Kémia | Biokémia » Buforin II antimikrobiális peptid heterológ expressziója és tisztítása

Orvostudományi Értesítő Bulletin of Medical Sciences www.orvtudertro Buforin II antimikrobiális peptid heterológ expressziója és tisztítása Boda Ferenc-András1, Szabó Zoltán-István2, Szőcs Erika3, Salamon Pál4, Orbán Csongor4, Székely Edit5 1Marosvásárhelyi Orvosi, Gyógyszerészeti, Tudomány- és Technológiai Egyetem, Általános és Szervetlen Kémia Tanszék 2Marosvásárhelyi Orvosi, Gyógyszerészeti, Tudomány- és Technológiai Egyetem, Ipari Gyógyszerészet és Gyógyszerészeti Menedzsment 3Sapientia Erdélyi Magyar Tudományegyetem, Csíkszeredai Kar, Génsebészet Szak 4Sapientia Erdélyi Magyar Tudományegyetem, Csíkszeredai Kar, Biomérnöki Tanszék 5Marosvásárhelyi Orvosi, Gyógyszerészeti, Tudomány- és Technológiai Egyetem, Mikrobiológiai Tanszék AUTHOR AFFILIATION 1University of Medicine, Pharmacy, Science and Technology of Târgu Mureș, Department of General and Inorganic Chemistry 2University of Medicine, Pharmacy, Science and

Technology of Târgu Mureș, Department of Pharmaceutical Industry and Management 3Sapientia Hungarian University of Transylvania, Faculty of Economics, Socio-Human Sciences and Engineering, Miercurea Ciuc, Genetic Engineering specialty 4Sapientia Hungarian University of Transylvania, Faculty of Economics, Socio-Human Sciences and Engineering, Miercurea Ciuc, Department of Bioengineering 5University of Medicine, Pharmacy, Sciences and Technology of Târgu Mureș, Department of Microbiology CORRESPONDING AUTHOR Zoltán-István Szabó University of Medicine, Pharmacy, Science and Technology of Târgu Mureș, Department of Pharmaceutical Industry and Management Gheorghe Marinescu Street, No. 38, 540139 Tîrgu Mureș, România Email: zoltan.szabo@umfstro Heterologous Expression and Purification of the Antimicrobial Peptide Buforin II ABSTRACT Antimicrobial peptides are natural substances that have played a role in the development of the adaptive immune system, and are currently involved

in the prevention of infections, through their direct antimicrobial and immunomodulatory properties. While the amino acid composition and spatial structure vary, most antibacterial peptides have a positive surface charge, which allows them to bind to the negative bacterial membranes. Buforin II is a widely studied antimicrobial peptide first obtained through the structural modification of buforin I, a peptide isolated from Bufo gargarizans. The peptide showed significant antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacterial strains. The mechanism of action of buforin II differs from that of other antimicrobial peptides, as it binds directly to bacterial DNA and RNA. The aim of our study was to obtain recombinant buforin II with a ubiquitin fusion partner, through heterologous expression in Escherichia coli Rosetta™ (DE3)pLysS cells, using a laboratory scale bioreactor. The incubation of expression host cells in a bioreactor allowed the constant monitoring and

control of the process parameters, leading to high biomass levels and an increased production rate of the peptide. The parameters used during incubation were: 37°C, pH=69 and dissolved oxygen level above 40%. Purification of the recombinant protein was accomplished by affinity chromatography using a Ni-chelate solid phase to which the 10xHistag of our construct showed affinity. Method optimisation consisted in the use of gradient and linear elution, of which the latter was found to be more effective. Digestion of the fusion partner from the target peptide was performed with ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase enzyme The expression and purification protocols developed in our experiment allow the production of a significant amount of buforin II, allowing its use for further research. Furthermore, the presented methods could be suitable for industrial production of the recombinant peptide. Keywords: buforin II, heterologous expression, antimicrobial peptide, AMP KIVONAT DOI:

10.2478/orvtudert-2019-0010 Az antimikrobiális peptidek természetes eredetű anyagok, melyek az evolúció során az adaptív immunrendszer kialakulásában játszottak szerepet, Orvostudományi Értesítő 2019, 92(2): 119-125 119 Orvostudományi Értesítő  ugyanakkor jelenleg is részt vesznek a fertőzések megakadályozásában, mind a direkt antimikrobiális, mind az immunmoduláló tulajdonságaik révén. Az antimikrobiális peptidek aminosav összetétele és térszerkezete változó, többségük pozitív felszíni töltéssel bír, ami lehetővé teszi a kórokozók negatív sejtmembránjához való kötődésüket. A buforin II egy átfogóan tanulmányozott antimikrobiális peptid, melyet először a Bufo gargarizans békafajból izolált buforin I peptid szerkezetmódosításával állítottak elő. A peptid jelentős antibakteriális hatást mutatott Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben. Hatástani szempontból a buforin II eltér más

antimikrobiális peptidtől, mivel közvetlenül a bakteriális DNS-hez és RNS-hez való kötődés által fejti ki hatását. Kutatásunk célja a buforin II antimikrobiális peptid nagy mennyiségben történő expressziója Escherichia coli Rosetta™ (DE3)pLysS sejtvonalban, ubiquitin fúziós partnerrel ellátva, laborszintű bioreaktor felhasználásával. A BUFII UBIQ His konstrukció kialakítása során figyelembe vettük a kiválasztott expressziós gazdasejtekkel való kompatibilitást, valamint a tervezett tisztítási eljárás követelményeit. A gazdasejtek bioreaktorban történő növelése lehetővé tette a folyamat paramétereinek állandó ellenőrzését és irányítását, ezáltal egy magas bio- massza szint és fehérje termelődési arány elérését. A sejttenyészet növeléséhez alkalmazott paraméterek: 37 °C, 6,9-es pH, 40% fölötti oldott oxigén szint. Az expressziót követően a rekombináns fehérje tisztítását affinitás kromatográfiával

valósítottuk meg, szilárd fázishoz kötött Ni-kelát segítségével. Ennek érdekében a konstrukciónk egy 10xHis-címkét is tartalmazott. Az eluálás optimalizálása során egyaránt alkalmaztunk lépcsős gradienssel, valamint lineáris gradienssel történő elválasztást. Ezek közül a lineáris elúció alkalmazásával sikerült a BUFII UBIQ His fehérjét megfelelően tisztított állapotban elkülöníteni Az ubiquitin fúziós partner emésztése a célpeptidről ubiquitin karboxil-terminális hidroláz enzimmel történt. A kísérletünk során kidolgozott vektorkonstrukció, expressziós és tisztítási protokollok lehetővé teszik a buforin II jelentős mennyiségben történő előállítását. Az expresszió során előállított buforin II antibakteriális peptid további kutatások alappillérét képezi. Ugyanakkor, a kidolgozott módszer alkalmas lehet a peptid ipari mértékű előállítására is. Bevezetés töltésű sejtmembránokhoz való

kötődésüket. Az AMP-k amfipatikus szerkezete tovább segíti a membránokkal történő kölcsönhatást, lipofil tulajdonságaik révén képesek kötődni, behatolni és pórusokat képezni a sejtmembránok szintjén, míg hidrofil tulajdonságaik és vízoldékonyságuk megkönnyíti a célsejtekhez való szállításukat [3,5]. Viszonylag egyszerű szerkezetük miatt az AMP-k költséghatékonyan előállíthatók vegyi folyamatok vagy rekombináns expresszió segítségével, továbbá lehetővé teszik olyan szerkezeti módosítások végrehajtását, amelyek növelik a kapott peptidek hatékonyságát és stabilitását [4,6]. Hatástani szempontból, a legtöbb AMP megbontja a sejtmembránok integritását, a lipopoliszacharid réteghez kötődve transzmembranális pórusokat képez, ami depolarizációt vált ki és a baktériumok pusztulásához vezet. Egyes AMP-k átjutnak a sejtmembránon, bekerülnek a citoplazmába és hatásukat intracelluláris célfehérjéken

fejtik ki [7] A közvetlen és gyors antibakteriális hatásukon túlmenően, az AMP-k rendelkeznek számos immunmoduláló aktivitással, melyek védik a gazdaszervezetet a kórokozók ellen. Immunmoduláló hatásuk közül említésre méltó a kemotaxis fokozása, az immunsejtek differenciálódásának modulálása, valamint a gyulladási citokinek szintézisének gátlása [8]. Szerkezeti és hatástani tulajdonságaiknak köszönhetően az AMP-k ígéretes terápiás alternatívát jelenthetnek a hagyományos antibakteriális hatóanyagok mellett. A multirezisztens kórokozók gyors ütemben történő elterjedése jelentős kihívást jelent a gyakorló orvosok, gyógyszerészek számára. Figyelembe véve, hogy a rendelkezésre álló antibiotikumok száma korlátozott, továbbá, hogy ezek hatásmechanizmusa gyakran hasonló, szükségessé vált új és hatékony antimikrobiális anyagok azonosítása és előállítása. Mivel a szintetikus antibiotikumok kifejlesztése

egy költséges és időigényes folyamat, ezért előtérbe kerültek a természetes eredetű, antimikrobiális hatású anyagok, melyek közül kiemelt jelentőséggel bírnak az antimikrobiális peptidek (AMP) [1,2]. Az AMP-k jelenlétét számos organizmusban kimutatták, többek között prokariótákban, növényekben, rovarokban, gerincesekben és emberben is [3]. Eredeti szerepük a fertőzések elleni védekezésben volt, az adaptív immunrendszer kialakulása előtt. Ugyanakkor jelenleg is fontos szerepük van a fertőzések megakadályozásában, részben a direkt antimikrobiális hatásuk, részben az immunmoduláló tulajdonságuk révén [4]. Noha az AMP-k tanulmányozása elsősorban az antibakteriális hatásukat célozta, nem elhanyagolható egyes AMP-k hatása vírusokra, gombákra és parazitákra sem [5]. Szerkezeti szempontból az AMP-k 5-100 aminosavból alkotott fehérje láncok. Aminosav összetételük és térszerkezetük változó, azonban többségük

pozitív felszíni töltéssel rendelkezik, ami lehetővé teszi a negatív 120 Kulcsszavak: buforin II, heterológ expresszió, antimikrobiális peptid, AMP Orvostudományi Értesítő  A jelenleg is zajló klinikai vizsgálatok olyan betegségek kezelésében alkalmaznak AMP-ket, mint a Gram-pozitív baktériumok (Clostridium difficile, methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus) okozta fertőzések, diabéteszes lábfekély, rosacea, idült bakteriális középfülgyulladás vagy körömgombásodás [9]. A buforin II egy átfogóan tanulmányozott AMP, melyet először a Bufo gargarizans békafajból izolált buforin I peptid szerkezetmódosításával állítottak elő [10]. A mindössze 21 aminosavból álló peptid jelentős antibakteriális hatást mutatott Gram-pozitív (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas putida) és Gram-negatív (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia sp.)

baktériumokkal, valamint gombákkal (Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae) szemben [10]. Más AMP-től eltérően, a buforin II nem a membrán szerkezetének roncsolásával fejti ki antibakteriális hatását, hanem közvetlenül a bakteriális DNS-hez és RNS-hez való kötődés által [11,12]. Ezen tulajdonsága miatt a buforin II és a szerkezetmódosítással előállított analógjai tumorellenes hatással is rendelkeznek [13,14]. Kutatásunk célja a buforin II antimikrobiális peptid nagy mennyiségben történő expressziója Escherichia coli Rosetta™ (DE3)pLysS sejtvonalban, ubiquitin fúziós partnerrel ellátva, laborszintű bioreaktor felhasználásával. A fúziós komplexet egy polihisztidin címke (tag) egészíti ki, lehetővé téve az expressziós termék affinitás kromatográfiával történő tisztítását. Anyag és módszer Vektorkonstrukció létrehozása A vektorkonstrukció létrehozása során pUBK vektort alkalmaztunk

(MTA-ELTE Fehérjemodellező Kutatócsoport), mely fúziós partnerként ubiquitin-t, illetve dekahisztidin címkét tartalmaz. A vektorkonstrukció tervezésére használt szoftver: SnapGene 419 A buforin II peptidet kódoló DNS szekvencia szintézisét követően, az inszert előállítása a két egyszálú oligonukleotid hibridizációjával valósult meg. A rekombináns vektor létrehozását BamHI és SacII restrikciós endonukleázok felhasználásával hajtottuk végre. A megfelelő klón kiválasztása érdekében a ligálási reakcióelegyet E. coli TOP10 (Thermo Scientific, #C404003) klónozó sejtvonalba transzformáltuk. BUFII UBIQ His expresszió A BUFII UBIQ His fehérje expresssziójára E. coli Rosetta™ (DE3)pLysS (Sigma-Aldrich #70956) törzset, mint proteáz-hiányos gazdasejtet használtunk. A rekombináns fehérje nagy mennyiségben való termelését 1 literes Sartorius Biostat®A Plus bioreaktorban valósítottuk meg. A fermentáció körülményeinek

vezérlését BioPAT®MFCS/DA Supervisory Control szoftverrel végeztük. A bioreaktort 0,7 L 2YT táplevessel (16 g/L Tripton, 10 g/L élesztő kivonat, 5 g/L NaCl) töltöttük fel, majd a teljes rendszert autoklávban sterilizáltuk (120 °C, 20 perc). A fermentáció paraméterei: 400 RPM, 37 °C, pH=6,9. A rendszer stabilizálódása után a reaktorba oltottuk az expressziós pUBK BUFII vektort tartalmazó sejteket, majd a sejttenyészetet 37 °C-on, 6,9-es pH-n és 40% fölötti oldott oxigén szint mellett növesztettük az OD=26 optikai denzitás eléréséig. Az optikai denzitás mérése CamSpec M330 UV-VIS spektrofotométerrel történt. A fehérje expressziót izopropil-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) indukáltuk, 1 mM végső koncentrációban. A fehérje expresszió 37 °C-on, 4 órán át zajlott A sejtek begyűjtését centrifugálással (12000xg, 10 perc, 4 °C, Sorvall LYNX 6000 Ultracentrifuga), feltárásukat Microfluidizer LM10 műszerrel végeztük. A feltáráshoz

használt lízis puffer összetétele: 20 mM Tris-HCl (pH=8), 250 mM NaCl, 2 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF), 1X proteáz inhibitor (Thermo Scientific). A feltárás során nyert kivonatot centrifugáltuk (60000xg, 60 perc, 4 °C, Sorvall LYNX 6000 Ultracentrifuga) a sejttörmelék eltávolításának érdekében. BUFII UBIQ His fehérje tisztítása Az affinitás kromatográfiás tisztítás 5 mL-es HisTrap (GE Healthcare) oszlopon történt, AKTA FPLC készüléken. A rendszer vezérlését és az adatgyűjtést UNICORN 5.11 szoftverrel végeztük. A mosó puffer összetétele: 20 mM Tris-HCl (pH=8), 250 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 20 mM imidazol; az eluciós puffer összetétele: 20 mM Tris-HCl (pH=8), 250 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 500 mM imidazol. Az alkalmazott tisztítási paraméterek a következők: 1 mL/perc áramlási sebesség, 1 mL frakció. Az eluálás során lépcsős gradienssel történő elválasztást, valamint lineáris

gradienssel történő elválasztást alkalmaztunk. A tisztítás során kapott fehérje oldatot dialízisnek vetettük alá, mely 24 órán keresztül tartott, 4 ºC-on, kevertetve, a következő pufferben: 20 mM TrisHCl (pH=8), 250 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM PMSF. 121 Orvostudományi Értesítő  1. ábra BUFII UBIQ His DNS konstrukció (A konstrukció ábrája SnapGene® 113 szoftver használatával készült) Ubiquitin fúziós partner leemésztése a célpeptidről A célpeptidet ubiquitin karboxil-terminális hidroláz (YUH1) enzimmel emésztettük le az ubiquitin fúziós partnerről. Az emésztés végtermékét a fúziós partnert és YUH1 enzimet tartalmazó reakcióelegyből egy 5 mL-es HisTrap (GE Healthcare) oszlopon, AKTA FPLC készüléken izoláltuk (a tisztítás körülményei megegyeznek az előző tisztítás paramétereivel). Eredmények és megbeszélés Vektorkonstrukció létrehozása A BUFII UBIQ His konstrukció kialakítása során figyelembe vettük a

kiválasztott expressziós gazdasejtekkel való kompatibilitást, valamint a tervezett tisztítási eljárás követelményeit. A tervezett DNS konstrukció az 1 ábrán látható. A kódoló szekvencia beillesztése pUBK vektorba történt, BamHI és SacII restrikciós endonukleázok fel- használásával. A kapott pUBK BUFII plazmid elméleti felépítését, a vektorkonstrukció releváns elemeivel a 2. ábra tartalmazza A konstrukció megfelelő beépülésének gyors ellenőrzése érdekében restrikciós endonukleázzal emésztést végeztünk a ligálási reakcióeleggyel transzformált E. coli TOP10 sejtekből izolált vektorokra A restrikciós emésztés agaróz-gélelektroforézis eredményét a 3. ábra tartalmazza A prokarióta gazdasejt (E. coli Rosetta™ (DE3)pLysS) kiválasztása korábbi kutatásaink eredményein alapult, amelyek során a gazdasejtek egyaránt megfelelőnek bizonyultak humán és állati eredetű fehérjék expressziójára [15,16]. A 20-50 aminosavat

tartalmazó peptidek szintézisénél előfordulhat, hogy nem vesznek fel megfelelő konformációt, valamint kevésbé állnak ellen a proteázok aktivitásának, emiatt lebomolhatnak. Ennek elkerüléséhez alkalmaztunk fúziós partnerként ubiquitint Az expressziót követően, a rekombináns fehérje tisztítását affinitás kromatográfiával valósítottuk meg, szilárd fázishoz kötött Ni-kelát segítségével. Ennek érdekében a konstrukciónk egy 10xHis-címkét is tartalmazott. BUFII UBIQ His expresszió A gazdasejtek bioreaktorban történő növelése lehetővé tette a folyamat paramétereinek állandó ellenőrzését és irányítását, ezáltal egy magas biomassza szint és fehérje termelődési arány elérését. A sejttenyészet növelésének paraméterei: 37 °C, 6,9-es pH, 40% fölötti oldott oxigén szint mellett. Az expresszió során követtük az optikai sűrűség változását, amelyet a 4. ábra tartalmazza 2. ábra A pUBK BUFII vektor térképe

(A vektorkonstrukció ábrája SnapGene® 1.13 szoftver használatával készült). 122 BUFII UBIQ His fehérje tisztítása A BUFII UBIQ His fehérje tisztítására egylépéses elválasztási technikát alkalmaztunk. A Ni2+ affinitás kromatográfiás tisztítást 5 mL-es HisTrap (GE Healthcare) oszlopon végeztük, optimalizált pufferrendszer használatával. Az eluálás optimalizálásának érdekében egyaránt alkalmaztunk lépcsős gradienssel történő elválasztást, valamint lineáris gradienssel történő elválasztást. Ezek közül a lineáris elúció alkalmazásával sikerült a BUFII Orvostudományi Értesítő  UBIQ His fehérjét megfelelően tisztított állapotban elkülöníteni. Az eluálás során vett mintákból futtatott SDSPAGE eredményét az 5 ábra tartalmazza Ubiquitin fúziós partner leemésztése a célpeptidről Az ubiquitin fúziós partner emésztése a célpeptidről ubiquitin karboxil-terminális hidroláz (YUH1) enzimmel

történt. Tekintettel arra, hogy a YUH1 enzim és a lehasított ubiquitin is rendelkezik polihisztidin címkével, a buforin II célpeptid egy újabb affinitás kromatográfiás tisztítással elválasztható a fúziós partnertől és az emésztőenzimtől. Mivel a lehasított célpeptid már nem rendelkezik polihisztidin címkével, ezért nem mutat affinitást az oszlop állófázisa iránt és az átfolyóban lesz megtalálható. Az átfolyóból Qubit 20 fluoriméterrel (Thermo Scientific) mértük a peptid koncentrációját. A fúziós partner sikeres emésztését a célpeptidről poliakrilamid gélelektroforézis segítségével igazoltuk (6. ábra). A 6 ábra 3 jelzésű mintája tartalmazza a BUFII UBIQ His rekombináns fehérjét. A 4 minta a YUH1 emésztő enzimet és a leemésztett ubiquitint tartalmazza. A buforin II peptid jelenléte, kis mérete miatt nem mutatható ki az alkalmazott Tris-glicin SDS-PAGE módszerrel. Összehasonlítás más expressziós módszerrel

Az általunk kidolgozott módszer célja a buforin II természetes peptid előállítása heterológ expresszió segítségével. Módszerünk hasonlóságot mutat a Wang és mtsai 3. ábra A restrikciós emésztés eredménye Az emésztés során keletkezett fragmentumok hossza a 3. és 4 minta restrikciós enzimmel való emésztés esetében megfeleltek a várt méreteknek. (M - GeneRuler 1 kb Plus, Sigma-Aldrich) 4. ábra A száraz sejttömeg és az optikai sűrűség alakulása a fermentáció során 123 Orvostudományi Értesítő  A két módszer között a legjelentősebb eltérést a felhasznált fúziós partner típusa adja. Míg az általunk kidolgozott eljáráshoz ubiquitin fúziós partnert alkalmaztunk, a Wang és mtsai által alkalmazott módszer tioredoxint (Trx) használt. Továbbá, az általunk alkalmazott IPTG helyett, a buforin IIb expresszióját laktózzal indukálták. Következtetések 5. ábra A fúziós fehérje Ni2+ affinitás kromatográfiával

való tisztítása utáni minták SDS-PAGE ellenőrzése: (1) – Molekulasúly-marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Thermo Scientific), (1-8) Lineáris gradiens elúcióval kapott minták, (9-10) Lépcsős gradiens elúcióval kapott minták. [17] által kidolgozott eljárással, melynek célja a buforin IIb, a buforin II szintetikus analógjának előállítása. Ezen hasonlóságok között megemlíthető az E. coli Rosetta™ (DE3)pLysS sejtek használata, mint prokarióta gazdasejt, fúziós partner alkalmazása az expresszió során, valamint Ni2+ affinitáson alapuló kromatográfiás eljárás használata az expresszált fehérje tisztítására. A kapott eredményeink alapján kijelenthető, hogy az ubiquitin fúziós fehérje alkalmas a célpeptidünk bioszintézisének kivitelezésére, elhárítva a kisméretű peptid expresszió során felmerülő lehetséges akadályokat. Ugyanakkor a célpeptid megfelelő hozamához vezet a megfelelő tisztítási protokoll

alkalmazásával. A kísérletünk során kidolgozott vektorkonstrukció, expressziós és tisztítási protokollok lehetővé teszik a buforin II célpeptid jelentős mennyiségben történő előállítását. Az expresszió során előállított buforin II antibakteriális peptid további kutatások alappillérét képezi Köszönetnyilvánítás Jelen kutatás a Studium-Prospero Alapítvány és a Magyar Tudományos Akadémia által meghirdetett kutatási pályázat támogatásával valósult meg (szerződésszám 139/26.012017) BFA az Erdélyi Múzeum-Egyesület Orvos- és Gyógyszerésztudományi Szakosztálya által meghirdetett Kutatási ösztöndíj 2018 pályázatban részesült (szerződésszám 300/2018). Rövidítések jegyzéke AMP – antimikrobiális peptid DTT – ditiotreitol FPLC – fast protein liquid chromatography IPTG - izopropil-tiogalaktopiranozid OD – optical density (optikai sűrűség) PMSF - fenil-metil-szulfonil-fluorid 6. ábra Az ubiquitin fúziós

partner emésztése előtt és után vett minták Tris-glicin SDS-PAGE ellenőrzése. (1) – Ubiquitin karboxil-terminális hidroláz enzim, (2) – molekulasúly marker (peqGOLD II, VWR), (3) – Emésztés előtti minta, (4) – Emésztés reakcióelegye. 124 Orvostudományi Értesítő  Irodalom 1. Mahlapuu M, Håkansson J, Ringstad L, Björn C Antimicrobial Peptides: An Emerging Category of Therapeutic Agents. Front Cell Infect Microbiol. 2016;6:194 2. Zhang L-J, Gallo RL Antimicrobial peptides Curr Biol 2016 Jan 11;26(1):R14-9. 3. Bahar A, Ren D, Bahar AA, Ren D Antimicrobial Peptides Pharmaceuticals. 2013 Nov 28;6(12):1543–75 4. Fjell CD, Hiss JA, Hancock REW, Schneider G Designing antimicrobial peptides: Form follows function. Nat Rev Drug Discov. 2012;11:37–51 5. Lakshmaiah Narayana J, Chen JY Antimicrobial peptides: Possible anti-infective agents. Peptides 2015;72:88–94 6. Li Y, Xiang Q, Zhang Q, Huang Y, Su Z Overview on the recent study of antimicrobial

peptides: origins, functions, relative mechanisms and application. Peptides 2012;37:207–15 7. Hancock REW, Sahl H-G Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nat Biotechnol. 2006;24(12):1551–7 8. Kosikowska P, Lesner A Antimicrobial peptides (AMPs) as drug candidates: a patent review (2003–2015). Expert Opin Ther Pat. 2016;26(6):689–702 9. Fox JL Antimicrobial peptides stage a comeback Nat Biotechnol. 2013;31(5):379–82 10. Park CB, Kim MS, Kim SC A novel antimicrobial peptide from Bufo bufo gargarizans. Biochem Biophys Res Commun 1996;218:408–13. 11. Park CB, Kim HS, Kim SC Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochem Biophys Res Commun 1998;244:253–7 12. Uyterhoeven ET, Butler CH, Ko D, Elmore DE Investigating the nucleic acid interactions and antimicrobial mechanism of buforin II. FEBS Lett

2008;582:1715–8 13. Lee HS, Park CB, Kim JM, Jang SA, Park IY, Kim MS, et al Mechanism of anticancer activity of buforin IIb, a histone H2A-derived peptide. Cancer Lett 2008;271:47–55 14. Marqus S, Pirogova E, Piva TJ Evaluation of the use of therapeutic peptides for cancer treatment J Biomed Sci 2017;24:21 15. Salamon P, Miklóssy I, Albert B, Korodi M, Nagy K, Bakos I, et al. Heterologous Expression and Purification of Recombinant Proapoptotic Human Protein Smac/Diablo with EGFP as Fusion Partner. Stud Univ Babeș-Bolyai Chem 2017 Jun;62(2):333–45. 16. Boda FA, Salamon P, Orbán C, Berta L, Curticăpean A, Gâz Șerban A, et al. Heterologous expression and purification of recombinant crotoxin B, the phospholipase A2 subunit of crotoxin. Stud Univ Babes-Bolyai Chem 2018; 17. Wang Q, Zhu F, Xin Y, Liu J, Luo L, Yin Z Expression and purification of antimicrobial peptide buforin IIb in Escherichia coli. Biotechnol Lett 2011;33:2121–6 125