1115-1122 16. Nuttall ME, Gimble JM (2004) Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications. Curr Opin Pharmacol 4:290-294. 17. Justesen J, Stenderup K, Ebbesen EN, Mosekilde L, Steiniche T, Kassem M (2001) Adipocyte tissue volume in bone marrow is increased with aging and in patients with osteoporosis. Biogerontology 2:165-171 18. Riggs BL (2000) The mechanisms of estrogen regulation of bone resorption. J Clin Invest 106:1203-1204. 19. Turner RT, Riggs BL,

Spelsberg TC (1994) Skeletal effects of estrogen. Endocr Rev 15:275-300. 20. Syed F, Khosla S (2005) Mechanisms of sex steroid effects on bone. Biochem Biophys Res Commun 328:688-696. 21. Lindberg MK, Moverare S, Eriksson AL, Skrtic S, Gao H, Dahlman-Wright K, Gustafsson JA, Ohlsson C (2002) Identification of estrogen-regulated genes of potential importance for the regulation of trabecular bone mineral density. J Bone Miner Res 17:2183-2195. 22. Abrahamsen B, Shalhoub V, Larson EK, Eriksen EF, Beck-Nielsen H, Marks SC, Jr. (2000) Cytokine RNA levels in transiliac bone biopsies from healthy early postmenopausal women. Bone 26:137-145 23. Robinson JA, Harris SA, Riggs BL, Spelsberg TC (1997) Estrogen regulation of human osteoblastic cell proliferation and differentiation. Endocrinol 138:2919-2927 24. Takahashi M, Kushida K, Hoshino H, Ohishi T, Inoue T (1999) Biochemical markers of bone turnover do not decline after menopause in healthy women. Brit J Obstet Gynaecol

106:427-431. 25. Kuroki T, Shingu M, Koshihara Y, Nobunaga M (1994) Effects of cytokines on alkaline phosphatase and osteocalcin production, calcification and calcium release by human osteoblastic cells. Brit J Rheum 33:224-230 26. Burger HG (1999) The endocrinology of the menopause. J Steroid Biochem Mol Biol 69:31-35. 27. Liang M, Liao EY, Xu X, Luo XH, Xiao XH (2003) Effects of progesterone and 18methyl levonorgestrel on osteoblastic cells. Endocrine Res 29:483-501 88 28. Mac Namara P, Loughrey HC (1998) Progesterone receptor A and B isoform expression in human osteoblasts. Calcif Tissue Int 63:39-46 29. Eijken M, Swagemakers S, Koedam M, Steenbergen C, Derkx P, Uitterlinden AG, van der Spek PJ, Visser JA, de Jong FH, Pols HA, van Leeuwen JP (2007) The activin Afollistatin system: potent regulator of human extracellular matrix mineralization. Faseb J 21:2949-2960. 30. Ikenoue T, Jingushi S, Urabe K, Okazaki K, Iwamoto Y (1999) Inhibitory effects of activin-A on

osteoblast differentiation during cultures of fetal rat calvarial cells. J Cell Biochem 75:206-214. 31. Ideker T, Winslow LR, Lauffenburger DA (2006) Bioengineering and systems biology. Ann Biomed Eng 34:1226-1233. 32. Ideker T, Galitski T, Hood L (2001) A new approach to decoding life: systems biology. Ann Rev Genomics Hum Genet 2:343-372. 33. Hood L (2003) Systems biology: integrating technology, biology, and computation. Mech Ageing Dev 124:9-16. 34. Fattore M, Arrigo P (2005) Knowledge discovery and system biology in molecular medicine: an application on neurodegenerative diseases. In Silico Biol 5:199-208 35. Prentice A (2001) The relative contribution of diet and genotype to bone development. Proc Nutr Soc 60:45-52. 36. Ralston SH (2005) Genetic determinants of osteoporosis. Curr Opin Rheum 17:475479 37. Zajickova K, Zofkova I (2003) Osteoporosis: genetic analysis of multifactorial disease. Endocrine Reg 37:31-44. 38. Liu YJ, Shen H, Xiao P, Xiong DH, Li LH,

Recker RR, Deng HW (2006) Molecular genetic studies of gene identification for osteoporosis: a 2004 update. J Bone Miner Res 21:1511-1535. 39. Xiong DH, Shen H, Zhao LJ, Xiao P, Yang TL, Guo Y, Wang W, Guo YF, Liu YJ, Recker RR, Deng HW (2006) Robust and comprehensive analysis of 20 osteoporosis candidate genes by very high-density single-nucleotide polymorphism screen among 405 white nuclear families identified significant association and gene-gene interaction. J Bone Miner Res 21:1678-1695. 40. Lofman O, Magnusson P, Toss G, Larsson L (2005) Common biochemical markers of bone turnover predict future bone loss: a 5-year follow-up study. Clin Chim Acta 356:67-75. 89 41. Langlois JA, Rosen CJ, Visser M, Hannan MT, Harris T, Wilson PW, Kiel DP (1998) Association between insulin-like growth factor I and bone mineral density in older women and men: the Framingham Heart Study. J Clin Endocrinol Metab 83:4257-4262 42. Grainger DJ, Percival J, Chiano M, Spector TD (1999) The role

of serum TGF-beta isoforms as potential markers of osteoporosis. Osteoporos Int 9:398-404 43. Yamaguchi T, Kanatani M, Yamauchi M, Kaji H, Sugishita T, Baylink DJ, Mohan S, Chihara K, Sugimoto T (2006) Serum levels of insulin-like growth factor (IGF); IGFbinding proteins-3, -4, and -5; and their relationships to bone mineral density and the risk of vertebral fractures in postmenopausal women. Calcif Tissue Int 78:18-24 44. Christenson RH (1997) Biochemical markers of bone metabolism: an overview. Clin Biochem 30:573-593. 45. Srivastava AK, Vliet EL, Lewiecki EM, Maricic M, Abdelmalek A, Gluck O, Baylink DJ (2005) Clinical use of serum and urine bone markers in the management of osteoporosis. Curr Med Res Opin 21:1015-1026 46. Dvornyk V, Recker RR, Deng HW (2003) Gene expression studies of osteoporosis: implications for microarray research. Osteoporos Int 14:451-461 47. Ralston SH (1994) Analysis of gene expression in human bone biopsies by polymerase chain reaction: evidence

for enhanced cytokine expression in postmenopausal osteoporosis. J Bone Miner Res 9:883-890 48. Turner AS (2001) Animal models of osteoporosis--necessity and limitations. Eur Cell Mater 1:66-81. 49. Thorndike EA, Turner AS (1998) In search of an animal model for postmenopausal diseases. Front Biosci 3:c17-26 50. Molnar A, Gyurjan I, Korpos E, Borsy A, Steger V, Buzas Z, Kiss I, Zomborszky Z, Papp P, Deak F, Orosz L (2007) Identification of differentially expressed genes in the developing antler of red deer Cervus elaphus. Mol Genet Genomics 277:237-248 51. Gyurjan I, Jr., Molnar A, Borsy A, Steger V, Hackler L, Jr, Zomborszky Z, Papp P, Duda E, Deak F, Lakatos P, Puskas LG, Orosz L (2007) Gene expression dynamics in deer antler: mesenchymal differentiation toward chondrogenesis. Mol Genet Genomics 277:221-235. 52. Walsh MC, Kim N, Kadono Y, Rho J, Lee SY, Lorenzo J, Choi Y (2006) Osteoimmunology: interplay between the immune system and bone metabolism. Ann Rev Immunol

24:33-63. 90 53. Zallone A (2006) Direct and indirect estrogen actions on osteoblasts and osteoclasts. Ann NY Acad Sci 1068:173-179. 54. Bouman A, Heineman MJ, Faas MM (2005) Sex hormones and the immune response in humans. Hum Reprod Update 11:411-423 55. Weitzmann MN, Pacifici R (2006) Estrogen regulation of immune cell bone interactions. Ann NY Acad Sci 1068:256-274 56. Clowes JA, Riggs BL, Khosla S (2005) The role of the immune system in the pathophysiology of osteoporosis. Immunol Rev 208:207-227 57. Choi Y, Woo KM, Ko SH, Lee YJ, Park SJ, Kim HM, Kwon BS (2001) Osteoclastogenesis is enhanced by activated B cells but suppressed by activated CD8(+) T cells. Eur J Immunol 31:2179-2188 58. Rauner M, Sipos W, Pietschmann P (2007) Osteoimmunology. Int Arch Allergy Immunol 143:31-48. 59. Stanley KT, VanDort C, Motyl C, Endres J, Fox DA (2006) Immunocompetent properties of human osteoblasts: interactions with T lymphocytes. J Bone Miner Res 21:29-36. 60.

Garcia-Martinez O, Reyes-Botella C, Aguilera-Castillo O, Vallecillo-Capilla MF, Ruiz C (2006) Antigenic profile of osteoblasts present in human bone tissue sections. Biosci Rep 26:39-43. 61. Skjodt H, Hughes DE, Dobson PR, Russell RG (1990) Constitutive and inducible expression of HLA class II determinants by human osteoblast-like cells in vitro. J Clin Invest 85:1421-1426. 62. Skjodt H, Moller T, Freiesleben SF (1989) Human osteoblast-like cells expressing MHC class II determinants stimulate allogeneic and autologous peripheral blood mononuclear cells and function as antigen-presenting cells. Immunol 68:416-420 63. Carlsten H (2005) Immune responses and bone loss: the estrogen connection. Immunol Rev 208:194-206. 64. Safadi FF, Dissanayake IR, Goodman GG, Jago RA, Baker AE, Bowman AR, Sass DA, Popoff SN, Epstein S (2000) Influence of estrogen deficiency and replacement on Tcell populations in rat lymphoid tissues and organs. Endocrine 12:81-88 65. Kamada M, Irahara M,

Maegawa M, Ohmoto Y, Murata K, Yasui T, Yamano S, Aono T (2001) Transient increase in the levels of T-helper 1 cytokines in postmenopausal women and the effects of hormone replacement therapy. Gynecol Obstet Invest 52:8288 91 66. Deguchi K, Kamada M, Irahara M, Maegawa M, Yamamoto S, Ohmoto Y, Murata K, Yasui T, Yamano S, Aono T (2001) Postmenopausal changes in production of type 1 and type 2 cytokines and the effects of hormone replacement therapy. Menopause 8:266-273. 67. Grcevic D, Katavic V, Lukic IK, Kovacic N, Lorenzo JA, Marusic A (2001) Cellular and molecular interactions between immune system and bone. Croat Med J 42:384-392 68. Cenci S, Toraldo G, Weitzmann MN, Roggia C, Gao Y, Qian WP, Sierra O, Pacifici R (2003) Estrogen deficiency induces bone loss by increasing T cell proliferation and lifespan through IFN-gamma-induced class II transactivator. Proc Nat Acad Sci USA 100:10405-10410. 69. Pacifici R (2008) Estrogen deficiency, T cells and bone loss. Cell Immunol

252:68-80 70. Kellgren JH, Lawrence JS (1957) Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis 16:494-502. 71. Benayahu D (1997) Estrogen effects on protein expressed by marrow stromal osteoblasts. Biochem Biophys Res Commun 233:30-35 72. Wang L, Liu S, Niu T, Xu X (2005) SNPHunter: a bioinformatic software for single nucleotide polymorphism data acquisition and management. BMC Bioinformatics 6:60 73. Bell PA, Chaturvedi S, Gelfand CA, Huang CY, Kochersperger M, Kopla R, Modica F, Pohl M, Varde S, Zhao R, Zhao X, Boyce-Jacino MT, Yassen A (2002) SNPstream UHT: ultra-high throughput SNP genotyping for pharmacogenomics and drug discovery. Biotechniques 32S:70-77 74. Podani J (2001) SYN-TAX 2000. User’s Manual Scientia, Budapest 75. Dai JJ, Lieu L, Rocke D (2006) Dimension reduction for classification with gene expression microarray data. Stat Appl Genet Mol Biol 5:Article6 76. Yeung KY, Ruzzo WL (2001) Principal component analysis for clustering gene expression

data. Bioinformatics 17:763-774 77. Raychaudhuri S, Stuart JM, Altman RB (2000) Principal components analysis to summarize microarray experiments: application to sporulation time series. Pac Symp Biocomput 455-466. 78. Podani J (2000) Introduction to the Exploration of Multivariate Biological Data. Backhuys, Leiden. 79. Jolliffe I (1986) Principal Component Analysis. Springer, New York 80. Cattell R (1966) The scree test for the number of factors. Multivar Behavioral Res 1:140-161. 92 81. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D (1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Nat Acad Sci USA 95:14863-14868 82. Saeed AI, Sharov V, White J, Li J, Liang W, Bhagabati N, Braisted J, Klapa M, Currier T, Thiagarajan M, Sturn A, Snuffin M, Rezantsev A, Popov D, Ryltsov A, Kostukovich E, Borisovsky I, Liu Z, Vinsavich A, Trush V, Quackenbush J (2003) TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques

34:374-378. 83. Xie Q, Ratnasinghe LD, Hong H, Perkins R, Tang ZZ, Hu N, Taylor PR, Tong W (2005) Decision forest analysis of 61 single nucleotide polymorphisms in a casecontrol study of esophageal cancer; a novel method. BMC Bioinformatics 6 Suppl 2:S4 84. Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ (2005) Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21:263-265 85. Curtin K, Wong J, Allen-Brady K, Camp NJ (2007) PedGenie: meta genetic association testing in mixed family and case-control designs. BMC Bioinformatics 8:448. 86. Schaid DJ, Rowland CM, Tines DE, Jacobson RM, Poland GA (2002) Score tests for association between traits and haplotypes when linkage phase is ambiguous. Am J Human Genet 70:425-434. 87. Vega D, Maalouf NM, Sakhaee K (2007) The role of receptor activator of nuclear factor-kappaB (RANK)/RANK ligand/osteoprotegerin: clinical implications. J Clin Endocrinol Metab 92:4514-4521. 88. Itoh S, Itoh F, Goumans MJ, Ten Dijke P (2000)

Signaling of transforming growth factor-beta family members through Smad proteins. Eur J Biochem 267:6954-6967 89. Kawabata M, Imamura T, Miyazono K (1998) Signal transduction by bone morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev 9:49-61 90. Gazzerro E, Canalis E (2006) Bone morphogenetic proteins and their antagonists. Rev Endocr Metab Disord 7:51-65. 91. Manolagas SC, Kousteni S, Jilka RL (2002) Sex steroids and bone. Recent Prog Hormone Res 57:385-409. 92. Reya T, Clevers H (2005) Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 434:843850 93. Koay MA, Brown MA (2005) Genetic disorders of the LRP5-Wnt signalling pathway affecting the skeleton. Trends Mol Med 11:129-137 93 94. Brama M, Gnessi L, Basciani S, Cerulli N, Politi L, Spera G, Mariani S, Cherubini S, dAbusco AS, Scandurra R, Migliaccio S (2007) Cadmium induces mitogenic signaling in breast cancer cell by an ERalpha-dependent mechanism. Mol Cell Endocrinol 264:102-108. 95. Fournier B, Gutzwiller S,

Dittmar T, Matthias G, Steenbergh P, Matthias P (2001) Estrogen receptor (ER)-alpha, but not ER-beta, mediates regulation of the insulin-like growth factor I gene by antiestrogens. J Biol Chem 276:35444-35449 96. Kian Tee M, Rogatsky I, Tzagarakis-Foster C, Cvoro A, An J, Christy RJ, Yamamoto KR, Leitman DC (2004) Estradiol and selective estrogen receptor modulators differentially regulate target genes with estrogen receptors alpha and beta. Mol Biol Cell 15:1262-1272. 97. Kouzmenko AP, Takeyama K, Ito S, Furutani T, Sawatsubashi S, Maki A, Suzuki E, Kawasaki Y, Akiyama T, Tabata T, Kato S (2004) Wnt/beta-catenin and estrogen signaling converge in vivo. J Biol Chem 279:40255-40258 98. Lu T, Achari Y, Sciore P, Hart DA (2006) Estrogen receptor alpha regulates matrix metalloproteinase-13 promoter activity primarily through the AP-1 transcriptional regulatory site. Biochim Biophys Acta 1762:719-731 99. Mueller MD, Vigne JL, Minchenko A, Lebovic DI, Leitman DC, Taylor RN (2000)

Regulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transcription by estrogen receptors alpha and beta. Proc Nat Acad Sci USA 97:10972-10977 100. Tou L, Quibria N, Alexander JM (2001) Regulation of human cbfa1 gene transcription in osteoblasts by selective estrogen receptor modulators (SERMs). Mol Cell Endocrinol 183:71-79. 101. Viereck V, Grundker C, Blaschke S, Siggelkow H, Emons G, Hofbauer LC (2002) Phytoestrogen genistein stimulates the production of osteoprotegerin by human trabecular osteoblasts. J Biol Chem 84:725-735 102. Wang J, Jarrett J, Huang CC, Satcher RL, Jr., Levenson AS (2007) Identification of estrogen-responsive genes involved in breast cancer metastases to the bone. Clin Exp Metastasis 24:411-422. 103. van den Wijngaard A, Mulder WR, Dijkema R, Boersma CJ, Mosselman S, van Zoelen EJ, Olijve W (2000) Antiestrogens specifically up-regulate bone morphogenetic protein-4 promoter activity in human osteoblastic cells. Mol Endocrinol 14:623-633.

94 104. Zhou S, Turgeman G, Harris SE, Leitman DC, Komm BS, Bodine PV, Gazit D (2003) Estrogens activate bone morphogenetic protein-2 gene transcription in mouse mesenchymal stem cells. Mol Endocrinol 17:56-66 105. Cao L, Bu R, Oakley JI, Kalla SE, Blair HC (2003) Estrogen receptor-beta modulates synthesis of bone matrix proteins in human osteoblast-like MG63 cells. J Biol Chem 89:152-164. 106. Monroe DG, Getz BJ, Johnsen SA, Riggs BL, Khosla S, Spelsberg TC (2003) Estrogen receptor isoform-specific regulation of endogenous gene expression in human osteoblastic cell lines expressing either ERalpha or ERbeta. J Biol Chem 90:315-326. 107. Srivastava S, Weitzmann MN, Cenci S, Ross FP, Adler S, Pacifici R (1999) Estrogen decreases TNF gene expression by blocking JNK activity and the resulting production of c-Jun and JunD. J Clin Invest 104:503-513 108. Romagnani S (2006) Regulation of the T cell response. Clin Exp Allergy 36:13571366 109. Corthay A (2006) A three-cell model

for activation of naive T helper cells. Scand J Immunol 64:93-96. 110. Gergely J, Erdei A (2000) Immunbiológia. Medicina, Budapest 111. Steinman RM, Hemmi H (2006) Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol 311:17-58 112. Schuurhuis DH, Fu N, Ossendorp F, Melief CJ (2006) Ins and outs of dendritic cells. Int Arch Allergy Immunol 140:53-72. 113. Hornef MW, Wick MJ, Rhen M, Normark S (2002) Bacterial strategies for overcoming host innate and adaptive immune responses. Nat Immunol 3:1033-1040 114. Carron JA, Wagstaff SC, Gallagher JA, Bowler WB (2000) A CD36-binding peptide from thrombospondin-1 can stimulate resorption by osteoclasts in vitro. Biochem Biophys Res Commun 270:1124-1127. 115. Calvo D, Gomez-Coronado D, Suarez Y, Lasuncion MA, Vega MA (1998) Human CD36 is a high affinity receptor for the native lipoproteins HDL, LDL, and VLDL. J Lipid Res 39:777-788. 116. Kawaguchi H, Akune T, Yamaguchi M, Ohba S, Ogata N, Chung UI,

Kubota N, Terauchi Y, Kadowaki T, Nakamura K (2005) Distinct effects of PPARgamma insufficiency on bone marrow cells, osteoblasts, and osteoclastic cells. J Bone Miner Metab 23:275-279. 95 117. Moerman EJ, Teng K, Lipschitz DA, Lecka-Czernik B (2004) Aging activates adipogenic and suppresses osteogenic programs in mesenchymal marrow stroma/stem cells: the role of PPAR-gamma2 transcription factor and TGF-beta/BMP signaling pathways. Aging Cell 3:379-389 118. Aitman TJ, Glazier AM, Wallace CA, Cooper LD, Norsworthy PJ, Wahid FN, AlMajali KM, Trembling PM, Mann CJ, Shoulders CC, Graf D, St Lezin E, Kurtz TW, Kren V, Pravenec M, Ibrahimi A, Abumrad NA, Stanton LW, Scott J (1999) Identification of Cd36 (Fat) as an insulin-resistance gene causing defective fatty acid and glucose metabolism in hypertensive rats. Nat Genet 21:76-83 119. Nagy L, Tontonoz P, Alvarez JG, Chen H, Evans RM (1998) Oxidized LDL regulates macrophage gene expression through ligand activation of PPARgamma. Cell

93:229240 120. Tamura M, Noda M (1999) Identification of DERMO-1 as a member of helix-loophelix type transcription factors expressed in osteoblastic cells. J Cell Biochem 72:167176 121. Gong XQ, Li L (2002) Dermo-1, a multifunctional basic helix-loop-helix protein, represses MyoD transactivation via the HLH domain, MEF2 interaction, and chromatin deacetylation. J Biol Chem 277:12310-12317 122. Lee MS, Lowe G, Flanagan S, Kuchler K, Glackin CA (2000) Human Dermo-1 has attributes similar to twist in early bone development. Bone 27:591-602 123. Park H, Jung YK, Park OJ, Lee YJ, Choi JY, Choi Y (2005) Interaction of Fas ligand and Fas expressed on osteoclast precursors increases osteoclastogenesis. J Immunol 175:7193-7201. 124. Ozeki N, Mogi M, Nakamura H, Togari A (2002) Differential expression of the FasFas ligand system on cytokine-induced apoptotic cell death in mouse osteoblastic cells. Arch Oral Biol 47:511-517. 125. Atkins GJ, Bouralexis S, Evdokiou A, Hay S, Labrinidis

A, Zannettino AC, Haynes DR, Findlay DM (2002) Human osteoblasts are resistant to Apo2L/TRAIL-mediated apoptosis. Bone 31:448-456 126. Roux S, Lambert-Comeau P, Saint-Pierre C, Lepine M, Sawan B, Parent JL (2005) Death receptors, Fas and TRAIL receptors, are involved in human osteoclast apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 333:42-50. 127. Murakami Y (2005) Involvement of a cell adhesion molecule, TSLC1/IGSF4, in human oncogenesis. Cancer Sci 96:543 96 128. Lin CY, Strom A, Vega VB, Kong SL, Yeo AL, Thomsen JS, Chan WC, Doray B, Bangarusamy DK, Ramasamy A, Vergara LA, Tang S, Chong A, Bajic VB, Miller LD, Gustafsson JA, Liu ET (2004) Discovery of estrogen receptor alpha target genes and response elements in breast tumor cells. Genome Biol 5:R66 129. Gelse K, Poschl E, Aigner T (2003) Collagens--structure, function, and biosynthesis. Adv Drug Deliv Rev 55:1531-1546. 130. Peiser L, Gordon S (2001) The function of scavenger receptors expressed by macrophages and their role in

the regulation of inflammation. Microbes Infect 3:149159 131. Peiser L, Mukhopadhyay S, Gordon S (2002) Scavenger receptors in innate immunity. Curr Opin Immunol 14:123-128. 132. Pluddemann A, Neyen C, Gordon S (2007) Macrophage scavenger receptors and hostderived ligands. Methods 43:207-217 133. Davey RA, Hahn CN, May BK, Morris HA (2000) Osteoblast gene expression in rat long bones: effects of ovariectomy and dihydrotestosterone on mRNA levels. Calcif Tissue Int 67:75-79. 134. Ikeda T, Yamaguchi A, Yokose S, Nagai Y, Yamato H, Nakamura T, Tsurukami H, Tanizawa T, Yoshiki S (1996) Changes in biological activity of bone cells in ovariectomized rats revealed by in situ hybridization. J Bone Miner Res 11:780-788 135. Yokose S, Ishizuya T, Ikeda T, Nakamura T, Tsurukami H, Kawasaki K, Suda T, Yoshiki S, Yamaguchi A (1996) An estrogen deficiency caused by ovariectomy increases plasma levels of systemic factors that stimulate proliferation and differentiation of osteoblasts in

rats. Endocrinol 137:469-478 136. Schroeder TM, Jensen ED, Westendorf JJ (2005) Runx2: a master organizer of gene transcription in developing and maturing osteoblasts. Birth Defects Res C, Embryo Today 75:213-225. 137. Komori T (2003) Requisite roles of Runx2 and Cbfb in skeletal development. J Bone Miner Metab 21:193-197. 138. Stein GS, Lian JB, van Wijnen AJ, Stein JL, Montecino M, Javed A, Zaidi SK, Young DW, Choi JY, Pockwinse SM (2004) Runx2 control of organization, assembly and activity of the regulatory machinery for skeletal gene expression. Oncogene 23:43154329 139. Enomoto H, Shiojiri S, Hoshi K, Furuichi T, Fukuyama R, Yoshida CA, Kanatani N, Nakamura R, Mizuno A, Zanma A, Yano K, Yasuda H, Higashio K, Takada K, 97 Komori T (2003) Induction of osteoclast differentiation by Runx2 through receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) and osteoprotegerin regulation and partial rescue of osteoclastogenesis in Runx2-/- mice by RANKL transgene. J Biol

Chem 278:23971-23977. 140. Franceschi RT, Xiao G (2003) Regulation of the osteoblast-specific transcription factor, Runx2: responsiveness to multiple signal transduction pathways. J Cell Biochem 88:446-454. 141. Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, de Crombrugghe B (2002) The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 108:17-29 142. Kim YJ, Kim HN, Park EK, Lee BH, Ryoo HM, Kim SY, Kim IS, Stein JL, Lian JB, Stein GS, van Wijnen AJ, Choi JY (2006) The bone-related Zn finger transcription factor Osterix promotes proliferation of mesenchymal cells. Gene 366:145-151 143. Stopinska-Gluszak U, Waligora J, Grzela T, Gluszak M, Jozwiak J, Radomski D, Roszkowski PI, Malejczyk J (2006) Effect of estrogen/progesterone hormone replacement therapy on natural killer cell cytotoxicity and immunoregulatory cytokine release by peripheral blood mononuclear cells of postmenopausal women. J

Reprod Immunol 69:65-75. 144. Gergely J, Erdei A (2000) Immunbiológia. Medicina, Budapest 145. Carroll MC (1998) The role of complement and complement receptors in induction and regulation of immunity. Ann Rev Immunol 16:545-568 146. van Lookeren Campagne M, Wiesmann C, Brown EJ (2007) Macrophage complement receptors and pathogen clearance. Cell Microbiol 9:2095-2102 147. Villiers MB, Perrin-Cocon L, Marche PN, Villiers CL (2004) Complement receptors and B lymphocytes. Crit Rev Immunol 24:465-478 148. Fan JD, Wagner BL, McDonnell DP (1996) Identification of the sequences within the human complement 3 promoter required for estrogen responsiveness provides insight into the mechanism of tamoxifen mixed agonist activity. Mol Endocrinol 10:16051616 149. Wiethe C, Dittmar K, Doan T, Lindenmaier W, Tindle R (2003) Enhanced effector and memory CTL responses generated by incorporation of receptor activator of NFkappa B (RANK)/RANK ligand costimulatory molecules into dendritic cell

immunogens expressing a human tumor-specific antigen. J Immunol 171:4121-4130 98 150. Salek-Ardakani S, Arens R, Flynn R, Sette A, Schoenberger SP, Croft M (2009) Preferential use of B7.2 and not B71 in priming of vaccinia virus-specific CD8 T cells J Immunol 182:2909-2918. 151. Arden NK, Baker J, Hogg C, Baan K, Spector TD (1996) The heritability of bone mineral density, ultrasound of the calcaneus and hip axis length: a study of postmenopausal twins. J Bone Miner Res 11:530-534 152. Arden NK, Spector TD (1997) Genetic influences on muscle strength, lean body mass, and bone mineral density: a twin study. J Bone Miner Res 12:2076-2081 153. Kaprio J, Rimpela A, Winter T, Viken RJ, Rimpela M, Rose RJ (1995) Common genetic influences on BMI and age at menarche. Hum Biol 67:739-753 154. Woei Ng K, Speicher T, Dombrowski C, Helledie T, Haupt LM, Nurcombe V, Cool SM (2007) Osteogenic differentiation of murine embryonic stem cells is mediated by fibroblast growth factor

receptors. Stem Cell Dev 16:305-318 155. Aguirre JI, Leal ME, Rivera MF, Vanegas SM, Jorgensen M, Wronski TJ (2007) Effects of basic fibroblast growth factor and a prostaglandin E2 receptor subtype 4 agonist on osteoblastogenesis and adipogenesis in aged ovariectomized rats. J Bone Miner Res 22:877-888. 156. Kawaguchi H, Katagiri M, Chikazu D (2004) Osteoclastic bone resorption through receptor tyrosine kinase and extracellular signal-regulated kinase signaling in mature osteoclasts. Mod Rheumatol 14:1-5 157. Vieira AR, Modesto A, Meira R, Barbosa AR, Lidral AC, Murray JC (2007) Interferon regulatory factor 6 (IRF6) and fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) contribute to human tooth agenesis. Am J Med Genet A 143:538-545 158. Coussens AK, van Daal A (2005) Linkage disequilibrium analysis identifies an FGFR1 haplotype-tag SNP associated with normal variation in craniofacial shape. Genomics 85:563-573. 159. Chmurzynska A (2006) The multigene family of fatty acid-binding

proteins (FABPs): function, structure and polymorphism. J Appl Genet 47:39-48 160. Shin HD, Kim LH, Park BL, Jung HS, Cho YM, Moon MK, Lee HK, Park KS (2003) Polymorphisms in fatty acid-binding protein-3 (FABP3) - putative association with type 2 diabetes mellitus. Hum Mutat 22:180 161. Xu Y, Mirmalek-Sani SH, Yang X, Zhang J, Oreffo RO (2006) The use of small interfering RNAs to inhibit adipocyte differentiation in human preadipocytes and fetalfemur-derived mesenchymal cells. Exp Cell Res 312:1856-1864 99 162. Nelson-Dooley C, Della-Fera MA, Hamrick M, Baile CA (2005) Novel treatments for obesity and osteoporosis: targeting apoptotic pathways in adipocytes. Curr Med Chem 12:2215-2225. 163. Jadhav SB, Jain GK (2006) Statins and osteoporosis: new role for old drugs. J Pharm Pharmacol 58:3-18. 164. Mencej S, Albagha OM, Prezelj J, Kocjan T, Marc J (2008) Tumour necrosis factor superfamily member 11 gene promoter polymorphisms modulate promoter activity and influence bone

mineral density in postmenopausal women with osteoporosis. J Mol Endocrinol 40:273-279. 165. Jorgensen HL, Kusk P, Madsen B, Fenger M, Lauritzen JB (2004) Serum osteoprotegerin (OPG) and the A163G polymorphism in the OPG promoter region are related to peripheral measures of bone mass and fracture odds ratios. J Bone Miner Metab 22:132-138. 166. Langdahl BL, Carstens M, Stenkjaer L, Eriksen EF (2002) Polymorphisms in the osteoprotegerin gene are associated with osteoporotic fractures. J Bone Miner Res 17:1245-1255. 167. Logothetis CJ, Lin SH (2005) Osteoblasts in prostate cancer metastasis to bone. Nat Rev Cancer 5:21-28. 100 11. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK Az értekezés témájához kapcsolódó saját közlemények jegyzéke: Balla B, Kósa JP, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P: Different gene expression patterns in bone tissue of aging postmenopausal osteoporotic and non-osteoporotic women. Calcif Tissue Int 2008;

82(1):1226 IF:2,435 Balla B, Kósa JP, Takács I, Kiss J, Podani J, Borsy A, Lazáry Á, Bácsi K, Nagy Zs, Speer G, Orosz L, Lakatos P: Menopauza hatása a csontszöveti génkifejeződésre posztmenopauzás és premenopauzás korú nem oszteoprotikus nőkben. Magy Belorv Arch 2008; 61(3):208-219 Lazáry Á, Kósa JP, Tóbiás B, Lazáry J, Balla B, Bácsi K, Takács I, Nagy Zs, Mező T, Speer G, Lakatos P: Single nucleotide polymorphisms in new candidate genes are associated with bone mineral density and fracture risk. Eur J Endocrinol 2008; 159(2):187-196 IF:3,239 Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Lakatos P: Transcriptional profiling of immune system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone tissue. Clin Immunol 2009; 131(2):354-9 IF:3,551 Kósa JP1, Balla B1, Speer G, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Orosz L, Lakatos P: Effect of menopause on gene

expression pattern in bone tissue of nonosteoporotic women. Menopause 2009; 16(2):367-77 IF:3,672 1 , megosztott első szerzőség Borsy A, Podani J, Stéger V, Balla B, Horváth A, Kósa J, Gyurján I Jr., Molnár A, Szabolcsi Z, Szabó L, Jako E, Zomborszky Z, Nagy J, Semsey Sz, Vellai T, Lakatos P, Orosz L: Identifying novel genes involved in both deer physiological and human pathological osteoporosis. Mol Genet Genomics 2009; 281(3):301-13 IF:2,978 Kósa JP1, Balla B1, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Karsai A, Speer G, Lakatos P: Postmenopausal expression changes of immune system-related genes in human bone tissue. J Clin Immunol 2009; 29(6):761-8 IF:3,248 1 , megosztott első szerzőség 101 Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Bácsi K, Nagy Zs, Speer G, Lakatos P: Az immunrendszerben szerepet játszó gének expressziós változásainak vizsgálata osteoporoticus humán csontszövetben. Immunológiai szemle 2009;

1(1-2):13-21 Takács I, Lazáry Á, Kósa JP, Kiss J, Balla B, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Lakatos P: Allelic variations of RANKL/OPG signaling system is related to bone mineral density and in vivo gene expression. Eur J Endocrinol 2010;162(2):423-31 IF:3791 Balla B, Kósa J, Takács I, Kiss J, Podani J, Lazáry Á, Bácsi K, Nagy Zs, Speer G, Lakatos P: Rendszerbiológiai szemlélet a primer csontvesztés molekuláris biológiai kutatásában és az osteoporosis immunológiai vonatkozásai. Orvosképzés 2009; 84(S5) Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Bácsi K, Nagy Zs, Speer G, Lakatos P: Menopausa hatása az immunrendszer működését szabályozó gének transzkriptomikai változásaira humán csontszövetben. LAM – közlésre elfogadva Takács I, Lazáry Á, Kósa J, Kiss J, Balla B, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Lakatos P: A RANKL/OPG jelátviteli rendszer allélikus variációinak összefüggése a csonttömeggel és az in vivo génexpresszióval. Magy

Belorv Arch – közlésre elküldve Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó publikációk: Kiss J1, Balla B1, Kósa JP, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Szlávy E, Szendrői M, Speer G, Orosz L, Lakatos P: Gene expression patterns in the bone tissue of women with fibrous dysplasia. Am J Med Genet A – közlésre elfogadva 1 , megosztott első szerzőség Bácsi K, Kósa J, Balla B, Lazáry Á, Takács I, Nagy Zs, Speer G, Lakatos P: A kalciummetabolizmus jelentősége a csontritkulás és a colorectalis daganat patogenezisében. Orvosképzés 2009; 84(S2):101-10. Bácsi K, Hitre E, Kósa JP, Horváth H, Lazáry Á, Lakatos LP, Balla B, Budai B, Nagy Zs, Lakatos P, Speer G: Effects of the lactase 13910 C/T and calcium-sensor receptor A986S G/T 102 polymorphisms on the incidence and recurrence of colorectal cancer in Hungarian population. BMC Cancer 2008; 8(1):317. IF:2,709 Bácsi K, Kósa JP, Lazáry Á, Balla B, Horváth H, Kis A,

Nagy Zs, Takács I, Lakatos P, Speer G: LCT 13910 C/T polymorphism, serum calcium, and bone mineral density in postmenopausal women. Osteoporos Int 2009; 20(4):639-45 IF:3,893 Lazáry Á, Speer G, Varga PP, Balla B, Bácsi K, Kósa JP, Nagy Zs, Takács I, Lakatos P: Effect of vertebroplasty filler materials on viability and gene expression of human nucleus pulposus cells. J Orthop Res 2008; 26(5):601-607 IF:2,437 Lazáry Á, Balla B, Kósa JP, Bácsi K, Nagy Zs, Takács I, Varga PP, Speer G, Lakatos P: A szintetikus csontpótló graftok alkalmazásának összefoglalása. A gipsz szerepe a csontpótlásban: molekuláris biológiai megközelítéssel, saját eredményeink alapján. Orv Hetil 2007; 148(51):2427-2433. Kósa JP, Kis A, Bácsi K, Nagy Zs, Balla B, Lazáry Á, Takács I, Speer G, Lakatos P: Új, a glükokortikoidok csontsejtekre gyakorolt hatásának közvetítésében szerepet játszó gének azonosítása izolált és immortalizált egér osteoblastsejteken. Magy Belorv

Arch 2007; 60:435441 Bácsi K, Kósa J, Lazáry Á, Balla B, Horváth H, Takács I, Nagy Zs, Speer G, Lakatos P: A CYP3A7*1C polimorfizmus hatása a csont ásványanyag-tartalmára posztmenopauzás nőkben. Orv Hetil 2007; 148(27):1273-1280. Bácsi K, Kósa J, Lazáry Á, Horváth H, Balla B, Lakatos P, Speer G: A dehidroepiandroszteron és dehidroepiandroszteron szulfát jelentősége a különböző kórállapotokban. Orv Hetil 2007; 148(14):651-657 Bácsi K, Kósa JP, Borgulya G, Balla B, Lazáry Á, Nagy Zs, Horváth Cs, Speer G, Lakatos P: CYP3A7*1C polymorphism, serum dehydroepiandrosterone sulfate level and bone mineral density in postmenopausal women. Calcif Tissue Int 2007; 80(3):154-159 IF:2,435 103 Lazáry Á, Balla B, Kósa JP, Bácsi K, Nagy Zs, Takács I, Varga PP, Speer G, Lakatos P: Effect of gypsum on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 mouse osteoblastic cells. Biomaterials 2007; 28(3):393-399. IF:6,262 Az értekezés témájához kapcsolódó

idézhető előadáskivonatok: Balla B, Kósa JP, Takács I, Speer G, Nagy Zs, Kiss J, Podani J, Lakatos P: Menopausa hatása az immunrendszer működését szabályozó gének csontszövet-specifikus kifejeződésére X. Magyar Osteológiai Kongresszus Balatonfüred, 2009. május 20-23 Ca és Csont 2009, 12 (2):57 Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Lakatos P: Transcriptional profile of immune system-related genes in postmenopausal osteoporotic versus non-osteoporotic human bone tissue. ECTS 35th European Symposium on Calcified Tissues Barcelona, Spain, 2008. május 24-28 Calcif Tissue Int 2008, 82(S1):Su-P207 Balla B, Kósa JP, Kiss J, Podani J, Takács I, Speer G, Nagy Zs, Lazáry Á, Bácsi K, Lakatos P: Immunológiailag releváns gének expressziójának összehasonlító elemzése osteoporotikus és nem-osteoporotikus nők csontszövetében. IX Magyar Osteológiai Kongresszus Balatonfüred, 2008. május 21-24 Ca és Csont 2008,

11(2):81 Balla B, Kósa JP, Kiss J, Borsy A, Podani J, Takács I, Lazáry Á, Nagy Zs, Bácsi K, Speer G, Orosz L, Lakatos P: Effect of estrogen deficiency on gene expression pattern in the bone tissue of postmenopausal versus premenopausal healthy women. ASBMR 29th Annual Meeting Honolulu, HI, USA, 2007. szeptember 16-19 J Bone Miner Res 2007, 22(S1):S261 Balla B, Kósa J, Takács I, Kiss J, Borsy A, Podani J, Lazáry Á, Bácsi K, Nagy Zs, Speer G, Orosz L, Lakatos P: Ösztrogén hiányában fellépő génexpressziós változás vizsgálata posztmenopauzás és premenopauzás nem oszteoprotikus nők csontszövetében. VIII Magyar Osteológiai Kongresszus Balatonfüred, 2007. május 23-26 Ca és Csont 2007, 10(2):51 Balla B, Kósa J, Takács I, Kiss J, Borsy A, Podani J, Lazáry Á, Bácsi K, Nagy Zs, Speer G, Orosz L, Lakatos P: Génexpressziós mintázat vizsgálata postmenopausas egészséges és 104 osteoporotikus nők csontszövetében. VII Magyar Osteológiai Kongresszus

Balatonfüred, 2006. május 24-27 Ca és Csont 2006, 9(1):11 Balla B, Kósa J, Takács I, Kiss J, Borsy A, Podani J, Lazáry Á, Bácsi K, Nagy Zs, Speer G, Orosz L, Lakatos P: Génexpressziós mintázat vizsgálata prae- és postmenopausas egészséges nők csontszövetében. Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság XXI Kongresszusa Debrecen, 2006. május 18-20 Magy Belorv Arch 2006, 59(1):24 Borsy A, Balla B, Gyurján I, Stéger V, Molnár A, Szabolcsi Z, Kósa J, Zomborszky Z, Papp P, Vellai T, Lakatos P, Orosz L: Red deer biology for biochemical research on human osteoporosis. ECTS 33rd European Symposium on Calcified Tissues Prague, Czech Republic, 2006. május 10-14 Calcif Tissue Int 2006, 78(S1):P138 105 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Megkülönböztetett tiszteletemet, elismerésemet és köszönetemet fejezem ki Lakatos Péter professzor úrnak, aki a Klinikán laboratóriumában biztosította a kutatómunkámhoz szükséges feltételeket, elindított ezen az

úton, valamint, hogy munkám során végig mellettem volt és határozottan támogatott. Szakmai útmutatásán túl atyai jó tanácsai, kritikai megjegyzései is segítettek a dolgozat elkészítésében. Korábbi közleményeim és jelen dolgozatom elkészítésében útmutatásai irányítottak. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, dr. Takács István docens úrnak baráti segítségét, bíztatását a Ph.D dolgozat megírására és természetesen, hogy elvállalta témavezetésemet és a dolgozatom kijavításával is segítette munkámat. Különös hálával tartozom dr. Speer Gábornak, dr Nagy Zsoltnak és dr Tóth Tamásnak az együtt végzett munkáért és a sok szakmai segítségért. Köszönöm kutatócsoportunk tagjainak, elsősorban Kósa Jánosnak, dr. Lazáry Áronnak, dr. Bácsi Krisztiánnak, dr Kis Adriánnak, Tóbiás Bálintnak és mindazoknak, akik az elmúlt évek során tanácsaikkal és kritikájukkal támogatták munkámat. Köszönetemet fejezem

ki Podani János professzor úrnak, aki megismertetett a többváltozós statisztikával, nélküle a dolgozat statisztikai kiértékelése sokkal semmitmondóbb lenne. Köszönöm az ELTE Genetika tanszékén dolgozó kollégák segítségét, elsősorban Borsy Adriennek, Gyurján Istvánnak, Stéger Viktornak, Vellai Tibor és Orosz László professzor úrnak. Köszönöm laboratóriumunk minden kedves munkatársának, elsősorban Szabóné Sinkovits Tünde, Keresztényi Györgyi és Máté Edit türelmét és gyakorlati segítségét. 106