Egészségügy | Felsőoktatás » Pádár Zsolt - Igazságügyi genetika alapjai

Igazságügyi genetika alapjai Molekuláris orvostudomány - molekuláris bűnjelek genetikai analízise Pádár Zsolt „Nyomok” - Death Valley, CA 2007 / 10 / 11 Igazságügyi genetika vannak az ÉLET dolgai É K E Y N és vannak ROSSZ dolgok az életben M K E L E ezek egy részét mi tesszük másokat velünk tesznek meg S C és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg N Ű vannak, az életben NAGYON ROSSZ dolgok is B amiről azt gondoljuk, csak mással történhet meg Genetika Transzmissziós genetika Molekuláris genetika Populáció genetika Ökológiai genetika Kvantitatív genetika Viselkedés genetika Klinikai genetika Citogenetika Mitokondriális genetika Genomika forward genetika reverse genetika evolúciógenetika - molekuláris taxonómia epigenetika farmakogenetika igazságügyi genetika patogenetika genetikai informatika génsebészet genetic engineering genetikai etika Jogtudományok Kriminalisztika Orvostudományok

Állatorvostudományok 2008. 11 1 / 2009 05 04 Az igazságügyi genetika Genetika és jogtudomány a gyermek tulajdonságai nem csupán a szülői tulajdonságok összegződése „a tudomány csak eljárás, nem maga az igazság” Alkalmazott tudomány fizikai nyomok és anyagmaradványok vizsgálata molekuláris genetikai technikák objektív alkalmazásával, ezáltal igazolva az adott bűncselekményt illetve az azzal fennálló kapcsolatot eszköz, melynek segítségével a kriminalisztikai hipotézisek megerősíthetők avagy elvethetők Kölcsönös befolyás az alaptudományokra molekuláris genetikai módszerek alkalmazása, módosítása alaptudományokkal kapcsolatos követelmények módosítása új tudományos adatok szolgáltatása gazdasági, társadalmi fejlődésére, közösségekre és a mindennapok emberére gyakorolt hatások Szakkérdések Humán vonatkozások bűncselekmények emberölés, rablás, erőszakos közösülés vitatott szülőség

leszármazás rendkívüli halál rendkívüli szívhalál (SCD) arrhythmiás szívhalál szindróma hirtelen csecsemőhalál (SIDS) tömegszerencsétlenségek áldozatok azonosítása Szakkérdések Nem humán vonatkozások állatok kutyák, macskák, vadvilág állatkínzás, állat támadások, vadorzás entomologia halál időpontja, helye növények és gombák levelek, magvak pollenek Mikrobák talajbaktériumok Genetikai polimorfizmusok analízise Recesszív gén hőmérséklet szenzitív expressziója TYR gén ► tirozináz enzim ► melanin szintézis Defektív tirozináz ► funkcióvesztés normál testhőmérsékleten Első lépés - a helyszín „CSIUniversity ☺” Vizsgálati komplexitás - „DNA investigation” Azonosítás – identifikáció Eredet meghatározása - honnan származik az eredmény? Azonosságok megállapítása – közös eredet – individualizáció sejtmagi és mitokondriális DNS Bármilyen biológiai anyagból

és anyagmaradványból történhet Mennyiségi korlátok – vizsgálhatóság, reprodukálhatóság, igazolhatóság Minőségi korlátok – minőségromlás, degradálódás, bomlás, szennyezettség, felülszennyezettség Reakció komplexitás – sztochasztika Genetikai komplexitás - pigmentáció Követelmények Az igazságügyi genetikai vizsgálatok nem tudományos kísérletek, hanem tudományos módszerekkel végzett analízisek Érzékenység, megbízhatóság, ismételhetőség, ellenőrizhetőség és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg Technológia, módszertan Tudományos kritériumok, statisztika Etikai kritériumok Felelősség Minőségirányítás A kiindulás Humán és nonhumán DNS Sejtmagi DNS Autoszómák Repetitive markerek (VNTR, STR) Single nucleotide polymorphisms (SNP) Ivari kromoszómák Repetitive markerek (VNTR, STR) Single nucleotide polymorphisms (SNP) Mitokondriális DNS Cytochrome (b) Kontroll régió (HVI, HVII, CR)

SNP Mérföldkövek Landsteiner Jeffreys Mullis PCR Short Tandem Repeats (STRs) Fluoreszcens festék AATG AATG AATG 7 repetíció 8 repetíció A flanking régiók (ahol a PCR primerek kötnek) konstans, a repetitív régió variabilis a mintákban Homozigota = mindkét allél egyforma hosszú Heterozigota = különböző allélhosszak A primerek pozíciója meghatározza a PCR termék méretét Elválasztás és detektálás Jelölt DNA fragmens (PCR termék) Kapilláris vagy gél Fluoreszcens detektálás Minta detektálás Méretszeparálás Ar+ LASER CCD Panel (488 nm) Szín szerinti szeparálás Detektálási régió Fluoreszcencia ABI Prism spectrograph A laboratóriumban Short Tandem Repeats (STRs) 13 STR lokusz kromoszómális pozíciója TPOX D3S1358 D8S1179 D5S818 FGA CSF1PO TH01 VWA D7S820 AMEL D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 AMEL Személyazonosító vizsgálat-multiplex STR AmpFlSTR® SGM Plus™ kit Két eltérő

személy amelogenin D19 D3 Allélméret (bp) D8 TH01 VWA D21 D16 D18 D2 FGA véletlenszerű egyezés esélye: ~1 a 3 milliárdhoz amelogenin D3 Gombostűfejnyi vérfoltból kb. 5 óra elteltével nyert eredmény D19 D8 VWA TH01 D16 D21 FGA D18 10 STR és a biológiai nem egyidejű vizsgálata D2 9 autoszómás lokusz 15 autoszómás lókusz mondjuk, egy szúnyogból ? Ez itt én vagyok !!! Növekvő Növekvő jelentőség jelentőség -- Y-kromoszóma Y-kromoszóma Y http://www.ncbinlmnihgov/genome/guide/ Human Genome STR lokuszok DYS19 DYS389I/II DYS390 DYS391 DYS392 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DYS393 DYS385 YCAII DYS437 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y DYS438 DYS439 17 Y-kromoszómás lokusz - haplotípus Beszédes boríték brutálisan meggyilkolt áldozat ellentmondó vallomás egyszerű személyiség „nem én voltam ” kevés információ, sok kétség boríték a helyszínen sejtmagi DNS vizsgálat Az

ujjnyomat Az ujjnyomat - eredmények autoszómális Y-STR lókuszok lókuszok származás Egy-nukleotid polimorfizmusok (SNP’s) Több millió SNP a genomban kb. 500-1000 bázispáronként pontmutációk génekben és/vagy regulátor régiókban Fenotípus kapcsolatok pigmentáció, testalkat, Leszármazási vonalak (Y-SNP’s) Diagnosztika multifaktoriális poligénes betegségek SNaPshotTM Multiplex Kit: egy bázis extenzió Különböző hosszúságú farokkal tervezett primerek Primer T T C A C A G Templát G Primer extenzió és termináció A T A T G C T A G C T A C G Elektroforézis C G Szín = genotípus Hossz = lókusz Automatikus analízis A mitokondriális genom cirkuláris DNS Cambridge Referencia Szekvencia ~ ezer kópia sejtenként nincs hiszton asszociáció magas mutációs ráta D-loop esetében ~ 9000 év alatt 1% oxidáló szabadgyök érzékenység betegségek, öregedés nincs excíziós repair-rendszer nem javítódik,

csak szelektálódik palacknyak hatás heteroplazmia rekombináció egy mitokondriumon belül, nukleáris DNS-re jellemző rekombinációs variancia nincs kizárólag anyai öröklődésű öröklődése földrajzilag determinált a nem kódoló szakaszok mutációinak rögzülése és maternális öröklődése lehetőséget ad a populációk geológiai eredet szerinti elkülönítésére A kontroll régió 16024 16365 73 HV2 HV1 16024 340 Kontroll Régió (D-loop) OH 12S rRNS cyt b ND6 ND1 „16 569” bp OL ND4 Kontroll Régió (CR) – D(isplacement)-loop ~1120 bp replikációs origó hipervariábilis szakaszok 16S rRNS 1/16569 ND5 576 ND2 HV1, HV2 és HV3 alacsony szelekciós nyomás a variációk forrása csak mutáció Szekvencia-adatbázisok ND4L EMPOP ND3 COI COIII ATP6 ATP8 COII Igazságügyi szempontok A mtDNS egyedi azonosításra kevésbé alkalmas, mint a nuDNS Nem az egyént, hanem az anyai leszármazási haplotípust identifikálja

Ugyanakkor A diverzitás mértéke miatt nagy a valószínűsége annak, hogy két véletlenül kiválasztott személy különböző mtDNS haplotípussal rendelkezik Populációtól függetlenül ez az érték általában 95 % valószínűség fölött van Új minták esetén kb. 2/3 része a mintáknak új haplotípust mutat Csak kevés ún. “közönséges” gyakori haplotípus van, melyek gyakorisága több mint 1% Több ezer haplotípus figyelhető meg, emiatt a haplotípusok relatív gyakorisága alacsony Terminális (Sanger-féle) szekvenálás dNTP és ddNTP eltérő fragmenshossz jelölt primerek vagy jelölt nukleotidok dideoxi inhibits ! D-loop szekvencia – anyai leszármazási vonal azonosításának igazságügyi eszköze A vizsgált minták mtDNS szekvenciáját a referenciaként használt CRS-hoz illesztjük (pl. 16071-16140) A referencia szekvenciától való eltérések pozíciója és nukleotidja megadja az adott minta mtDNS haplotípusát Bizonyíték

(Q) Összehasonlító (R) 16093C 16129A 16093C 16129A A haplotípusok Leszármazás 3 AFRIKAI - 9 EURÓPAI - 7 ÁZSIAI FŐ HAPLOCSOPORT Eseti alkalmazás 2004 – házaspár eltűnése használati tárgyak, fésű, fogkefe, sapka, pohár 2006 – NN férfi holttest emberölés gépkocsiból hajszál-töredék morfológiai hasonlatosság a fésű hajszálaival 2007 – koponya, állkapocs 2008 – összehasonlító minták ♀ gyermek és ♂ testvér Kié a koponya és a hajszál töredék? Koponya maradvány fésű csont hajszál gyermek testvér Eredmények Eredmények kizárás A cytochrome b gén 14747 15886 pozíció (1140 bázispár) cytochrome b-c1 komplex kódoló szekvencia: - kisebb mutációs ráta - szinonim mutációk Genetikai drift - fajok közötti szekvenciális különbségek Filogenetikai analízisek A cytochrome b gén mint a fajazonosítás igazságügyi eszköze 14747 15886 pozíció (1140 bázispár) PCR: 358 bp

szakasz Átlagos eltérés kb. 15-20% SNP a cytochrome b génben (Canis f.) A vélemény Szakértői válasz – kiértékelés Populáció genetika Reprezentatív populáció Statisztikai genetika Származás Leszármazás, rokonság Téves vélemények Technikai okok Kontamináció, inkompatibilitás Személyi okok Jártasság Bayes-féle hipotézis tesztelés Vád hipotézise (Hp): Pl.: A helyszínen talált vérnyom XY-tól származott Védelem ellenhipotézise (Hd): Pl.: A vérnyom az adott népességből véletlenszerűen kiválasztott másik, NN személytől származott Bayes-formula (valószínűségi tesztelés) Pr(H p I) Pr(H d I) × Pr(E H p , I) Pr(E H d , I) = Pr(H p E, I) Pr: valószínűség Pr(H d E, I) E: bizonyíték a posteriori a priori valószínűségi valószínűségi valószínűségi hányados hányados (genetikai bizonyíték) hányados (PoPR) (PrPR) I: információ H: hipotézis p: ügyész d: ügyvéd A valószínűségi

hányados Ha a biológiai nyom egy személytől származott, és a laboratóriumi hiba kizárt, Pr(E|Hp,I)=1. Pr(E Hp, I) 1 1 = ≈ LR = Pr(E Hd, I) Pr(G c G s , Hd , I) Pr(G c Hd , I) Egyezési valószínűség Profilgyakoriság Pr: valószínűség E: bizonyíték G: genetikai profil I: információ H: hipotézis p: ügyész d: ügyvéd c: helyszín s: gyanúsított A valószínűségi hányados – legegyszerűbb formájában – a genetikai-profil előfordulási gyakoriságának reciprokával egyezik meg. Köszönöm a figyelmet! Genetikailag módosított karácsonyfa, Amboy, CA