Biology | Genetics » Cseh Attila - Agrobacterium rezisztens növények létrehozása géncsendesítéssel

Agrobacterium rezisztens növények létrehozása géncsendesítéssel DIPLOMAMUNKA Készítette: CSEH ATTILA Biológus MSc szakos hallgató Témavezetők: GALAMBOS ANIKÓ, DR. PUTNOKY PÉTER PTE TTK Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Pécs, 2012. TARTALOMJEGYZÉK 1. Irodalmi áttekintés 5 1.1 Az agrobaktérium, mint növényi kórokozó 5 1.2 A tumorképződés folyamata 5 1.21 Agrobacterium-közvetített transzformáció 7 1.3 Agrobaktérium fertőzés elleni védekezés 9 1.4 A géncsendesítés 10 1.5 A munka előzményei 15 1.51 A növényi transzformációra alkalmas pJP17 vektor 15 1.52 iaaM csendesítésre módosított miRNS gének létrehozása 15 1.521 A módosított miRNS gének klónozása 17 2. Célkitűzések 18 3. Alkalmazott anyagok és módszerek 19 3.1 Baktériumok, plazmidok 19 3.2 Táptalajok és baktériumok növesztése 20 3.3 Plazmid DNS izolálás 20 3.4 Emésztés restrikciós endonukleázokkal és agaróz

gélelektroforézis 21 3.5 T4 polimeráz kezelés, DNS ligálás, transzformálás 21 3.6 Polimeráz láncreakció 22 3.7 Fragment izolálás 23 3.8 DNS-szekvencia meghatározás 23 3.9 A baktériumok keresztezése 23 3.10 Dohány transzformáció 24 3.11 Növényi fertőzési teszt 25 4. Eredmények és megvitatásuk 26 4.1 Transzgenikus dohánynövények létrehozása 26 4.11 Kettő transzgenikus dohányvonal fertőzési eredménye 27 4.2 A pCambia2300 vektor átalakítása 29 4.21 Az átalakított miR159 mikro RNS gének beépítése a pCambia2300 vektorba . 32 4.22 Növényi kísérletek 34 2 5. Összefoglalás 35 6. Irodalomjegyzék 36 7. Köszönetnyilvánítás 42 3 Rövidítések jegyzéke: Amp Ampicillin Rif Rifampicin Km Kanamycin Cm Chloramphenicol Spc Spectinomycin Tc Tetracyclin bp bázispár kb kilobázis DNS dezoxi-ribonukleinsav RNS ribonukleinsav miRNS mikro RNS siRNS small interfering RNS DMSO dimetil-szulfoxid EDTA

etilén-diamin-tetraacetát SDS nátrium-dodecil-szulfát Tris tris-(hidroxi-metil)-amino-metán IPTG izopropil-β-D-galaktopiranozid X-gal 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-tiogalaktopiranozid PCR polimeráz láncreakció TDZ thidiazuron NAA naftil-ecetsav H+ hormontartalmú MS Murashige és Skoog Cla (cf) claforán 4 1. Irodalmi áttekintés 1.1 Az agrobaktérium, mint növényi kórokozó Számos gazdasági növényt tudnánk felsorakoztatni, melyek sok, különféle növényi betegségre fogékonyak, többek között Agrobacterium infekcióra is. A magasabb rendű növényeken kifejlődő Agrobacterium által okozott daganatos elváltozás (golyvásodás) a XIX. század óta ismert növényi betegség, mely komoly károkat okoz a dísznövény-, szőlő- és növénytermesztésben. Gazdanövényköre tehát rendkívül széles, a nyitvatermők és a kétszikűek mintegy 60%-án képes tumort indukálni (DE CLEENE AND DE LEY, 1976), az egyszikűeknek

viszont csak mintegy 3%-a fogékony (DE CLEENE, 1985). Ezek az adatok azonban nem tekinthetők teljes körűnek, mivel e korábban közölt gazdanövénykör vizsgálatok óta további fajokat is sikerült fertőzni (SMITH AND HOOD, 1995). A tumorképződés élettani és genetikai alapjainak vizsgálatát már a 1930-as - 40-es években elkezdték, mivel hasonlóságot véltek felfedezni az emberi rák és a baktérium által indukált növényi sejtburjánzás között. Tisztázódott, hogy a növényi tumorképzés során a növény genetikailag transzformálódik. Az 1970-es évek közepétől újra nagy lendületet vettek az agrobaktériummal kapcsolatos kutatások, és a 80-as évektől elkezdődött az Agrobacterium felhasználása a növényi génmanipuláció területén. Az Agrobacterium törzsekkel szemben rezisztens növényfajták előállítása nagy gazdasági jelentőséggel bírna, hiszen a betegséggel szembeni védekezés terén a fertőzés szisztematikus jellege

miatt a hagyományos kémiai védekezési eljárásokkal sajnos a mai napig nem értünk el látványos eredményeket. A gyakorlatban az Agrobacterium rezisztencia kialakításának egyik módja lehet olyan transzgenikus növények létrehozása, melyekben a patogén baktérium által bejuttatott gének megnyilvánulása gátolt. 1.2 A tumorképződés folyamata Az agrobaktériumok Gram-negatív talajbaktériumok, melyek a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik, és tumorokat okoznak rajtuk. A kórfolyamat során a baktérium egy rendkívül kifinomult makromolekuláris transzport rendszer segítségével 5 genetikailag transzformálja a gazdanövényt. Ennek következtében a növényi sejtek hormonális egyensúlya felborul, ami a tumoros növekedés közvetlen kiváltó oka. A baktériumok patogenitása összefügg a tumorindukáló (Ti) plazmid jelenlétével, amely egy körülbelül 200 kilobázis (kb) nagyságú plazmid (ZAENEN J ET AL., 1974) A Ti plazmid egy

része a transzfer DNS (T-DNS) a folyamat során átkerül a növényi sejtbe és a sejtmag DNS-állományába integrálódik (1. ábra) (BINNS AN 2002, GELVIN S. 2000, TINLAND B ET AL 1995, TZFIRA T ET AL 2004) 1. ábra: Az agrobaktérium által okozott tumorképződés folyamata (I.) A talajban élő agrobaktériumok a növényeket a sebzési helyeken fertőzik; (II) A baktériumban található Ti plazmid T-DNS része tartalmazza a tumoros növekedésért és az opin szintézisért felelős géneket; (III.) A T-DNS beépül a növényi sejtmag DNSállományába; (IV) A baktérium által kialakított tumor, vagy „gyökérgolyva” A T-DNS egy jobb és egy baloldali határoló szekvenciával rendelkezik (RB, right border; LB, left border), amelyek 25 bázispár nagyságúak (2. ábra) A határoló szekvenciák közötti régióban helyezkednek el a tumoros növekedésért és az opin (tápanyagforrás a baktérium számára) szintézisért felelős gének. A tumorszövet

kialakításában szerepet játszó gének növényi növekedési hormonok bioszintéziséért felelős fehérjéket kódolnak. Ezen hormonok túltermelése felborítja a normális növényi sejtosztódási folyamatokat, és tumoros növekedést indít el. Az egyik ilyen hormon az auxin, melynek bioszintéziséért két gén, az iaaM és az iaaH által kódolt enzim, a triptofán-monooxigenáz és az indol-3-acetamid hidroláz a felelős (GAUDIN V ET AL. 1994). A másik fontos hormon pedig a citokinin, amelynek képződésében az ipt gén által kódolt AMP-izopentenil transzferáz enzim vesz részt. Az iaaM és ipt gének inaktivációjával elvben megszüntethető a tumorképződés. 6 2. ábra: A Ti plazmid felépítése, fontosabb régiói A Ti plazmidon található virulencia gének irányítják a T-DNS átvitelt, a T-DNS régió a növényi tumorképződés szempontjából fontos géneket kódol (auxin, citokinin bioszintézis) 1.21 Agrobacterium-közvetített

transzformáció A Ti plazmidon (2. ábra) végzett analízisek bizonyították, hogy a két határoló szekvencia között található gének önmagukban nem befolyásolják a fertőzőképességet, az átvitelt és az integrációt. A T-DNS növényi sejtmagba való transzportálásában a baktérium sejtben lokalizálódó kromoszomális (chv), valamint a Ti plazmidon található virulencia gének (vir gének) vesznek részt. Ha a vir gének nem működnek, akkor nem játszódik le a tumorképzés folyamata. A vir (virA-virH) gének különböző Vir fehérjéket kódolnak, amelyek egymás után aktiválódva elősegítik a T-DNS növényi sejtmagba való átjutását (3. ábra) Ez a folyamat szabályozott és függ attól, hogy a baktérium milyen érzékenyen reagál a növény megsebzésre adott válaszára. A növényt ért sebesülés hatására növényi védekező reakció indul be, enzimek képződnek antimikrobiális vegyületek előállítására, az elhalt sejtrétegek

szintén védelmi vonalat képeznek, más sejtek differenciálódnak és elkezdenek osztódni, a sejtfalképződés beindul, helyi savasodás lép fel. A sejtosztódás és a sejtfalat alkotó poliszacharidok és a lignin szintézise közben jellegzetes vegyületek szabadulnak fel (fenolos komponensek, cukor és származékai, szerves savak [szukcinát, phidroxybenzoát], bizonyos aminosavak [valine, arginin]), melyek az Agrobacterium számára szignált jelentenek. Ezen Agrobacterium számára vonzó, kemoattraktáns 7 vegyületek (pl. acetosziringon) indukálják a chv gének transzkripcióját (BOLTON GW ET AL. 1986, MELCHERS LS ET AL. 1989) A kromoszomális virulencia gének (chvA, chvB, chvE) a baktériumok növényi sejtfalhoz való kötődésében fontosak, illetve a megfelelő ozmotikus viszonyok kialakításában játszanak szerepet. A chvE gén például cukor-kötő fehérjét kódol, mely a sejtmembránon található kemotaxis receptorokkal kölcsön hat, a

sérült sejt felismerésben játszik szerepet. A ChvE-cukor komplex képződése és kölcsönhatása megváltoztatja a VirA konformációját, melynek hatására az érzékenyebb lesz a fenolos molekulákra. Egyszikűekben is termelődnek ilyen vegyületek, de nincs sejtosztódás a sebnél, ezért okozhat nehézséget transzformálásuk. 3. ábra: Agrobacterium-mediált transzformáció folyamata (1) sebzés; (2) vir gének indukciója; (3) egyszálú T-DNS képződése; (4) T-DNS transzfer; (5) T-DNS sejtmagba importálódása és integrálódása a gazda kromoszómáiba; (6) növényi növekedési hormonok (auxin, citokinin) és opin bioszintézise; (7) tumor képződése Végső soron az Agrobacterium genetikailag „gyarmatosítja” a növényi sejteket, amikor genomjukba saját információját bejuttatva, a növényi sejteket a baktérium számára hasznos molekulák termelésére kényszeríti. Termelődésük hatására a sejtek korlátlanul kezdenek osztódni és megindul

a rákos burjánzás, míg végül a növény felületén megjelenik a golyvaszerű képlet, a korona gubacs. 8 Mivel a Ti plazmid T-DNS régiójának, a két határoló régió közötti szekvenciája nem meghatározó a T-DNS növényi genomba történő beépülésének szempontjából, ezért gyakorlatilag alkalmas arra, hogy klónozó vektorként használva idegen géneket építsünk bele, és juttassunk be általa magasabb rendű növényekbe (GHEYSEN G. 1987, REAM W. 1989) Miután a T-DNS a növényi genomba integrálódott, tulajdonképpen a továbbiakban növényi szekvenciaként működik. Ezek a felfedezések tették lehetővé, elérhetővé, különféle transzformációs vektorrendszerek kidolgozását. 1.3 Agrobaktérium fertőzés elleni védekezés A védekezést illetően jelenleg egyértelműen a megelőzésre, a prevencióra kell alapoznunk. A patogén baktérium a növényt az esetek egy jelentős részében látensen fertőzi, ezért az egészségesnek

látszó szaporítóanyag sokszor fertőzött és a betegség kiinduló forrása lehet. A fertőzött szaporítóanyag tehát kulcsszerepet játszik a betegség terjedésében, ezért alapvető fontosságú az Agrobacterium-mentes, egészséges szaporítóanyag használata. Ennek hátránya egyrészt, hogy munkaigényessége miatt csak korlátozott számú tétel tesztelése lehetséges, illetve hazánkban a megfelelő laboratóriumok nem állnak rendelkezésünkre. A betegség ellen elsősorban a beteg részek levágásával és megsemmisítésével lehet védekezni, mivel a kórokozó a beteg vesszőkben telel át. Tavasszal, a nedvkeringés („könnyezés”) megindulásakor a tápanyagdús szövetnedvben a baktériumok felszaporodnak, és a xylem-transzporton keresztül elárasztják a növény föld feletti részeit, ahol belső sérülések esetén megjelennek a tumorok (LEHOCZKY, 1978). Tehát a gyors felmelegedés segíti a tumorok kifejlődését, így a korai metszés

is egy védekezési módszer lehet. Fontos szempont lehet még a talaj fertőtlenítése (üvegházakban a talaj gőzölése), vagy vetésforgó használata. A betegség megelőzésére eredményesen alkalmazhatók a baktericidhatású réztartalmú, rézoxid hatóanyagú készítmények (frissen metszett gyökeret telepítés előtt 1 %-os réz, vagy kasugamicines agyagba mártják) (HOLB I, 2005). Azonban hatékony kémiai védekezési mechanizmus egyelőre nem áll rendelkezésünkre az agrobaktérium fertőzéssel szemben. Számos helyen végeztek különféle kutatásokat a szőlő golyvásodásának megelőzésére alkalmas antagonista baktériumok izolálására (STAPHORST JL ET AL. 1985, WEBSTER J ET AL. 1986, PU XA ET AL. 1933, BURR TJ ET AL. 1994, BELL CR ET AL. 9 1995, KHMEL IA EZ AL. 1998). Találtak olyan agrobaktérium törzset, mely széleskörű antagonista hatást mutatott a különböző patogén Agrobacterium vitis törzsekkel szemben in vitro,

és szőlőn is gátolta a tumorképződést. Tumorfejlődést gátló, azonban antagonista hatást nem mutató A. vitis törzseket is izoláltak Ezek a biológiai védekezés szempontjából mindenféleképpen ígéretesnek tűnnek (BURR TJ ET AL. 1999) A hagyományos, keresztezéses növénynemesítés mellett ─ ami nagyon idő- és költségigényes feladat ─ a molekuláris genetikai módszerek alkalmazása további lehetőséget jelenthet a golyvásodás elleni védekezésben. A patogén nagyfokú genetikai sokfélesége miatt azonban ezek a vizsgálatok nagy körültekintést igényelnek. Figyelembe véve a bakteriális kórokozók által okozott jelentős veszteségeket, világszerte intenzíven kutatják azokat a géntechnológiai lehetőségeket, amelyek ellenállóságot biztosítanak a gazdasági növényeink számára. Tumor képződéssel szembeni rezisztencia kialakítása lehetséges, egyrészt a vir gének manipulációján keresztül a T-DNS átvitelének és

integrációjának megakadályozásával, vagy a fertőzési folyamatban részt vevő növényi gének inaktiválásával, másrészt a TDNS által kódolt növényi hormon-prekurzor molekulák (indol-acetamid) inaktiválásával, harmadrészt pedig a T-DNS onkogénjeinek a gátlásával. Ezen utóbbi lehetőségnél az Agrobacterium rezisztencia kialakításában a géncsendesítés módszere speciálisan alkalmazható. 1.4 A géncsendesítés A DNS jelentőségének megismerését követően évtizedekig a fehérjét kódoló szakaszok mind részletesebb feltárása állt a kutatások középpontjában, miközben a genom jelentős részét, több mint 98%-át kitevő, nem kódoló DNS szekvenciák vizsgálatára kisebb hangsúly helyeződött. A géncsendesítés jelenségére akkor derült fény, amikor a kutatók egyes transzgenikus növények esetében azt észlelték, hogy a növénybe átvitt transzgén feltűnően gyengén fejeződik ki (KIRÁLY L. 1999) A

géncsendesítés (gene silencing-GS, RNS interferencia) egy nemrégiben megismert mechanizmus, amely eukarióta szervezetekben gének expresszióját képes módosítani (gátolni). A jelenséget ugyan a növényekben fedezték fel (NAPOLI ÉS MTSAI 1990, VAN DER KROL ÉS MTSAI. 1988), de állatokban és gombákban is megfigyelhető (FIRE, 1998, HAMMOND ÉS MTSAI. 2001) 10 A megfigyelések alapján a géncsendesítés két alaptípusa különböztethető meg. Létezik a transzkripciós géncsendesítés (transcriptional gene silencing, TGS), amelynél a géninaktiválás a transzkripció szintjén történik, azaz a célgénből nem keletkezik mRNS. Másik alaptípusa a poszttranszkripciós géncsendesítés (posttranscriptional gene silencing, PTGS), gén inaktiválás a transzkripció (mRNS képződés) után, azaz a célgéneredetű mRNS-ek a citoplazmában fokozott mértékben lebomlanak. Jelen pillanatban úgy vélik, a mechanizmus alapvetően több célt is

szolgálhat. Egyfelől véd a kétszálú RNS-t tartalmazó vírusoktól, másfelől az RNS interferenciának köze van a saját gének ki- és bekapcsolásához, valamint szerepe lehet az ugráló genetikai elemek kontrollálásában is (KIRÁLY L. 1999) Ha víruskórokozó genetikai anyagának egy részét (például a köpenyfehérje gént vagy a vírus replikáz gént) transzformációval bejuttatták a növénybe, a transzgenikus növény rezisztens lett a vírusfertőzéssel szemben (RNS-közvetített vírus rezisztencia). Ez a rezisztencia csak olyan rokon vírustörzsek ellen hatásos, amelyek szekvencia homológiát mutatnak azzal a vírussal, amelyből az átvitt transzgén származott. A géncsendesítés és a vírus RNS-től függő rezisztencia tehát egy jelenség két változata: mindkét esetben az mRNS bontásról van szó (KIRÁLY Z. 2002) Ha a növény felismeri, hogy az idegen transzgén mRNS vagy az idegen vírus RNS mennyisége egy küszöbértéken felül már

túlságosan nagy, beindul az RNS degradálás. Meglepő, hogy a csendesítés mechanizmusa nemcsak a mesterségesen átvitt transzgénre hat, hanem a növény eredeti, endogén homológ génjére is. Ez a tény a molekuláris növénynemesítés szempontjából olykor jelentős hátránnyal járhat. Az RNS silencing indukciója során a duplaszálú RNS-eket (dsRNS) a DICER enzimkomplex RNáz aktivitása révén úgynevezett siRNS-ekre (small interfering RNS) hasítja. A siRNS-ek olyan 21-24 nukleotid hosszúságú jellegzetes szerkezettel bíró duplaszálú RNS molekulák, amelyek 3’ végén 2 bázis túlnyúlik és az 5’ végükön foszfát csoportot tartalmaznak. A siRNS-ek az RNS silencing végrehajtó komplexébe, a RISC (RNA-induced silencing complex) endonukleáz komplexbe épülnek be, ahol egyszálúvá alakulnak. A RISC felismeri és elhasítja a beépült siRNS-sel komplementer szekvenciát tartalmazó mRNS-eket (4. ábra) 11 4. ábra: siRNS alapú

géncsendesítési folyamat (PETER M WATERHOUSE ET AL, 2003) A siRNS-eken kívül azonban találhatók olyan genomban kódolt szabályozó egyszálú RNS molekulák, melyek komplementer részei képeznek kettős szálú részleteket, ezeket mikro RNS (miRNS) névvel különböztetjük meg. Ezek az eukariótákból leírt nem kódoló kis RNS-ek, melyek a genomban kódolt MIR génekről keletkeznek. A miRNS-eknek rendkívül fontos szerepük van a különböző fejlődésszabályozási folyamatokban, a fehérje-kódoló gének kb. 30%-át szabályozzák Az első miRNS-eket Nematoda-ban írták le, melyeket a lin-4 (LEE let-7 gének kódolják (REINHART ET AL., ET AL., 1993) és a 2000). Ezek a különböző lárvastádiumok közötti átmenetet szabályozzák. Napjainkban a növényekben, állatokban, ill vírusokban leírt miRNS-ek száma 4000-re tehető, melyek miRNS adatbázisban hozzáférhetőek (GRIFFITHS-JONES ET AL., 2006). Az azonosított miRNS-ek döntő

többsége transzkripciós faktorokat szabályoz. Az eddigi adatok azt mutatják, hogy a növényi miRNS-ek többsége konzervatív, vagyis ugyanaz a miRNS megtalálható különböző növénycsaládokban és a rokon miRNS-ek közt csak kismértékű eltérés mutatható ki. Előfordulnak köztük azonban fajspecifikusak is (SUNKAR ET AL., 2005) A miRNS gének általában saját promoterrel rendelkeznek és transzkripciójukat a fehérje kódoló génekhez hasonlóan az RNS polimeráz II végzi (LEE ET AL., 2004). 12 A MIR gének transzkriptumai (pri-miRNS) körülbelül 1 kb hosszúságúak, poliadeniláltak, 5’ végi sapkát tartalmaznak és hajtűszerű másodlagos szerkezetet vesznek fel. A növényi pre-miRNS-ek az állati prekurzorokkal szemben egyesével keletkeznek és általában jóval hosszabbak (60-300 nt), mint az állati pre-miRNS-ek (BARTEL AND BARTEL, 2003; BARTEL, 2004). Arabidopsis thalianaban négy DCL (DICER-LIKE) enzimet kódoló gén található,

melyek közül a miRNS képződésben alapvetően a DCL1 vesz részt (XIE ET AL., 2004). A DCL1 egyedül is képes a pri-miRNS-ek és a pre- miRNS-ek hasítására, de pontos működéséhez mindkét esetben szükség van HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) és SERRATE (SE) fehérjékre is (DONG ET AL., 2008; LAUBINGER ET AL., 2008; YANG ET AL, 2006B) A kihasadt miRNS-t a HUA ENHANCER1 (HEN1) metilálja. A metiláció védi a miRNS-eket a kis RNS-eket lebontó nukleázoktól (SDN1). A növények miRNS-einek citoplazmába történő transzportjában feltételezhetően a HASTY (HST) játszik szerepet, bár HST hiányában sem figyelhető meg miRNS felhalmozódás a sejtmagban (PARK ET AL., 2005) A citoplazmába jutott miRNS/miRNS duplex egyik szála növények és állatok esetében is beépül az RNS csendesítés végrehajtó komplexébe (RNA-induced silencing complex, RISC), míg a másik szál lebomlik. A RISC fő komponense az ARGONAUTE (AGO), mely a cél mRNS-ek hasításáért

felelős (BAUMBERGER AND BAULCOMBE, 2005). Végeredményében a miRNS-ek két fő módon szabályozhatják célgénjük kifejeződését: az mRNS-ek hasításával vagy transzlációs gátlásával (5. ábra) A végrehajó enzimkomplex szekvencia specificitását mindkét esetben a RISC-be beépült miRNS-ek határozzák meg. Növényekben a miRNS-ek általában teljes vagy majdnem teljes komplementaritást mutatnak a cél mRNS-sel, mely a cél szekvencia hasítását indukálja (TANG ET AL., 2003) Ismeretes, hogy a növényi silencing útvonalak aktivitása hőmérsékletfüggő, alacsony hőmérsékleten alig működnek, míg magas hőmérsékleten igen hatékonyak. Az siRNS irányított csendesítés hatékonysága alacsonyabb hőmérsékleten csökken, ez azonban a miRNS regulálta géncsendesítésre nem vonatkozik. Ha miRNS a silencing templátja, akkor a reakció kimenetele független a hőmérséklettől. Ennek komoly mezőgazdasági vonatkozása lehet, hiszen a miRNS

regulálta géncsendesítés még akkor 13 is biztosítja a kórokozóval szembeni növényi rezisztenciát, amikor már az siRNS alapú csendesítési mechanizmus működése hiányt szenved az alacsony hőmérséklet miatt. 5. ábra: A miRNS képződésének, működésének, géncsendesítéshez való kapcsolódásának folyamata növényekben pri-miRNS transzkriptum képződése; DCL1 hasítás, pre-miRNS-ek keletkezése, miRNS/miRNS duplex kialakulása; metiláció; sejtmagi export; RISC kialakulása; transzlációs gátlás vagy cél mRNS hasítás és lebontás (BARTEL AND BARTEL, 2003) 14 1.5 A munka előzményei 1.51 A növényi transzformációra alkalmas pJP17 vektor Munkánkhoz kiindulásként Lee és társai által végzett kísérletek eredményeit használtuk fel (LEE H ET AL. 2003) Agrobacterium tumefaciens A348 törzsből származó iaaM és ipt szekvenciák segítségével készítettek egy olyan konstrukciót, melyben a két gént egymás után

építették, majd ezt két, egymással szemben elhelyezkedő, szensz és antiszensz RNS átírását biztosító promoter közé helyezték és növényi transzformációs vektorba juttatták. A konstrukció, különösen az iaaM gén esetében, hatásosan működött és akadályozta a tumorképződést. Ez a pJP17 vektorkonstrukció (6 ábra), amelynek hatásosságát koinokulációs kísérletek segítségével bizonyították. 6. ábra: A pJP17 vektorkonstrukció T-DNS része RB, LB: jobb és baloldali határoló régiók, nptII: neomicin foszfotranszferáz (KmR) gén, nos3’ és nos5’ nopalin szintáz 3’ és 5’ szekvencia, pCMV és pFMV növényi promoterek 1.52 iaaM csendesítésre módosított miRNS gének létrehozása Munkánk másik alapjaként egy olyan kísérlet szolgált, melyben sikeresen alakítottak ki mikro RNS alapú géncsendesítés segítségével vírus rezisztenciát (NIU QW ET AL. 2006) Niu és munkatársai módosítottak egy, a géncsendesítés

folyamatában részt vevő, Arabidopsis mikro RNS gént (miRNA159). Két mesterséges mikro RNS gént hoztak létre, melyek virális mRNS szekvenciák felismerését kódolták. Azok a transzgenikus növények, amelyek az amiR-P69 módosított mikro RNS-t termelték, ellenállóak lettek a TYMV vírussal szemben, az amiR-HC-PRO módosított mikro RNS-t termelő növények pedig a TuMV vírussal szemben mutattak rezisztenciát. A mindkét átalakított mikro 15 RNS-t termelő növények rezisztensek lettek a TYMV és a TuMV vírusfertőzésre egyaránt. Munkánk során az iaaM gén csendesítését terveztük, hasonló módon. A különböző agrobaktérium iaaM szekvenciák nagyon eltérőek, még közel rokon törzsek esetén is nehezen található bennük hosszabb, konzerválódott régió. Mivel a géncsendesítés szekvencia specifikus mRNS felismerésen alapul, így feltételezhetően egyetlen Agrobacterium iaaM szekvenciára tervezett konstrukció a különböző törzsek

esetében nem működne, hacsak nem található meg mindegyik agrobaktérium törzs iaaM génjében ugyanaz a cél szekvencia részlet. Ehhez először különböző A tumefaciens és A. vitis törzsek iaaM szekvenciáit illesztettük és legalább 21 bp hosszan konzerválódott szekvenciákat kerestünk, annak érdekében, hogy erre a szekvenciára specifikus mikro RNS átalakítással több különböző agrobaktérium törzzsel szemben is hatékonyan működő géncsendesítési folyamatot alakíthassunk ki (7. ábra) Ilyen 21 bp hosszú konzerválódott régiót, amely mindegyik általunk illesztett szekvenciában megegyezett volna, nem találtunk, ezért három eltérő helyen lévő 21 bp hosszú szekvencia részletet választottunk ki. Ezek közül két szekvencia az A tumefaciens és rokon törzsekben konzerválódott, míg a harmadik elsősorban az A. vitis S4 törzsre specifikus szekvencia részlet. A negyedik szekvenciaként az egyik kiválasztott szekvencia részlet reverz

komplementerét alkalmaztuk kontrollként. Ezek után többlépcsős PCR reakció segítségével szekvencia specifikusan módosítottuk a miRNA159 génnek a géncsendesítés folyamatában részt vevő szekvenciáját. iaaM specifikus szekvencia 7. ábra: A géncsendesítés folyamatában részt vevő szekvencia specifikus mRNS felismerést biztosító 21 bp hosszú szekvencia, egy ilyen szekvenciát módosítottunk az adott iaaM célszekvenciára 16 1.521 A módosított miRNS gének klónozása A négyféle, átalakított mikro RNS géneket hordozó PCR fragmenteket először pBluescript (pBS) plazmidba klónoztuk, majd EcoRI-HindIII fragmentként izoláltuk. Ezek a „rövid” fragmentek, melyek a gén előtt feltételezett promoter szekvenciát nem tartalmaznak. Ezek mellett izoláltunk EcoRI-HindIII fragmentként „hosszú” fragmenteket is, melyek egy feltételezett promoter szekvenciát tartalmaztak a gén előtt. Ezt a nyolcféle, 4 „rövid” és 4

„hosszú” miRNS szekvenciát a növényi transzformációra alkalmas pPZP111 vektorba építettük EcoRI-HindIII fragmentként. A módosított miRNS gének létrehozását és a klónozó vektor átalakítását Galambos Anikó végezte el, én ezek után kapcsolódtam be a munkába. 17 2. Célkitűzések Az előző eredmények alapján és ismeretében célul tűztük ki: - a pJP17 vektorkonstrukcióval transzgenikus dohánynövények létrehozását és ezen növények különböző Agrobacterium törzsekkel szembeni rezisztenciájának meghatározását, - átalakított mikro RNS gének segítségével feltételezetten szélesebb agrobaktérium rezisztenciát biztosító vektorok kialakítását, transzgenikus dohánynövények készítését és Agrobacterium törzsekkel szembeni ellenálló képességük jellemzését. 18 3. Alkalmazott anyagok és módszerek 3.1 Baktériumok, plazmidok A munkánk során használt baktériumok és plazmidok jellemzőit az 1.

táblázat tartalmazza. 1. táblázat: A munka során alkalmazott baktériumtörzsek és plazmidok TÖRZS JELLEMZŐK REFERENCIA E. coli törzsek: recA1,endA1,gyrA96,thi1,hsdR17,supE44,relA1,lacZ ∆M15,TcR BULLOCK WO ET AL. 1987 JF1754 hsdR. del-lac-gal metB leuB hisB McNEIL,J . B and J D. FRIESEN 1981 PP211 JF1754 (pRK2013) KmR Putnoky Péter RifR, SpcR Szegedi Ernő RifR Szegedi Ernő XL1-Blue Agrobacterium törzsek: MOG301 A. tumefaciens C58 A. tumefaciens A348 Szegedi Ernő A. vitis AT1 RifR Szegedi Ernő A. vitis Tm4 RifR Szegedi Ernő Plazmidok: pBS pBluescript II SK (+) klónozó vektor AmpR STRATAGENE pPZP111 CmR pRK2013 helper plazmid keresztezéshez, KmR Jakab Gábor pCambia2300 KmR DITTA ET AL. 1980 HAJDUKIEWICZ P. ET AL. 1994 pROK2 KmR Joseph Ecker pJP17 pJP21::iaaMc58-STOP, ipt-c58, (6. ábra) LEE H ET AL. 2003 19 3.2 Táptalajok és baktériumok növesztése Az Agrobacterium törzseket 28oC-on TA (OROSZ L ET AL. 1973)

táptalajon, az E. coli törzseket pedig 37oC-on LB (SAMBROOK J ET AL. 1989) tápközegben növesztettük A táptalajok a megfelelő antibiotikumot a 2. táblázatban leírtak szerint tartalmazták Táptalaj készítésekor a tápoldatokat 1,5% agarózzal egészítettük ki. A baktérium törzseket 15 %-os glicerines TA-ban -20oC-on lefagyasztva tároljuk. 2. táblázat: Az alkalmazott antibiotikumok és végkoncentrációjuk (µg/ml) Rövidítés E. coli (µg/ml) Agrobacterium sp. (µg/ml) Ampicillin Amp 100 - Chloramphenicol Cm 5, 15 15 Rifampicin Rif - 30 Kanamycin Km 30 30 Tetracyclin Tc 15 - Spectinomycin Spc 100 100 Antibiotikumok 3.3 Plazmid DNS izolálás A plazmid DNS-t 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett E. coli sejtekből Ish-Horowicz és Burke (ISH-HOROVICZ D ET AL 1981) módszerének módosított változata szerint preparáltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf csőbe tettünk és a

sejteket centrifugálással leülepítettük. A tisztítás során minden centrifugálás 5 percig tartott, 12000 fordulatszámmal, szobahőmérsékleten. A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCl, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz pH=8,0) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 µl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd 160 µl jéghideg Na-acetát oldatot (3M, pH=4,8) adtunk hozzájuk és az oldatot erősen összeráztuk. 5 perc 0°C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 320 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 20 perc -20°C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 100 µl Tris-acetát pufferben (50 mM Tris, 100 mM Na-acetát, pH=8,0) feloldottuk. Ezután 200 µl abs etanollal a DNS-t ismét kicsaptuk, centrifugáltuk, 20 szárítottuk az előzőekhez hasonló módon, majd 30-50 µl RNáz tartalmú desztillált vízben (100 µg/ml forralt

RNázA) oldottuk fel, az adott plazmid kópiaszámának függvényében. Restrikciós emésztésekhez 1-10 µl (250-1000 ng/µl) preparátumot használtunk fel. A DNS-szekvencia meghatározáshoz a preparátumokat további lépésekben tisztítottuk. Az előzőek szerint készített 50 µl plazmid preparátumhoz 0,1 térfogat 10% SDS oldatot és 1 térfogat 0oC-os 7,5 M NH4-acetát oldatot adtunk és 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával kicsaptuk a plazmid DNS-t (-20°C, 20 perc inkubálás). Centrifugálás, etanolos mosás, szárítás után a tisztított DNS-molekulát 40 µl desztillált vízben vettük fel. A preparátumok minőségét agaróz gélelektroforézis segítségével ellenőriztük általában 1 µl minta felhasználásával. 3.4 Emésztés restrikciós endonukleázokkal és agaróz gélelektroforézis A DNS-minták emésztését a FERMENTAS cég termékeit

használva a megadott protokollok szerint végeztük. Az emésztési reakciók után agaróz gélelektroforézissel ellenőriztük a mintákat. A fragmentek elválasztására 1%-os agaróz gélt és TBE puffert használtunk az általánosan alkalmazott módszerek, protokoll szerint. Kontrollként PstI enzimmel emésztett λ-DNS vagy GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus molekulát (FERMENTAS) alkalmaztunk. 3.5 T4 polimeráz kezelés, DNS ligálás, transzformálás Az izolált fragmentet T4 polimeráz kezeléssel tettük alkalmassá a vektorba való beépüléshez. A reakciót fragment DNS oldat, dNTP, 10×puffer és desztillált víz segítségével végeztük 20 µl térfogatban. A T4 polimeráz enzim hozzáadása után 3 perc 23°C-os, majd 10 perc 75°C-os inkubálás következett. A kezeléssel létrehozott tompa végek lehetővé tették a fragment „blunt end” vágott vektorba való beépítését. Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket

-80°C-ról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 30 percig jégen inkubáltuk, majd hősokkot alkalmaztunk (3 perc, 37°C). Ez után 400 µl LB tápfolyadékot adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket szelektív 21 táptalajra kentük. pBluescript használata esetén 25 ml táptalajba 100 µl ampicillin (25 mg/ml), 40 µl IPTG (100 mM) és 40 µl X-gal oldatot (2%, dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsok közül a fehér telepeket választottuk ki további ellenőrzésre. A kompetens sejteket általában az XL1-blue törzsből készítettük, szobahőmérsékleten OD600=0,5 denzitásig felnövesztett sejtekből, melyeket többszöri mosás, centrifugálás után tízszeresre koncentráltunk és 400 µl-es adagokban, 7% dimetil-szulfoxid (DMSO) jelenlétében -80°C-ra lefagyasztottunk. 3.6 Polimeráz láncreakció A pBS plazmid AmpR génjét az amp-fw2 és amp-rev1 primerek

segítségével, a pCambia2300 plazmid inszertet tartalmazó részét a pROK-Fw és F755p primerek segítségével sokszoroztuk fel polimeráz láncreakcióval. Az Agrobacterium törzsek ellenőrzésére az iaaM génre specifikus Iam F és Iam R, illetve a poligalakturonáz génre specifikus PGF és PGR primereket használtuk. Az alkalmazott oligonukleotid primereket és a használt PCR programokat a 3. és 4 táblázatok tartalmazzák. 3. táblázat: A munka során használt oligonukleotidok Oligonukleotidok neve Nukleotidszekvenciák Tm (oC) amp-fw2 agaattcGCGGAACCCCTATTTGTT 49 amp-rev1 gaagcttGGTCTGACGCTCAGTGGA 48,4 pROK-Fw catttggagagaacacg 48 F755p cttccggctcgtatgttg 50 Iam F ccaaattgcgcgattattg 51 Iam R acttttggcttaggaacatc 51 PGF ggggcaggatgcgtttttgag 54 PGR gacggcactggggctaagga 54 22 4. táblázat: Az alkalmazott PCR programok AmpR o CAM K o iaMPG 1. 94 C 02:00 1. 94 C 02:00 1. 94oC 02:00 2. 94oC 00:30 2. 94oC 00:30 2. 94oC 00:30 3. 50oC

00:30 3. 58oC 00:30 3. 56oC 00:30 4. 72oC 01:40 5. go to 2 33x 6. END 4. 72oC 00:40 5. go to 2 33x 6. END 4. 72oC 01:30 5. go to 2 33x 6. END 3.7 Fragment izolálás Polimeráz láncreakció után a keletkezett DNS fragmentet agaróz gélelektroforézis segítségével izoláltuk. Az izolálni kívánt fragment előtt bemetszést végeztünk és a gélbe Whatman DE 81 papírt helyeztünk, majd további 20 perces 60 V feszültség melletti elektroforézis után a fragment a papírra került. Ezt követően a papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t 2x50 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS kicsapásához 10 µl 3M Na-acetát oldatot (pH=7,0) és 120 µl izopropanolt használtunk. A csapadékot 20 perc, - 20oC inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 20 µl steril desztillált vízben oldottuk fel. 3.8 DNS-szekvencia meghatározás A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotid szekvenciáját a megfelelő

oligonukleotidok a szegedi Bay Zoltán Intézet (ABI3500 Genome Analyzer) laboratóriumában határozták meg. A részszekvenciákat a Chromas Pro (www.technelysiumcomau/ChromasProhtml) program segítségével ellenőriztük, javítottuk és a Lasergene (DNA Star Inc.) program alkalmazásaival illesztettük össze és elemeztük tovább. 3.9 A baktériumok keresztezése A pPZP111, pCambia2300 és a pJP17 plazmid származékokat a PP211 helper plazmidot tartalmazó baktériumtörzs segítségével, konjugációval juttattuk be E. coli sejtekből a megfelelő Agrobacterium törzsbe (MOG301). 23 Ez a módszer a „háromszülős keresztezés”, mely magában foglalja a donor és a recipiens törzset, valamint a mobilizáló plazmidot tartalmazó, „helper” törzset. A keresztezni kívánt donor és recipiens baktériumokat és a „helper” törzset felnövesztettük a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0,9%-os NaCl-oldatban

felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. Éjszakán át, 28°C-on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat 0,9%-os NaCloldatban ismét felszuszpendáltuk, majd különböző hígításokban szelektív lemezekre szélesztettünk belőlük 50 µl szuszpenziót. A 48 óra elteltével felnőtt telepek közül a kiválasztottakat legalább két lépésben tisztítottuk tovább szelektív lemezen, mielőtt tovább dolgoztunk velük. 3.10 Dohány transzformáció A folyamat 1. lépése a kokultiváció, a fiatal baktériumtenyészetet és a fiatal dohánynövény leveleket együtt tenyésztjük. Ehhez szacharóz, agar, valamint hormon- és vitamintartalmú tápoldat, illetve táptalaj szükséges. Anyagok és eszközök: MS H+ tápoldat, 1% szacharózzal + 0,055 mg/l TDZ (=0,25 µM) és 0,050 mg/l NAA, MS H+ táptalaj 1% szacharózzal + 0,055 mg/l TDZ és 0,050 mg/l NAA (kokultivációnál a 3% szacharóz az agrobaktérium vektor

növekedésére gátló lehet). 20 ml MS H+ oldatot mértünk széles szájú Erlenmeyer lombikba, valamint kb. 40 ml MS tápoldatot külön kiöntöttünk a levelek darabolásához. A dohányleveleket Petri csészében, steril tápoldat alatt kb. 6-8 mm-es korongokra vágtuk, a főér kihagyásával Kb. 20-24 korongot összegyűjtöttünk 20 ml tápoldatban (széles szájú, 100 ml-es Erlenmeyer lombik). Fél kémcsövekbe 1 ml MS H+ oldatot mértünk, ebben készítettük el a baktérium szuszpenziót (kb. 5x108sejt/ml), amiből 0,5 ml-t adtunk a levélkorongokhoz, majd enyhén összeráztuk. Kb. 20-25 perc után a levélkorongokat fonákkal felfelé kiraktuk MS H+ táptalajra, két napig 25-27oC-on sötétben tartottuk a lemezeket. A folyamat 2. lépése a szelektív táptalajra való átrakás A szelekciós médium tartalmazza a baktériumok megöléséhez szükséges antibiotikumot (claforán). 100-as Erlenmeyer lombikokba 50-60 ml MS tápoldatot mértünk 100 mg/l claforánnal 24

kiegészítve, ezekben történt a baktérium lemosása a levéldarabkák felületéről. Az alaposan lemosott levéldarabkákat ezután Petri csészékre tettük át, amikbe már a recept szerint elkészített táptalajt kiöntöttük. Anyagok: MS H+ (0,055 mg/l TDZ és 0,050 mg/l NAA), 3% szacharózzal, 0,6 % agarral, 200-200 mg/l claforán/carbenicillin + 100 mg/l kanamycin, vagy egyéb szelekciós ágens. Fényszobában 23-27 oC-on inkubáltuk Ezután következett a hajtásregeneráció. A korongokról izoláltuk a képződő kalluszokat és átraktuk a fenti táptalajra, de már NAA nélkül. A hajtásregenerációt a növényregeneráció követte, amikor is a képződött hajtásokat gyökereztetés céljából hormonmentes táptalajra helyeztük, de az antibiotikumokat nem hagytuk el. További in vitro szaporításra elég 1% szacharóz A munkafolyamat utolsó lépése az üvegházra edzés, amikor a regenerálódott növényeket steril kerti talajra ültettük ki (közel

semleges pH-jú), és kizárólag steril csapvízzel öntöztük. A páratartalmat egy hét után fokozatosan csökkentettük, kb. további 10 napon keresztül Amint a növények megedződtek, lehetett tápoldatozni. 3.11 Növényi fertőzési teszt Az agrobaktériumokat TA táptalajon két napig 28oC növesztettük a megfelelő antibiotikumok jelenlétében, majd 0,9%-os NaCl-oldatban szuszpendáltuk fel a kultúrákat, és OD590=1,5 denzitásra állítottuk be a sejtszámot. Koinokulációs kísérletek esetén a „védő” és a kórokozó baktériumokat 9:1 arányban kevertük össze. A dohány, illetve kalanchoe növények szárát két-három helyen átszúrtuk, előzetesen a baktérium szuszpenzióba, illetve kontroll NaCl-oldatba mártott lándzsatű segítségével. Kezelésenként 5-6 növényt fertőztünk, majd a növényeket növénynevelő szobában 24oC-on, 14 óra megvilágítás mellett neveltük. A tumorképződést 5 hét elteltével értékeltük ki. 25

4. Eredmények és megvitatásuk Célunk volt a pJP17 vektor hatásosságának tesztelése, valamint olyan új, miRNS konstrukciót tartalmazó vektorok létrehozása, melyek több, különböző Agrobacterium törzs tumorképzését is megakadályozzák. A munka során már korábban átalakított pPZP111 plazmidról az előzetes gyors koinokulációs kalanchoe kísérletekből és dohánynövényen való tesztelés után kiderült, hogy a plazmid nem alkalmas növényi transzformációra, még az átalakított, mesterséges miRNS fragmenteket nem tartalmazó, „üres” vektor sem volt hatásos. Ennek megállapításában nagy segítségünkre voltak a kontrollként használt pJP17 vektorral transzformált növények. Így új vektort kellett keresnünk, a választás a növényi transzformációra alkalmas pCambia2300 vektorra esett, mely plazmid átalakításának folyamata a 4.2 fejezetben kerül ismertetésre 4.1 Transzgenikus dohánynövények létrehozása Az Anyagok és

módszerek 3.10 fejezetében leírt protokoll alapján sikerült transzgenikus dohánynövényeket készíteni, összesen 16 vonalat hoztunk létre a pJP17 konstrukció segítségével. A növényi teszteléshez az Agrobacterium tumefaciens A348 és C58, illetve Agrobacterium vitis Tm4, AT1 és S4 törzseket választottuk. A növényi fertőzés megkezdése előtt PCR reakcióval meggyőzödtünk róla, hogy a fertőzésben használt agrobaktériumok valóban a megfelelő törzsek. Az A tumefaciens A348 és C58 törzseket iaaM szekvenciájukra specifikus primer pár segítségével, az A. vitis Tm4 és AT1 törzseket pedig a poligalakturonáz génre specifikus primer páros segítségével ellenőriztük (8. ábra) Az A vitis S4 törzset még nem használtuk a növényfertőzési kísérletekben, így ezt a törzset még nem is vizsgáltuk. 26 8. ábra: A fertőzésben használt agrobaktériumok PCR reakcióval való ellenőrzése C58, A348: A. tumefaciens C58 és A348 törzsek

iaaM génre specifikus primerpárossal keletkezett PCR fragmentje; AT1, Tm4: A. vitis AT1 és Tm4 törzsek poligalakturonáz génre specifikus primerpárossal keletkezett PCR termék; L: 100bp DNA Ladder Plus 4.11 Kettő transzgenikus dohányvonal fertőzési eredménye Eddig kettő transzgenikus vonalat tudtunk úgy elszaporítani, hogy tesztelni tudjuk különböző agrobaktériummal szembeni fogékonyságukat (N3 és N4 vonalak). Emellett kontroll (K) növényi tesztekben ellenőriztük, hogy a rendelkezésünkre álló, a kísérletekben használni kívánt Agrobacterium törzsek valóban képesek-e a dohánynövényeken tumort okozni. Egy-egy agrobaktérium törzzsel 2-2 növényt fertőztünk, 2-2 sebzési helyen. A kísérletek eredményét az 5 táblázat tartalmazza, ill a 9. ábra szemlélteti 5. táblázat: Az agrobaktérium fertőzés eredménye A348 C58 Tm4 AT1 K + + + + N3 + + + + N4 - - + + (1) +: van tumor, -: nincs tumor 27 -K K A348 K

C58 K Tm4 K AT1 N3 A348 N3 C58 N3 Tm4 N3 AT1 N4 A348 N4 C58 N4 Tm4 N4 AT1 9. ábra: Agrobacterium törzsek tumorképzése dohánynövényeken -K: fertőzetlen kontroll; K A348, K C58, K Tm4, K AT1: A. tumefaciens A348, C58, A. vitis Tm4, AT1 által okozott tumor kontroll dohányokon; N3 A348, N3 C58, N3 Tm4, N3 AT1: A348, C58, Tm4, AT1 által okozott tumor az N3 fogékony transzgenikus dohány vonalon; N4 A348, N4 C58: sebzési hely az A348, C58 fertőzésre rezisztens N4 transzgenikus dohányvonalon; N4 Tm4, N4 AT1: Tm4, AT1 által okozott tumor az N4 transzgenikus dohányvonalon A többi transzgenikus vonalunk tesztelése is folyamatban van, de a kísérletek kiértékelése még nem történt meg. Ezen transzgenikus vonalak elkészítése mellett párhuzamosan miRNS-t expresszáló transzgenikus növényeket is szerettünk volna létrehozni a pCambia2300 vektor segítségével. Ehhez azonban szükség volt a klónozó vektor átalakítására 28 4.2 A pCambia2300

vektor átalakítása Előzetes vizsgálataink során kiderült, hogy a pCambia vektor használható a klónozáshoz, valamint sikerült önmagában az „üres” vektorral transzgenikus kalluszt létrehozni dohányleveleken, így remélhetőleg a miRNS konstrukciókat tartalmazó vektorok is sikeresen alkalmazhatók lesznek dohánynövény regeneráltatására. A klónozás érdekében előbb ezen a vektoron néhány átalakítást kellett elvégeznünk. A mesterséges miRNS géneket az egyszerűbb, és „orientált” klónozás érdekében EcoRI-HindIII fragmentként kívántuk beépíteni a bináris plazmidba. A miRNS inszertek beépítése előtt szükség volt egy 35S promoter és egy terminátor szekvencia beépítésére is. A pROK2 vektorban egy 1077 bp nagyságú EcoRI-HindIII fragmentként megtalálható a 35S promoter (cauliflower mosaic virus, CaMV) és a nopalin szintáz (nos) gén terminátor szekvenciája, így egy EcoRI-HindIII kettős emésztéssel az kivágható,

illetve beépíthető a pCambia2300 plazmidba. Azonban az EcoRI- miRNS -HindIII fragmentek beépítése során kivágódna ez a fontos 35S promoter régió, így az inszertek beépítése előtt a promoter szekvencia két végéről el kell tüntetni e két enzim hasítóhelyet (10. ábra) pROK2 MCS pS35 Xba Bam SmaI KpnI SacI NOS TER oldal gggggacTCTAGAggatccccgggtaccGAGCTCgaatttccc 10. ábra: A klónozó vektor átalakítása, a pROK2 poliklónozó helye (MCS) 1.: a pROK2 35S promoter-NOSt beépítése a pCambia2300 vektorba; 2-3: EcoRIHindIII hasítóhelyek elrontása 29 A pCambia vektort először EcoRI enzimmel emésztettük meg, és T4 polimeráz enzimkezeléssel feltöltöttük a restrikciós hasítóhelyet, majd HindIII enzim esetében ismételtük meg a lépéseket. Ellenőrzésképpen EcoRI, HindIII és EcoRI-HindIII kettős emésztést végeztünk. Kontrollként a KpnI enzimet használtuk, ami emészti az eredeti és az elrontott EcoRI, illetve HindIII hasítóhelyet

tartalmazó plazmidot is. Az ellenőrző emésztések igazolták, hogy kizárólag a kívánt hasítóhelyeket sikerült elrontani, ami a további tervezett munka előfeltétele (11. ábra) Az átalakított plazmidot szekvencia szinten is ellenőriztük. 11. ábra: A klónok ellenőrzése EcoRI, HindIII és KpnI restrikciós enzimekkel 3.: emésztetlen pROK2 35S promotert (EcoRI-HindIII fragmentként) tartalmazó pCambia2300 plazmid; 1.: emésztetlen pROK2 35S promotert (EcoRI-HindIII hely elrontott) tartalmazó pCambia2300 plazmid; 3EH, 1EH: EcoRI-HindIII kettős emésztett minták; 3E, 1E: EcoRI emésztett minták; 3H, 1H: HindIII emésztett minták; 3K, 1K: KpnI emésztett minták; λ: lambda DNS kontroll PstI restrikciós enzimmel hasítva A következő lépésben célunk volt az EcoRI-HindIII klónozó helyek bevitele a 35S promoter és nos terminátor szekvenciák közé. Ehhez az Amp antibiotikum rezisztenciagént választottuk, melynek felsokszorozására két primert

terveztünk, úgy hogy az 5’ primer szekvencia az EcoRI, a 3’ primer szekvencia pedig a HindIII hasítóhelyet tartalmazza, hogy klónozása után újra megjelenjen a vektoron. Így egyrészt szelektálni tudunk a két, restrikciós enzim hasítóhely beépülésére, másrészt a következő klónozási lépésnél ellenőrizni tudjuk, hogy az EcoRI és a HindIII enzim is hasította-e a 30 vektort. A sikeres kettős emésztést az antibiotikum rezisztenciát tartalmazó DNSfragment megjelenése jelzi Kolónia PCR segítségével felsokszoroztuk a kiválasztott antibiotikum rezisztencia gént. A kapott megfelelő méretű (1110 bp) DNS fragmentet izoláltuk, SmaI enzimmel linearizált pCambia vektorba ligáltuk, majd XL1-Blue sejtekbe transzformáltuk. A transzformáns kolóniákból plazmidot izoláltunk és EcoRI-HindIII kettős emésztéssel ellenőriztük, hogy valóban a kívánt konstrukciót hordozzák-e. A beépült fragment orientációjának meghatározására is

szükség volt, hiszen számunka a promoter után EcoRI-HindIII orientációban beépült inszertet tartalmazó plazmidok a fontosak. Az orientáció meghatározásához XbaI-HindIII enzimeket választottunk. A kettős emésztés során a megfelelő orientációban beépült inszertek esetén a gélen jól látható fragment jelenik meg (12. ábra) 12. ábra: Az orientáció meghatározás XbaI és HindIII restrikciós enzimekkel 2, 3, 4: emésztetlen minták; 2EH, 3EH, 4EH: EcoRI-HindIII enzimekkel emésztett minták; 2XH, 3XH, 4XH: XbaI-HindIII enzimekkel emésztett minták; λ: lambda DNS kontroll PstI restrikciós enzimmel hasítva 2XH és 4XH mintáknál látható a megfelelő méretű fragment, ami akkor keletkezik, ha jó orientációban van az inszert, így a XbaI-HindIII enzimek az inszertet is kivágják. 31 4.21 Az átalakított miR159 mikro RNS gének beépítése a pCambia2300 vektorba A tanszéken nyolcféle, módosított miRNS159 szekvenciát hoztak létre

(Galambos Anikó munkája). Ezeknek a miRNS szekvenciáknak az átalakítása többlépcsős PCR és klónozási folyamat során történt. Ezeket az átalakított szekvenciákat tartalmazó EcoRImiRNS-HindIII fragmenteket izoláltuk, majd a pCambia2300 plazmid EcoRI-HindIII helyére ligáltuk (14. ábra), majd XL1-Blue kompetens sejtekbe transzformáltuk és megfelelő antibiotikumot tartalmazó szelektív táptalajon növesztettük. A felnőtt telepek közül kolónia PCR segítségével kiválogattuk a pozitív klónokat, melyekből aztán plazmid DNS-t is tisztítottunk. Az inszert jelenlétét EcoRI-HindIII kettős emésztéssel (13. ábra) és szekvenálási reakcióval ellenőriztük 13. ábra: EcoRI-HindIII kettős emésztés eredménye 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15: emésztetlen minták; 1EH, 7EH, 11EH, 15EH: EcoRIHindIII kettős emésztett „rövid” fragmentet hordozó minták; 3EH, 5EH , 9EH, 13EH: EcoRI-HindIII kettős emésztett „hosszú” fragmentet hordozó minták;

L: 100bp DNA Ladder Plus 32 14. ábra: A létrehozott miRNS gének beépítésének folyamata a már átalakított pCambia2300-as vektorba A. Az átalakított pCambia2300-as vektoron SmaI emésztés után beépítettük az EcoRIHindIII végekkel rendelkező Amp rezisztencia gént B. A rezisztencia gén kivágása után (1) a módosított miRNS géneket a pCambia2300as vektorba ligáltuk (2) 33 A szekvenáltatás eredménye igazolta, hogy mindegyik fragment bázispárra pontosan az általunk átalakított szekvenciákat tartalmazza, így az elkészített konstrukciók hatásosságának ellenőrzése megkezdődhet a növényi tesztekben. 4.22 Növényi kísérletek A tervezett fertőzési kísérletekhez a létrehozott új és a kontroll „üres” plazmid konstrukciókat konjugációval juttattuk be a MOG301 „disarmed” („lefegyverzett”, a tumort eredményező, vad típusú T-DNS szakaszt eltávolították belőle) Agrobacterium törzsbe. Az Anyagok és módszerek

3.10 fejezetében leírt protokoll alapján megkezdtük a transzgenikus dohánynövények készítését. 34 5. Összefoglalás Az agrobaktériumok Gram-negatív talajbaktériumok, melyek a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik. A folyamat során az Agrobacterium genetikailag transzformálja a növényt a T-DNS segítségével. Ezen, többek között, auxin és citokinin bioszintézis gének találhatók, melyek tumoros sejtburjánzást eredményeznek. Elvben létre lehet hozni olyan Agrobacterium rezisztens transzgenikus növényeket, melyekben a baktérium által bejuttatott gének megnyilvánulása gátolt. Mi az auxin túltermelésért felelős iaaM gén géncsendesítés segítségével történő inaktiválását választottuk. Mivel számos patogén agrobaktérium törzs van, amelyek iaaM szekvenciái részben eltérőek egymástól, kérdés, hogy egy adott csendesítésre használt szekvencia mennyire biztosít védettséget a többi törzs

tumorképzésekor. Először egy olyan szekvencia hatását vizsgáltuk, amely az A. tumefaciens A348 törzs iaaM génjének nagy részét tartalmazta (pJP17), ami a legtöbb rokon törzs iaaM szekvenciájával több vagy kevesebb részletében teljesen azonos. E konstrukció agrobaktériumokkal szembeni hatásosságát transzgenikus dohánynövények fertőzésével vizsgáltuk. Eddig 16 transzformáns vonalat hoztunk létre, melyeket vegetatív módon szaporítunk fel. A különböző agrobaktérium törzsekkel történő fertőzési tesztekben eddig két vonalat sikerült jellemeznünk. Ezek közül egy mutatott rezisztenciát az A tumefaciens A348 és C58 törzsekkel szemben, de fogékony volt A. vitis AT1 és Tm4 fertőzésre. E kísérletek mellett egy Arabidopsis miRNS génből (miR159a) korábban laboratóriumunkban létrehozott, iaaM mRNS szekvenciákra specifikus konstrukciók transzformációs vektorokba klónozását végeztem el. Először a pPZP111 bináris plazmidot

használtuk fel erre a célra, de kiderült, hogy ez a tervezett vizsgálatokra nem alkalmas. Ezek után a pCambia2300 bináris plazmid átalakítását végeztük el a mesterséges miRNS gének klónozásához, majd a klónozott, nyolc féle módosított miRNS gén szekvenciájának ellenőrzését segítettem. A létrehozott vektorokat agrobaktériumba juttattuk és megkezdtük a transzgenikus dohánynövények létrehozását. 35 6. Irodalomjegyzék BARTEL, B. AND BARTEL, D.P 2003 MicroRNAs: at the root of plant development? Plant Physiol 132(2): 709-17. BARTEL, D.P 2004 MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function Cell 116(2): 281-97. BAUMBERGER, N. AND BAULCOMBE, D.C 2005 Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 102(33): 11928-33. BELL CR, DICKIE GA, CHAN JW. 1995. Variable response of bacteria isolated from grapevine xylem to control grape crown gall disease in

planta. Am J Enol Vitic 46: 499508 BINNS AN. 2002 T-DNA of Agrobacterium tumefaciens: 25 years and counting Trends in Plant Science 7: 231-233 BOLTON GW, NESTER EW, GORDON MP. 1986. Plant phenolic compounds induce expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science 232: 983-985 BULLOCK WO, FERNANDEZ JM, SHORT JM. 1987 XL1-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection. Biotechniques 5: 376-9 BURR TJ, REID CL. 1994 Biological control of grape crown gall with non-tumorigenic Agrobacterium vitis strain F2/5. Am J Enol Vitic 45: 213-9 BURR TJ, OTTEN L. 1999 Crown gall of grape: biology and disease management Annu Rev Phytopathol 37 36 DE CLEENE, M. 1985 Susceptibility of monocotyledons to Agrobacterium tumefaciens Phytopath. Z, 113: 81–89 DE CLEENE, M. AND DE LEY, M. 1976. The host range of crown gall Bot Rev, 442: 389–466. DITTA, G., STANFIELD, S, CORBIN, D &

HELINSKI, DR 1980 Proc Natl Acad Sci U.SA 77: 7347-7351 DONG, Z., HAN, MH AND FEDOROFF, N 2008 The RNA-binding proteins HYL1 and SE promote accurate in vitro processing of pri-miRNA by DCL1. Proc Natl Acad Sci U S A 105(29): 9970-5. FIRE A, XU S, MONTGOMERY MK, KOSTAS SA, DRIVER SE, MELLO CC 1988. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811. GAUDIN V, VRAIN T, JOUANIN L. 1994 Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiol Biochem 32: 11-29 GELVIN S. 2000 Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Ann Rev Plant Physiol 51: 223-56 GHEYSEN G, VAN MONTAGU M, ZAMBRYSKY P. 1987 Integration of Agrobacterium tumefaciens DNA (T-DNA) involves rearrangements of target plant DNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA 84: 6169-73 GRIFFITHS-JONES, S., GROCOCK, RJ, VAN DONGEN, S., BATEMAN, A AND ENRIGHT, A.J 2006 miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature

Nucleic Acids Res 34 (Database issue), D140-4. HAJDUKIEWICZ P, SVAB Z, MALIGA P. 1994 The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25(6): 989-994 37 HAMMOND, S.M, BOETTCHER, S, CAUDY, AA, KOBAYASHI, R, HANNON, GJ 2001 Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293 (5532): 1146-1150. HOLB I. 2005 Polifág kórokozók elleni ökológiai védekezés ISH-HOROVICZ D, BURKE JF. 1981 Rapid and efficient cosmid cloning Nucl Acids Res 9: 2989-98 KHMEL IA, SOROKINA TA, LEMANOVA LB, LIPASOVA VA, METLITSKY OZ, ET AL. 1998. Biological control of crown gall in grapevine and raspberry by two Pseudomonas spp. with a wide spectrum of antagonistic activity. Biocontr Sci Technol 8: 45-57 KIRÁLY L. 1999 The Silencing of (Trans)Genes - A Mechanism of Virus Resistance in Plants. Acta Phytopatologica Et Entomologica Hungarica 34: 263-75 KIRÁLY Z. - BARNA B - KECSKÉS A - FODOR J 2002

Down-Regulation of Antioxidative Capacity in a Transgenic Tobacco Which Fails to Develop Acquired Resistance to Necrotization Caused by TMV. Free Radical Research 36: 981-991 LAUBINGER, S., SACHSENBERG, T, ZELLER, G, BUSCH, W, LOHMANN, JU, RATSCH, G AND WEIGEL, D. 2008. Dual roles of the nuclear cap-binding complex and SERRATE in premRNA splicing and microRNA processing in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 105(25): 8795-800. LEE H, HUMANN J, PITRAK J, CUPERUS J, PARKS T, ET AL. 2003. Translation start sequences affect the efficiency of silencing of Agrobacterium tumefaciens T-DNA oncogenes. Plant Physiol 133: 966-77 LEE, R.C, FEINBAUM, RL AND AMBROS, V 1993 The C elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75(5): 843-54 LEE, Y., KIM, M, HAN, J, YEOM, KH, LEE, S, BAEK, SH AND KIM, V.N 2004 MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. Embo J 23(20): 4051-60 38 LEHOCZKY J. 1978 Root-system of the

grapevine as a reservoir of Agrobacterium tumefaciens cells. Proc 4th Internat Conf Plant Path Bact: 239–243, Angers, France MCNEIL, J . B AND J J FRIESEN 1981 Mol Gen Genet 184: 386-393 MELCHERS LS, REGENSBURG-TUINK AJG, SCHILPEROORT RA, HOOYKAAS PJJ. 1989 Specificity of signal molecules in activation of Agrobacterium virulence gene expression. Mol Microbiol 3: 969-77 NAPOLI C, LEMIEUX C, JORGENSEN R 1990. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. The Plant Cell 2: 279-289 NIU QW, LIN SS, REYES JL, C CK, WU HW, ET AL. 2006. Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nat Biotechnol 11: 1420-8 OROSZ L, SVAB Z, KONDOROSI A, SIK T. 1973 Genetic studies on Rhizobio- phage 163 Genes and functions on the chromosome Mol Gen Genet 125: 341- 50 PARK, M.Y, WU, G, GONZALEZ-SULSER, A, VAUCHERET, H AND POETHIG, RS 2005 Nuclear processing and export

of microRNAs in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 102(10): 3691-6. PETER M. WATERHOUSE & CHRISTOPHER A HELLIWELL 2003 Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing. Nature Reviews Genetics 4: 29-38 PU XA, GOODMAN RN. 1993a Effects of fumigation and biological control on infection of indexed crown gall free grape plants. Am J Enol Vitic 44: 241-8 REAM W. 1989 Agrobacterium tumefaciens and interkingdom genetic exchange Annu Rev Phytopathol. 27: 583-618 39 REINHART, B.J, SLACK, FJ, BASSON, M, PASQUINELLI, AE, BETTINGER, JC, ROUGVIE, A.E, HORVITZ, HR AND RUVKUN, G. 2000 The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403(6772): 901-6 SAMBROOK J, FRITSCH EF, MANIATIS T. 1989 Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press SMITH, R. H AND HOOD, E. E 1995 Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons. Crop Sci, 35: 301–309 SUNKAR, R.,

GIRKE, T, JAIN, PK AND ZHU, JK 2005 Cloning and characterization of microRNAs from rice. Plant Cell 17(5): 1397-411 TANG, G., REINHART, BJ, BARTEL, DP AND ZAMORE, P.D 2003 A biochemical framework for RNA silencing in plants. Genes Dev 17(1): 49-63 TIINLAND B, SCHOUMACHER F, GLOECKLER V, BRAVO-ANGEL AM, HOHN B. 1995 The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T-DNA into the plant genome. EMBO J 14: 3585-95 TZFIRA T, LI J, LACROIX B, CITOVSKY V. 2004. Agrobacterium T-DNA integration: molecules and models. Trends in Genetics 20: 375-83 VAN DER KROL AR, LENTING PE, VEENSTRA J, VAN DER MEER IM, KOES RE, GERATS AGM, MOL JNM, STUITJE AR 1988. An anti-sense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation. Nature 333: 866-869 WEBSTER J, DOS SANTOS M, THOMSON JA. 1986. Agrocin-producing Agrobacterium tumefaciens strains active against grapevine isolates. Appl Environm Microbiol 52: 217219 XIE, Z.,

JOHANSEN, LK, GUSTAFSON, AM, KASSCHAU, KD, LELLIS, AD, ZILBERMAN, D.,JACOBSEN, SE AND CARRINGTON, J.C 2004 Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2(5): E104 40 YANG, L., LIU, Z, LU, F, DONG, A AND HUANG, H. 2006b SERRATE is a novel nuclear regulator in primary microRNA processing in Arabidopsis. Plant J 47(6): 841850 ZAENEN J, VAN LAREBEKE N, TENCHY H, SCHELL J. 1974 Supercoiled circular DNA in crown gall inducing Agrobacterium strains. J Mol Biol 86: 109-27 41 7. Köszönetnyilvánítás Munkámat a PTE Természettudományi Kar, Biológiai Intézet, Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem. Hálával tartozom a tanszék összes dolgozójának, hogy megfelelő hátteret biztosítottak terveim megvalósításához. Köszönettel tartozunk Dr. Szegedi Ernőnek (FVM Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, Kecskemét) hasznos elméleti és gyakorlati tanácsaiért. Külön köszönettel tartozom

témavezetőimnek, Galambos Anikónak és Dr. Putnoky Péternek munkám irányításáért, sok segítségéért, hasznos tanácsaiért. 42