Chemistry | Biochemistry » Dr. Sziksz Erna - Fehérje meghatározás Western blottal

SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Fehérje meghatározás Western blottal Dr. Sziksz Erna I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Western blot / Protein immunblot Western blot: • széleskörűen használt szemi-kvantitatív analitikai technika fehérjék meghatározására • molekuláris biológia, biokémia, immungenetika Southern blot: DNS meghatározás Northern blot: RNS meghatározás Eastern blot: módosított fehérjék meghatározása • • • • Minta: szöveti homogenizátum vagy sejtextraktum Natív vagy denaturált fehérjék elválasztása: gélelektroforézis Transzfer: nitrocellulóz vagy PVDF membránra Detektáció: célfehérjére specifikus antitesttel I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Minta előkészítés Minták: teljes szövet vagy sejtkultúra Szöveti homogenizálás: homogenizátorral, szonikátorral, vagy nagy nyomáson történő centrifugálással Lízis: lízis pufferrel, mely

tartalmaz: • különböző detergensek, sók és pufferek a sejtek lizálásához és a fehérjék szolubilizálásához • proteáz és foszfatáz inhibitorok a minta degradálódásának elkerüléséhez Dounce homogenizátor Szöveti homogenizátor Szonikátor I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A lízispuffer összetétele • • • • • • Tris-HCl: puffer Triton-X 100 vagy Nonidet P-40: detergensek NaF és Na3VO4: foszfatáz inhibitorok EDTA vagy EGTA: pufferek phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF): szerin-proteáz inhibitor proteáz inhibitorok: aprotinin, leupeptin, pepstatin I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Sejt frakcionálás • Centrifugálás nagy sebességgel (12-15.000 g, 10-15 min, 4°C) • A felülúszókat (teljes sejt lizátum) -80°C-on tartjuk • A különböző sejtalkotók, sejtorganellumok is elválaszthatóak (citoszól, mitokondriális, nukleáris vagy membránfrakció)

Fehérjekoncentráció meghatározása: Bradford módszer • BSA standard sor • spektrofotométer (595 nm) I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Gélelektroforézis Fehérjék elválasztása: • izoelektromos pont (pI) szerint • molekulasúly szerint • elektromos töltés szerint A szeparáció fajtája függ: • a minták előkészítésétől • a gél típusától SDS-PAGE: Fehérjék elválasztása elektroforetikus mobilitásuk alapján • a minták az SDS kötődésével a tömegükkel arányos töltést kapnak • elválasztás kizárólag méret alapján I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A lizált fehérjeminták előkészítése A Laemmli reagens általános összetétele: • Sodium(Na) dodecil szulfát (SDS): anionos detergens, amely a fehérjéket a tömegükkel arányosan negatív töltéssel látja el • Ditiotreitol (DTT) vagy 2-merkaptoetanol: redukálószer, amely a diszulfid hidak

felbontásával denaturálja a fehérjéket • Glicerol: tartósító- és ülepítőszer • Brómfenolkék (BPB): jelzőfesték az elektroforézis nyomonkövetéséhez I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST SDS-PAGE Redukáló SDS-PAGE • az SDS és a redukálószerek denaturált állapotban tartják a polipeptideket • a fehérjék elektroforetikus mobilitását elsősorban molekulatömegük határozza meg • a fehérjéket az SDS negatív töltéssel látja el, és a pozitív töltésű elektród felé vándorolnak Nem-redukáló vagy natív PAGE • nincs forralás és redukálószerek • az elektroforézis SDS nélkül zajlik • az eredeti struktúra fontos a további vizsgálatokhoz • a fehérjék elektroforetikus mobilitása nem csak a méretüktől, hanem a töltésüktől is függ I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Akrilamid gélek készítése A gél összetevői: • akrilamid és biszakrilamid: ezek

a monomerek szabadgyökök jelenlétében keresztreagálnak egymással; az aktivált monomerek hosszú polimer láncokat alkotnak • Tris-Cl: megfelelő pH-jú puffer • SDS: minden fehérjének a tömegével arányos negatív töltést ad • ammónium perszulfát (AMPER): szabadgyökök képzésével elindítja a polimerizációt • tetrametil-etiléndiamin (TEMED): az akrilamid polimerizáció katalizátora Az akrilamid és biszakrilamid monomerek polimerizációja Egy poliakrilamid gél transzmissziós elektronmikroszkópos képe I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Gél koncentrációk Szeparáló gél: alsó, magasabb (8-12%) poliakrilamid tartalommal Koncentráló gél: felső, alacsony (4-6%) poliakrilamid tartalommal Precast gélek: a gyártó által előre csomagolt gélek Az akrilamid koncentrációja határozza meg a gél felbontását: • alacsony koncentrációjú gélek nagy molekulatömegű fehérjék szétválasztására • magas

koncentrációjú gélek kisebb fehérjék szétválasztására I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Gélelektroforézis • gél polimerizáció • szeparáló (alsó) gél öntése • vékony rétegben izopropanolt rétegzünk a szeparáló gél tetejére • koncentráló (felső) gél öntése • zsebek készítése fésűvel • a minták és a marker betöltése a zsebekbe • a futtatókád áramforráshoz kapcsolása, a kívánt futtatási körülmények beállítása (1-2 óra, 120V, 20 mA) I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Gélelektroforézis • A negatív töltésű fehérjék a pozitív (+) elektród (anód) felé vándorolnak • A különböző méretű fehérjék másképp vándorolnak a gélmátrixban • A fehérjék méretük/molekulatömegük szerint válnak szét • A fehérjék különböző elektroforetikus mobilitásuknak megfelelően oszloponként vízszintes csíkokban szeparálódnak

Electrophoretic apparatus I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A poliakrilamid gélek festése Coomassie Brilliant Blue (CBB): • a legelterjedtebb fehérje festék • nem specifikusan köti a fehérjéket • a fehérjéket ecetsavval fixáljuk Coomassie Brilliant Blue festés Ezüst festés: • széleskörűen használt technika • a CBB festésnél érzékenyebb Ezüst festés I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Más gyakran használt elektroforetikus eljárások • Két dimenziós (2D) gélelektroforézis: a fehérjék elválasztása az 1. dimenzióban izoelektromos pont, a 2. dimenzióban molekulatömeg szerint történik • Kapilláris elektroforézis (CE): ionos állapotú fehérjék elválasztása méretük szerinti töltés alapján egy elektrolittal töltött vékony kapillárisban • Hőmérséklet Gradiens Gél Elektroforézis (TGGE) és Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézis (DGGE): olyan

elektroforetikus eljárások, melyek vagy hőmérsékleti, vagy a kémiai gradiens létrehozásával denaturálják a mintát, miközben az egy akrilamid gélben fut I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Western blot: fehérje transzfer Elektroblotting: • A fehérjék átblottolása az akrilamid gélből PVDF vagy nitrocellulóz membránra elektromos áram segítségével (2 óra, 70V, 220 mA hűtött rendszerben) • A fehérjék a gélből a membránra kerülnek, miközben megtartják szerkezetüket • A fehérjék a membrán egy vékony felszíni rétegén detektálhatóak • A fehérjék hidrofób és ionos kötésekkel kapcsolódnak a membránhoz I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A fehérje transzfer sikerességének ellenőrzése • A membrán festése Coomassie Brilliant Blue vagy Ponceau S festékkel • Ponceau S: gyakrabban használt, nagyobb érzékenység és vízoldékonyság Western blot készülék

Ponceau S festés I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A blotok blokkolása • A blokkolás a célfehérje kimutatásához használt antitest aspecifikus kötődését gátolja a membránhoz • A membránt általában TBS-TWEEN pufferben oldott 1-5% Bovine serum albumin (BSA) vagy zsírszegény tejpor oldatában inkubáljuk • TBS-TWEEN: Tris-Buffered Saline (TBS) kismennyiségű detergenssel (Tween 20 vagy Triton X-100) • A BSA vagy tejpor leköti az aspecifikus kötőhelyeket a membránon I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A célfehérjék detektálása Elsődleges antitest • Specifikus a célfehérjét tartalmazó fajra • Inkubálás: az 1. antitest oldatában • Oldat: TBS-TWEEN pufferben oldott tejpor vagy BSA • Inkubációs körülmények: enyhe rázatás • Inkubációs idő: 30 perc - overnight • Inkubációs hőmérséklet: eltérő (4°C - 25°C) Másodlagos antitest • Specifikus az

elsődleges antitestre • Biotinnal vagy riporter enzimmel (pl. HRP) kapcsolt • Inkubálás: a 2. antitest oldatában • Oldat: TBS-TWEEN pufferben oldott tejpor vagy BSA • Inkubációs körülmények: enyhe rázatás • Inkubációs idő: 30 perc - 2 óra I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A célfehérjék detektálása Kemilumineszcens előhívás: • A 2. antitestre kapcsolt tormaperoxidáz hasítja a kemilumineszcens szubsztrátot • A reakcióból származó termék a célfehérje mennyiségével arányos kemilumineszcens jelet ad • Fotografikus filmet helyezünk a membránra • A blothoz kötődött antitestek kemilumineszcens fényjele képet hoz létre a filmen • Újabban CCD kamerákkal készítenek digitális felvételt a blotokról I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A célfehérjék detektálása Egyéb alkalmazások Kolorimetrikus detektáció: • a 2. antitesthez kapcsolt enzim egy

szubsztrát molekulát hasít, amely színes reakcióterméket képez Fluoreszcens detektáció: • a 2. antitesthez a közeli infravörös tartományban jelet adó fluorofórt kapcsolnak Autoradiográfia: • a 2. antitesthez radioaktív izotópot kapcsolnak Fluoreszcens detektáció Detektációs kazetta autoradfiográfiához/ kemilumineszcens detektációhoz I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A célfehérjék detektálása Quantum dot (Qdot) nanokristály technológia Qdot technológia: • kimutatás a 2. ea biotinjához kapcsolódó sztreptavidin Qdot-biokonjugátummal Qdot nanokristály: • a fluoreszcenciához hasonló, de más fizikai hátterű fénykibocsátásra alkalmas félvezető anyag • a Qdot mérete szabja meg a kibocsátott fény hullámhosszát Qdot nanokristály szerkezete Előnyök: • a fluoreszcens technikát használó molekuláris biológiai módszerek bármelyikében használható • nincsenek átfedő spektrumok

• egyetlen gerjesztő fényforrás elegendő • hosszú életidejű jel és stabilitás: hosszú távú vizsgálatok időbeli nyomonkövetésére alkalmas I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A Western blotok kiértékelése • A jelölt csíkok összevetése a markerrel • Az eljárás kontrollja egy strukturális fehérje, mint az aktin vagy a tubulin • A képeket denzitometriával értékeljük ki • A legújabb szoftverek az adatok további értékelésére adnak lehetőséget (pl. molekulasúly analízis) I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Másodlagos próba • A nitrocellulóz és a PVDF membránok „strippelhetőek” • A membrán újra felhasználhatóvá válik további antitest próbák számára • A stripping puffer eltávolítja az 1. és 2 antitesteket a blotokról • A fehérjeveszteség csökkentése érdekében erősen ajánlott a PVDF membránok használata nitrocellulóz helyett Egy

Western blot membrán újrafelhasználása I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Western blot problémák megoldása Pöttyök a filmen (hiányzó csíkok): • a légbuborékok miatt a transzfer nem volt kellően hatékony • a film szennyezett volt az előhíváskor Túl sok csík a bloton: • gyakran aspecifikus kötődést jelent • rossz vagy régi volt az 1. antitest • nem tartott elég ideig a blokkolás • a célfehérje proteolitikus hasításon ment át Nagy háttér; alacsony jel-zaj arány a bloton: • fekete vagy eleve sötét film; túl hosszú exponálás • a blokkolás nem volt megfelelő; az 1. antitest aspecifikusan kötődött, és a 2. antitest nem volt megfelelően lemosva • nem megfelelő mosási lépések • a film világít a sötétben – az 1. vagy 2 antitest hígítása nem megfelelő I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Western blot problémák megoldása Nincs vagy gyenge a jel:

• nem volt elég fehérje loadolva a gélre • rossz vagy régi volt az 1. antitest • a foszfoproteinek gyakran overnight inkubálást igényelnek az 1. antitesttel • kevés volt a 2. antitest • túlblokkolás • az előhívó reagensek rosszak / hiba történt az összeállításukkor Elkenődött vagy életlen csíkok • a csíkok elmaszatolódtak a felmelegedett gélben: a feszültség vagy az áramerősség csökkentése, futtatás hidegszobában, új futtatópuffer készítése • a csíkok „súlyzó” alakúak a túl magas feszültség miatt: a blotmembrán előzetes beáztatása transzfer pufferbe A következő weboldalon további WB hibák és megoldásuk találhatóak: http://openwetware.org/wiki/Griffin:Western Blot Optimization I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A Western blot technika használhatósága Előnyök: • • • • • alkalmas szövetből, sejtkultúrából egy adott fehérje szemi-kvantitativ

meghatározására kvantitativvá denzitometriás értékelés során tehető az egyes minták között összehasonlitható a vizsgált fehérje mennyisége akár vizuális úton is a fehérjék a membránon koncentrálódnak, ami kimutatási lehetőségüket növeli a membránra kitett fehérjék gyorsan és reverzibilisen festhetőek Hátrányok: • a fehérjék méretüktől és bázikusságuktól függően eltérő hatékonysággal vihetők fel a membránra • az antitestet a fehérje natív alakja ellen termeltették, viszont a denaturált és redukált körülmények között az antitest nem mindig képes megfelelően kötődni a vizsgálandó fehérjéhez • a szövet, sejtkultúra valamennyi sejtje benne lesz a lizátumban, nem kapunk információt arról, hogy pontosan melyik szöveti sejt expresszálta a vizsgált fehérjét, és arról sem, hogy az egyes sejtekben milyen intenziv a fehérje expressziója • több napos, sok hibalehetőséget rejtő, komplex eljárás,

nagy anyagigénnyel/költséggel I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika