Chemistry | Biochemistry » Dr. Sziksz Erna - Fehérje meghatározás Western blottal

Datasheet

Year, pagecount:2013, 26 page(s)

Language:Hungarian

Downloads:4

Uploaded:December 08, 2018

Size:6 MB

Institution:
-

Comments:

Attachment:-

Download in PDF:Please log in!



Comments

No comments yet. You can be the first!

Content extract

SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Fehérje meghatározás Western blottal Dr. Sziksz Erna I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Western blot / Protein immunblot Western blot: • széleskörűen használt szemi-kvantitatív analitikai technika fehérjék meghatározására • molekuláris biológia, biokémia, immungenetika Southern blot: DNS meghatározás Northern blot: RNS meghatározás Eastern blot: módosított fehérjék meghatározása • • • • Minta: szöveti homogenizátum vagy sejtextraktum Natív vagy denaturált fehérjék elválasztása: gélelektroforézis Transzfer: nitrocellulóz vagy PVDF membránra Detektáció: célfehérjére specifikus antitesttel I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Minta előkészítés Minták: teljes szövet vagy sejtkultúra Szöveti homogenizálás: homogenizátorral, szonikátorral, vagy nagy nyomáson történő centrifugálással Lízis: lízis pufferrel, mely

tartalmaz: • különböző detergensek, sók és pufferek a sejtek lizálásához és a fehérjék szolubilizálásához • proteáz és foszfatáz inhibitorok a minta degradálódásának elkerüléséhez Dounce homogenizátor Szöveti homogenizátor Szonikátor I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A lízispuffer összetétele • • • • • • Tris-HCl: puffer Triton-X 100 vagy Nonidet P-40: detergensek NaF és Na3VO4: foszfatáz inhibitorok EDTA vagy EGTA: pufferek phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF): szerin-proteáz inhibitor proteáz inhibitorok: aprotinin, leupeptin, pepstatin I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Sejt frakcionálás • Centrifugálás nagy sebességgel (12-15.000 g, 10-15 min, 4°C) • A felülúszókat (teljes sejt lizátum) -80°C-on tartjuk • A különböző sejtalkotók, sejtorganellumok is elválaszthatóak (citoszól, mitokondriális, nukleáris vagy membránfrakció)

Fehérjekoncentráció meghatározása: Bradford módszer • BSA standard sor • spektrofotométer (595 nm) I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Gélelektroforézis Fehérjék elválasztása: • izoelektromos pont (pI) szerint • molekulasúly szerint • elektromos töltés szerint A szeparáció fajtája függ: • a minták előkészítésétől • a gél típusától SDS-PAGE: Fehérjék elválasztása elektroforetikus mobilitásuk alapján • a minták az SDS kötődésével a tömegükkel arányos töltést kapnak • elválasztás kizárólag méret alapján I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A lizált fehérjeminták előkészítése A Laemmli reagens általános összetétele: • Sodium(Na) dodecil szulfát (SDS): anionos detergens, amely a fehérjéket a tömegükkel arányosan negatív töltéssel látja el • Ditiotreitol (DTT) vagy 2-merkaptoetanol: redukálószer, amely a diszulfid hidak

felbontásával denaturálja a fehérjéket • Glicerol: tartósító- és ülepítőszer • Brómfenolkék (BPB): jelzőfesték az elektroforézis nyomonkövetéséhez I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST SDS-PAGE Redukáló SDS-PAGE • az SDS és a redukálószerek denaturált állapotban tartják a polipeptideket • a fehérjék elektroforetikus mobilitását elsősorban molekulatömegük határozza meg • a fehérjéket az SDS negatív töltéssel látja el, és a pozitív töltésű elektród felé vándorolnak Nem-redukáló vagy natív PAGE • nincs forralás és redukálószerek • az elektroforézis SDS nélkül zajlik • az eredeti struktúra fontos a további vizsgálatokhoz • a fehérjék elektroforetikus mobilitása nem csak a méretüktől, hanem a töltésüktől is függ I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Akrilamid gélek készítése A gél összetevői: • akrilamid és biszakrilamid: ezek

a monomerek szabadgyökök jelenlétében keresztreagálnak egymással; az aktivált monomerek hosszú polimer láncokat alkotnak • Tris-Cl: megfelelő pH-jú puffer • SDS: minden fehérjének a tömegével arányos negatív töltést ad • ammónium perszulfát (AMPER): szabadgyökök képzésével elindítja a polimerizációt • tetrametil-etiléndiamin (TEMED): az akrilamid polimerizáció katalizátora Az akrilamid és biszakrilamid monomerek polimerizációja Egy poliakrilamid gél transzmissziós elektronmikroszkópos képe I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Gél koncentrációk Szeparáló gél: alsó, magasabb (8-12%) poliakrilamid tartalommal Koncentráló gél: felső, alacsony (4-6%) poliakrilamid tartalommal Precast gélek: a gyártó által előre csomagolt gélek Az akrilamid koncentrációja határozza meg a gél felbontását: • alacsony koncentrációjú gélek nagy molekulatömegű fehérjék szétválasztására • magas

koncentrációjú gélek kisebb fehérjék szétválasztására I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Gélelektroforézis • gél polimerizáció • szeparáló (alsó) gél öntése • vékony rétegben izopropanolt rétegzünk a szeparáló gél tetejére • koncentráló (felső) gél öntése • zsebek készítése fésűvel • a minták és a marker betöltése a zsebekbe • a futtatókád áramforráshoz kapcsolása, a kívánt futtatási körülmények beállítása (1-2 óra, 120V, 20 mA) I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Gélelektroforézis • A negatív töltésű fehérjék a pozitív (+) elektród (anód) felé vándorolnak • A különböző méretű fehérjék másképp vándorolnak a gélmátrixban • A fehérjék méretük/molekulatömegük szerint válnak szét • A fehérjék különböző elektroforetikus mobilitásuknak megfelelően oszloponként vízszintes csíkokban szeparálódnak

Electrophoretic apparatus I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A poliakrilamid gélek festése Coomassie Brilliant Blue (CBB): • a legelterjedtebb fehérje festék • nem specifikusan köti a fehérjéket • a fehérjéket ecetsavval fixáljuk Coomassie Brilliant Blue festés Ezüst festés: • széleskörűen használt technika • a CBB festésnél érzékenyebb Ezüst festés I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Más gyakran használt elektroforetikus eljárások • Két dimenziós (2D) gélelektroforézis: a fehérjék elválasztása az 1. dimenzióban izoelektromos pont, a 2. dimenzióban molekulatömeg szerint történik • Kapilláris elektroforézis (CE): ionos állapotú fehérjék elválasztása méretük szerinti töltés alapján egy elektrolittal töltött vékony kapillárisban • Hőmérséklet Gradiens Gél Elektroforézis (TGGE) és Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézis (DGGE): olyan

elektroforetikus eljárások, melyek vagy hőmérsékleti, vagy a kémiai gradiens létrehozásával denaturálják a mintát, miközben az egy akrilamid gélben fut I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Western blot: fehérje transzfer Elektroblotting: • A fehérjék átblottolása az akrilamid gélből PVDF vagy nitrocellulóz membránra elektromos áram segítségével (2 óra, 70V, 220 mA hűtött rendszerben) • A fehérjék a gélből a membránra kerülnek, miközben megtartják szerkezetüket • A fehérjék a membrán egy vékony felszíni rétegén detektálhatóak • A fehérjék hidrofób és ionos kötésekkel kapcsolódnak a membránhoz I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A fehérje transzfer sikerességének ellenőrzése • A membrán festése Coomassie Brilliant Blue vagy Ponceau S festékkel • Ponceau S: gyakrabban használt, nagyobb érzékenység és vízoldékonyság Western blot készülék

Ponceau S festés I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A blotok blokkolása • A blokkolás a célfehérje kimutatásához használt antitest aspecifikus kötődését gátolja a membránhoz • A membránt általában TBS-TWEEN pufferben oldott 1-5% Bovine serum albumin (BSA) vagy zsírszegény tejpor oldatában inkubáljuk • TBS-TWEEN: Tris-Buffered Saline (TBS) kismennyiségű detergenssel (Tween 20 vagy Triton X-100) • A BSA vagy tejpor leköti az aspecifikus kötőhelyeket a membránon I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A célfehérjék detektálása Elsődleges antitest • Specifikus a célfehérjét tartalmazó fajra • Inkubálás: az 1. antitest oldatában • Oldat: TBS-TWEEN pufferben oldott tejpor vagy BSA • Inkubációs körülmények: enyhe rázatás • Inkubációs idő: 30 perc - overnight • Inkubációs hőmérséklet: eltérő (4°C - 25°C) Másodlagos antitest • Specifikus az

elsődleges antitestre • Biotinnal vagy riporter enzimmel (pl. HRP) kapcsolt • Inkubálás: a 2. antitest oldatában • Oldat: TBS-TWEEN pufferben oldott tejpor vagy BSA • Inkubációs körülmények: enyhe rázatás • Inkubációs idő: 30 perc - 2 óra I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A célfehérjék detektálása Kemilumineszcens előhívás: • A 2. antitestre kapcsolt tormaperoxidáz hasítja a kemilumineszcens szubsztrátot • A reakcióból származó termék a célfehérje mennyiségével arányos kemilumineszcens jelet ad • Fotografikus filmet helyezünk a membránra • A blothoz kötődött antitestek kemilumineszcens fényjele képet hoz létre a filmen • Újabban CCD kamerákkal készítenek digitális felvételt a blotokról I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A célfehérjék detektálása Egyéb alkalmazások Kolorimetrikus detektáció: • a 2. antitesthez kapcsolt enzim egy

szubsztrát molekulát hasít, amely színes reakcióterméket képez Fluoreszcens detektáció: • a 2. antitesthez a közeli infravörös tartományban jelet adó fluorofórt kapcsolnak Autoradiográfia: • a 2. antitesthez radioaktív izotópot kapcsolnak Fluoreszcens detektáció Detektációs kazetta autoradfiográfiához/ kemilumineszcens detektációhoz I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A célfehérjék detektálása Quantum dot (Qdot) nanokristály technológia Qdot technológia: • kimutatás a 2. ea biotinjához kapcsolódó sztreptavidin Qdot-biokonjugátummal Qdot nanokristály: • a fluoreszcenciához hasonló, de más fizikai hátterű fénykibocsátásra alkalmas félvezető anyag • a Qdot mérete szabja meg a kibocsátott fény hullámhosszát Qdot nanokristály szerkezete Előnyök: • a fluoreszcens technikát használó molekuláris biológiai módszerek bármelyikében használható • nincsenek átfedő spektrumok

• egyetlen gerjesztő fényforrás elegendő • hosszú életidejű jel és stabilitás: hosszú távú vizsgálatok időbeli nyomonkövetésére alkalmas I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A Western blotok kiértékelése • A jelölt csíkok összevetése a markerrel • Az eljárás kontrollja egy strukturális fehérje, mint az aktin vagy a tubulin • A képeket denzitometriával értékeljük ki • A legújabb szoftverek az adatok további értékelésére adnak lehetőséget (pl. molekulasúly analízis) I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Másodlagos próba • A nitrocellulóz és a PVDF membránok „strippelhetőek” • A membrán újra felhasználhatóvá válik további antitest próbák számára • A stripping puffer eltávolítja az 1. és 2 antitesteket a blotokról • A fehérjeveszteség csökkentése érdekében erősen ajánlott a PVDF membránok használata nitrocellulóz helyett Egy

Western blot membrán újrafelhasználása I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Western blot problémák megoldása Pöttyök a filmen (hiányzó csíkok): • a légbuborékok miatt a transzfer nem volt kellően hatékony • a film szennyezett volt az előhíváskor Túl sok csík a bloton: • gyakran aspecifikus kötődést jelent • rossz vagy régi volt az 1. antitest • nem tartott elég ideig a blokkolás • a célfehérje proteolitikus hasításon ment át Nagy háttér; alacsony jel-zaj arány a bloton: • fekete vagy eleve sötét film; túl hosszú exponálás • a blokkolás nem volt megfelelő; az 1. antitest aspecifikusan kötődött, és a 2. antitest nem volt megfelelően lemosva • nem megfelelő mosási lépések • a film világít a sötétben – az 1. vagy 2 antitest hígítása nem megfelelő I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST Western blot problémák megoldása Nincs vagy gyenge a jel:

• nem volt elég fehérje loadolva a gélre • rossz vagy régi volt az 1. antitest • a foszfoproteinek gyakran overnight inkubálást igényelnek az 1. antitesttel • kevés volt a 2. antitest • túlblokkolás • az előhívó reagensek rosszak / hiba történt az összeállításukkor Elkenődött vagy életlen csíkok • a csíkok elmaszatolódtak a felmelegedett gélben: a feszültség vagy az áramerősség csökkentése, futtatás hidegszobában, új futtatópuffer készítése • a csíkok „súlyzó” alakúak a túl magas feszültség miatt: a blotmembrán előzetes beáztatása transzfer pufferbe A következő weboldalon további WB hibák és megoldásuk találhatóak: http://openwetware.org/wiki/Griffin:Western Blot Optimization I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika SEMMELWEIS EGYETEM, BUDAPEST A Western blot technika használhatósága Előnyök: • • • • • alkalmas szövetből, sejtkultúrából egy adott fehérje szemi-kvantitativ

meghatározására kvantitativvá denzitometriás értékelés során tehető az egyes minták között összehasonlitható a vizsgált fehérje mennyisége akár vizuális úton is a fehérjék a membránon koncentrálódnak, ami kimutatási lehetőségüket növeli a membránra kitett fehérjék gyorsan és reverzibilisen festhetőek Hátrányok: • a fehérjék méretüktől és bázikusságuktól függően eltérő hatékonysággal vihetők fel a membránra • az antitestet a fehérje natív alakja ellen termeltették, viszont a denaturált és redukált körülmények között az antitest nem mindig képes megfelelően kötődni a vizsgálandó fehérjéhez • a szövet, sejtkultúra valamennyi sejtje benne lesz a lizátumban, nem kapunk információt arról, hogy pontosan melyik szöveti sejt expresszálta a vizsgált fehérjét, és arról sem, hogy az egyes sejtekben milyen intenziv a fehérje expressziója • több napos, sok hibalehetőséget rejtő, komplex eljárás,

nagy anyagigénnyel/költséggel I. Sz Gyermekgyógyászati Klinika