Kémia | Biokémia » Lipidek vizsgálata, foszfatidilkolin, koleszterin, epesavak kimutatása

BIOKÉMIA I. – GYAKORLAT Lipidek vizsgálata: foszfatidilikolin, koleszterin, epesavak kimutatása  Foszfatidilkolin (PC) kimutatása          Biológiai membránok fő glicerofoszfolipidje; jelentős mennyiségben van a tojássárgájában (lecitin). A PC-ben L-glicerint az 1. és 2 helyen két zsírsav észteresíti, a 3 helyen foszfodiészter kötéssel kolin kapcsolódik a glicerinhez. Amfipatikus, a „feje” a foszfokolin, a „lába” a 2 hosszú zsírsavlánc. Vizes oldatban micellákat képez. Etanolban, kloroformban, éterben jól oldódik, nem oldódik viszont acetonban. Tojássárgáját 3 térfogat etanollal keverünk 5 percen át. Kémcsőbe szűrjük szűrőpapíron át, a szűrlet víztiszta sárga folyadék. Kémcsőben 2-3 ml acetonhoz néhány csepp szűrletet adunk  a PC kicsapódik, homályosodás jelentkezik. Másik kémcsőben 1 ml

szűrlethet 1 ml kadmuimkloridot adunk  azonnal fehér csapadék keletkezik (PC-kadmiumklorid komplex). Harmadik kémcsőben 1 ml szűrlethez desztillált vizet adunk. Az egyenletesen opaleszkáló elegy a kialakult micelláknak köszönhető.  Koleszterin kimutatása           Nagy molekulasúlyú, egyértékű ciklusos alkohol, apoláros kolesztán váza miatt vízben oldhatatlan. A szervezetben legnagyobb mennyiségben található szteroid, szerepe van a membrán stabilitásában. Kiinduló anyaga számos vegyületnek (szteroid hormonok, epesavak, D 3 -vitamin). Normálisan éhomi vérszérum 3,9-5,2 mmól/l koleszterint tartalmaz, ami szérum transzport-lipoproteinekhez van kötve. Jól oldódik kloroformban. Klomoroformmal extrahált oldathoz azonos térfogat tömény kénsavat téve az vízelvonást és oxidációt szenved. A 3. –OH csoport a 4 C-atom hidrogénjével kapcsolva H 2 O formájában eliminálódik, a két kettős kötést

tartalmazó kénsav oxidálja, lánchasadás után szerkezetileg nem egységes színes termékek képződnek. Klinikai koleszterin meghatározó módszer, hogy ecetsavanhidriddel és minimális mennyiségű tömény kénsavval kezelve konjugált kettőskötéseket tartalmazó gyűrűs vegyületet kapunk, aminek a színe kék. Spektrofotometriásan mérhető. Egy patkányagyat 3 rész gipsszel péppé dörzsölünk (nedvességet a gipsz megköti). A pépet spatulával 10-15 üveglapra kenjük, 40-50 oC-os szárítóban kiszárítjuk. BIOKÉMIA I. – GYAKORLAT        A száradó pépet szétosztjuk kémcsövekbe. 1 műanyag kanálnyit téve egy kémcsőbe 8-10 ml kloroformot adunk hozzá, jól összerázzuk, majd megszűrjük. A kloroformos szűrletet két egyenlő részre osztjuk. Az egyikhez 2-3 ml azonos mennyiségű tömény kénsavat adunk pipettával, megkeverjük,

állni hagyjuk. A feslő réteg (kloroformos) sárgásvörös, az alsó (kénsavas) opálos barnásvöröses. A színt a koleszterin dehidratált oxidált származékai adják. Másikhoz 10-12 csepp ecetsavanhidridet adunk pipettával, majd 2 csepp tömény kénsavat. Összerázás után az oldat megkékül. Több kénsav hatására megvörösödik, megzöldül.  Epesavak kimutatása            Biológiai detergensek, a duodenumban a lipideket emulgeálják, ezenkívül a pancreasból érkező lipázokat is aktiválják. Az epesavak a koleszterin egyetlen vízoldékony, jelentősebb mennyiségben képződő lebontási termékei. Az epesavak az 5-β-kolánsav származékai, kolánvázas vegyületek. Hidroxil csoportjaik az α-felszín felé néznek (poláros) a β-felszín apoláros, C- és H-tartalmú felület. Az epesavak és az epesavas sók csökkentik a víz felületi feszültségét. Finom kénpor a víz felszínén marad, azonban a felületi

feszültség csökkentésével könnyen a mélybe süllyed. 3 kémcsőbe 10 ml deszt. vizet, ill 1 ml epét és 9 ml deszt vizet, ill 5 ml epét és 5 ml deszt. vizet teszünk Összekeverjük, majd a felületekre kénport rétegezünk. Szacharózból kénsav hatására képződő oximetilfurfurollal az epesavak, mint OHcsoportokat hordozó gyűrűs vegyületek, színes kondenzációs terméket adnak. Kémcsőbe 1 ml epéhez 1 ml deszt. vizet, majd 2-3 csepp szacharóz oldatot adunk Összerázzuk, és tömény kénsavat rétegezünk alá. A fázishatáron vöröses-ibolya színű gyűrű jelenik meg