Medical knowledge | Neurology » Varju Patrícia - Kismolekulájú klasszikus neurotranszmitterek a korai idegi elköteleződés során

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Idegtudományi Program Kismolekulájú „klasszikus” neurotranszmitterek a korai idegi elköteleződés során: a glutaminsav és GABA rendszer vizsgálatai a neuronképzés folyamataiban, in vitro doktori (PhD) értekezés Varju Patrícia Témavezető: Dr Madarász Emília Készült a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutató Intézetében Budapest, 2002 1 Kismolekulájú „klasszikus” neurotranszmitterek a korai idegi elköteleződés során: a glutaminsav és GABA rendszer vizsgálatai a neuronképzés folyamataiban, in vitro Készítette:Varju Patrícia Témavezető: Dr Madarász Emília Készült a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutató Intézetében Budapest, 2002 ÖSSZEFOGLALÁS A felnőtt idegrendszerben a glutaminsav és a GABA az idegsejtek közötti kommunikáció kémiai mediátorai. Bebizonyosodott, hogy az idegrendszer korai fejlődése során ezek a neurotranszmitterek

befolyásolják a neurális progenitor sejtek osztódását és differenciációját, hatást gyakorolnak a fiatal neuronok nyúlványosodására, migrációjára és fontos szerepet játszanak a szinaptogenezisben is. A neuroektoderma sejtekben lezajló differenciálódás in vitro vizsgálatát olyan sejtvonalak megalapítása tette lehetővé, melyek korlátlan osztódóképességük mellett megőrzik neurális fejlődési potenciáljukat. Laboratóriumunk munkatársai transzgenikus, p53–deficiens, 9 napos egérembrió elő- és középagyhólyagjából izoláltak immortalizált neuroepiteliális progenitor sejtvonalakat, melyek közül az eddig még nem jellemzett NE-7C2 sejtvonallal kezdtem el dolgozni. Az NE-7C2 sejtvonal korai fejlődési állapotot reprezentáló neurális progenitor sejtekből áll, amelyek all-trans retinsav (ATRA) hatására jól meghatározott lépéseken keresztül idegi irányba differenciálódnak. Munkám célja az volt, hogy az in vitro neurogenezis

jellemző stádiumaiban meghatározzam a glutaminsav hatásait közvetítő ionotróp receptorok megjelenését és lehetséges szerepét az idegi elköteleződés során, továbbá hogy feltérképezzem a glutaminsav - GABA átalakulásért felelős enzimcsalád, a glutaminsav dekarboxiláz (GAD) embrionális és felnőtt formáinak expressziós mintázatát, tanulmányozzam az idegsejt-fenotípus kialakításában esetlegesen betöltött szerepüket. Kísérleteim során molekuláris biológiai, biokémiai és immuncitokémai módszerekkel meghatároztam az AMPA és NMDA receptor alegységek expressziós mintázatát és sejtes lokalizációját, valamint vizsgáltam a funkcionális receptorok megjelenését és szerepét az in vitro neurogenezis alatt. Az embrionális ill felnőtt GAD mRNS- és fehérje-formák expressziós mintázatát és sejtes lokalizációját molekuláris valamint sejtbiológiai módszerekkel jellemeztem az in vitro idegsejt-képzés folyamán.

Immuncitokémiai vizsgálatokkal azonosítottam az in vitro differenciáció során megjelenő GABA-t tartalmazó sejteket és vizsgáltam a GABA sejten belüli eloszlását . Eredményeim megmutatták, hogy az NE-7C2 sejtek neurális differenciációja során a glutaminsav ionotróp receptorokon át képes befolyásolni a progenitorok osztódását és a fiatal neuronok nyúlványosodást. A GABA szintéziséért felelős GAD enzimek embrionális formái a korai idegi elköteleződési folyamatokban juthatnak szerephez, míg a felnőtt formák a neuronok érése során expresszálódnak. 2 Glutamic acid and GABA in the early stages of neurogenesis: studies in the course of in vitro neural cell fate decision Done by: Patricia Varju Supervisor: Emília Madarász PhD Institute of Experimental Medicine of Hungarian Academy of Sciences Budapest, 2002 SUMMARY In the adult nervous system glutamic acid and GABA are mediators of synaptic communication. During embryonic development these

neurotransmitters regulate mitotic division if neural progenitors and influence migration, neurite elongation and synapse formation. Continuously proliferating cell lines capable to differentiate into neural cells could serve as in vitro models for studies on neurogenesis by early embryonic neuroectoderm. Previous works from our laboratory demonstrated that immortalized neuroepithelial cell lines could be established from the anterior vesicles of 9-day-old p53-/- mouse embryos. The NE-7C2 cell line was one of the isolated p53-/- neuroectodermal clones. NE-7C2 cells represent neuroectodermal progenitors in an early developmental stage. All-trans retinoic acid treatment of NE-7C2 cells elicited the establishment first the neuronal and than the astroglial features during well-characterized developmental phases. The aim of my work was to determine the time-schedule of the appearance of ionotropic glutamate receptor subunit proteins and the fully active forms of these receptors in the

course of in vitro neuron formation and to study the expression pattern of embryonic and adult forms of glutamic acid decarboxylases (GADs) during the establishment of neuronal phenotype. Molecular biological and biochemical methods were used to describe the expression pattern of the AMPA and NMDA type glutamate receptors. The possible roles of these receptors were investigated by Ca2+-imaging techniques during the well-characterized stages of in vitro neurogenesis. The time-schedule of the expression of embryonic and adult forms of GADs were also analyzed and some possible functions of the protein isoforms have been suggested. The distribution of cells containing glutamate receptor subunit proteins or GABA was analyzed by immunocytochemical methods. The results demonstrate that the activation of ionotropic glutamate receptors can influence the neuronal cell fate determination. AMPA-gated channel activation may alter the mitotic activity of progenitors and the network formation of

young neurons, while NMDA receptor functioning gets role in later phases of neuronal cell differentiation. The increased responsiveness to glutamate indicates that both AMPA and NMDA receptor mediated activities can influence the process elongation and network formation by maturing neurons. The embryonic forms of GAD67 enzyme could play a role in early steps of neuron formation while the full-length forms were detected at the period of neuronal maturation. 3 TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÁS 2 TARTALOMJEGYZÉK 4 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 7 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS 9 I. KISMOLEKULÁJÚ NEUROTRANSZMITTEREK, MINT FEJLŐDÉSREGULÁLÓ ANYAGOK 11 I./1 A glutaminsav 12 1.1 Az AMPA-vezérelt ioncsatornák 13 1.11 Szerkezet 13 1.12 Az AMPA receptorok farmakológiai sajátosságai 15 1.2 A kainát receptorok 16 1.21 Szerkezet 16 1.22 A kainát vezérelt receptorok farmakológiai jellemzése 17 1.3 NMDA receptorok 18 1.31 Szerkezet 18 1.32 Az NMDA

receptorok farmakológiai jellemzése 21 1.4 Az ionotróp glutamát receptorok előfordulása és szerepe az idegrendszer embrionális fejlődése során 22 I./2 A GABA 24 2.1 A GABA-szintézis szabályozása: GAD formák 26 2.2 Rövidített GAD fehérjék 28 II. AZ IDEGSEJT IRÁNYÚ ELKÖTELEZŐDÉS KORAI LÉPÉSEINEK TANULMÁNYOZÁSA AZ EGYEDI SEJTEK SZINTJÉN 31 III. AZ ALL-TRANSZ RETINSAV SZEREPE AZ IDEGRENDSZER EMBRIONÁLIS FEJLŐDÉSE SORÁN 33 IV. CITOSZKELETÁLIS ÁTRENDEZŐDÉSEK A NEURONÁLIS DIFFERENCIÁCIÓ SORÁN 34 IV./1 A köztes filamentum fehérjék 35 IV./2 A mikrotubuláris rendszer 36 CÉLKITŰZÉSEK 38 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 39 I. AZ ALKALMAZOTT SEJTTENYÉSZTÉSI KÖRÜLMÉNYEK 39 I./1 Sejtek fenntartása, kezelése 39 I./2 Kromoszóma-preparátumok készítése 39 II. SZEMIKVANTITATÍV RT-PCR VIZSGÁLATOK 40 II./1 Ionotróp glutamát receptor alegységek kódoló RNS formáinak kimutatása 40 4 1.1 AMPA receptor alegységek

mRNS-einek kimutatása 41 1.2 NMDA receptor alegységek mRNS-einek kimutatása 41 II./2 GAD65 és GAD67 transzkriptumok kimutatása 41 III. WESTERN BLOT ANALÍZIS 42 III./1 Fehérjeminták készítése szubcelluláris frakcionálással 42 III./2 Fehérjetartalom meghatározása 43 III./3 Western blot 43 3.1 NMDA receptor alegység fehérjéinek kimutatása 43 3.2 GAD fehérjeformák kimutatása 44 IV. IMMUNCITOKÉMIAI VIZSGÁLATOK 45 IV./1 Neuron-és gliaspecifikus fehérjék kimutatása 45 IV./2 NMDA receptor NR1 és NR2B alegységeinek kimutatása 46 IV./3 GAD fehérjeformák kimutatása 46 V. A TENYÉSZETEK SEJT ILL IDEGSEJT-TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA 47 V./1 A tenyészetek sejtszámának meghatározása a tenyészetek életképességének mérésével 47 V./2 Idegsejtek számának meghatározása immuncitokémiával 47 V./3 Idegsejtek mennyiségi meghatározása in situ ELISA módszerrel 48 2+ VI. SEJTEN BELÜLI SZABAD CA -SZINT MEGHATÁROZÁSA

MIKROFLUORIMETRIÁVAL 49 VII. AZ EXTRACELLULÁRIS GLUTAMÁT KONCENTRÁCIÓJÁNAK FLUORIMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA SEJTEK FOLYADÉKKÖRNYEZETÉBŐL 50 2. TÁBLÁZAT 51 3. TÁBLÁZAT 52 EREDMÉNYEK 53 I. AZ NE-7C2 SEJTVONAL JELLEMZÉSE 53 I./1 Az p53 -/- NE-7C2 sejtvonal kromoszóma-készletének változása a sejtvonal immortalizációja során 53 I./2 AZ NE-7C2 sejtvonal progenitor sajátságainak meghatározása 57 II. IONOTRÓP GLUTAMÁT RECEPTOROK SZABÁLYOZOTT IDŐBELI MEGJELENÉSE AZ IN VITRO NEUROGENEZIS SORÁN 63 II./1 NMDA-vezérelt glutamát receptorok kimutatása NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során 63 1.1 NMDA receptor alegységek expressziója NE-7C2 sejtekben 63 1.2 NMDA receptor alegységek fehérjeformáinak kimutatása Western blot és immuncitokémia segítségével 67 1.3 Funkcionális NMDA-csatornák megjelenése NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során 71 5 II./2 AMPA receptorok kimutatása NE-7C2 sejtekben és szerepük a

neuronális differenciáció korai szakaszában 78 2.1 AMPA receptor alegységek expressziós mintázata NE-7C2 sejtek idegi irányú differenciációja során 78 2.2 Funkcionális Ampa-csatornák kimutatása NE-7C2 sejtek fejlődési stádiumaiban 78 2.3 Funkcionális AMPA receptorok szerepe folytonosan osztódó ill neuronális irányban differenciálódó NE-7C2 sejtekben 83 2.4 Az extracelluláris folyadék glutaminsav tartalmának vizsgálata NE-7C2 sejtek felülúszó médiumából 85 III. GLUTAMINSAV DEKARBOXILÁZ FORMÁK EXPRESSZIÓJA ÉS A GABASZINTÉZIS KAPCSOLATA NE-7C2 SEJTEK INDUKÁLT NEUROGENEZISE SORÁN 88 III./1 GAD mRNS formák expressziójának vizsgálata 88 III./2 Rövidített és teljes hosszúságú GAD fehérje-formák időbeli megjelenése NE-7C2 sejtek in vitro indukált neurogenezise során 92 III./3 GAD fehérjeformák sejtszintű lokalizációjának vizsgálata forma-specifikus ellenanyagokkal 94 III./4 NE-7C2 sejtek GABA-tartalma az in vitro

indukált neurogenezis különböző stádiumaiban 98 LEGFONTOSABB EREDMÉNYEK 100 4. TÁBLÁZAT 101 MEGBESZÉLÉS 102 I. Az NE-7C2 sejtek korai neuroektodermális fejlődési állapotot reprezentáló progenitorok 102 II. Ionotróp glutamát receptorok az in vitro indukált neurogenezis alatt 108 II./1 Sejtfelszíni NMDA receptorok a fiatal neuronok nyúlványelongációs szakaszában jelennek meg 108 II./2 Az NE-7C2 sejtek mind indukálatlan, mind indukált állapotban funkcionális AMPA receptorokat expresszálnak 112 2+ II./3 A Ca -tranziensek jelentősége az idegrendszer embrionális fejlődése során 115 III. Az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban ill az indukció korai szakaszában embrionális GAD fehérjéket expresszálnak, melyeket az érett neuronokban felvált a felnőtt GAD65 forma 118 LEGFONTOSABB KÖVETKEZTETÉSEK 123 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 124 IRODALOMJEGYZÉK 125 6 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK AET – aminoethylthioammonium bromide ATRA

– all-trans retinsav BCIP – 5-bromo-4-kloro-3-indolyl foszfát BSA – borjú szérum albumin [Ca2+]IC – intracelluláris Ca2+ -szint cDNS – komplementer DNS szál CNS – központi idegrendszer CRABP – Cellular Retinoic Acid Binding Protein DAB – DiAmino-Benzidine DMSO – dimetil-szulfoxid dNTP – dezoxinukleotid-trifoszfát E1-21 – embrionális fejlődés napjai EC – embrionális karcinóma ELISA – Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ER – endoplazmatikus retikulum ES – embrionális stem sejt FCS – fötális borjú savó FITC – Fluoreszcein IzoTioCianát GAD – glutaminsav dekarboxiláz enzim GAPDH – glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz GFAP – gliális fibrilláris savas fehérje iGluR – ionotróp glutamát receptor IP3R – inozitol trifoszfát receptor IZ – intermedier zóna KL – kortikális lemez Map – mikrotubulus asszociált fehérje MEM – Minimal Essential Medium mGluR – metabotróp glutamát receptor 7 MTT – (3–(4,5

Dimethylthiazol–2–yl)–2,5diphenyltetrazólium–bromide, NBT – nitro blue tetrazólium N-CAM – neurális sejtadhéziós molekula NFH – nehéz neurofilamentum fehérje NFL – könnyű neurofilamentum fehérje NFM – közepes neurofilamentum fehérje N-tubulin – III β-tubulin ORF – Open Reading Frame vagy nyitott leolvasási keretet P0- – posztnatális fejlődés napjai PBS – Phosphate Buffered Saline PCR – polimeráz lánc reakció PLL – poli–L–lizinnel PLP – piridoxál-foszfát RaIDH – retinal dehidrogenáz RAR – retinsav receptor RARE– Retinoic Acid Response Element RT-PCR – reverz transzkripcióval kapcsolt polimeráz lánc reakció RXR – retinoid X receptor RXRE – Retinoid X Response Element RyR – ryanodin receptor SDS – Sodium-Dodecyl Sulfate SVZ – szubventrikuláris zóna TBS – Tris-pufferelt sóoldat TM – transzmembrán VDCC - feszültségfüggő Ca2+-csatorna VZ – ventrikuláris zóna 8 BEVEZETÉS ÉS IRODALMI

ÁTTEKINTÉS A megtermékenyített petesejt által hordozott genetikai anyag kódolja mindazt az információt, ami a gerinces idegrendszert felépítő billiónyi idegsejt és gliasejt kialakításához lehetőséget ad. Azok, a minden gerinces élőlényben hasonló módon lejátszódó fejlődési folyamatok, genetikus és epigenetikus mechanizmusok, amelyek az idegsejtek nagyfokú fenotipikus variabilitását eredményezik, nagyrészt még ismeretlenek. Az embriogenezis korai szakaszában a zigótából kialakul egy háromrétegű embrió, ami magába foglalja az elsődleges germinatív rétegeket, az ektodermát, a mezodermát és az endodermát. A neurális ektoderma (velőlemez) kialakulását a mezodermális és ektodermális sorsot indukáló faktorok gátlása eredményezi. Az így kialakuló velőlemezből (1. A ábra) fejlődik ki az idegszövet A velőlemezt felépítő sejtek szaporodása és morfológiai megváltozása következtében kialakul a velőárok (1. B ábra)

és a velőlemez szélein található velősáncok egymáshoz közelednek (1. C ábra), majd összeolvadnak, kialakítva a zárt velőcsövet (1. D és E ábra) Ezzel egyidőben a velőlemez szélein található sejtek leválnak a velőcsőről és létrehozzák a velőlécet (1. E ábra). A velőcső záródása nem egyidőben történik az embrió teljes hosszában, hanem a brachiális régióban megindulva terjed rostrális és caudalis irányokban. Végül mind az elülső, mind a farki neuropórus is bezáródik és a neuroektoderma teljes hossza mentén kialakul egy zárt cső. A velőcső elülső régiójának különböző mértékű növekedésével és tágulásával kialakul az idegrendszer anterior régiójának előagyi, középagyi és utóagyi szakaszokra való tagolódása (Gilbert, 1991). A neuroepitéliumot kezdetben folytonosan osztódó idegi őssejtek építik fel és osztódásaikkal növelik a kamra falát. Az őssejtek közük sok időről időre - eddig még

csak részben ismert szignálok hatására - az osztódást befejezve kilép a sejtciklusból és posztmitótikus neuronná alakul a korai fejlődés során. A posztmitótikus sejtek kapcsolata megszakad a kamrafallal és kivándorolnak a ventrikuláris zónából (VZ). A neuronok képződése, majd idegsejtté való elköteleződése lejátszódhat akkor is, ha a progenitorokat kiemeljük eredeti környezetükből. A neuronok régió- és rétegspecifikus érése, „finom” elköteleződése azonban az embrionális agyszöveti 9 10 környezet függvénye. A pán-morfogenetikus fejlődés és a régióspecifikus érés lezajlásához olyan hatásokra van szükség, amelyeket összefoglalóan környezeti faktoroknak neveznek. A környezeti faktorok lehetnek nem-diffúzibilis jelmolekulák, amelyek a közvetlen kontaktusokon át megvalósuló sejtes kommunikáció mediátorai (delta/notch és ephrin/Eph receptor útvonalak), vagy diffúzibilis, nagyobb távolságokon át is

ható jelmolekulák. A kialakult idegszövet klasszikus kismolekulájú neurotranszmittereiről feltételezik, hogy korai embrionális stádiumokban diffúzibilis jelmolekulák szerepét töltik be (LoTurco et al., 1991; Komuro and Rakic, 1993; Zheng et al., 1994; Behar et al, 1996) I. Kismolekulájú neurotranszmitterek, mint fejlődésreguláló anyagok A felnőtt idegrendszerben a neurotranszmitterek az idegsejtek közötti kommunikáció kémiai mediátorai. Ez a speciális szerep valószínűleg ősibb, parakrin funkcióból fejlődhetett ki, hiszen az alacsonyabbrendű élőlényekben ezek az anyagok a sejtek közötti diffúziós szignalizáció feladatát töltik be. Ez az elgondolás olyan kísérleti eredmények alapján született, melyek bebizonyították, hogy a „klasszikus” neurotranszmitterek legtöbbje (serotonin, dopamin, norepinefrin, GABA, acetilkolin, glutaminsav) megtalálható a primitív élőlényekben (csalánozók, laposférgek), nem idegi

szövetekben és olyan korai embrionális állapotokban is, ahol az idegrendszerre jellemző kommunikációs formák még nem fejlődtek ki (Lauder, 1993). Farmakológiai kísérletek sora mutatja, hogy a kismolekulájú aminosav-neurotranszmitterek morfogenetikus aktivitással rendelkeznek és befolyásolják a proliferáció, sejtvándorlás és differenciáció eseményeit primitív és evolúciósan fejlett élőlényekben (Lauder, 1993, LoTurco et al., 1995; Behar et al., 1996; Ma et al, 1998; Haydar et al, 2000; Nguyen et al, 2001) Ezek a filogenetikailag ősi funkciók – úgy tűnik - működnek az idegrendszer fejlődése során is, ahol ezek a kismolekulájú neurotranszmitterek befolyásolják a neurális progenitor sejtek osztódását és differenciációját, valamint hatást gyakorolnak a fiatal neuronok nyúlványosodására és migrációjára. Az alábbiakban a glutaminsav és GABA korai idegi elköteleződésben eddig megismert szerepére, valamint a két aminosav

hatásait közvetítő szignál transzdukciós rendszerek ismertetésére térek ki. 11 I./1 A Glutaminsav A glutaminsav a kifejlett gerinces élőlények idegrendszerében a legfontosabb serkentő neurotranszmitter szerepét tölti be. Neuroexcitiátoros tulajdonságának felfedezése (Curtis et al., 1959) óta eltelt 40 évben farmakológiai, elektrofiziológiai és molekuláris biológiai kísérletek segítségével sikerült leírni a glutamát-közvetítette szinaptikus jelátviteli folyamatok részleteit. Mára két fő glutamát receptor típust különböztetünk meg: az ionotróp (iGluR) és metabotróp (mGluR) receptorokat. A metabotróp receptorok közé olyan sejtmembránon átívelő 7 transzmembrán (TM) szerkezettel jellemezhető fehérjék tartoznak, melyek a sejtmembrán intracelluláris oldalán G-fehérjét kötnek. A mGluR receptorokat három csoportba osztjuk szekvencia-homológia, agonista-szelektivitás és a sejten belül aktivált szignál-transzdukciós

útvonal alapján. Az mGluR receptorok az embrionális fejlődés során már igen korai fejlődési stádiumokban kimutathatók és fontos szerepet játszanak a fiatal neuronok Ca2+-homeosztázisának szabályozásában (McCool et al., 1998; Flint et al., 1999) A felnőtt idegrendszerben főleg prae- ill extraszinaptikus lokalizáció jellemző rájuk és a neurotranszmitter-ürülés szabályozásában tulajdonítanak igen fontos szerepet ezen receptoroknak. Mivel a mGluR-k neurogenezisben játszott szerepével nem foglalkozom a dolgozatban, ezért további részletes jellemzésükre nem térek ki. Az ionotróp receptorokat felépítő fehérjék a sejtmembránt áthidaló ioncsatornákat alakítanak ki, melyeken keresztül glutamát kötődésének hatására ionáram indul meg a membrán két oldala között. Az ionotróp receptorokon belül megkülönböztetünk NMDA-vezérelt, AMPA-vezérelt és kainát típusú csatornákat, melyek specifikus agonistáikról kapták

elnevezésüket. Az elmúlt években azonban született néhány olyan kísérleti eredmény, amelyek alapján valószínű, hogy mind az AMPA (Wang and Durkin, 1995; Wang et al., 1997; Kawai and Sterling, 1999), mind a kainát típusú receptorok (Ziegra et al., 1992; Rodriguez-Moreno and Lerma, 1998; Lee et al, 2000) kapcsolódhatnak G-fehérjével és G-fehérje közvetített szignál-transzdukciós útvonalakon keresztül is befolyásolhatnak sejtélettani folyamatokat. 12 1.1 Az AMPA-vezérelt ioncsatornák 1.11 Szerkezet Az AMPA receptorok 4-féle alegységből GluR1-4 épülhetnek fel. Minden alegység glikozilált, kb. 900 aminosav hosszúságú és 65-75% szekvencia-homológiát mutat (Nakanashi et al., 1990; Sakimura et al, 1992) Az alegységek 3 TM régióból és egy membránba ívelő hurokból (TM2) épülnek fel (2. A ábra, Bennett and Dingledine, 1995), az N-terminális régió extracelluláris, míg a C-terminális régió intracelluláris orientációjú

(2. B ábra) A funkcionális receptorok tetramer (Rosemund et al, 1998; Madden, 2002) szerkezetűek és a TM2 domén vesz részt az ioncsatorna pórusának kialakításában (2. C ábra) Az S1 és S2 extracellulárisan elhelyezkedő hurkok tartalmazzák az agonista-kötő régiókat (2. B ábra; Keinänen et al, 1997) Az intracellulárisan elhelyezkedő C-terminális farok szerepe az alegységek membránhoz való szállítása majd kihorgonyzása (PDZ-doménen keresztül) és a jel továbbítása citoplazma felé (Bigge, 1999). Az intracelluláris régió foszforilációs helyeket is tartalmaz, melyek a receptor aktivitásának szabályozásában játszanak szerepet. Az AMPA-vezérelt receptorok ionszelektivitását a receptorok alegységösszetétele határozza meg. GluR2 alegység jelenlétében az ioncsatorna alacsony Ca2+permeabilitással és lineáris áram-feszültség görbével jellemezhető (Sommer et al, 1990; Jonas and Burnashev, 1995), míg GluR2 hiányában az ioncsatorna

nagymértékben áteresztővé válik Ca2+-ra és kettősen rektifikáló áram-feszültség összefüggést mutat. A GluR2 alegység ionszelektivitásáért egyetlen, a TM2 domén 586. pozíciójában elhelyezkedő aminosav a felelős. Míg a GluR2 alegység ezen pozícióját egy pozitívan töltött arginin (R) foglalja el (2. C ábra), a többi AMPA receptor alegység ezen pozíciójában egy töltést nem hordozó glutamin (Q) található (2. C ábra) A Q/R aminosav-csere a GluR2 alegységben az mRNS adenozinjának editálásával jön létre az 13 14 adenozin-deamináz enzim1 segítségével (Hume et al., 1991; Verdoorn et al, 1991; Burnashev et al., 1992; Paupard M-C et al, 2000) A GluR2 mRNS editációja nagyon hatékony és szinte 100%-a az agyi GluR2 alegységeknek editált formában van jelen a patkányban (Sommer et al., 1991) Az AMPA receptor alegységeket kódoló génekről “alternatív splicing”2 mechanizmusával kétféle típusú fehérje keletkezhet

attól függően, hogy a Flip vagy a Flop exon kerül be az érett mRNS-ekbe (2. A ábra) A Flip forma lassú deszenzitizációjú, míg a Flop forma gyors deszenzitizációs kinetikával jellemezhető. A Flip formák által kialakított receptorokon keresztül hosszan elhúzódó ionáram alakulhat ki. A Flop formák AMPA receptorba épülése esetén rövid ideig tartó, nagy amplitúdójú ionáram jön létre, melynek a szinaptikus jelátvitelben lehet jelentősége. A TM3 és TM4 domének között található egyik arginin RNS-editáció mechanizmusával glicinre cserélődhet (3. A ábra), mely a deszenzitizáció utáni receptor “recovery” idejét csökkenti le (Lomeli et al., 1994) 1.12 Az AMPA receptorok farmakológiai sajátosságai Az AMPA receptorokat eredetileg mint quiskalát-vezérelt ioncsatornákat írták le, és csak később sikerült megmutatni, hogy az AMPA a szelektív ligandumuk (a 1 Napjainkig két olyan enzimet azonosítottak emlősökben, amelyeknek

adenozin-deamináz aktivitása van: ADAR1 (dsRNS-specifikus adenozin-deamináz) és az ADAR2 (dsRNS-specifikus editáz 1, más néven RED1). A fehérjecsalád harmadik tagja a RED2, amely struktúrálisan ugyan nagyfokú hasonlóságot mutat, de nem tudja deaminálni a kettős szálú RNS-t. Az ADAR1 és ADAR2 a legtöbb szövetféleségben expresszálódik, míg a RED2-t eddig csak idegrendszerben írták le. Az ADAR2 enzimnek in vitro szubsztrátjai az AMPA/kainát típusú receptorokat és az 5HT-2C receptort kódoló mRNS-sek. Az ADAR2 először az E17 embrionális korban sikerült kimutatni, amely időpontban az AMPA-típusú receptor GluR2 alegysége 99% editált formában van jelen. Ez az eredmény azt valószínűsíti, hogy vagy az ADAR1 vagy egy másik, eddig még nem karakterizált enzim a felelős a GluR2 editációért. 2 Az alternatív hasítás kifejezést az angol „alternative splicing” magyar megfelelőjeként használom a dolgozat során. A „splicing” vagy

hasítás az mRNS érése során történik, amikor az intron kivágódik és az exonok összekapcsolódnak. Mind az intronok, mind az exonok végein találhatók ún „splice site”-ok vagy hasitási szekvenciák, melyek megmutatják a spliceosoma-nak az exon/intron határokat. 15 quiskalát a metabotróp receptoroknak is agonistája). 3[H]AMPA-kötés leszorítási vizsgálata a következő agonista erősségi sorrendet adta GluR1, GluR2 és GluR3 alegységekből felépülő rekombináns receptorokon: quiskalát > AMPA = domoát > glutamát > kainát.3 (Fletcher and Lodge, 1996) Az AMPA, quiskalát és glutamát által kiváltott ionáramok gyorsan lecsengenek és a receptor deszenzitizálódik, míg a kainát által aktivált receptor kevésbé érzékeny a deszenzitizációra Az AMPA receptorok kompetitív antagonistái két vegyületcsoportból kerülnek ki: a quinoxalinedion-típusú vegyületek (CNQX, NBQX, DNQX) és a decahydroisoquinoline vegyületek

(LY293558, YM90K; Fletcher and Lodge, 1996). Az AMPA receptorokon egymással átfedő pozícióban található egy pozitív és egy negatív alloszterikus modulációs hely is. A negatív modulációs helyre kötő 2,3 benzodiazepine típusú vegyületek (GYKI52466, GYKI53655; Tarnawa et al., 1989) a receptor nemkompetitív antagonistái és szelektívek az AMPA receptorokra A pozitív alloszterikus modulátorok a pirrolidin típusú vegyületek közül (aniracetam, piracetam) ill. a benzothiadiazid (ciklotiazid4, diazoxid) csoportból kerülnek ki és a receptor agonista hatására bekövetkező deszenzitizációját csökkentik (Fletcher and Lodge, 1996). Mivel a két alloszterikus modulációs hely egymással átfedő pozícióban található a receptoron, a drogok együttes jelenléte és relatív koncentrációja befolyásolhatja e szerek hatását. 1.2 Kainát receptorok 1.21 Szerkezet A kainát receptor alegységeknek két csoportra osztjuk: az alacsony (GluR5-7) és a magas

(KA1, 2) kainát affinitással rendelkező alegységek csoportjára. Számos más kainát-kötő fehérjét is leírtak alacsonyabbrendű gerincesekben (összefoglalja Ziegra et al., 1992; Lerma et al, 2001), de ezek a fehérjék nem alakítanak ki funkcionális 3 Az AMPA receptorok további agonistái az ibotén sav (Hansen et al., 1995) és a különböző willardiine származékok (Wong et al., 1994), valamint az AMPA terc-butil analóg vegyülete, az ATPA is (Krogsgaard-Larsen et al., 1994) 4 A ciklotiazid a flip formák deszenzitizációját csökkenti szelektíven, míg egy másik vegyület, a PEPA, a flop variánsok által képzett csatornák deszenzitizációját gátolja. 16 ioncsatornákat. A kainát receptor alegységeket is kb 900 aminosav építi fel, 3 TM domént és egy membránba ívelő hurokrégiót (TM2) különíthetünk el a fehérjében, hasonlóan az AMPA receptor alegységekhez. A funkcionális receptor kialakításában 4 alegység vesz részt.

GluR5-7 alegységek homomer és heteromer kombinációban is kialakíthatnak funkcionális receptort, míg a KA1 és KA2 alegységek csak GluR5-7 alegységgel funkcióképesek. A GluR5 és GluR7 alegységek esetében több izoformát is leírtak, amelyek „alternatív hasítás”-sal keletkeznek; hasonló variánsok a többi alegység esetében nem ismertek. A szerkezeti variabilitás másik forrása lehet a GluR5 és GluR6 alegységek esetében (Egebjerg and Heinemann, 1993) az RNS editálás az alegységek Q/R pozíciójában (TM2 szegmensben) , az editáció mértéke azonban alacsonyabb, mint a GluR2 alegység esetében. Két további pozíciót azonosítottak még az alegységek TM1 szegmensében, amelyek szintén editálódhatnak: az I/V pozíció, ahol valinra cserélődhet az izoleucin (Köhler et al., 1993); ill a Y/C pozíció, ahol tirozin cserélhet le egy ciszteint. Az RNS editálás az idegrendszer fejlődése során szabályozott folyamat (Paschen et al., 1997) és az

ioncsatorna Ca-permeabilitását szabályozza a kainát receptorok esetében is. 1.22 A kainát-vezérelt receptorok farmakológiai jellemzése A kainát receptorok általánosan használt agonistái a kainát és a domoát (az általuk kiváltott válasz gyorsan deszenzitizálódik) annak ellenére, hogy mindkét agonista képes aktiválni az AMPA receptorokat is (nem deszenzitizálódó válaszokat létrehozva).5 További receptor agonisták a glutamát γ-szubsztitúciójával előállított analógok (LY339434; Small et al., 1997; valamint a SYM2081, Zhou et al, 1997) és a halogén-szubsztituált willardiine és azawillardiine származékok (Swanson et al., 1998) A nagy affinitású kötőhelyeken (KA1 és KA2 alegységek) a kainát >domoát > glutamát > AMPA, míg az alacsony affinitású kötőhelyeken a domoát > kainát > glutamát > AMPA agonista-erősségi sorrend mérhető. Az kainát receptorok egyetlen szelektív antagonistája az NS102 (Verdoorn et

al., 1994). További antagonistái a receptornak a quinoxalinedion vegyületek (DNQX, CNQX, NBQX; Lerma et al., 2001) és a decahydroisoquinolinok (LY382884; 5 Az AMPA azonban nem, vagy csak nagyon kis mértékben képes aktiválni a kainát receptorokat. 17 Bleakman et al., 1996), melyek mindegyike mutat aktivitást AMPA receptorokon is A kainát receptorok deszenzitizációját csökkentő alloszterikus modulátorok a növényi lektinek közül kerülnek ki (konkanavalin A; Mayer and Vyklicky, 1989). Ismert alegység-összetételű, „tiszta” kainát receptorok kainát hatására gyorsan deszenzitizálódnak, amely megkülönbözteti őket az AMPA receptoroktól (Bleakman and Lodge, 1998). A receptorok aktivációjuk után egy átmeneti, nem aktiválható állapotban kerülnek, melynek időtartama a receptor alegység-összetételétől is függ. 1.3 NMDA Receptorok 1.31 Szerkezet Az NMDA receptorokat egyedinek tekinthetjük a glutamát-vezérelt receptorok között, mivel

kettős ligandumkötés (glutamát és glicin; Meguro et al., 1992) és depolarizáció (a Mg2+-blokk feszültségfüggő felfüggesztése; Mayer, 1998) egyidejűleg szükséges a csatorna kinyitásához. Az NMDA receptor alegységeket szekvenciahomológia alapján három csoportba osztjuk: az NR1 alegység; az NR2A-D alegységek; ill. az NR3A, B alegységek csoportjára (Monyer et al, 1992; Ciabarra et al, 1995; Chatterton et al., 2002) Az NR1 alegység 8-féle izoformája ismert, melyek 3 exon (N1, C1 és C2) alternatív jelenlétével keletkeznek (3. ábra; 1 táblázat; Hollmann et al, 1993). Variáns N1 C1 C2 C2’ NR1-1a NR1-1b Nr1-2a NR1-2b NR1-3a NR1-3b NR1-4a NR1-4b + + + + + + + + - + + + + - + + + + 1. táblázat Az NR1 mRNS alternatív hasítása során keletkező formák elnevezése a Hollmann által bevezetett nevezéktan alapján. 18 19 Az NR1 alegység extracelluláris részén elhelyezkedő N1 kazetta jelenléte csökkenti a receptor

glutamát-affinitását, megnöveli az ionáram amplitúdóját és befolyásolja a receptor Zn2+ és spermin érzékenységét (Zukin and Bennett, 1995; Rumbaugh et al., 2000) A C1 kazetta olyan szekvenciákat kódol, melyek az intracellulárisan elhelyezkedő fehérjékkel való kapcsolódást közvetítik. Ilyen fehérjék pl. a könnyű neurofilamentum fehérje (NFL; Ehlers et al, 1998) vagy a yotiao (Lin et al., 1998) A C1 exon területén azonosítottak protein kináz C által foszforilálódó helyeket is (Tingley et al., 1997; Zheng et al, 1999) A C2 exon beépülése a fehérjébe azt eredményezi, hogy a fehérje csak NR2 alegységek jelenlétében tud a sejtmembránhoz szállítódni, NR2 alegység hiányában a citoplazmában raktározódik (McIlhinney et al., 1996; Okabe et al, 1999) Amennyiben a C2 exon nem kerül bele az NR1 fehérjébe, az exon végén található Stop kodon hiányában a transzláció továbbmegy, és egy C2’ szakasz kerül a fehérje C-terminális

végére (3. ábra) Azok a variánsok, amelyek C2’ részletet tartalmaznak, kapcsolódni tudnak a PSD95 horgonyzó fehérjéhez (Kornau et al., 1995) Az NR2 alegységeknek nincs ismert splice-variánsuk. A receptor alegységek a már korábban leírt 4 TM domén szerkezettel jellemezhetők, de az NR2 alegységek intracelluláris C-terminális régiója jóval hosszabb, mint az AMPA és kainát receptor alegységek esetében. Az NR3 alegységek TM2 doménje és S1 ill. S2 ligandumkötő régiója eltér az NR1 és NR2 alegységeknél megismert szerkezettől, részletes jellemzésükre nem térek ki. Az NR1 alegység önmagában is képes ioncsatorna kialakítására in vitro, de az ionáram amplitúdója igen alacsony homomer NR1 csatorna esetében A funkcionális ioncsatorna in vivo 4 alegységből áll össze, melyben minimum egy NR1 alegység és bármilyen típusú NR2 alegységek vannak jelen (Monyer et al., 1992) Az NMDA receptor TM2 doménjében a receptor ionszelektivitását

meghatározó aminosavpozícióban (azaz a Q/R helyen) minden esetben aszparagin található (Mishina et al., 1991), melynek következtében az NMDA receptorok Ca2+-t eresztenek át nagy mennyiségben. Az NMDA receptorok pórusában nyugalmi állapotban Mg2+ ionok találhatók (Mayer, 1998), melyek a környező membrán-területek depolarizációjával 20 kimozdíthatók. Tehát a receptor aktivációjához a két agonista (glutaminsav és glicin) kötődése mellett egyidejű depolarizációra is szükség van a csatorna nyitásához. Az NR1/NR2/NR3 összetételű ioncsatornák Ca2+-permeabilitása csökken a beépülő NR3 alegység következtében, ami valószínűsíti, hogy ezen alegységek domináns negatív formákként viselkednek (Das et al., 1998) Az NR1/NR3 alegységkombinációjú ioncsatornák Ca2+-impermeábilis, excitatórikus, glicin-vezérelt receptorok (Chatterton et al., 2002) 1.32 Az NMDA receptorok farmakológiai jellemzése Az NMDA receptorokon két

agonista-kötő régiót azonosítottak: az egyik a glutamát kötéséért felelős (az NR2 alegységek), míg a másik a koagonista glicint (az NR1 alegység) köti (Madden, 2002). A receptor glutamát-helyre kötődő legfontosabb szelektív agonistái az NMDA, quinolinsav és az RS-(tetrazol-5-yl)-glicin, míg a glicinhelyen a glicin és a D-szerin tud kötődni (Mori and Mishina, 1995; Mothet et al., 2000) A receptor szelektíven ható kompetitív antagonistái közül a glutamát helyre kötődő DLAP5 (DL-2-amino-5-foszfonovaleriánsav), DL-AP7 és LY 235959, valamint a glicinhelyre kötődő 5,7-diklorokynurén sav, az L-655,708 benzodiazepin-származék és a quinoxalindion típusú vegyületek közé tartozó MNQX érdemel figyelmet nagyfokú szelektivitása miatt (Mori and Mishina, 1995). A receptor nem-kompetitív antagonistái a nyitott csatornában kötődnek és gátolják a csatornán át történő ionmozgást. Ide soroljuk a dizocilpinek közé tartozó MK-801-t, a

fenciklidin-származékokat (TCP, PCP), a ketamint és a memantint (Mori and Mishina, 1995). Az NMDA-vezérelt ioncsatornák működését számos vegyület és ion is befolyásolja, melyeket a recetor alloszterikus modulátorainak neveznek. Ide tartoznak a szulfhidril-csoportot tartalmazó (redox) reagensek, amelyek erős oxidáló ill. redukáló hatással bírnak (Lazarewicz et al., 1989), az etanol (Lovinger et al, 1989), a spermin és spermidin (Araneda et al., 1999; Zhang et al, 1994), a nitrogén-monoxid (Manzoni et al., 1992) és a proton (Traynelis and Cull-Candy, 1991) 21 1.4 Az ionotróp glutamát receptorok előfordulása és szerepe az idegrendszer embrionális fejlődése során Az idegrendszer embrionális fejlődése során az ionotróp glutamát receptor alegységek expressziós mintázata változik. A patkány neurogenezise során az 5 kainát receptor alegység mRNS-e már igen korán kimutatható (embrionális fejlődés 12. napján [E12]; Gallo et al., 1995;

Maric et al, 2000), de a [3H]kainát kötés és a fehérje nagymennyiségű kifejeződése a funkcionális receptorok kialakulását követően, kb. két nappal később (E14) indul (Bahn et al., 1994) Ebben az embrionális időszakban a kainát receptor alegységeket a még nagyrészt osztódó progenitorok és frissen differenciálódott migráló neuronok expresszálják (Gallo et al., 1995; Scherer and Gallo, 1998; Maric et al., 2000) Az AMPA receptor alegységek az embrionális fejlődés során szintén igen korán megjelennek és expressziójuk időben és térben is meghatározott mintázatot követ. Legkorábban a GluR3 és GluR4 alegység mRNS-ket mutatták ki patkányban és egérben az embrionális fejlődés 10. napján a neurális csövet felépítő, nestin-tartalmú idegi progenitor sejtekben (Schererer and Gallo, 1998). A GluR1 és GluR2 alegység mRNSek E125 embrionális korban voltak először kimutathatók teljes egér agyból készült homogenátumokból (Simonian

and Herbison, 2001). E14 kortól mind a négy AMPA receptor alegység mRNS-e expresszálódott (Monyer et al., 1991) Amíg azonban a GluR2 alegység a szürkeállomány teljes területén előfordult, addig a másik 3 alegység expressziója kisebb területekre korlátozódott. Az embrionális fejlődés során az expresszálódó GluR alegységeknek csaknem 100%-a Flip forma volt (Monyer et al., 1991). A Flip forma expressziója a posztnatális fejlődés (P) során végig megmaradt, a Flop forma expressziója azonban csak P9-P12 időszakban indult meg (Monyer et al., 1991). A Flop forma viszonylag késői beépülése az AMPA receptorokba egybeesik a nagymértékű szinaptogenezis idejével az előagyi területen (Aghajanian and Bloom, 1967). Az idegrendszer embrionális fejlődése során az NMDA receptor alegységek közül a legkorábban az NR1, ill. az NR2 alegységek közül az NR2B és az NR2D alegységek expresszálódnak patkányban és egérben (E13; Monyer et al., 1992;

Watanabe et al., 1992, 1993) Az NR3-s alegységek embrionális expressziója még nem tisztázott. Azonban amíg az NR1 és NR2B alegységek szinte minden agyi régióban előfordulnak, az NR2D alegység mRNS-e a köztiagy és agytörzs területeire 22 korlátozódik. Az NR2A és NR2C alegységek szintje a posztnatális időszakban válik jelentőssé, mellyel egyidőben az NR2D alegység expressziója nagymértékben visszaszorul (Monyer et al., 1992) A kifejlett idegrendszerben az NR2 alegység mRNSek régió-specifikus eloszlást mutatnak, míg az NR1 alegység a teljes idegrendszer területén expresszálódik (Monyer et al., 1992; Watanabe et al, 1992, 1993) Az NR2C alegység főleg a kisagyban, az NR2D a talamusz és agytörzs területein, az NR2A az agykéreg és a hippocampusz míg az NR2B az előagyi területen fordul elő. Funkcionális glutamát receptorok már igen korán, a szinaptikus ingerület-átvitel kifejlődése előtt megjelennek az idegrendszer embrionális

fejlődése során. AMPA receptorokat mutattak ki E13 korú patkány embrió előagyából disszociáltatott, BrdU-t inkorporáló neurális progenitor sejtekben (Maric et al., 2000), ill a VZ területét elhagyó, már posztmitótikus neuronokban. Ez alapján feltételezhető, hogy az elsőként kialakuló, Ca2+-permeábilis AMPA receptorok szerephez juthatnak a progenitorok osztódásának szabályozásában és a posztmitótikus fiatal neuronok migrációjában (Métin et al., 2000; Simonian and Herbison, 2001) Az embrionális fejlődés késői szakaszában az AMPA receptorok Ca2+-permeábilitása lecsökken és előfordulásuk főleg a szinaptikus területekre korlátozódik. E14 korból származó, disszociáltatott patkány agytörzsi progenitorsejtek életképességét szintén befolyásolni lehetett AMPA/kainát receptor agonistákkal és antagonistákkal (Bardoul et al., 1997), ami alapján valószínű, hogy ezen receptorok fontos szerepet játszanak a neuronok

túlélésének szabályozásában az idegrendszer embrionális fejlődésének kritikus stádiumaiban. Az első funkcionális NMDA receptorokat az E16 korból származó szövetszeletekben sikerült kimutatni, a kortikális lemez területére bevándorolt neuronokon (LoTurco et al., 1991) A funkcionális NMDA receptort expresszáló sejtek aránya az embrionális fejlődés előrehaladtával folyamatosan emelkedik és a posztnatális időszakban éri el expressziós maximumát. Az NMDA receptoroknak fontos szerepet tulajdonítanak a neuronok túlélésének növelésében (Balázs et al., 1988), a nyúlványok növekedésében (Brewer and Cotman 1989), a neuronok radiális migrációjának irányításában (Komuro and Rakic, 1993), valamint a nyúlványhálózatok kialakulásában és a szinaptikus kapcsolatok differenciálódásában (Vallano, 1998). 23 A sejtfelszíni ionotróp ill. metabotróp glutamát receptorok aktiválása a sejten belül másodlagos hírvivők (Ca2+,

ciklikus nukleotidok és foszfolipidek) felszabadulását váltja ki. Az idegrendszer embrionális fejlődése során az intracelluláris Ca2+ -szint változások ([Ca2+]IC) sokféle időbeli és térbeli mintázatot mutatnak és fontos szabályozó szereppel rendelkeznek a progenitorok osztódása, a fiatal neuronok migrációja (citoszkeletális átrendeződések mediálása), a programozott sejthalál és a trofikus faktorok kiürítésének folyamataiban. Az [Ca2+]IC változások jellegzetes mintázatainak kialakítása során a sejtek citoplazmájába kerülő Ca2+ legfontosabb forrásai az extracelluláris tér és az intracelluláris Ca2+-raktárak (endoplazmatikus retikulum és mitokondrium). Az intercelluláris közegből a Ca2+ az iGluR-k mellett a feszültségfüggő Ca2+-csatornákon (VDCC) keresztül juthat a sejt belsejébe, míg az endoplazmatikus retikulumból a metabotróp (glutamát ill. GABA) receptorok által aktivált IP3R receptorokon valamint a RyR receptorokon

keresztül ürül a citoplazmába a Ca2+. GABAA receptorok aktivációja Cl- ionok kiáramlását okozza a citoplazmából az extracelluláris tér irányába, ami depolarizálja a membránt és aktiválhatja a VDCC-kat. Ezáltal indirekt módon szintén kiválthatja az [Ca2+]IC megemelkedését. A Ca2+ szignál-transzdukciós szerepének vizsgálatát elősegítették azok a módszerek, amelyek a Ca2+-érzékeny fluoreszcens festékek (indo-1; quin-2, fura-2), ill. fehérjék (aequorin) sejtbe juttatásával az [Ca2+]IC dinamikus változásainak érzékeny mérését tették lehetővé. I./2 A GABA A központi idegrendszer (CNS) legfontosabb gátló neurotranszmittere, a GABA nélkülözhetetlen a legtöbb idegrendszeri funkció szabályozásában. A GABA a központi idegrendszeren kívül előfordul a petefészekben, a herében, a hasnyálmirigy inzulintermelő β-sejtjeiben is (Erdö and Wolff 1990, Tillakaratne et al., 1995; Chessler and Lernmark, 2000), a pontos szerepe ezekben

a szövetekben és sejtekben azonban még nem teljesen ismert. A GABA-közvetített szignalizáció szabályozásában többfajta mechanizmust szerepel, melyek közül központi jelentőségű a GABA szintéziséért felelős glutaminsav dekarboxiláz enzimek (GAD) expressziójának és aktivitásának modulálása. 24 Az embrionális fejlődés során a GABA már jóval a szinaptogenezis előtt megjelenik és trofikus faktorként szolgálhat a differenciálódó neuronok számára (Lipton and Kater, 1989; Meier et al., 1991; Lauder, 1993; Katarova et al, 2000b) Egér és patkány idegrendszer korai fejlődési szakaszában (E9-E13) a GABA-tartalmú idegrostok olyan területek mentén nőnek, ahol aktív neurogenezis folyik (Lauder et al., 1986; Del Rio et al., 2000; Katarova et al, 2000a) A GABAerg útvonalak kifejlődését azonban megelőzi a GABAA receptor alegységek megjelenése (Laurie et al., 1992; Ma and Barker, 1995). A korai embrionális stádiumokban (E9-E13) trofikus

faktorként szolgáló GABA-nak egy alternatív forrása lehet a szérumban jelen lévő GABA, amely a vér-agy gát kifejlődése előtt be tud diffundálni az erek falából az idegszövet intercelluláris terébe. A szinapszisok kialakulása előtt a GABA kiürülése a rostokból és axonális növekedési kúpokból a membrán-kötött GABA-transzporterek megfordulásával (Taylor and Gordon-Weeks, 1991) illetve exocitózissal is megtörténhet (Gao and van den Pol, 2000). A neurális progenitorok fejlődése során jelentős mennyiségű (≈ 10 µmol / 100 mg protein) GABA-t mutattak ki a szaglógumó ill. a kisagy területén is (Miranda-Contreras et al., 1999, 2000) E13 kortól P0 stádiumig A GABAerg rostok, a GABA-szintetizáló enzimek, a GABA-ürítő mechanizmusok, a GABA receptorok és a GABA együttes jelenléte a korai embrionális fejlődés során megerősíti azt a feltételezést, hogy a GABA trofikus faktor a fejlődő neuronok számára. A kifejlett

idegrendszerben a GABA a posztmitótikus neuronok hiperpolarizációját idézi elő és ezzel neuronális gátlást hoz létre. Az embrionális fejlődés során egészen az első posztnatális hétig a GABAA receptor Cl- csatornák aktivációja depolarizációt idéz elő és ezzel egyidőben megemeli a [Ca2+]IC-t (Cherubini et al., 1991; LoTurco et al, 1995; Rivera et al., 1999; Owens et al, 1996, 1999) A depolarizáló hatás a progenitorsejtek magas Cl- ion tartalmával magyarázható (Rivera et al., 1999), amely a neuronális érés során fokozatosan lecsökken. Az aktivált GABAA receptorokon a Cl-ionok kiáramlását membrán-depolarizáció követi aktiválva a VDCC-t, amelyeken keresztül nagymennyiségű Ca2+ jut a sejt belsejébe (Reichling et al., 1994; Serafini et al., 1998) Az embrionális fejlődés során a GABA trofikus hatásait nagy valószínűséggel a Ca2+-ionok, mint másodlagos hírvivők közvetítik. 25 2.1 A GABA-szintézis szabályozása: GAD formák

A gerinces idegrendszerben a GABA szintézisét két enzim katalizálja, a 65 kD és 67 kD molekulatömegű GAD enzimek (4. ábra; Martin and Rimwall, 1993) A két gad gén génduplikációval keletkezhetett egy közös ősi gad génből kb. 400-560 millió évvel ezelőtt (Bosma et al., 1999) A felfedezés, hogy a gerincesek GABAerg idegsejtjeiben két gad gén (Erlander et al., 1991) és két eltérő funkciójú GABA-raktár (szinaptikus és metabolikus) található adta az ötletet, hogy a GAD65 és GAD67 fehérjék különböző GABA-raktárak feltöltését végzik (Martin and Rimwall, 1993; Martin et al., 2000) Megerősíti ezt a feltételezést, hogy a gad65 és gad67 gén-kiütött állatok eltérő fenotípust mutatnak. A gad67-hiányos állatok farkastorokkal születnek és születés után nem sokkal el is pusztulnak (Condie et al., 1997; Asada et al, 1997) A gad67+/- heterozigóta állatokban a GABA szintje nagymértékben lecsökken, ami azt mutatja, hogy a GAD65

jelenléte nem tudja kompenzálni a GAD67 fehérje részleges elvesztését. Ezzel ellentétben a gad65 gén-kiütött állatok életképesek, de epilepszia fejlődik ki bennük (Kash et al., 1997), szorongásos viselkedést mutatnak és a neurális hálózatuk működése is károsul (Stork et al., 2000) Azok az állatok, amelyek genomja sem a gad65-t sem a gad67-t nem tartalmazza, hasonló fenotípust mutatnak, mint a gad67-/- állatok. (Ji et al, 1999) Érdekes megemlíteni, hogy bár ezekben az állatokban az idegrendszer GABA-tartalma elhanyagolhatóan alacsony, az agykéreg, kisagy és hippocampusz szöveti fejlődése nem sérül E14-P0 korig (Ji et al., 1999) A két GAD enzimforma eltér kinetikai tulajdonságaiban (Martin et al., 2000), intracelluláris eloszlásában (Kanaani et al., 1999) és a kofaktor piridoxál-foszfát (PLP) kötésében is (Kaufman et al., 1991; Martin et al, 2000) Mindkét fehérjén belül megkülönböztetünk egy N-terminális (a két fehérje ezen

szakasza között kb. 23%-os a szekvencia hasonlóság) és egy C-terminális domént (kb. 73%-os aminosav egyezés) Az N-terminális domén szabályozza a fehérje sejten belüli célba juttatását, valamint a GAD65 – GAD67 homo- és heterodimerek kialakítását. A C-terminális régió hordozza a 26 27 kofaktor-kötő helyet és az enzimaktív régiót (Sheikh and Martin, 1996; Soghomonian and Martin, 1998). A GAD67 fehérje nagyobb része a citoplazmában található és csak kis százaléka kerül ki a membránba (Christgau et al., 1991; Kanaani et al, 1999), míg a GAD65 fehérje főleg membránokhoz asszociálódik (Kanaani et al., 1999; Obata et al, 1999; Hsu et al., 2000) A GAD65 fehérje sejtmembránhoz való kihorgonyzása palmitoil-oldalláncok segítségével történik (Christgau et al., 1992), de a palmitoiláció nem játszik szerepet a fehérje membránhoz való szállításban (Shi et al., 1994) A GAD67 fehérje membránhoz való targetálása a GAD65

fehérjétől független folyamat (Kanaani et al., 1999) és valószínűleg a nem-szinaptikus GABA-release-ben lehet szerepe (Kanaani et al., 1999) A GAD65 fehérjék preszinaptikus lokalizációja és szinaptikus vezikulákhoz való asszociációja (Hsu et al., 2000) alapján ezen forma szerepe a GABAerg szinaptikus jelátviteli folyamatokban jelentős (Sheikh and Martin, 1996). 2.2 Rövidített GAD fehérjék Az embrionális fejlődés során alternatív hasítással embrionális transzkriptumok (I-80 és I-86; 4. ábra) keletkeznek a gad67 génről (a gad65 gén esetében ilyen termék nem ismert). Ezek a transzkriptumok magukba foglalnak egy-egy embrionális exont (7A és 7B), melyek szekvenciája majdnem teljesen azonos (5. ábra) Az embrionális exonok tartalmaznak egy átfedő Stop/Start kodont (TGATG), mely a fő nyitott leolvasási keretet (Open Reading Frame; ORF) megszakítja és két ORF-t alakít ki az mRNS-n belül (5. ábra), így bicisztronikus – két polipeptidet

kódoló - transzkriptum keletkezik (Szabó et al., 1994) Az első leolvasási keret egy 25 kD fehérjét kódol (4, 5 ábra; GAD25), míg a második leolvasási keretről átírt fehérje 44 kD molekulatömegű (4., 5 ábra; GAD44; Szabó et al, 1994) Az I-86 transzkriptumban a 7B exon által kódolt plusz 6 aminosav (GTG ATG) tartalmaz egy újabb Stop kodont (5. ábra), mely megszakítja a második leolvasási keretet, így erről a transzkriptumról csak egy fehérje, a GAD25 tud átíródni. Az I-86 mRNS expressziója az embrionális fejlődés korai időszakára esik (Szabó et al., 1994), amikor az idegrendszert még főleg osztódó progenitorok és frissen differenciálódott neuronok építik fel (E10.5 – E155) Az I-80 mRNS - mely mindkét fehérjét kódolja - expressziós maximuma későbbi fejlődési 28 stádiumokra esik (Szabó et al., 1994), amikor a már kialakult neuronok migrációja zajlik (E12-E18). A GAD25 fehérje a teljes hosszúságú GAD67 fehérje

N-terminális 212 aminosavát tartalmazza, valamint még 11 aminosavat, amit az embrionális exonok kódolnak (5. ábra) A GAD25 fehérje csak azokat a regulációs szekvenciákat hordozza, amelyek a teljes hosszúságú GAD67 enzimen belül a fehérje-fehérje kapcsolatok kialakítását közvetítik, így a GAD25 fehérje enzimatikus aktivitással nem rendelkezik. A fehérje főleg korai embrionális stádiumokban fordul elő (E10.5-E125; Szabó et al, 1994), de felnőtt agyban is kimutatható azokon a helyeken, ahol szinaptikus átrendeződések történnek (Krizbai et al., 2000) A GAD44 fehérje 15, embrionális exon által kódolt aminosavat hordoz az Nterminális végén és 381 aminosavat a felnőtt GAD67 fehérje C-terminális régiójából (5. ábra), magában foglalva a kofaktor-kötő régiót és az aktív centrumot is. In vitro mérések megmutatták, hogy a fehérje enzimatikus aktivitással rendelkezik (Szabó és munkatársai, nem közölt adat). A GAD44 fehérje E11

kortól egészen a posztnatális P11 időszakig detektálható, felnőtt állat idegrendszerében azonban nem mutatható ki (Szabó et al., 1994) A teljes hosszúságú GAD67 fehérje expressziója fordított tendenciát mutat: embrionális korszakban alig detektálható, mennyisége nagymértékben emelkedik születés után és a posztnatális 4. héten eléri szintje a felnőttre jellemző értéket A fejlődő telencephalon területén az embrionális transzkriptumok átmeneti expressziót mutatnak az osztódó sejteket tartalmazó VZ és a szubventrikuláris zóna (SVZ) területén ill. azokon a területeken, ahol migráló neuroblasztok találhatók (Behar et al, 1994; Katarova et al., 2000a) Ez alapján feltételezhető, hogy az embrionális GAD formáknak szerepe lehet a neuronblasztok osztódásának szabályozásában, a neuronális differenciációban és a kialakuló neuronok migrációjában. A GABA az idegrendszer embrionális fejlődése során sokrétű

szereppel rendelkezik. Korai embrionális stádiumban (E15) mikromoláris koncentrációban adott GABA befolyásolja a neurális progenitor sejtek osztódását mind a VZ, mind a SVZ területén (LoTurco et al., 1955; Haydar et al, 2000) Fiatal neuronok random ill 29 30 irányított mozgását GABA fento- és mikromoláris koncentrációival befolyásolni lehetett mind frissel izolált sejtek tenyészeteiben (Behar et al., 1996) mind organotipikus szövetszeletekben (Behar et al., 1998) A neuronális nyúlványhálózatok kialakulása során a differenciálatlan idegsejtekből érett neuronok fejlődnek és az aktívan mozgó axonális növekedési kúpok átalakulnak helyhez kötött szinaptikus elemekké. Az idegsejtek ezen fejlődési stádiumában a GABA receptor agonisták megnövelik a sejtek metabolikus aktivitását (Hansen et al., 1987; Spoerri, 1988), megemelik adott GABAA receptor alegységek expresszióját, növelik a már jelen lévő receptorok GABA-kötését

(Kim et al., 1994), valamint indukálják neuron-specifikus fehérjék szintézisét is (neuron-specifikus enoláz, neurális sejtadhéziós molekula, Belhage et al., 1988) II. AZ IDEGSEJT IRÁNYÚ ELKÖTELEZŐDÉS KORAI LÉPÉSEINEK TANULMÁNYOZÁSA AZ EGYEDI SEJTEK SZINTJÉN A neurogenezis molekuláris- és sejtbiológiai folyamatai in vivo csak korlátozott mértékben tanulmányozhatóak. Az embriókban a sejtkapcsolatok tetszés szerint nem változtathatók, fejlődésreguláló anyagok hatásainak mechanizmusa csak részben tesztelhető. Azonos fejlődési potenciállal rendelkező, neurális progenitor sejtekből álló primer tenyészetet nem lehet létrehozni, mert az embrionális idegrendszer területén a progenitorok differenciációja térbeli és időbeli eltéréseket mutat – azaz egy adott fejlődési stádiumban a jelenlévő sejtek eltérő differenciáltsági állapotokat képviselnek. A korai fejlődési stádiumban lévő embrionális agyhólyagból izolált

primer sejttenyészetek összetétele és fejlődési potenciálja is heterogén, a primer progenitorok osztódóképeségüket in vitro hamar elveszítik, fejlődési potenciáljuk megváltozhat. Az eredményes és ismételhető kísérletekhez sejtösszetétel, fejlődési potenciál és indukálhatóság tekintetében egyforma sejttömegre lenne szükség. A neurogenezis korai szakaszának in vitro vizsgálatait olyan folytonosan osztódó (immortalizált), neurális progenitor sajátságokkal rendelkező sejteken végezhetjük, amelyekből a differenciáció adott szakaszában jelentős homogén sejttömeg állhat rendelkezésre. Perifériás idegrendszeri tumorokból előállított sejtvonalak (PC12; Green and Tischler, 1976), ill. embrionális karcinómákból (EC) izolált multipotenciális neurális progenitorok (P19, PCC-7, NTera-2) in vitro differenciáltatása széles 31 lehetőségeket kínál a neurogenezis egyes lépéseinek tanulmányozására. A mi laboratóriumunk

azonban olyan modell sejtvonalon kívánt dolgozni, amely nem tumor eredetű és külső onkogéneket sem hordoz. Laboratóriumunk munkatársai transzgenikus, p53–deficiens, 9 napos egér embrió (6. ábra) elő- és középagy-hólyagjából izoláltak immortalizált neuroepiteliális progenitor sejtvonalakat (Schlett and Madarász, 1997). A funkcionális p53 génnel nem rendelkező egértörzset Livingstone és munkatársai állították elő (Livingstone et al., 1992) Kísérletek igazolják, hogy funkcionális p53 gén hiányában az egerek normálisan fejlődnek, de korábban öregszenek (Tyner et al., 2002) és idős korban megnő a tumorok gyakorisága is (Donehower et al., 1992) Ugyanakkor a p53 gén hiánya elősegíti az izolált sejtek (pl. fibroblasztok, hematopoietikus őssejtek) immortalizációját (Donehower et al., 1992; Harvey et al, 1993; Bond et al, 1994; Metz et al., 1995) 6. ábra 9 napos egér embrió anterior régiójának hosszmetszeti képe. A kettős

nyilak az elő-, közép- és utóagy hólyagok határait jelzik. A p53 gén a tumor szupresszor gének családjába tartozik és fontos szerepet játszik a sejtciklus G1/S ill. G2/M átmenetének szabályozásában (Takimoto and ElDeiry, 2001) A p53-/- állatok normális fejlődése azonban jelzi, hogy a fehérje hiányát a sejtek és a szervezet kompenzálni tudja. Önálló transzkripciós faktorként aktiválja a p21 fehérje expresszióját, mely a cdk/cyclin komplexekhez kapcsolódva gátolja a DNS szintézis megindulásához szükséges transzkripciós faktorok kialakulását (White, 1994; Peters, 1994), így a sejtek a G1 fázisban megrekednek. A funkcionális p53 hiány másik – feltételezhetően immortalizációt kiváltó – hatása egyes apoptótikus folyamatok kiesése lehet (Hughes, et al., 1997; Bates and Vousden, 1996) A fehérje hiányában az önpusztító program azokban a sejtekben, amelyek genetikai állománya károsodott, vagy pedig olyan környezeti

feltételek közé kerültek, amelyek nem permisszívek a sejt túléléséhez (pl. növekedési faktorok hiánya) beindul A p53–deficiens sejtvonalak esetén a sejtek öregedését jelző telomera-rövidülés funkcionális p53 fehérje hiányában egy kritikus telomera hossz elérése után nem tudja beindítani a p53-mediált apoptózist 32 (Kang and Park, 2001), így az elöregedett sejtek p53 hiányában tovább folytathatják az osztódást. A p53-deficiens sejtvonalak esetében az immortalizáció több mechanizmus – a sejtciklus–reguláció sérülése, a meghatározott környezeti feltételek mellett indukálódó vagy telomera-rövidülés indukálta apoptózis kiesése – révén is kialakulhatott. A laboratóriumunkban eddig vizsgált p53-deficiens sejtvonalak (NE-4C, NE4C/A, NE-4C/B) indukálatlan állapotban folytonosan osztódnak, míg all-trans retinsav– kezelés (ATRA) hatására ideg– és gliasejteket alakítanak ki (Schlett and Madarász, 1997). A

sejtciklusból való kilépésük, végdifferenciálódásuk tehát funkcionális p53 gén hiányában is lehetséges. III. AZ ALL-TRANSZ RETINSAV (ATRA) SZEREPE AZ IDEGRENDSZER EMBRIONÁLIS FEJLŐDÉSE SORÁN Régóta ismert tény, hogy mind az A–vitamin hiánya, mind többlete súlyos fejlődési rendellenességek kialakulásához vezet az embrionális fejlődés során. Számos adat utal arra, hogy ezekért a rendellenességekért nem az A-vitamin, hanem a belőle kialakuló retinsav szintjének megváltozása a felelős (Durston et al., 1989; Agarwal and Sato, 1993). Sok multipotenciális sejtvonal esetében bizonyították, hogy retinsav– kezeléssel szöveti differenciáciálódásra késztethetők (pl. embrionális stem sejtek; PCC7, P19, NTera-2, NE-4C) A retinsav fejlődést szabályozó hatása régóta ismert és a sejtvonalak segítségével in vitro is vizsgálható (Imrik and Madarász, 1981; JonesVilleneuve et al., 1982; Henion and Weston, 1994; Schlett and

Madarász, 1997) Számos előnye mellett azonban, az idegrendszeri elköteleződés vizsgálatánál hátrányt jelent az embrionális karcinóma eredetű sejtek ill embrionális stem sejtek széles fejlődési potenciálja: a P19 sejtvonal a differenciáltatásra használt retinsav koncentrációjának függvényében mind fibroblasztok, mind izomsejtek, mind idegi elemek kialakítására is képes (Jones-Villeneuve et al., 1982; McBurney et al, 1982; Edwards and McBurney; 1983). A gerinces embriókban a fejlődés korai szakaszában termelődik retinsav: madaraknál a Hensen–csomóban, emlősőknél pedig a primitív árok mentén. A retinsav koncentráció-grádienst alkot az antero-poszterior testtengely mentén, így koncentráció- 33 függő módon képes aktiválni a testtengelyek szerinti (anterior-poszterior, dorzálisventrális, mediális-laterális) polarizációt kialakító régió-speifikus (pl. Hox, Otx, Lim, Emx, En, Pax) gének expresszióját (Simeone et al.,

1995; Bally-Cuif and Boncinelli, 1997; Lumsden and Krumlauf, 1996). RXRE– (Retinoid X Response Element) és RARE–szekvenciák (Retinoic Acid Response Element) találhatók fejlődésreguláló gének (Hox–géncsalád, Otx–2), illetve a retinsav saját receptorainak (RXRβ) szabályozó régiójában (Marshall et al., 1994; Chambon, 1996) Az elülső neuropórus záródása előtti (közép- és késő-gasztruláció) szakaszban exogén úton bejuttatott retinsav az elülső idegrendszeri struktúrák különböző mértékű redukciójához, illetve a gerincvelő és a nyúltagy különböző mértékű előreterjedéséhez vezet (Corcoran, 1998). Molekuláris biológiai vizsgálatok megmutatták, hogy a retinsav–függő morfológiai változások jól korrelálnak néhány régió–specifikus transzkripciós faktor expressziós mintázatának megváltozásával (Conlon, 1995; Simeone et al., 1995; Bally-Cuif and Boncinelli, 1997; Lumsden and Krumlauf, 1996) Az, hogy az

exogén úton bejuttatott retinsav súlyos fejlődési rendellenességek kialakulásához vezet és hatása koncentrációfüggő, bizonyítja, hogy a retinsav morfogenetikus hatású anyag. A retinsav nemcsak az idegrendszer fejlődésében játszik fontos szerepet, hanem a csontrendszer és a végtagok kialakításában is (Simeone et al., 1995). IV. CITOSZKELETÁLIS ÁTRENDEZŐDÉSEK A NEURONÁLIS DIFFERENCIÁCIÓ SORÁN A retinsav-indukálta idegsejt irányú elköteleződés együtt jár a sejtalak jellegzetes megváltozásával, melyet a citoszkeletális fehérjék expressziójának változásában is nyomon követhetünk. A neuronok differenciációja és érése során megindul a neuron-specifikus enzimrendszerek expressziója, megjelennek a neurotranszmisszióban szerepet játszó átvivő-anyagok sejtfelszíni receptorai, kialakul metabolizmus-rendszerük, valamint a szinaptikus komplexek differenciációja is elindul. A sejtváz dinamikus átépülésre képes

alkotói sejt-specifikus, illetve fejlődési állapot függő összetételben és elrendezésben találhatók a fejlett gerincesek sejtjeiben. 34 Az idegrendszert kialakító progenitorsejtek fenotípus determinációja során a sejtvázban is mélyreható változások lépnek fel a sejtek osztódása, vándorlása és nyúlványosodása során. A kialakuló idegsejtek érése folyamán jellegzetesen és reprodukálhatóan megjelenő vagy eltűnő molekulák kimutatása így jelentősen megkönnyíti egyes sejtcsoportok ill. elköteleződési lépések azonosítását IV./1 Az köztes filamentum fehérjék Az eukarióta sejtváz főbb komponensei a köztes filamentumok (10nm átmérő), a mikrofilamentumok és a mikrotubulusok. A köztes filamentumokra a többi citoszkeletális vázelemnél nagyobb sejttípus-specifitás jellemző. A köztes filamentum szupercsaládba tartozó hat molekulacsaládra egyaránt jellemző, hogy az egyes családokon belüli nagyfokú homológia

ellenére a molekulcsaládok között csak korlátozott hasonlóságot találtak. Az idegi progenitor sejtek jellegzetes, átmenetileg expresszálódó köztes filamentum fehérjéje a nesztin6 (Lendhal et al., 1990) Expressziója az idegsejtek korai fejlődése során lecsökken és érett neuronokból teljesen el is tűnik (Schlett and Madarász, 1997). Az idegsejtek fejlődése során a neurofilamentum (NF) fehérjék közül elsőként a NFL és a közepes neurofilamentum fehérje (NFM) expressziója indul meg, melyet csak késéssel követ a nehéz neurofilamentum fehérje (NFH) expresszió (Shaw and Weber, 1982; Riederer et al., 1992). A neurofilamentumok in vivo obligát heteropolimerek, amelyek NFL és NFM vagy NFH formát tartalmaznak. A három alegység hozzájárulása a heteropolimer kialakításához jelentősen változik a neuronális differenciáció különböző szakaszaiban. A neurofilamentumok dinamikus átrendeződése az alegységek foszforilációja révén

szabályozódik mind in vivo, mind in vitro (Lee and Cleveland, 1996). A neurális nyúlvány-növekedés korai szakaszában a neurofilamentumok csak kis mennyiségben fordulnak elő a növekvő nyúlványokban, de a nyúlványok stabilizálódása, a szinaptikus 6 Nesztin tranziens expresszióját szintén megfigyelték embrionális és újszülött állatok izomszövetében (Lendhal et al., 1990; Zimmerman et al, 1994) NFM és NFL ektopikus expressziója volt megfigyelhető éretlen Schwann sejtekben (Kelly et al., 1992; Roberson et al, 1992) ill NFH expresszió T-lymphocitákban és embrionális szívizom-sejtekben (Murphy et al., 1993) Ezen fehérjék idegrendszeren kívüli expressziójának jelentősége még nem tisztázott. 35 struktúrák differenciációja és a mielin-hüvely kialakulása után a neurofilamentum fehérjék meghatározó citoszkeletális elemmé válnak az axonokban (Lee and Cleveland, 1996), fenntartva a nyúlvány-rendszer alakját és az axon

átmérőjét (Lee and Cleveland, 1996). A gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP) az asztrociták sejtvázának jellegzetes köztes filamentum fehérjéje (Dahl and Bignami, 1986). IV./2 A mikrotubuláris rendszer A mikrotubuláris rendszert α és β tubulin fehérjék építik fel, melyek heterodimerekként fordulnak elő. Gerincesekben hat különböző α és hat különböző β tubulin gén ismert (Sullivan, 1988; Wang et al., 1986), melyek közül 5-5 variáns expresszióját az idegrendszerben is leírták (Villasante et al., 1986) A β típusú tubulin fehérjék közül a neuronális differenciáció során a III β-tubulin (N-tubulin) az elsőként megjelenő izotípus és az egyetlen, amely főleg neuronokban (Asai and Remolona, 1989; és kismértékben a testis sertoli sejtjeiben (Lewis and Cowan, 1988) expresszálódik. Jelenlétét kimutatták már a neuronok utolsó osztódása alatt (Dráberová et al., 1998, Menezes and Luskin, 1994). A N-tubulin elsőként E8

embrionális korban sikerült kimutatni (Fanarraga et al., 1999), mennyisége nagymértékben emelkedett E13-tól egészen postnatális P5 korig. A differenciálódó idegsejtekben korábban megjelenő foszforilálatlan N-tubulin forma a sejtváz plaszticitását biztosítja a nyúlvány-növekedés korai szakaszában (Ferreira and Caceras, 1992), míg a foszforilált formák a kialakuló nyúlványokat stabilizálják. Az idegsejtek fejlődése során a sejtvázat felépítő fehérjék expressziója fejlődéstanilag meghatározott és függ az expresszáló sejt típusától és a sejt fejlődési állapotától. Két fő expressziós csoportot különítünk el: a korai és késői expressziójú fehérjéket. Az első csoportba a Map5 (mikrotubulus-asszociált fehérje; Riederer et al, 1986), Map2b és Map2c (Binder et al., 1984; Riederer and Matus, 1985) valamint a juvenilis τ fehérje (Brion et al., 1988) tartozik Ezek a fehérjék a sejtvázba épülve biztosítják a

sejtváz nagyfokú plaszticitását, mely nélkülözhetetlen a nyúlványnövekedés és differenciáció során. A késői komponensek, mint az NFL, NFM (Dahl and Bignami, 1986), Map1a és Map2a (Riederer and Matus, 1985), felnőtt τ 36 fehérje (Binder et al., 1985) és agyszövet-specifikus spektrin (Riederer et al, 1987) a neuronális struktúrák fenntartása és stabilizálása során döntő jelentőségűek. 37 CÉLKITŰZÉSEK 1. A klasszikus neurotranszmitterek (glutaminsav és GABA) korai neurogenezisben betöltött szerepének vizsgálatára olyan in vitro modellrendszert kívántam kialakítani, amely alkalmas a neurogenetikus folyamatok sejtbiológiai és molekuláris biológiai vizsgálatára. A modellrendszer felhasználásával az idegi irányú elköteleződés folyamatának biztosan reprodukálható fázisait anatómiai, citokémiai sajátságok alapján szerettem volna jellemezni. 2. Az in vitro neurogenezis különböző stádiumaiban vizsgálni

kívántam a glutaminsav hatásait közvetítő ionotróp glutamát receptorok megjelenését és lehetséges szerepét az idegi elköteleződés során. A célok között szerepelt: a/ az NMDA receptor alegységek mRNS- és fehérje-formáinak kimutatása b/ funkcionális NMDA receptorok kimutatása c/ AMPA receptor alegységek expressziójának vizsgálata d/ Funkcionális AMPA receptorok kimutatása és neurogenezisben betöltött szerepük vizsgálata az NE-7C2 sejtek in vitro idegi fejlődése során 3. Feladatul tűztem ki a glutaminsav - GABA átalakulásért felelős enzimcsalád, az embrionális és felnőtt GAD formák in vitro expressziós mintázatának feltérképezését és esetleges szerepük tanulmányozását az idegsejt-fenotípus kialakításában: a/ az embrionális és felnőtt GAD mRNS- és fehérje-formák expressziós mintázatának és sejtes lokalizációjának tanulmányozását b/ GABA-tartalmú idegsejtek azonosítását és eloszlásuk

vizsgálatát az NE-7C2 sejtek in vitro idegi fejlődése során 38 ANYAG ÉS MÓDSZER I. AZ ALKALMAZOTT SEJTTENYÉSZTÉSI KÖRÜLMÉNYEK I./1 Sejtek fenntartása, kezelése Az NE-7C2 sejtvonalat az Idegi Sejtbiológia laboratórium munkatársai állították elő (Schlett and Madarász, 1997) és fagyasztva különböző passzázsok állnak rendelkezésre. Az NE-7C2 sejteket 5% CO2 tartalmú, 37°C–os termosztátban poli–L– lizinnel (PLL) bevont szövettenyésztő petricsészében (Greiner), Minimal Essential Mediumban (MEM, Sigma) növesztettem, melyhez 10% FCS–t (Fötális Borjú Savó, Sigma), 4mM glutamint, 40 µg/ml gentamicint és 1.25µg/ml amphotericinB-t adtam A sejteket 105 sejt/cm2 sűrűségig engedtem nőni, majd 0.05% tripszin–PBS (Phosphate Buffered Saline) oldattal felpasszáltam és 5x higításban újra kiültettem őket. Immuncitokémiai festések során 24 lyukú szövettenyésztő edényeket használtam üveglemezekkel és 105 sejtet tettem minden

lyukba, míg az in situ ELISA mérésekhez 96 lyukú szövettenyésztő tálcákra ültettem ki 104 sejtet minden lyukba. Az [Ca2+]IC mérésekhez 35mm átmérőjű petricsészékben UV fényt áteresztő üveglemezeken nőttek a sejtek meghatározott időtartamokig. All-transz retinsav (Sigma) 0.01M-os, dimetil-szulfoxidban (DMSO, Sigma) oldott törzsoldatát folyékony nitrogénben tároltam. Ennek 10-4M MEM-ben oldott munkahigításával közvetlenül állítottam be a 10-6- 10-8 M-os végkoncentrációt a sejtek folyadékkörnyezetében. I./2 Kromoszóma-preparátumok készítése A növekedés log fázisában lévő tenyészeteket 10-7 M végkoncentrációban kolcemiddel kezeltem 1,5 órán keresztül. A sejteket tripszines kezeléssel felszedtem az aljzatról és 1000g - n 10 percig tartó centrifugálással összegyűjtöttem. A sejtcsapadékot 0.56% KCl-al 10 percig hipotonizáltam, majd a duzzadt sejteket és citoplazma-mentes sejtmagokat frissen készített metanol-ecetsav

1:3 arányú keverékével 3-4x fixáltam. A preparátumot krómkénsavval zsírtalanított tárgylemezre csöppentettem és 24–48 óráig száradni hagytam. A feldolgozást megelőzően a lemezeket 2% Giemsa–tartalmú (066 39 M Na2HPO4, 0.66 M KH2PO4) oldattal 10 percig festettem és 1250x nagyítás mellett számoltam le a kromoszómákat. Az NE-7C2 sejtvonal kromoszómaszám-változásait 81 passzázs során követtem. A vizsgált passzázsokból 50-50 mitózisban megszámoltam a kromoszómákat és grafikusan ábrázoltam a kromoszómaszámok megoszlását egy-egy passzázson belül (7. ábra). A vizsgált passzázsokban összeadtam azokat a kromoszómaszámokat, amelyek az 50 és 80 értékek közé estek és elosztattam az összeget az ezen tartományba eső mitózisok számával. Az így meghatározott értéket a kromoszómaszámok súlyozott átlagának neveztem. II. SZEMIKVANTITATÍV RT-PCR VIZSGÁLATOK II./1 Ionotrop glutamát receptor alegységek kódoló RNS

formáinak kimutatása A munka a Stuttgarti Egyetem Sejt- és Immunbiológiai Laboratóriumában Dr Ulrich Eisel-el való kollaboráció keretében készült. Kontroll és ATRA-kezelt NE-7C2 sejtek tenyészeteiből Trizol-LS reagens segítségével (Gibco BRL) totál RNS-t izoláltam és a mintákat kiküldtem a Stuttgarti Egyetem laboratóriumába (két független mintasorozat), ahol a kísérlet további lépéseit Dr Schlett Katalin végezte el. Az RT-PCR reakciók során felhasznált pozitív kontroll RNS-eket 30 napos egér kisagyi és előagyi régióiból PeqGold RNAPure (PEQLAB Biotech., Erlangen, Germany) felhasználásával készítette Az RNS-mintákat DNázI-el kezelte 37°C-on 15 percig, majd az így kapott genomiális szennyezéstől mentes RNSből 3µg-t átírt komplementer cDNS-re a First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI Fermantas, St. Leon-Rot, Germany) valamint random hexamer vagy oligodT primerek felhasználásával. A PCR-reakciókhoz PTC-200 Peltier Thermal Cycler

berendezést (MJ Research Inc., Watertown, MA, USA) és HotStarTaq polimerázt (Qiagen, Hilden, Germany; 1U / 50µl reakciótérfogat) használt. Az mRNS expresszió mennyiségi kiértékelése céljából ugyanabban a reakcióelegyben a glicerin-aldehid-foszfát dehidrogenázt (GAPDH, 11. primer pár) kódoló mRNS-t is felszaporította párhuzamosan az AMPA és NMDA receptor alegység mRNS-kel. A negatív kontrollok ugyanazt a reakcióelegyet tartalmazták de templátként RNS szolgált, a pozitív 40 kontrollok esetében pedig előagyi és kisagyi (az NR2C detekció esetén) cDNS-ről történt az amplifikáció. A PCR termékeket 2%-os, etidium-bromiddal megfestett agaróz gélen futtatta meg és értékelte ki. A PCR analízisekhez tervezett primer-párok szekvenciáját az 2. Táblázat tartalmazza. Az RT-PCR analízisek mindkét mintasorozatból többször lettek megismételve, az ábrákon egy-egy reprezentatív eredmény szerepel. II./1/1 AMPA receptor alegység

mRNS-einek kimutatása A PCR reakciómix 1.5 mM MgCl2-t, 02 mM dNTPs-t (PEQLAB Biotech; Erlangen, Germany) és 0.2 µM primert tartalmazott az 1-3 primer párokkal (2 táblázat) történő amplifikálás esetén. A PCR reakció egy 15 percig tartó aktiválással indult 95ºCon, majd 35 ciklus következett az alábbi hőmérsékleteken: 94ºC 60 sec, 60ºC 60 sec és 72ºC 60 sec. Az amplifikációk egy 72ºC-on 10 percig tartó elongációs szakasszal zárultak. II./1/2 NMDA receptor alegységek mRNS-einek kimutatása A PCR reakciókeverék 2.5 mM MgCl2-t és 04 mM dNTP mixet tartalmazott az 4. és 11 primerekkel (2 táblázat) történő cDNS amplifikáció során, illetve 15mM MgCl2-t és 0.2 mM dNTP mixet a 5-10 primerekkel (2 táblázat) való láncreakció esetén. A PCR reakció egy 15 percig tartó aktiválással indult 95ºC-on, majd ezt követte egy 40-szer ismétlődő hőmérsékleti ciklus: 94ºC 60 sec, 72ºC 120 sec (a 4., 6 és 10 primer párok); 94ºC 60 sec, 62ºC

45 sec, 72ºC 120 sec (5. primer pár); 94ºC 45 sec, 67ºC 60 sec, 72ºC 60 sec (7. és 8 primer pár); 94ºC 60 sec, 63ºC 60 sec, 72ºC 60 sec (9 primer pár); ill. 30 ciklus 94ºC 60 sec, 55ºC 60 sec, 72ºC 60 sec a 11-es primer pár esetén. A reakciók egy 10 percig tartó elongációs szakasszal zárultak 72ºC-on II./2 GAD65 és GAD67 transzkriptumok kimutatása A vizsgálatokat a Dr Szabó Gábor által vezetett Genetikai és Molekuláris Biológiai Laboratóriumban készítettem az MTA-KOKI-ban. Totál RNS-t izoláltam kontroll és ATRA-kezelt NE-7C2 sejtek tenyészeteiből (két független mintasorozat) Trizol-LS reagens segítségével (Gibco BRL). 2µg RNS-t átírtam komplementer cDNS-é a GeneAmp RNA-PCR Kit (Perkin-Elmer) segítségével 41 random hexamer primerekkel. A PCR-reakciókhoz Hybaid Thermal Cycler berendezést (Thermo Hybaid, UK), Perkin-Elmer vagy Promega Taq polimerázt (1U / 30µl reakciótérfogat) használtam és a reakció-elegyhez radioaktívan

jelölt [32P]dCTP-t (3000Ci/mmol; Izotóp Intézet, Budapest) is adtam. PCR analízisekhez tervezett primerpárok szekvenciáját az 2 Táblázat tartalmazza (12 – 15 primer párok) A PCR amplifikációt egy 95ºC-on 5 percig tartó denaturációval indítottam, majd 31 ciklus következett az alábbi hőmérsékleteken: 94ºC 45 sec, 58ºC 45 sec, 72ºC 60 sec (12. és 14. primer párok); 94ºC 45 sec, 62ºC 45 sec, 72ºC 90 sec (13 primer pár) A reakció egy 10 percig tartó elongációs szakasszal zárult 72ºC-on. A negatív kontrollok ugyanazt a reakcióelegyet tartalmazták de templátot nem adtam a rendszerhez. Az mRNS expresszió mennyiségi kiértékelése céljából a β-aktint kódoló mRNS-t is felszaporítottam (15. primer pár) párhuzamosan a GAD mRNS-kel 16-20 cikluson keresztül ugyanabban a reakcióelegyben. Az amplifikált radioaktív termékeket 15% ill 1.6% etidium-bromiddal festett gélen futtattam és nylon membránra vittem át (GeneScreen Plus,

NEN). Az autoradiogrammok denzitometriás kiértékelését a Scion Image programmal (Scion Corp.) végeztem el és a GAD-csíkok denzitását β-aktin-ra vonatkoztatva normalizáltam. A GAD mRNS-ek kimutatását mindkét mintasorozaton kétszer végeztem el és egy-egy reprezentatív eredményt kiválasztva készítettem el az ábrát. III. WESTERN BLOT ANALÍZIS III./1 Fehérjeminták készítése szubcelluláris frakcionálással 90mm átmérőjű petricsészén növő NE-7C2 sejteket 0.02% EDTA-t tartalmazó 2+ Ca , Mg2+-mentes PBS oldattal összegyűjtöttem majd 800g-n centrifugálással leülepítettem. A továbbiakban minden lépést +4ºC-on végeztem el A sejteket tartalmazó csapadékot a felhasználásig -80ºC-on tároltam. A szubcelluláris frakcionálás céljából a sejteket kézi sejt-homogenizátorral (Sigma) feltártam 300 µl pufferben (pH=7.4), amely 10 mM HEPES-t, 250 mM szacharózt [valamint 1 mM aminoethylthioammonium bromide (AET) és 0.2 mM PLP-t a GAD

fehérjeformák esetében] és proteáz-gátlókat tartalmazott (100 mM phenylmethylsufhonyl fluorid, 10 mM benzamidine, 1 µg/ml leupeptin, antipain, pepstain, aprotinin). Ezután a 42 sejthomogenátumot lecentrifugáltam 2000g-vel 5 percig, hogy a sejtmagokat eltávolítsam. A felülúszót és 16000g-vel centrifugáltam tovább 30 percig, hogy elválasszam a nagyobb sejtalkotókat és membrán-darabokat (durva membrán-frakció). A felülúszó citoplazmás frakció eltávolítása után a csapadékot feloldottam 100 µl pufferben, amely 10 mM HEPES-t, 150 mM NaCl-t és az előzőekben felsorolt proteázgátlókat tartalmazta. A durva membrán frakciót ezután jégen inkubáltam 1 órán keresztül. A GAD fehérjeformák kimutatása esetében a durva-membrán frakciót 100µl 2% TritonX-114-t tartalmazó pufferben oldottam vissza, amely 10 mM HEPES-t, 150 mM NaCl-t, 1mM AET-t, 0.2 mM PLP-t és az előzőekben felsorolt proteáz-gátlókat is tartalmazta. A membrán-mintákat

elhomogenizáltam és lecentrifugáltam 16000g-vel 30 percig. A felülúszó frakció a TritonX-114 oldható durva-membrán frakció nevet kapta A keletkező csapadékot 50µl pufferben oldottam vissza, amely 150 mM NaCl-t, 10 mM HEPES-t, 1 mM AET-t, 0.2 mM PLP-t és proteáz-gátlókat tartalmazott (TritonX-114 oldhatatlan durva-membrán frakció). III./2 Fehérjetartalom meghatározása A minták fehérjetartalmának meghatározását Bradford módszere szerint végeztem (Bradford 1976) a Biorad Standard Protein Assay felhasználásával. A 01 N NaOH-ban felvett mintákat Bradford reagenssel 10 percig inkubáltam. Az oldatok abszorbanciáját ELISA-reader segítségével mértem 595 nm hullámhosszon (405 nm referencia hullámhossz mellett). Kalibráláshoz borjú szérum albumin (BSA) koncentráció-sort használtam (0.1-20 µg/µl koncentráció-tartományban) A minták fehérjetartalmát 1µg/µl-re állítottam be Laemmli-puffer (Laemmli et al., 1970) segítségével III./3

Western blot III./31 NMDA receptor alegység fehérjéinek kimutatása A citoplazmás és durva membrán frakciókból vett mintákat 2x töménységű minta-pufferben (125mM Tris-HCl, pH 6.8; 6% glicerin; 4% SDS; 10% βmerkaptoetanol és 00025% brómfenol kék) felvettem és 1 órán keresztül inkubáltam 37ºC-on. A mintákat ezután 12% poliakrilamid gél zsebeibe vittem fel (10 µg fehérje / zseb NR1 és NR2B esetében valamint 10 és 60 µg fehérje / zseb NR2A esetében) és a 43 fehérjéket elektroforézissel elválasztottam. A fehérjék szeparálása BioRad Mini Protean II készülék segítségével 50mA áramerősség mellet 1 órán át tartott (Futtató puffer: 192 mM glicin, 25 mM Tris bázis). A gélből a fehérjéket átblottoltam (blottoló puffer: 192 mM glicin, 25 mM Tris bázis, 20% metanol) nitrocellulóz membránra (Immobilon NCpure, Millipore) 80V-on 50 percig, majd 90V-on 10 percig. Az aspecifikus kötőhelyek lefedésére a membránt 30 percig

rázattam Tris-pufferelt sóoldatban (TBS; 50 mM Tris, 100mM NaCl; pH=7.4), amely 005% Tween-20-t és 2% BSA-t tartalmazott A membránokat egy éjszakán keresztül inkubáltam az I. réteg ellenanyagokkal A kísérlet céljától függően az alábbi ellenanyagokat használtam: anti - NR1 (0.5 µg/ml; Chemicon), anti - NR1 (1 µg/ml; az ellenanyag M. Watanabe-tól származik, Watanabe et al., 1998), anti - NR2A (1 µg/ml,; Upstate Biotechnology), anti - NR2A (1 µg/ml; az ellenanyag M. Watanabe-tól származik) és anti - NR2B (1 µg/ml; Transduction Laboratories). A membránokat ezután háromszor mostam TBS-oldattal, amely 005% Tween-20-t tartalmazott (TBST), majd alkalikus foszfatázzal konjugált anti-nyúl vagy anti-egér IgG (Jackson Immuno-Research Laboratories) 1:10000 higított oldatával (TBST-ben) jelöltem a membránt 1 órán keresztül, szobahőn. A membránokat háromszor mostam TBST oldattal, majd a kötött ellenanyagot 5-bromo-4-kloro-3indolyl foszfát (BCIP, 0.165

µg/ml; Sigma) és nitro blue tetrazólium (NBT, 033 µg/ml; Sigma) alkalikus puffer-oldatában (0.1M Trizma-base, 5mM MgCl2 és 01M NaCl; pH=9.5) tettem láthatóvá III./32 GAD fehérjeformák kimutatása A GAD fehérjeformákat Katarova Zóya módszere alapján mutattam ki (Katarova et al., 1990) A korábban leírt három szubcelluláris frakcióból (citoplazmatikus frakció, TritonX-114 oldható és TritonX-114-oldhatatlan durva membrán frakciók) vett mintákat Laemmli-pufferben forraltam 5 percig, majd 12%-os gélen futtattam (15µg fehérje / zseb, BioRad Mini Protean II) 50mA áramerősség mellett a már korábban említett futtató puffer felhasználásával. A fehérjéket ezután átblottoltam nitrocellulóz membránra (Hybond-C, Amersham) lépcsősen növelve a feszültséget. A kis molekulatömegű GAD25 és GAD44 fehérjéket 60V-on 20 percig, majd 80V-on 30 percig blottoltam, a GAD65 és GAD67 fehérjéket 60V-on 10 percig, 80V-on 40 percig, majd 90V 10 percig

transzferáltam. A membránokat ezután 2% BSA- 44 TBST oldatban inkubáltam 30 percig, hogy az ellenanyag aspecifikus kötődését lecsökkentsem, majd egy éjszakán keresztül inkubáltam a következő I. réteg ellenanyagok valamelyikével: # 6799 poliklonális szérum, mely az összes GAD-formát felismeri (1/2000; Katarova et al., 1990), a GAD65 fehérje ellen termeltetett GAD6 monoklonális ellenanyag (1/500; Developmental Studies Hybridoma Bank, Chang and Gottlieb, 1998) és # 8876 poliklonális szérum, amely az embrionális GAD25 fehérjére specifikus (1/1000; Szabó et al., 1994) A membránokat ezután háromszor mostam TBST-oldattal, majd alkalikus foszfatázzal kapcsolt anti-nyúl (Jackson ImmunoResearch Laboratories) vagy anti-egér (Promega) IgG 1:10000-re higított oldatában (TBST-ben) rázattam 1 órán keresztül szobahőn. Az ellenanyaggal megjelölt fehérjéket BCIP és NBT előbbiekben leírt oldatával festettem meg. IV. IMMUNCITOKÉMIAI VIZSGÁLATOK Az

immuncitokémiai vizsgálatokhoz a sejteket 12 mm átmérőjű, PLL-el bevont üveg fedőlemezen (Erie Scientific) tenyészettem 24-lyukú szövettenyésztő edényekben (Greiner). Az immunfestések során felhasznált ellenanyagokat a 3 táblázat foglalja össze. IV./1 Neuron-és gliaspecifikus fehérjék kimutatása A tenyészeteket PBS oldatával mostam, majd 4%-os paraformaldehid oldatban (Taab; PBS-ben oldva) fixáltam 20 percig szobahőmérsékleten. A GABA kimutatásához 4% paraformaldehid és 0.1% glutáraldehid frissen készített oldatával fixáltam 10 percig. Háromszori mosás után TritonX-100 01%-os oldatával (5 percig, szobahőn) átjárhatóvá tettem a sejtfelszíni membránokat. Ezt követően 1% BSA-PBS vagy 5% FCS-PBS oldatban inkubáltam a tenyészeteket 1 órán keresztül, hogy az aspecifikus kötődést megakadályozzam. Vizsgálataimban az alábbi ellenanyaghigításokat alkalmaztam: N-tubulin (Dráberová et al, 1998) 1/1000, gliális fibrilláris savas

fehérje (GFAP, Sigma) 1/1000, szinapszin I (Chemicon Int.) 1/500, szinaptofizin (Sigma) 1/500, neurofilament 68 kD (NFL, Sigma) 1/500, neurofilament 145 kD (NFM, Sigma) 1/500, neurofilament 200 kD (NFH, Sigma) 1/500, Map2 (Sigma) 1/1000 és nesztin (Pharmingen) 1/1000. A tenyészetek háromszori mosása (PBS) után biotin(Vector) ill fluoreszcein izotiocianát-(FITC; Sigma) kapcsolt másodlagos antitesteket 45 adtam a tenyészetekhez 1/500 higításokban 1 órán keresztül. A fluoreszcens festékkel jelölt preparátumokat Mowiol 4.88 (Polysciences) segítségével üveg tárgylemezekre ragasztottam és Zeiss Axiophot fluoreszcens mikroszkóppal értékeltem ki. A normál fénymikroszkópos vizsgálatokhoz harmadik rétegként avidin-biotin komplexet (Vector) adtam 1/500 higításban 45 percig, majd az immunjelet 3-3’-diamino-benzidin (0.55 mg/ml TBS-ben; pH=7.6) és 03% H2O2 oldatával tettem láthatóvá IV./2 NMDA receptor NR1 és NR2B alegységeinek kimutatása A

tenyészeteket 4%-os paraformaldehid oldattal fixáltam 20 percig szobahőmérsékleten, majd háromszori mosás után a tenyészetek egy részét TritonX-100 0.1 %-os oldatával permeabilizáltam a fent leírtak szerint Ezt követően 1% BSA-PBS oldattal 1 órán keresztül blokkoltam a nem-specifikus kötőhelyeket. Az ellenanyag higítások a következők voltak: anti-NR1 (K21322, az ellenanyagot M. Herkert-től kapta a munkacsoport, Herkert et al., 1998) 1/100, anti-NR1 (Pharmingen) 1/500, anti-NR2B (K83084, az ellenanagot szintén M. Herkert-től kapta Madarász Emília, Herkert et al, 1998) 1/100 és anti-NR2A (Upstate Biotochnology) 1/500. Az immunreakciót egyrészt anti-egér IgG FITC-el hívtam elő, másrészt biotin, majd avidin-biotin komplex segítségével amplifikáltam és DAB-csapadékkal tettem láthatóvá az előzőekben leírtak alapján. IV./3 GAD fehérjeformák kimutatása A GAD fehérjeformák kimutatását 4% paraformaldehid fixálás előzte meg 20

percig, majd a fixált tenyészeteket 1% BSA-TBST oldattal permeabilizáltam és blokkoltam. Első rétegként a következő ellenanyagokat használtam a felsorolt higításokban: # 6799 (1/1000), N65 (1/500, a 65kD GAD fehérjeformát ismeri fel; az ellenanyagot Szabó Gábor munkacsoportja kapta P. DeCamilli-től; Solimena et al, 1993), # 8876 (1/1000, a 25 kD GAD fehérje ellen lett termeltetve) és affinitás-tisztított # 8877 (GAD44 fehérjére specifikus poliklonális ellenanyag, melyet Szabó Gábor munkacsoportja állítatott elő; 1/100). Az első réteg ellenanyagokat 48 óráig hagytam a tenyészeteken +4ºC-on. A tenyészetek háromszori mosását követően biotinnal jelölt anti-egér IgG vagy anti-nyúl IgG (1/1000, Vector) ellenanyagokkal inkubáltam 1 órán keresztül, majd ezt követően sztreptavidin peroxidázzal (1/1000, Sigma) szintén 1 órán 46 át. Az immunjel további erősítéséhez biotinnal kapcsolt tyramidot (TSA Biotin System, NEN) is használtam

1/100 higításban, majd az így megjelölt immunkomplexet sztreptavidin-Cy3 (1/1000, Sigma) ill. avidin-FITC (1/500, Vector) segítségével tettem láthatóvá. A festett tenyészeteket hordozó fedőlemezeket Mowiol 4.88-al tárgylemezekre ragasztottam és az immunjelet BioRad konfokális lézer mikroszkóppal valamint Zeiss Axiophot fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltam. V. A TENYÉSZETEK SEJT- ILL IDEGSEJT-TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA V./1 A tenyészetek sejtszámának meghatározása a tenyészetek életképességének mérésével A mérési módszer a sejtek anyagcsere-aktivitását határozza meg a redukáló képesség mérése által. A sejteket 96 lyukú műanyag szövettenyésztő tálcán növesztettem 100 µl tápfolyadékban. Az MTT (3–(4,5 Dimethylthiazol–2–yl)– 2,5diphenyltetrazólium–bromide, Sigma) reagens törzsoldatát (1.25 mg/ml) –20°C–on tároltam. A sejttenyészetekhez 125 µg MTT reagenst adtam 60 µl tápfolyadékban oldva. A

sejtekben található NADH2 és NADPH2 a tetrazóliumsót kék színű formazánkristállyá redukálja, így a sejtekben található kristályok mennyisége arányos lesz a redukáló-kapacitással. A kék formazánkristályok megjelenése után 140 µl savas izopropil–alkoholt (100 ml 2–propanol, 0.6 ml cc HCl) adtam a tenyészethez a kristályok és a sejtek feloldása végett. 10 perc állás után optikai tisztaságig szuszpendáltam az oldatot és ELISA készüléken kettős hullámhosszon lemértem (referencia hullámhossz: 630 nm; mérési hullámhossz: 570 nm). A tenyészetekben mért optikai denzitás adatok arányosnak mutatkoztak a tenyészetekben lévő élő sejtek számával. V./2 Idegsejtek számának meghatározása immuncitokémiával Az egy fedőlemezen található összes idegsejtet sejtszámolással határoztam meg. A neuronokat N-tubulin immunfestéssel azonosítottam (lásd korábban), majd 400x nagyítás mellett látóterenként megszámoltam az idegsejtek

számát. 47 Minden esetben három testvértenyészet adatait vettem fel (n=3) és kiszámítottam a tenyészetekben átlagosan egy látótérre eső N-tubulin immunreaktív sejtek számát. Ezt követően ezekből az átlagokból meghatároztam a három tenyészetben átlagosan egy látótérre eső neuronok számát és kiszámítottam az ettől való eltéréseket is. A szignifikanciát kettős T-teszt segítségével határoztam meg. *: p<0.05; *: p<0.005 V./3 Idegsejtek mennyiségi meghatározása in situ ELISA módszerrel A sejtek PLL-el bevont 96 lyukú műanyag szövettenyésztő tálcán nőttek (Greiner). A fixálás és tritonozás az immuncitokémiai módszereknél leírtakkal megegyezett. A fixált, permeabilizált sejteket N-tubulin specifikus ellenanyaggal jelöltem (1:5000, egér IgG, monoklonális). Foszfát pufferes (PBS) mosások után antiegér IgG-HRPO (horse radish peroxidase, Sigma) ellenanyaggal inkubáltam a tenyészeteket (1:10000 higítás, 1.5

óra), majd a peroxidáz szubsztrátjaként citrát pufferben oldott (24 mM citromsav, 51 mM Na2HPO4 x 2H2O) orto-fenilén-diamint (OPD, 2mg/ml; 10 µl cc H2O2 / 50ml puffer) használtam előre meghatározott ideig. Az enzimreakciót 4.5 M kénsav oldatával állítottam le A színreakciót ELISA fotométer (SLT Labinstruments Company) segítségével detektáltam, melynek során a mérési hullámhossz 492 nm, a referencia hullámhossz pedig 405 nm volt. A reakció intenzitását a két hullámhosszon mért adszorpció különbsége adta (OD492 - OD402). Az N-tubulin tartalmakat 9-9 párhuzamosan kezelt testvértenyészetben határoztam meg minden egyes mérési időpontban ill. kezelési csoportban, és kiszámoltam az egy tenyészetre átlagosan jellemző N-tubulin értéket és a hozzá tartozó szórást is. A szignifikanciát kettős T-teszt segítségével határoztam meg. *: p<0.05; *: p<0.005 48 VI. SEJTEN BELÜLI SZABAD CA2+-SZINT MEGHATÁROZÁSA

MIKROFLUORIMETRIÁVAL A vizsgálatokhoz felhasznált sejteket PLL-el bevont üveglemezen (22 mm átmérő) növesztettem. A mérés előtt 1 µM Fura-2/AM-t (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) tartalmazó oldattal inkubáltam a sejteket 45 percig CO2-inkubátorban, Mg2+jelenletében (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM glükóz és 10 mM HEPES; pH=7.4) vagy hiányában (140 mM NaCl, 47 mM KCl, 26 mM CaCl2, 10 mM glükóz és 10 mM HEPES; pH=7.4) A mikrofluorimetriás vizsgálatok inverz Nikon TDM Diaphot epifluoreszcens mikroszkóp fűthető tárgyasztalán történtek, 100x objektív nagyítás mellett. A kalciumot kötött Fura-2 formát 340 nm, a kalciumot nem kötő formát pedig 380 nm hullámhosszú fénnyel gerjesztettem. Az emittált fény intenzitását 520 nm hullámhosszon detektáltam fotosokszorozó (D104 Microscope Photometer, PTI, South Brunswick, NJ, USA) segítségével. Az intracelluláris Ca2+tartalom változásait a két intenzitás-érték

hányadosából képzett arány (F1/F2) mutatta meg (Felix program, Gryenkiewicz et al., 1985) Az NMDA-t (Sigma; 100 µM), AMPA-t (Tocris; 100 µM), ω-conotoxinMVIIC-t (Tocris 1 µM) és nifedipint (Tocris; 1 µM) mikrokapilláris segítségével nitrogéngáz túlnyomással a sejtek közvetlen környezetébe injektáltam, míg a D,L AP5-t (Tocris; 500 µM), KCl-t (20 mM) és GYKI52466-t (100 µM, Tarnawa Istvántól kapta a munkacsoport) közvetlenül a mérőoldatba higítottam. Az NMDA-hatásokat 10 µM glicin, az AMPA-hatásokat 10 µM ciklotiazid jelenlétében mértem. A mérések során kiválasztottam a tenyészetből egy-egy sejtet és a fotosokszorozó nyílását leszűkítettem a kiválasztott sejt sejttestére. Ha a hatóanyagokat (D,L AP5 és GYKI52466) a mérőoldatba adagoltam, az adott mérés befejeztével a tenyészetet nem használtam tovább. A mikrokapilláris segítségével bejuttatott nifedipin és conotoxin esetében egyegy tenyészedényből három sejtet

regisztráltam egymástól távol eső területekről, és ezután a tenyészetet további mérésre nem használtam. 49 VII. AZ EXTRACELLULÁRIS GLUTAMÁT KONCENTRÁCIÓJÁNAK FLUORIMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA SEJTEK FOLYADÉKKÖRNYEZETÉBŐL A méréseket a Semmelweis Egyetem Biokémiai Intézetében, Dr Tretter László irányításával, Környei Zsuzsa segítségével végeztem. A tenyésztő-médium glutaminsav-koncentrációjának meghatározásához három-három párhuzamosan kezelt sejtkultúra felülúszóját használtam fel minden mérési időpontban. A tenyészetek tápfolyadékából 650 µl mintát vettem és 1000 rpm mellett 10 percig centrifugáltam. A sejtes törmeléktől mentesített felülúszókból 600 µl-t a mérésig -20 Co-on, lefagyasztva tároltam. A mérés megkezdése előtt a felolvasztott mintákat szérummentes táppal (MEM, 900 µl) dializált glutamát-dehidrogenáz enzimmel (40 µl GDH, 60 U/ml, Sigma) és NADP+-al (30 µl, 1mM

végkoncentráció, Reanal) 1570 µl -re egészítettem ki. Az elegyet 20 percig sötétben inkubáltam, majd Perkin-Elmer LS-50 spektrofluoriméteren 350 nm hullámhosszú fénnyel történő gerjesztés mellett 460 nmen mértem a keletkezett NADPH fénykibocsátását. A fluoreszcencia-intezitás adatokból a glutaminsav-tartalmat ismert koncentrációjú glutamát oldatokkal készített kalibrációs sor alapján számoltam ki. 50 Primer Pár Primer szekvencia 1 GluR1 2 GluR2 3 GluR4 4 GluRζ1 N1 NR1 C1 NR1 C2, C1 5 6 7 NR2A 8 NR2B 9 NR2C 10 NR2D 11 GAPDH 12 embGAD 13 GAD67 14 GAD65 15 aktin 16 GluR6 17 KA1 18 KA2 Pozíció (bp) Forward 5´ctccttctgtggggccctcc3’ 557-576 904-885 Reverse 5´cccaggatggcgttgaggcg3’ Forward 5´cggcgtgtaatccttgactgc3’ 815-835 1156-1136 Reverse 5´cctctgcttccgaagattgcg3’ Forward 5´ccaggttctgaaacacctcc3’ 1023-1042 1387-1367 Reverse 5´gtgtcattgcccagagtaggc3’ Forward 5´gacaagagcatccacctgagcttcc3´

481-505 777-753 Reverse 5´agcgtcgtcctcgcttgcagaaagg3´ Forward 5´tgtgtccctgtccatactcaag3´ 2406-2427 2712-2693 Reverse 5´gtcgggctctgctctaccactc3´ Forward 5´atgcccctgccaccctcacttttg3´ 2501-2524 2881-2859 Reverse 5´gcagctggccctcctccctctca3´ Forward 5´ggagaagggtactccagcgctgaac3´ 81-105 Reverse 5´agtctgtgaggagataaaatccagc3´ 360-335 Forward 5´gcaagcttctgtcatgctcaacatc3´ 456-480 Reverse 5´gctctgcagcttcttcagctgattc3´ 675-651 Forward 5´actccttggtgcttgggcagg3´ 811-831 Reverse 5´cagcacctgcagctgctgctc3´ 1231-1211 Forward 5´cttggctcctccacagagcaacagc3´ 481-505 Reverse 5´cctcttctgccgcccggaaaacagg3´ 778-754 Forward 5´tgatgacatcaagaaggtggtgaag3´ 805-829 Reverse 5´tccttggaggccatgtaggccat3´ 1044-1022 Forward 5’gctggaaggcatggaaggtttta3’ 438-461 Reverse 5’tgagccccatcaccgtagca3’ 662-682 Forward 5’gatacttggtgtggcgtagccc3’ 85-107 Reverse 5’acgggtgcaatttcatatgtgaacata3’ 633-660 Forward 5’ggctctggcttttggtccttc3’ 13-32 Reverse 5’tgccaattcccaattatactcttga3’

426-450 Forward 5’agctgagagggaaatcgtgc3’ 569-588 Reverse 5’gatggaggggccggactcat3’ 1048-1067 Forward 5’ccaagcccggagcctaacgc3’ 263-282 Reverse 5’ccagccaccccaagagacag3’ 621-640 Forward 5’cacggagccccccaagctgc3’ 410-429 Reverse 5’cagccgtcacttgccagttc3’ 777-786 Forward 5’gcccagtggactgccctctc3’ 142-161 Reverse 5’ccactctggccttggctggg3’ 480-498 Termék mérete (bp) 347 bp 341 bp 364 bp 297 bp (N1 nem tart.) 360 bp (N1 tart.) 307 bp 381bp (C1 and C2 tart.) 270bp (C2 tart.) 280 bp 220 bp 421 bp 298 bp 240 bp 244 bp 575 bp 438 bp 498 bp 337 bp 348 bp 317 bp 2. táblázat Az RT-PCR vizsgálatok során felhasznált primerek szekvenciája, elhelyezkedésük a vonatkozó cDNS-n és az általuk közrefogott szakasz hossza. 51 Ellenanyag anti-nesztin anti-N-tubulin anti-MAP2 anti-NFM anti-NFH anti-synapsin I anti-GFAP anti-NR1 anti-NR1 anti-NR1 K21322 anti-NR1 anti-NR2A anti-NR2A anti-NR2B anti-NR2B K83084 anti-panGAD 6799 anti-GAD25 8876 anti-GAD44 8877 anti GAD65

GAD6 anti GAD65 N65 anti-GABA IgG típus egér IgG egér IgG egér IgG egér IgG egér IgG egér IgG egér IgG egér IgG nyúl IgG nyúl IgG egér IgG nyúl IgG egér IgG egér IgG nyúl IgG nyúl IgG nyúl IgG nyúl IgG egér IgG nyúl IgG nyúl IgG Forrás Pharmingen P. Dráber Sigma Sigma Sigma Chemicon Sigma Pharmingen Chemicon M Herkert M. Watanabe Upstate Biotechnology M. Watanabe Transduction Laboratories M Herkert Z. Katarova G. Szabó G. Szabó Hibridóma Bank M. Solimena Sigma Higítás 1/1000 1/1000 1/1000 1/500 1/500 1/500 1/1000 1/500 0.5 µg/ml 1/100 1 µg/ml 1 µg/ml 1 µg/ml 1 µg/ml 1/500 1/1000 1/1000 1/100 1/500 1/500 1/1000 Felhasználás IC IC, ELISA IC IC IC IC IC IC WB IC WB WB WB WB IC IC, WB IC, WB IC WB IC IC 3. táblázat Az immuncitokémiai (IC), in situ ELISA és Western blot (WB) vizsgálatok során felhasznált ellenanyagok specifikációja és az alkalmazott ellenanyag-higítások. 52 I. Az NE-7C2 sejtvonal jellemzése I./1 Az p53 -/- NE-7C2

sejtvonal kromoszóma-készletének változása a sejtvonal immortalizációja során Az NE-7C2 neuroektodermális sejtvonal p53-hiányos (Livingstone et al., 1992), transzgenikus, 9 napos egér embrió elő- és középagyhólyagból kiültetett primer tenyészetből nyert 1-sejt eredetű klón (Schlett and Madarász, 1997). A primer idegi tenyészetben a tenyésztés 4. hetében megjelenő proliferáló gócok izolálásával NE9 „master” sejttenyészet, majd a „master” tenyészetben kialakuló, neurális sejtadhéziós (N-CAM) fehérjét expresszáló epiteloid sejtcsoportokból egy-sejt klónozássa E9 vonalakat állított elő Dr Madarász Emília. Ezekből másodlagos klónozással Dr Schlett Katalin több sejtvonalat (NE-4C, NE-7C2) hozott létre. A sejtvonalak külső onkogént nem hordoznak, spontán immortalizációjuk a funkcionális p53 fehérje hiányában következett be. Mivel a p53 fehérje fontos szerepet játszik a genetikai állomány integritásának

megőrzésében, megvizsgáltuk a sejtek kromoszóma-állományának feltételezett ingadozásait az NE-7C2 p53-/- sejtvonal folyamatos fenntartása során. A tenyészeteket a növekedés log-fázisában kolcemiddel kezeltem (10-7 M) 1.5 órán keresztül. A kolcemid a magorsó fonalak épülését megakadályozva gátolja a kromoszómák két utódsejtbe való szétvándorlását, így a mitózis gátlásával egyrészt felszaporodnak a metafázisban lévő sejtek, másrészt a kondenzálódott kromoszómák a sejtmembránon belül maradnak. A kolcemid kezelést követően a sejtek duzzasztásával izoláltam és fellazítottam a sejtmagokat, majd a kiszabaduló kromoszómákat Giemsafestéssel tettem láthatóvá („Anyag és Módszer” fejezet). Az NE-7C2 sejtvonal kromoszómaszám-változásait 60 passzázs, azaz kb. 300 sejtduplikációs ciklus során követtem. A vizsgált passzázsokból 50-50 sejtben számoltam meg a kromoszómákat és grafikusan ábrázoltam a

kromoszómaszámok megoszlását a vizsgált sejtpopulációban (7. ábra) Meghatároztam a kromoszómaszámok súlyozott átlagát is vizsgált passzázsokban az “Anyag és Módszer” fejezetben leírtak alapján (8. ábra) 53 54 A p53-hiányos, 9 napos egér embrió agyhólyagjából kiültetett primer tenyészetből 3 átültetés után nyert (NE9m) „master” vonalban a sejtek nagy része az egérre jellemző 40-es kromoszómaszámmal rendelkezett (7. ábra) Megfigyelhető azonban, hogy a sejtek egy kisebb hányada az eredeti kromoszómakészlet kétszeresének megfelelő kromoszómaszámmal jellemezhető. Az NE9m tenyészetből klónozással nyert E9 tenyészetben jelentősen megnőtt a kétszeres kromoszómaszámú sejtek állománya és igen kis százalékban hexaploid kromoszóma-állományú sejtek is kimutathatók voltak (7. ábra) A primer tenyészetben megjelenő proliferáló sejtek többsége, amelyek a sorozatos átültetések során elszaporodtak, tehát a

kétszeres kromoszómaszámmal rendelkeztek. A sejtvonal fenntartása során a kromoszómaszám a korai passzázsokban (10p - 35p) a 70-es érték körül ingadozott. Az első 35 passzázs alatt (150 sejtosztódás) a kromoszómaszám a kezdeti 70-es értékről fokozatosan csökkent. A kromoszómaszám súlyozott átlagának vizsgálata alapján megállapítottam, hogy a sejtek kromoszómakészlete a sejtosztódások számával nem lineárisan csökken, hanem egy adott érték, a 60 kromoszóma felé tart (8. ábra) A különböző passzázsokból nyert kromoszómapreparátumokban folyamatosan jelen voltak 3x kromoszómaszámmal rendelkező sejtek is (7. ábra), bár csak kis százalékát adták a teljes populációnak A diploid egér kromoszómaszámtól eltérő genom-méretű sejtek elszaporodása jól mutatja, hogy a p53 fehérje fontos szerepet játszik a genom stabilitásának fenntartásában. Hiányában megnő a rendellenes kromoszómaszámú sejtek aránya A megfigyelés

azt is jelzi, hogy bizonyos többlet kromoszómával rendelkező sejtek szelektív előnnyel rendelkezhetnek társaikkal szemben. Hasonló kromoszómaduplikációs és kromoszómavesztési tendenciát mutatott egy másik p53-/sejtvonal is (NE-4C; Varju P., 1997; szakdolgozat), ahol a duplikált kromoszómakészlettel rendelkező sejtek a sejtvonal fenntartása során fokozatosan elveszítették a kromoszómaállomány egy részét és a sejtek kromoszómakészlete a 60-s érték körül stabilizálódott. Az NE-4C és NE-7C2 esetében a szelektív előnyt biztosító kromoszómaszám 1.5 x haladta meg a normál sejtek kromoszómaszámát (n=40) A kromoszóma-készlet vizsgálata tehát megmutatta, hogy a sejtek kromoszómakészlete a p53 fehérje hiányában a „normálistól” eltérő értéket mutat, amely azonban stabilizálódik a sejtvonal fenntartása során. 55 56 I./2 Az NE-7C2 sejtvonal progenitor sajátságainak meghatározása Az NE-7C2 sejtvonal

sejtjei 10% FCS-t tartalmazó tápoldatban epitél jellegű sejtek monolayer tenyészeteként nőnek (9. A ábra) Növekedésük letapadásfüggő, szaporodásuk mértéke a sejtszám növekedésével csökken (kontakt gátlás mechanizmusa). A folytonosan osztódó sejtek a neurális progenitorok jellegzetes marker fehérjéjét, az intermedier filamentum fehérjék családjába tartozó nesztint expresszálják (9. B ábra) A sejtvonal sejtjei nagy sejtsűrűség mellett, kis gyakorisággal spontán is képesek idegsejtté differenciálódni (kb. 1000 sejtből 1) A spontán differenciálódott sejtek kisméretű sejttesttel és általában egy, el nem ágazó nyúlvánnyal jellemezhetők (9. C ábra) Asztroglia irányú sejtdifferenciációt indukálatlan tenyészetekben nem tapasztaltunk. A neurális progenitorsejtek idegi irányú differenciációját növekedési faktorok és vitamin-származákok egyaránt elősegíthetik. Korábbi kutatási eredmények azt

mutatták, hogy a PCC7 (Pfeiffer et al., 1981; Imrik and Madarász, 1991), P19 (Jones-Villeneuve et al., 1982) és NTera-2 (Damjanov et al, 1984) embrionális teratokarcinóma sejtvonalak retinsav adására idegi irányban differenciálódnak. A laboratóriumunkban már korábban jellemzett p53-/- sejtvonal, az NE-4C, ATRA hatására szintén nagymértékű neuronális differenciációt mutatott (Schlett and Madarász, 1997). Az irodalmi adatok és saját eredményeink alapján az NE-7C2 sejtvonalon a növekedési faktorok közül az NGF, EGF, IGF-1 valamint az A-vitamin származék ATRA neuronális differenciációt indukáló hatását vizsgáltam meg. A növekedési faktorok (120 ng/ml) és az ATRA alkalmazott koncentrációit irodalmi adatok és saját eredményeink alapján állapítottam meg. A neuronális differenciáció során az idegi irányban elkötelezett sejteket N-tubulin tartalmuk alapján immuncitokémiával azonosítottam és mennyiségüket in situ ELISA módszerrel

határoztam meg a kezelések 7. napján Az NE-7C2 sejtvonal sejtjeit a vizsgált növekedési faktorok nem késztették idegi irányú differenciálódásra. ATRA 10-8 – 5x10-6 M koncentrációja növekvő mértékű neuronális differenciációt indukált (10. ábra) A legmagasabb koncentráció esetében a sejtek mintegy 50%-a idegsejtté fejlődött. Az NE-7C2 sejteket a továbbiakban 10-6 M végkoncentrációjú retinsavval indukáltam, mivel ez a 57 58 koncentráció már igen jelentős differenciációt váltott ki, de még nem járt jelentős mértékű sejtpusztulással. ATRA 10-6 M koncentrációjának hatására az NE-7C2 sejtek jól meghatározott, reprodukálható lépéseken keresztül differenciálódnak morfológiailag fejlett idegsejtekké. Az első N-tubulin immunreaktív idegsejtek az ATRA-indukció 2 napján jelennek meg a differenciálatlan sejtek tetején, általában csepp alakú sejttesttel és egy rövid nyúlvánnyal jellemezhetők (11. A

ábra) Az indukció 4 napjára a neuronok száma jelentősen megemelkedik, a nyúlványok száma megnő és elágazásokat alakítanak ki (11. B ábra) Az indukció 6 napjára a neuronális sejttestek kompakt aggregátumokba tömörülnek és a nyúlványok kötegelődve hagyják el az aggregátumok területét (11. C ábra). Az indukció 10 napjára szinte minden neuronális sejttest aggregátumba ágyazott és közöttük a kapcsolatot nyúlványkötegek biztosítják (11. D ábra) A neuronális differenciáció során jellegzetes módon változik a köztes filamentum rendszer is. Az in vivo csak neuronokra jellemző neurofilamentum fehérjék közül az NFL és NFM (12. A ábra) formákat sikerült kimutatnom az indukció 4 napjától kezdve. Az immunpozitív sejtek száma fokozatosan nőtt a neuronális fejlődés előrehaladtával. Az NFH jelenlétét csak az indukció második hetében tudtam detektálni (12. B ábra) a sejttestekben és a nyúlványokban, illetve a nyúlványok

növekedési kúpjaiban (12. B ábra inszert) A köztes filamentum rendszer mellett a mikrotubulárisrendszer összetétele is változott a neuronális differenciáció során Az N-tubulin, amely a progenitorok utolsó osztódása után már jelen van, a posztmitótikus neuronok teljes élettartama során kimutatható (11. ábra) A mikrotubulus-asszociált fehérjék közül a Map2, melyet in vivo főleg dendritekben és sejttestekben sikerült kimutatni, az NE-7C2 sejtek indukciójának 6. napjától detektálható (12 C ábra) Az indukció 8. napjától a morfológiailag fejlett neuronok teljes citoplazmájában kimutatható a szinapszin-I (12. D ábra) és a szinaptofizin (12 E ábra), a preszinapszisok működésében fontos fehérjék. Jelenlétük arra utal, hogy a sejtek közötti szinaptikus kommunikáció kialakításában szerepet játszó komponensek szintézise is megindul a tenyészetekben. 59 Az ATRA-indukció során megjelenik az idegszövet másik jellemző

sejttípusa, az asztroglia is (12. F ábra) Az első asztroglia típusú sejtek az indukció 10 napjától 60 61 azonosíthatók GFAP tartalmuk alapján. Számuk folyamatosan nő az indukció előrehaladtával. Az asztrogliasejtek nem egyenletes eloszlásban jelentkeznek a tenyészetekben, hanem szigetszerű kis csoportokban helyezkednek el. A GFAP immunpozitív sejtek a neuronális gócok belsejében mutathatók ki először, majd megjelennek az idegsejt-aggregátumok körül is. A megfigyelés arra utal, hogy az asztroglia irányú differenciációhoz neuronok által szekretált faktorok jelenlétére lehet szükség. Immuncitokémiai módszerekkel az oligodendroglia sejtek által expresszált fehérjék közül sem a galaktocerebrozid, sem a mielin bázikus fehérje jelenlétét nem sikerült kimutatni hosszú – 10-30 napos – indukció során sem. Annak igazolására, hogy az oligodendroglia sejtek valóban nem jelennek meg az NE-7C2 sejtek ATRAindukciója során,

mindkét ellenanyaggal párhuzamosan festettünk primer gliális tenyészeteket is, ahol pozitívan festődő oligodendroglia sejteket sikerült azonosítani. Korábbi tanulmányok a P19 sejtvonalon igazolták, hogy retinsav meghatározott koncentrációja mellet izomsejtek fejlődése indukálható (Manabe and Owens, 2001). ATRA különböző koncentrációi mellett megvizsgáltam simaizom-specifikus α-actin jelenlétét a tenyészetekben immuncitokémiai módszerrel. Sem morfológiai, sem immuncitokémiai evidenciát nem találtam simaizom-sejtek differenciálódására a tenyészetekben. Az NE-7C2 sejtek in vitro indukált neurogenezise jól reprodukálja az in vivo megfigyelt idegi sejtdifferenciálódás morfológiai jelenségeit. A továbbiakban a tenyészetben lejátszódó idegsejt-képzést modellként használtam az idegi sejtdifferenciáció során bekövetkező változások tanulmányozására és a biokémiai / molekuláris biológiai jelenségek és

sejtmorfológiai változások közötti korreláció megállapítására. 62 II. Ionotrop glutamát receptorok szabályozott időbeli megjelenése az in vitro neurogenezis során II./1 NMDA-vezérelt glutamát receptorok kimutatása NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során II./11 NMDA receptor alegységek expressziója NE-7C2 sejtekben NE-7C2 sejtek neuronális differenciációja során vizsgáltuk az NMDA-vezérelt ioncsatorna alegységeinek expresszióját. A Stuttgarti Egyetem Sejt és Immunbiológiai Tanszékével kollaborációban Dr Schlett Katalin szemikvantitatív RT-PCR vizsgálatokat végezett el az általam küldött RNS-mintákból. A polimeráz láncreakciókban felhasznált primereket a 2. táblázat tartalmazza Vizsgáltuk az NR1 alegység különböző splicevariánsainak (ábra) valamint az NR2A, NR2B, NR2C és NR2D alegységek megjelenését és a transzkripció változásait az indukált neurogenezis során. A transzkriptumok relatív expressziós

szintjének meghatározásához belső viszonyítási alapként a GAPDH (glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz) mRNS 30 cikluson keresztül amplifikált mennyisége szolgált. Az NR1 alegység három olyan kazettát tartalmaz (N1, C1 és C2), amelynek a kódoló exonjai az mRNS érése során kivágódhatnak a transzkriptumból (13. ábra) Ez a folyamat az alternatív exon-használat, melynek eredményeként egy génről többféle funkcionális fehérje keletkezhet. Hogy meghatározható legyen, hogy az NR1 alegység mely variánsainak mRNS-e van jelen, a stuttgarti intézetben három primer párt (2. táblázat; 4., 5 és 6 primer párok) terveztek a transzkriptum 5’ ill 3’ végeire A 4-es primer pár az N1 kazettát (5. exon) határoló szekvenciát ismeri fel (13 ábra) Abban az esetben, ha az exon bennmarad az érett mRNS-ben, egy 360 bp hosszúságú terméket kapunk a PCR reakció eredményeként, ha azonban kivágódik, a termék mérete 297 bp lesz. Az 5 primer pár

(13 ábra) „sense” tagja a C1 kazettát (21 exon) határoló szakaszra specifikus, míg „antisense” tagja a C1 kazettán belüli szekvenciát köti meg. Így csak akkor keletkezik termék, ha a 21. exon bennmarad az érett mRNS-ben A 6 primer pár (2. táblázat, 13 ábra) egyik tagja a 21 exon 5’ határoló régióját ismeri fel, a másik tagja a C2 kazettára (22. exon) specifikus Amennyiben a 21 és a 22 exon is bekerül az érett mRNS-be, a termék mérete 381 bp lesz. Ha az érett mRNS csak a 22 exont tartalmazza, 63 64 270 bp hosszúságú terméket fogunk kapni. Abban az esetben, ha a 22 exont kivágódik az RNS-ből, PCR termék nem keletkezik. A 22 exont kivágódása során az exon végén található STOP szignál is kivágódik, így a transzláció során a riboszóma továbbhalad és átírja a C2’ szekvenciát, amelynek a végén egy újabb STOP szignál helyezkedik el. Az NR1 variánsok megnevezését Hollmann által megalapított nevezéktan

(Hollmann et al., 1993) alapján használom a dolgozat során (1. táblázat) Az NR2A, B, C és D alegységek génjeiről csak egyfajta kódoló mRNS keletkezik, így a 7-10. primer párok esetében egyfajta PCR termék szaporodik fel Az indukálatlan sejtek sokféle NR1 variánst expresszáltak. A transzkriptumok jelentős része tartalmazta mind a C1, mind a C2 kazettát, de az N1 kazettát nem (14. ábra, NR1-1a splice-forma). A csak C1-t vagy csak C2-t tartalmazó mRNS-ek szintén expresszálódtak, de lényegesen alacsonyabb szinten (14. ábra, NR1-2a, -3a variánsok) ATRA-indukálta neurogenezis során fokozatosan emelkedett az NR1 transzkriptum összmennyisége, és az indukció 7. napjától N1 kazettát is tartalmazó mRNS formákat is sikerült kimutatni (14. ábra, NR1-b variánsok) Az indukció korai szakaszában (0-4 napig) az NE-7C2 sejtek főleg olyan NR1 mRNS-t expresszáltak, amely tartalmazta mind a C1, mind a C2 doméneket. Az indukció előrehaladtával

megemelkedett azoknak az mRNS-eknek a mennyisége is, amelyek csak az egyik - vagy a C1 vagy a C2 - exon kazettát tartalmazták. A morfológiailag jól fejlett idegsejtek (indukció 10 napja) minden NR1 splice-variánst expresszáltak. Az NR2 alegységek közül az NR2A és NR2D alegységek transzkriptumait már indukálatlan NE-7C2 sejtek is expresszálták. E két transzkriptum mennyisége a neuronális differenciáció során az alapszinthez képest nem változott nagymértékben. Az NR2B alegységet kódoló mRNS szinte alig volt detektálható az indukálatlan mintában és az indukció korai szakaszában (0-4. napig, 14 ábra) Az indukció második hetében a transzkriptum mennyisége nagymértékben nőtt (14. ábra) Az NR2C alegység nem volt kimutatható sem a proliferáló, sem a neuronális irányban differenciálódó sejtek tenyészeteiből (14. ábra) 65 66 Az mRNS-vizsgálatok azt mutatták, hogy az NE-7C2 in vitro neurogenezis során elsősorban az NR1

mennyisége és variánsainak száma, valamint az NR2B transzkriptum mennyisége nő. II./12 NMDA receptor alegységek fehérjeformáinak kimutatása Western blot és immuncitokémia segítségével Hogy meghatározzam, hogy az indukció egyes szakaszaiban mely alegységek fehérjeformái fordítódnak le, továbbá hogy képet kapjak az egyes fehérjeformák sejten belüli elhelyezkedéséről, szubcelluláris frakciókat (durva-membrán és citoplazma preparátumokat) készítettem és azokban Western blot segítségével mutattam ki a vizsgált NMDA receptor alegység fehérjeformákat. Az NR1 alegység különböző variánsainak kimutatására kétféle ellenanyagot használtam: pan-NR1 (Watanabe et al., 1998, 15 ábra) amely a fehérje N-terminálisán elhelyezkedő, minden splice variánsban megtalálható 4. – 51 aminosavakat ismeri fel; C2-NR1 (Chemicon) amely a C2 kazetta aminosav szekvenciájára specifikus (891. – 920. aminosavak, 15 ábra) Pozitív kontrollként

felnőtt egér előagyból (EA) készített homogenátumot vittem fel a gélekre. A pan-NR1 ellenanyag a citoplazma és durva-membrán frakciókban egy 116 kD méretű sávot festett mind az indukált, mind az indukálatlan mintákban (15. ábra) A durva-membrán frakcióban egy kisebb molekulatömegű csík is azonosítható volt, mely az előagyi mintában szintén festődött. A kettős csík arra utal, hogy legalább kétféle NR1 splice-forma van jelen NE-7C2 sejtekben, de nem kizárható a fehérje degradációja sem. A C2-NR1 ellenanyag segítségével C2 kazettát tartalmazó fehérjeformát sikerült kimutatni a citoplazma frakciókból az indukció minden stádiumában, és az indukálatlan tenyészetek citoplazma és durva-membrán frakcióiban is (15. ábra) A citoplazma frakcióban a fehérje mennyisége az indukció előrehaladtával csökkent. Az NR2B alegységet a C-terminális 892. – 1051 aminosav-szekvenciát felismerő ellenanyaggal (BD Transduction Laboratories)

csak az indukció 10. napján sikerült kimutatnom, akkor is csak a durva-membrán frakcióból (15. ábra) A fehérje kb 180 kD- 67 68 nak megfelelő csíkot adott, ami az egér agyban megállapított 175 kD molekulatömeggel jó egyezést mutat. Az NR2A alegységet két, a fehérje C-terminális részére specifikus ellenanyag (Upstate Biotechnology, Watanabe NR2A-C, Watanabe et al., 1998) segítségével is megpróbáltam kimutatni. Mivel az Upstate Biotechnology által gyártott ellenanyag érzékenyebbnek bizonyult, az ábrákon az ezzel kapott eredmények szerepelnek. Annak ellenére, hogy a kódoló RNS jelentős mennyiségben expresszálódott (14. ábra), az NR2A alegység fehérjét 10 µg fehérjemennyiségből - ami többi alegység kimutatására elegendő volt – nem sikerült megbízhatóan kimutatnom (15. ábra) egyik ellenanyaggal sem. Az előagyi mintából ugyanakkor az ellenanyagok egy 170 kD molekulatömegű fehérjét festettek meg, amely megfelel a

már korábban megállapított molekulatömegnek. 60 µg fehérje futtatása után mindkét ellenanyag két csíkot festett (15. ábra) a citoplazmás frakciók mindegyikében A durva-membrán frakcióban az indukció 6. és 10 napján két halványan festődő csík jelent meg, melyek valamivel kisebb molekulatömegűek voltak, mint az előagyból kimutatott fehérje. Az eredmények arra utalnak, hogy a fehérje degradálódik, vagy éretlen, poszttranszlációs módosításoktól mentes formában van jelen NE-7C2 sejtekben. Az NR2C alegységet kódoló mRNS-t nem tudtam kimutatni, így erre a fehérjére Western blot analízist sem végeztem. Az NR2D alegységre specifikus ellenanyag a kísérletek elvégzése idején nem volt kereskedelmi forgalomban, ezért ezt az alegységet fehérjeszinten nem tudtam vizsgálni. A Western blot analízist követően az NMDA receptor alegységek sejten belüli eloszlását immuncitokémiai festéssel próbáltam meghatározni. Az NR1

alegység sejtszintű lokalizációjának kimutatására egy poliklonális (K21322, Herkert et al., 1998) és egy monoklonális (660. – 811 aminosav-szekvencia; Pharmingen) ellenanyagot használtam. Mindkét ellenanyag a fehérje összes variánsát felismeri és a fehérje extracellulárisan elhelyezkedő részleteire - az első TM domént megelőző szakasz ill. a III. és IV TM domén közötti extracelluláris hurok régió - specifikus Amennyiben a sejtek membránját átjárhatóvá tettem TritonX-100-al, a sejten belül elhelyezkedő NR1 fehérjét is láthatóvá tudtam tenni. Ha a sejteket nem permeabilizáltam, akkor elsősorban a 69 70 membránba kihorgonyzott receptor alegységek festődtek. Mindkét ellenanyag ugyanazt a festődési mintázatot mutatta, de a festés erősebb volt a K21322 szérummal. A 16 ábrán (A, B és C) a K21322 ellenanyaggal festett sejtek felvételei szerepelnek. Annak ellenére, hogy Western blot segítségével a fehérje kimutatható

volt már az indukálatlan tenyészetekben ill. az indukció korai szakaszában is, indukálatlan tenyészetekben nem sikerült specifikus festést bizonyítanom sem sejten belül, sem a sejtek felszínén. Az első. háttérből kiváló - festődő idegsejtek az indukció 5 napján jelentek meg és számuk folyamatosan nőtt az indukció előrehaladtával. Az ATRA-kezelés 8 napjától szinte minden nyúlványos sejt festődött a nem-permeabilizált tenyészetekben (16. A, B ábra) A festődés igen erős volt a sejttesten és a nyúlványok proximális régiójában (16. B ábra). Ezekben a tenyészetekben az aljzatsejtek nem festődtek Ha a tenyészeteket permeabilizáltam, a neuronok mellett egyes kiterült, lapos aljzatsejtekben is erős festődés jelentkezett (16. C ábra) A festődés mintázata alapján arra következtettünk, hogy a fehérje intracelluláris vezikulákban található. Az NR2A alegység a Western blot kísérletek alapján igen alacsony szinten van jelen. A

rendelkezésemre álló kétféle ellenanyag a fehérje C-terminális, intracellulárisan elhelyezkedő régiójára specifikus, így a festéseket permeabilizált tenyészeteken végeztem el. Háttér feletti festődést egyik ellenanyaggal sem kaptam (ábra nem szerepel róla). Az NR2B fehérjét olyan poliklonális szérummal (K83084, Herkert et al., 1998) tettem láthatóvá, mely a fehérje extracellulárisan elhelyezkedő N-terminális 439. – 453 aminosavaira specifikus. Immunjelölt sejteket az indukció 8 napjától sikerült azonosítani (16. D ábra) A festődés igen erős volt a sejtmag körül ill a nyúlványok kezdeti szakaszain (16. E ábra) Az NR2D alegységre specifikus ellenanyag nem állt rendelkezésünkre a kísérletek elvégzése idején, így a fehérje sejten belüli lokalizációját nem vizsgáltam. II./13 Funkcionális NMDA-csatornák megjelenése NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során A funkcionális NMDA-csatornák megjelenését NE-7C2

sejtek plazmamembránjában az NMDA hatására bekövetkező [Ca2+]IC változásainak 71 72 detektálásával követtem nyomon Fura-2 mikrofluorimetriával. A sejtmembránon átdiffundáló Fura2/AM Ca2+-indikátort az intracelluláris észteráz enzimek membránimpermeábilis formává alakítják át, így a töltési idő elteltével az inkubáló-médiumban maradt felesleges festéket eltávolítva (3x mosás pufferrel) kizárólag a sejten belül csapdába esett Fura-2 fluoreszcenciáját mérjük. Az [Ca2+]IC változásait úgy számoltam ki, hogy az NMDA adása előtti szintet 100%-nak vettem és megállapítottam, hogy NMDA hatására hány százalékkal emelkedett meg az [Ca2+]IC az alapszinthez viszonyítva. Az NMDA alkalmazott koncentrációját dózishatás görbe (17 ábra) alapján állapítottam meg. Indukálatlan tenyészetek sejtjeiben 100 µm NMDA hatására az [Ca2+]IC nem változott (18. A ábra) Az indukció korai szakaszában (3 nap) a sejtek szintén

nem adtak NMDA-indukálta Ca2+-választ (18. A ábra) A neurogenezis első hetének végére jelentek meg az első olyan sejtek, melyek NMDA adására az [Ca2+]IC megemelésével válaszoltak (18. A ábra) Az NMDA-reszponzív sejtek neuronális morfológiával rendelkeztek, az aljzaton elhelyezkedő nem-neurális sejtek NMDA-specifikus Ca2+szint emelkedést nem mutattak. Az indukció 6 - 8 napja között a nyúlványos sejtek közül kevés válaszolt NMDA adására, az indukció 10. napjától kezdve azonban minden neuronális morfológiájú sejt szignifikáns [Ca2+]IC emelkedéssel válaszolt NMDA-ra (18. A ábra). Ha a sejteket az NMDA-receptorok kompetitív antagonistájával inkubáltam (DL AP5), az NMDA kiváltotta [Ca2+]IC-szint emelkedés elmaradt (18. B ábra) Az NMDA-kiváltotta választ nagymértékben meghatározza a mérőoldat összetétele (Monyer et al., 1994; Mayer, 1998) 2 mM extracelluláris Mg2+ jelenlétében a neuronok csak 20 mM KCl jelenlétében mutattak

NMDA-specifikus [Ca2+]IC emelkedést (19. A ábra) 20 mM KCl önmagában kismértékben megemelte a sejtek nyugalmi Ca-szintjét, de a jellegzetes Ca-csúcs elmaradt. Mg2+-mentes közegben viszont az NMDA képes volt kiváltani a [Ca2+]IC-szint megemelkedését depolarizáció nélkül is (19. B ábra) Az ábrákon az NMDA-kiváltotta válaszokat a Ca++-kötött és szabad Fura-2 arányaként adtam meg és a tényleges Ca++-koncentráció változásokat nem számoltam ki. Az [Ca2+]IC emelkedéséért az NMDA receptorok aktiválása mellett a VDCC csatornák is felelősek lehetnek. Az NMDA-csatornákon beáramló Ca2+-ionok a sejtmembrán depolarizációját okozhatják, amely aktiválhatja a sejtmembránban 73 74 75 elhelyezkedő VDCC-kat. + extracelluláris K Depolarizációt előidézhetünk mesterségesen is, az koncentráció megemelésével. Egy testvér sejtvonalon (NE-4C) végzett elektrofiziológiai mérések (Herberth et al., 2002) megmutatták, hogy 30

mM KCl jelenlétében az indukálatlan sejtek membránpotenciálja a Nerst egyenletnek megfelelően változik. Indukálatlan tenyészetben az NE-7C2 sejtek 30 mM KCl adására nem mutattak [Ca2+]IC emelkedést (20. A ábra) Az indukció során a differenciálódó neuronok az indukció 7. napjától már válaszoltak KCl-ra, majd az indukció második hetének végére jelentős [Ca2+]IC változással reagáltak a KCl adásra (20. B ábra) A VDCC egyik típusa, az L-típusú Ca2+-csatorna (Catteral and Striessnig, 1992) nifedipinnel, míg a főleg neuronális típusú N-, P- és Q-csatornák ω-conotoxin MVIICvel blokkolhatók (Sather et al., 1993) Hogy megállapíthassam, hogy az NMDAkiváltotta [Ca2+]IC növekedést mennyiben okozhatta a különböző VDCC-k aktivációja, az NMDA kiváltotta sejtválaszokat nifedipin és ω-conotoxin - irodalmi adatok alapján meghatározott koncentrációinak – jelenlétében is mértem. Az ábrákon a Ca2+-beáramlás mértékét a Ca2+-kötött

és szabad Fura-2 emissziós hányadosaként adtam meg (F1/F2). A nifedipin hatását 12 napig indukált NE-7C2 neuronokon vizsgáltam, a görbe 8 neuron válaszának átlagát mutatja nifedipin jelenlétében és hiányában, Mg2+-mentes közegben. Az NMDA kiváltotta [Ca2+]IC-szint emelkedést a nifedipin (1 µM) kb. 40%-al csökkentette (21. A ábra) Az ω-conotoxin (1 µM) ennél kisebb mértékű, kb 10%-os csökkenést okozott az NMDA-kiváltotta Ca2+-válaszokban (21. B ábra) Ebből arra következtettem, hogy az NMDA-csatornán át beáramló Ca2+-ionok mellett a depolarizáció által aktivált VDCC-kon át beáramló Ca2+-ionok tovább emelik az [Ca2+]IC szintet. 76 77 II./2 AMPA receptorok kimutatása NE-7C2 sejtekben és szerepük a neuronális differenciáció korai szakaszában II./21 AMPA receptor alegységek expressziós mintázata NE-7C2 sejtek idegi irányú differenciációja során Az AMPA receptor alegységek expresszióját - a Stuttgarti Egyetem Sejt

és Immunbiológiai Tanszékével végzett kollaborációs munka keretében Dr Schlett Katalinnal, szemikvantitatív RT-PCR módszer segítségével vizsgáltuk az NE-7C2 sejtek in vitro indukált neurogenezise során. Az AMPA-típusú ionotróp glutamát receptorok 4 alegységét kódoló gének (GluR1-4) közül a kísérletek végzése idején három egér gén (GluR1, 2 és 4) szekvenciája volt ismert (NM 008165, NM 013540, NM 019691). Az adatok hiányában a GluR3 alegység expresszióját nem tudtuk vizsgálni. Indukálatlan tenyészetekben (K) a három vizsgált alegység közül csak a GluR4 alegység expresszálódott (22. ábra) Az alegység mRNS szintje gyakorlatilag változatlan maradt a retinsav- indukció teljes időtartama alatt, csak az indukció 10. napján látszott kismértékű emelkedés a transzkriptum mennyiségében (22. ábra) A GluR2 alegység transzkriptum az indukció 3. napjától volt detektálható és az mRNS szintje folyamatosan emelkedett az indukció

előrehaladtával (22. ábra) A GluR1 alegység az indukció 2.-4 napján igen alacsony szinten expresszálódott, az indukció előrehaladtával azonban a transzkriptum mennyisége nagymértékben emelkedett és az indukció 7. napjától már jelentős mennyiséget ért el (22 ábra) II./22 Funkcionális AMPA-csatornák kimutatása NE-7C2 sejtek fejlődési stádiumaiban A funkcionális AMPA-csatornák jelenlétét NE-7C2 sejtek sejtfelszíni membránjában az intracelluláris Ca2+-szint AMPA hatására bekövetkező változásának detektálásával követtem nyomon Fura-2 mikrofluorimetriával. Az AMPA receptorok Ca-permeabilitását a receptorok alegység-összetétele szabályozza. A GluR1, 3 és 4 78 79 alegységekből felépülő AMPA-csatornák nagymértékű Ca2+ ion áteresztő-képességgel jellemezhetők (Bleakman and Lodge, 1998), míg a GluR2 alegység editált formájának beépülése eltolja a receptor szelektivitását az egyértékű kationok

irányába (Bleakman and Lodge, 1998). Amennyiben a receptorok elveszítik Ca2+ -permeabilitásukat, az 80 [Ca2+]IC szintet a VDCC-k aktivációja emelheti meg, melyet az AMPA receptorokon beáramló kationok által létrehozott membrán-depolarizáció aktivál. Ha azonban a sejtek VDCC-ái nem aktiválódnak és csak Ca-impermeábilis AMPA receptorok találhatók bennük, akkor ezzel a módszerrel nem tudjuk kimutatni a funkcionális AMPA receptorokat. Mivel az AMPA-receptorok igen gyorsan deszenzitizálódnak, a méréseket mindig 10 µM ciklotiazid (az AMPA receptor deszenzitizációját gátló szer; Bleakman and Lodge, 1998) jelenlétében mértem. A mérések során a receptor agonistájaként AMPA-t használtam, amely a kainát receptoroknak csak nagyon gyenge agonistája (Bleakman and Lodge, 1998). Az AMPA és ciklotiazid alkalmazott koncentrációját irodalmi adatok alapján állapítottam meg. A válaszok AMPA-specifikus voltát az AMPA receptorok specifikus

gátlószerének adagolásával igazoltam (23. B ábra) Indukálatlan sejteken végzett mikrofluorimetriával az elkötelezetlen progenitorsejtek kb. 40%-ában szignifikáns mértékű [Ca2+]IC emelkedést tapasztaltam 100 µM AMPA hatására (23. A ábra) A többi – látszólag azonos - sejtben nem láttam ilyen irányú változást. Indukálatlan NE-7C2 sejtek a vizsgált AMPA-receptor alegységek közül a GluR4-t expresszálták, mely homomer - egyféle alegységtípusból felépülő - csatornák kialakítására is képes. Indukálatlan sejtekben tehát az AMPA hatására bekövetkező [Ca2+]IC emelkedéséért a homomer GluR4 csatornák lehetnek a felelősek. Mivel depolarizáló KCl hatására a sejtekben nem volt mérhető [Ca2+]IC-szint emelkedés (20. A ábra), a VDCC-k szerepe a [Ca2+]IC-szint emelkedésben elhanyagolható lehet. Az indukció 8-10. napjain végzett mikrofluorimetriás mérések azt mutatták, hogy nem minden neuronális morfológiájú sejtben

emelkedik meg az [Ca2+]IC AMPA hatására (23. A ábra), a nyúlványos sejtek egy jelentős részében az [Ca2+]IC nem változott az alapszinthez képest. Az indukció előrehaladtával a GluR2 alegység beépülése a receptorba a Ca2+-permeabilitás elvesztését jelentheti (ha az alegység editálódik) és ebben az esetben az [Ca2+]IC emelkedésének forrása csak a VDCC-on át beáramló Ca2+ ion lehet. Mivel a kísérletek végzése idején a laboratórium még nem rendelkezett a VDCC-ra specifikus drogokkal, így az AMPA hatására bekövetkező [Ca2+]IC emelkedést nem mértem a VDCC blokkolók jelenlétében. Mivel azonban a fejlett NE-7C2 neuronokban az NMDA-kiváltotta [Ca2+]IC emelkedésének egy jelentős részét a VDCC-on keresztül beáramló Ca2+ ionok okozták (21. ábra), ill KCl hatására is 81 [Ca2+]IC-szint emelkedés volt mérhető indukált sejtekebn (20. B ábra), feltételezhetjük, hogy az AMPA-indukálta Ca2+-válaszban szintén szerepet játszanak a

VDCC-k csatornák. További vizsgálatokkal kell eldönteni a VDCC-k és a GluR2 alegység jelentőségét az AMPA-kiváltott [Ca2+]IC emelkedésben NE-7C2 sejtekben. Az AMPA és ciklotiazid jelenlétében mért [Ca2+]IC-szint emelkedést az AMPAreceptor nem-kompetitív gátlószerének jelenlétében is megvizsgáltam. A GYKI52466 irodalmi adatok alapján hasonlóan hatásos mind a 4-féle AMPA receptor alegységen. GYKI52466-al 5 percig előinkubáltam a tenyészeteket, majd az AMPA-reszponzív sejteken a GYKI52466 jelenlétében mért [Ca2+]IC-szint emelkedést a gátlószer adása előtt mért [Ca2+]IC-szint emelkedéshez viszonyítottam (23. B ábra) Az ábrán szerepelő reprezentatív eredmény azt mutatja, hogy a GYKI52466 nem tudta teljes mértékben kivédeni az AMPA adására bekövetkező [Ca2+]IC-szint emelkedést. A GYKI52466 jelenlétében is fennmaradó Ca-szint emelkedést az esetlegesen expresszálódó kainát receptorok* adhatják, amelyeket az AMPA magas

koncentrációja aktiválhat. *A kainát receptorok ötféle alegység homo- és heteromer kombinációiból épülhetnek fel. A GluR5-7 alegységek homo- és heteromer, míg a KA1 és KA2 alegységek csak heteromer kombinációban alkotnak funkcionális receptort. Az kainát receptor alegységek közül specifikus oligonukleotid primerekkel Dr Schlett Katalin vizsgálta a GluR6, KA1 és KA2 alegységek expressziós változásait az in vitro neurogenezis során. Indukálatlan tenyészetekben a GluR6 és KA2 alegységek mRNS formái igen magas szinten expresszálódtak és szintjük az indukció időtartama alatt nem növekedett tovább. A KA1 alegység transzkriptum igen alacsony szinten volt detektálható mind az indukálatlan, mind a 2 napig retinsavval indukált tenyészetekben. Az indukció 4 napjától szintje megemelkedett és az indukció teljes időtartama alatt jelen volt a tenyészetekben. Mivel a kainát receptorok neurogenezisben betöltött szerepével a továbbiakban nem

foglalkoztam, az adatok csak kiegészítésként szerepelnek. 82 II./23 Funkcionális AMPA receptorok szerepe folytonosan osztódó ill neuronális irányban differenciálódó NE-7C2 sejtekben A glutamát esetleges neurogenezist befolyásoló hatását úgy vizsgáltam, hogy NE-7C2 sejtek indukálatlan, ill. neuronális irányban differenciálódó tenyészetét az AMPA receptorok specifikus antagonistájával (GYKI52466, Tarnawa and Vizi, 1998) kezeltem. A GYKI52466-t kétféle koncentrációban alkalmaztam (5 µM és 50 µM), mivel ennél magasabb koncentrációkban már toxikusnak bizonyult. A szer toxicitását a tenyészetekben lévő sejtek életképességének mérésével előzetesen ellenőriztem az MTT-redukció módszerével (Mosmann, 1983). Az AMPA receptorok szelektív gátlásának hatását a neurogenezisre a tenyészetekben található N-tubulin immunreaktív sejtek mennyiségének meghatározásával vizsgáltam a tenyésztés 7. napján,

immuncitokémiai és in situ ELISA módszerrel. Indukálatlan tenyészetekben a tenyésztés 7. napjára spontán módon is differenciálódnak N-tubulint expresszáló sejtek (9. C ábra), számuk azonban mindig igen alacsony (10 látótérben 1 N-tubulin pozitív sejt; 24. A ábra 1 oszlop) GYKI52466-kezelés hatására a neuronális irányban differenciálódó sejtek száma nagymértékben megemelkedett. Az antagonista 5 µM koncentrációja mintegy 15x - ére emeli meg a neuronális irányban differenciálódó sejtek számát (2. oszlop), míg 50 µM ban közel 40x az emelkedés (3 oszlop) Ez azonban messze elmarad a retinsav által előidézett neurogenezis mértékétől, ahol látóterenként átlagosan 29 neuron található (4. oszlop). Az indukálatlan tenyészetekben GYKI52466 hatására bekövetkező neuronális differenciáció mértékét in situ ELISA módszerrel is detektáltam. Kezeletlen tenyészetekben a 7. napon mérhető relatív N-tubulin tartalom igen

alacsonynak mutatkozott (24. B ábra, 1 fekete oszlop) GYKI52466 5 µM koncentrációja nem okozott változást a relatív N-tubulin tartalomban (2. fekete oszlop) a kezeletlen tenyészethez viszonyítva. 83 84 Ennek oka az lehet, hogy az in situ ELISA módszer nem elég érzékeny ahhoz, hogy különbséget tudjon tenni kismértékű eltérések között. Az 50 µM-ban alkalmazott antagonista kezelés hatására bekövetkező neuronszám-emelkedést (3. fekete oszlop) már sikerült kimutatnom ezzel a módszerrel is, bár a növekedés mértéke igen alacsony volt és az értékek közötti különbség a nagy szórások miatt nem volt szignifikáns. Mivel az indukált neurogenezis során igen nagyszámú neuron differenciálódik és aztán aggregálódik, a pozitívan jelölt neuronok pontos leszámolása nehezen megoldható. Retinsavval indukált tenyészetekben a GYKI52466-kezelés neurogenezisre gyakorolt hatását így in situ ELISA méréssel detektáltam. A

GYKI52466-al nem kezelt, de retinsavval indukált tenyészetekben a relatív N-tubulin tartalom (24. B ábra, 1 fehér oszlop) jóval meghaladta az indukálatlan tenyészetekben mért értéket. GYKI52466 5 µM koncentrációja a tenyészetekben mérhető N-tubulin tartalmat nem emelte jelentősen (2. fehér oszlop) Ha azonban 50 µM-ban adtam a tenyészetekhez az antagonistát, az Ntubulin tartalom csaknem kétszeresére emelkedett (3 fehér oszlop) A GYKI52466 féléletideje igen rövid a rágcsálókban (Tarnawa and Vizi, 1998). Kísérleteim során a sejteken a tenyésztő-médiumot, mely az antagonistát is tartalmazta, 24 óránként cseréltem. Ez alatt a 24 óra alatt nagy valószínűséggel teljes mértékben lebomlott a hatóanyag és így – minden bizonnyal - csak részlegesen sikerült az AMPA receptorokat gátolni. További kísérletek szükségesek, melyek során stabilabb AMPA antagonistákat alkalmaznánk és így a kísérlet teljes időtartama alatt ki tudnánk

védeni az AMPA receptorok aktivációját. Megállapítható, hogy az AMPA receptorok gátlása az indukálatlan tenyészetekben neurogenezist indukál, a retinsavval indukált tenyészetekben pedig fokozza a neurogenezist. II./24 Az extracelluláris folyadék glutaminsav tartalmának vizsgálata NE7C2 sejtek tenyésztő médiumában Az NE-7C2 sejtekben jelen lévő NMDA, AMPA és kainát receptorok természetes agonistája a glutamát. A szervezetünket felépítő sejtek anyagcseréjük során jelentős mennyiségű glutaminsavat használnak fel. A metabolikus glutaminsav-hatások 85 mellett azonban az idegsejtek és gliasejtek glutamát-felhasználása és érzékenysége jelentősen eltér a nem-neurális sejtek glutamát anyagcseréjétől. A neurális sejt-fenotípusok kialakulása során vizsgáltam az NE-7C2 sejtek folyadékkörnyezetének glutamát-tartalmát. A vizsgálatokhoz két tenyésztési hét alatt gyűjtöttem mintákat három-három párhuzamosan

kezelt indukált, illetve indukálatlan tenyészet tápközegéből, és az extracelluláris glutamát koncentrációját fluorimetriás módszerrel határoztam meg a Semmelweis Egyetem Biokémiai Tanszékén, Dr Tretter László és Dr Környei Zsuzsa segítségével. Indukálatlan tenyészetekben az extracelluláris glutamát koncentrációja 7 µM és 12 µM között ingadozott (25. ábra) Az indukció első 3 napján a glutamát koncentrációja kismértékben csökkent (25. ábra), de nem különbözött jelentősen az indukálatlan tenyészetekben mért értékektől. Az indukció 4 napjától azonban a glutamát szintje a 4 - 5 µM közé csökkent és ezen az alacsony értéken maradt az indukció további szakaszában (25. ábra) Az indukált tenyészetek alacsony extracelluláris glutamát szintje jelzi, hogy a neurális irányban elköteleződött sejtek megnövekedett mértékben képesek környezetükből a glutamátot eltávolítani. 86 87 III. GAD FORMÁK

EXPRESSZIÓJA ÉS A GABA-SZINTÉZIS KAPCSOLATA NE-7C2 SEJTEK INDUKÁLT NEUROGENEZISE SORÁN A glutaminsav extracelluláris szintjének aktív szabályozottsága jelezte, hogy a glutaminsav felhasználás a neuronális érés során jelentősen változhat. Az idegsejtek glutaminsav anyagcseréjének egyik fontos ága a glutaminsav GABA átalakulás, amelynek kulcsenzime a GAD. Megvizsgáltam, hogy az NE-7C2 sejtek neuronná fejlődése során megjelenik-e a GAD, és a fejlődés melyik stádiumára tehető a fokozott GABA szintézis kialakulása. Az GAD mRNS ill. fehérje-formák kimutatását az MTA-KOKI Molekuláris Biológiai és Genetikai Laboratóriumával kialakult közös munka keretében Dr Szabó Gábor és Dr Katarova Zója szakmai irányítása mellett végeztem. III./1 GAD mRNS formák expressziójának vizsgálata Az NE-7C2 sejtek neuronális differenciációja a során a gad65 és gad67 gének transzkripciós aktivitását szemikvantitatív RT-PCR módszer

segítségével tanulmányoztam olyan primer párok felhasználásával, amelyek különbséget tesznek az embrionális és felnőtt korban expresszálódó GAD mRNS formák között. A gad67 génről két, majdnem teljesen egyforma embrionális transzkriptum keletkezhet (I-80, I86, 5. ábra; Szabó et al, 1994) Az I-80 mRNS a csak embrionális korban átíródó 7A exont tartalmazza, míg az I-86 mRNS által kódolt transzkript a 7B embrionális exont hordozza (5. ábra), melynek szekvenciája plusz 6 bázist tartalmaz a 7A exonhoz képest Mindkét exonban található egy átfedő STOP/START kodon, míg a 7B exonban a plusz 6 bázis egy extra STOP kodont kódol (5. ábra), mely meggátolja a transzlációt az mRNS további szakaszáról. A 12 primer pár (2 táblázat) „antisense” tagja (26 ábra) olyan szekvencia részletet ismer fel, amely mind a 7A mind a 7B exonban megtalálható, míg a „sense” primer az embrionális exonokon kívül eső 5’ szekvenciára specifikus.

Így a 12. primer párral felszaporítható termék mind az I-80-ról, mind az I-86-ról keletkezhet. A teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló transzkriptumban nincs jelen egyik embrionális exon sem, így a 6. és 8 exonok egymás mellé kerülnek A 13 primer pár (2. táblázat) 88 89 „antisense” tagja a 6. és 8 exonok egymással szomszédos szekvencia-részleteit ismeri fel (3 bp a 6. exonból és 24 bp a 8 exonból) és köti meg (tehát az embrionális formákat nem), míg a „sense” primer a gad67 gén azon szakaszára lett tervezve, amely genom által kódolt gad67 „pseudogén”-ben nincs jelen (26. ábra, Brilliant et al, 1990) A 14 primer pár a GAD65 fehérjét kódoló mRNS-t ismeri fel (26. ábra) Belső standardként β-aktint szaporítottam 16-20 cikluson keresztül a 15. primer pár segítségével A β-aktin gén expresszióját függetlennek tekintjük mind a sejtciklustól, mind a differenciációtól, azaz mennyiségét állandónak

vettük az indukció teljes időtartama alatt. A felhasznált primerek szekvenciáját az 2. táblázat tartalmazza Az indukálatlan NE-7C2 sejtek alacsony szinten expresszálták az embrionális transzkriptumokat (27. A, A’ ábra) Az ATRA indukálta neurogenezis során az embrionális formák expressziós szintje átmeneti emelkedést mutatott. Az indukció 2 napján a transzkriptum szintje nagymértékben megemelkedett és a 4. napra elérte maximumát (27. A, A’ ábra) Ez az időszak egybeesik a neuronális nyúlványok megjelenésének szakaszával. Az indukció előrehaladtával az embrionális mRNS-ek szintje folyamatosan csökkent és elérte a kiindulási mennyiséget az indukció második hetének végére (27. A, A’ ábra) A teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló mRNS-t az indukálatlan, folytonosan osztódó sejtek nem expresszálták (27. B, B’ ábra) A transzkriptum az indukció 2. napjától volt detektálható, szintje folyamatosan emelkedett az indukció

előrehaladtával, és az indukció 12. napjára jelentős mennyiségben volt jelen (27. B, B’ ábra) Az embrionális ill felnőtt GAD67 mRNS-formák expressziójának időbeli mintázata alapján megállapítható, hogy az embrionális 7A és 7B exonok expressziója a neuronális fejlődés szigorúan meghatározott szakaszaira korlátozódik. A GAD65 fehérjét kódoló mRNS-formát csak indukált sejtekből sikerült kimutatni (27. C, C’ ábra) A transzkriptum már az indukció korai szakaszában alacsony szintű expressziót mutatott, de szignifikáns mennyiségben csak az indukció 7. napjától expresszálódott. Az indukció későbbi szakaszában az mRNS szintje nem emelkedett tovább (27. C, C’ ábra) 90 91 III./2 Rövidített és teljes hosszúságú GAD fehérje-formák időbeli megjelenése NE7C2 sejtek in vitro indukált neurogenezise során Hogy meghatározzam, milyen GAD fehérje-formák transzlálódnak az ATRAindukció különböző szakaszaiban,

Western blot analízist végeztem NE-7C2 sejtek tenyészeteiből készített szubcelluláris frakciókból (lásd „Anyag és Módszer” fejezet). A GAD fehérjeformák kimutatásához korábban már karakterizált ellenanyagokat használtam: 1) # 6799 poliklonális szérum (Katarova et al., 1990), mely mind az embrionális, mind a felnőtt GAD formákat felismeri, 2) # 8876 poliklonális szérum, (Szabó et al., 1994) a 25 kD tömegű rövidített formát ismeri fel ill 3) a 65 kD formára specifikus GAD6 monoklonális ellenanyag, (GAD6 hibridóma sejtvonal felülúszó; Hibridóma Bank; Chang and Gottlieb, 1988). Pozitív kontrollként 13 napos egér-embrió (E13) ill. újszülött kisállat (P0) előagyából készített fehérje-mintákat futtattam a géleken. Alacsony feszültségtartományban végzett blottolás mellett (lásd „Anyag és Módszer” fejezet) főleg a kis molekulatömegű embrionális formákat lehetett kimutatni. Mind a 25 kD, mind a 44 kD embrionális forma

a TritonX-114 oldhatatlan durvamembrán frakcióban jelentkezett, más frakciókban jelenlétüket nem sikerült igazolni. A # 6799 és a # 8876 ellenanyag igen hasonló GAD25 fehérje-expressziós mintázatot mutatott, a 28. ábrán a # 8876 ellenanyaggal kapott blot szerepel A GAD25 fehérje már indukálatlan progenitorokban detektálható volt (28. A ábra) A viszonylag alacsony mRNS szint mellett (27. ábra) meglepően magas volt a fehérje mennyisége A fehérje szintje az idegi indukció korai szakaszában kismértékben még tovább emelkedett, majd az indukció 6. napjától igen alacsony szintre csökkent, de az indukció második hetében is detektálható maradt (28. A ábra) Az indukció korai szakaszában valamint az indukálatlan sejtekben a fehérje kettős csíkot adott a blottokon (28. A ábra), amely (Szabó Gábor és mtsai adatai alapján) feltételezhetően posttranszlációs módosítások során keletkeznek, de a fehérje degradációjának lehetősége sem

kizárt. A GAD44 fehérje nem volt detektálható az indukálatlan sejtekben (28. B ábra) A fehérje a ATRA-indukció igen szűk időtartományában tranziens módon transzlálódott. Az indukció 4 napján szintje még igen alacsony, a 6 napra nagymértékben 92 93 megemelkedett és elérte maximumát (28. B ábra) A fehérje mennyisége a 10 napig csökkent, majd tejesen el is tűnt az indukció második hetének végére (28. B ábra) Fokozatosan emelkedő feszültség mellett végzett blottolás során a nagyobb molekulatömegű tartományba eső GAD fehérje-formák kimutatása is lehetővé vált. A teljes hosszúságú GAD67 fehérjét azonban nem sikerült kimutatnom egyetlen szubcelluláris frakcióból sem, annak ellenére, hogy a kódoló mRNS szintje az indukció második hetében már igen jelentős mennyiséget ért el. Ha a fehérje csak kis mennyiségben van jelen a sejtekben, akkor elképzelhető, hogy a futtatás során felvitt 15µg totál fehérje nem

tartalmazott kimutatható mennyiségű GAD67 fehérjét. Hogy elkerüljem ezt a hibaforrást, megpróbálkoztam a fehérjét feldúsítani a mintákban immunprecipitációval ill. ammónium-szulfát precipitációval is A fehérjét azonban így sem sikerült kimutatni, amiből arra következtettem, hogy vagy az mRNS nem transzlálódik, vagy a fehérje életideje nagyon rövid az indukció általam vizsgált szakaszában. A GAD65 fehérjét a TritonX-114 oldható durva-membrán frakcióban tudtam csak kimutatni. A fehérje az indukció 6 napján jelent meg alacsony szinten, mennyisége az indukció 10. napjától emelkedett, párhuzamosan a neuronok érésével (28. C ábra) III./3 GAD fehérjeformák sejtszintű lokalizációjának vizsgálata formaspecifikus ellenanyagokkal Hogy meghatározzam, melyek azok a sejtek, amelyek a különböző GAD fehérjéket expresszálják, immuncitokémiai vizsgálatokat végeztem az indukció különböző szakaszaiban az egyes fehérjeformákra

specifikus ellenanyagokkal. A festések során az immunjelet tyramid szignál amplifikációval erősítettem és a festéseket normál fluoreszcens ill. konfokális lézer mikroszkóppal értékeltem NE-7C2 sejtek indukálatlan tenyészetében a GAD25 fehérje alacsony szinten majdnem minden sejtben detektálható volt a poliklonális 8876 szérummal. Az immunreaktivitás a teljes sejttestet kitöltötte (29. A ábra) Az alacsony intenzitású immunjelet specifikus festésnek tekintettem, mivel a Western blot analízis is megerősítette a fehérje jelenlétét. A retinsav-indukálta idegi differenciáció a fehérje 94 expressziójának megemelkedését eredményezte a neuronális irányba elköteleződő sejtekben (29. B, C ábra) Az ellenanyag mind a sejtmag körüli, igen kis kiterjedésű sejttestben (29. B ábra), mind a hosszú nyúlványokban jól látható fluoreszcens jelet adott (29. C ábra) A nem-neurális sejtek festődése a háttértől nem tért el A GAD44

fehérje kimutatására nyúl poliklonális szérumot használtam (# 8877), melyet affinitás-tisztítottam bakteriálisan expresszáltatott GAD44 fehérje-szekvencián (Szabó et al., 1994) Az indukálatlan sejtekben immunfestést nem láttam Az első immunreaktív sejtek az indukció 4. napján voltak azonosíthatók (30 A ábra) és az immunjel a citoplazma marginális zónájában dúsult fel. Az indukció 7 - 10 napjára az immunjelölt sejtek száma megnőtt (30. B és C ábra) és a festődés mind a perinukleáris régióban mind a nyúlványok proximális szakaszán erős volt. A differenciáció későbbi szakaszában a jelölt sejtek száma nagymértékben csökkent és az indukció 12. napjára nem találtam jelölt sejtet a tenyészetekben. A GAD65 fehérjére adott specifikus festődést (N65 ellenanyag, Solimena et al., 1993) elsőként az indukció 7. napján detektáltam a neuronális morfológiával jellemezhető sejtekben. Az indukálatlan aljzatsejtek nem festődtek

GAD65-specifikus szérummal. Az indukció 10 napjára az idegsejt legtöbbje jelölődött (31 A-F ábra) és a fehérje mind a sejttestben, mind a nyúlványokban jelen volt. Mivel nincs olyan ellenanyag, amely a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét meg tudná különböztetni rövidített szekvenciájú variánsaitól, szelektív festést erre a formára nem tudtam elvégezni. A fehérjét sem Western blot, sem immunprecipitáció segítségével nem tudtam detektálni, tehát nagy valószínűséggel nincs jelen az indukció általunk vizsgált szakaszában. 95 96 97 III./4 NE-7C2 sejtek GABA-tartalma az in vitro indukált neurogenezis különböző stádiumaiban Az in vitro indukált neurogenezis során az NE-7C2 sejtek két olyan GAD fehérjét (GAD65 és GAD44) is expresszáltak, amelyek a gluatminsavból GABA-t tudnak előállítani. A GABA-t tartalmazó sejteket immuncitokémiai festéssel azonosítottam retinsavval indukált ill. indukálatlan tenyészetekben Az

indukálatlan sejtek, amelyek csak GAD25 formát expresszálnak, nem tartalmaztak immuncitokémiailag detektálható mennyiségű GABA-t (32. A ábra) Immunreaktív sejteket nem láttam az indukció 2. és 4 napján sem Az indukció 6 napján (32 B ábra) jelentek meg az első magas GABA-tartalmú sejtek és számuk folyamatosan nőtt az indukció előrehaladtával (32. C-D ábra) A festődés kitöltötte a teljes citoplazmát és a nyúlványokat, erősen megjelölve az axonális növekedési kúpokat (32. E és F ábra) Az indukció későbbi szakaszában (8-10. nap) a nyúlványokon elhelyezkedő varikozitások szintén erősen jelölődtek. 98 99 LEGFONTOSABB EREDMÉNYEK 1. Az NE-7C2 sejtvonal megalapítása során kezdeti genetikai instabilitást tapasztaltam, mely fokozatos kromoszómaszám-vesztéssel járt. A sejtvonal kromoszómaszáma a 30. passzázstól (kb 100 sejtduplikációs ciklus eltelte után) kezdve stabilizálódott, és a normál egér

genomnál másfélszer több kromoszómát tartalmazó vonal alakult ki. 2. Az NE-7C2 sejtvonal korai fejlődési állapotot reprezentáló neurális progenitor sejtekből áll. A sejtvonal ATRA-indukálta neurogenezise jól karakterizált progenitor stádiumok szukcessziós sorozata, mely megfelelő modellként szolgálhat a korai neurogenezis meghatározott lépéseinek tanulmányozására. 3. Az in vitro neuronális differenciáció során az idegsejtek nyúlványnövekedésének szakaszában megjelennek a sejtek felszínén funkcionális NMDA receptorok, melyek aktivációja az [Ca2+]IC megemelkedését okozza. 4. Mind az indukálatlan, mind az indukált NE-7C2 sejtek funkcionális AMPA receptorokat expresszálnak, amelyeken át a progenitor sejtek osztódása is szabályozható. 5. A funkcionális NMDA és AMPA receptorok együttes jelenléte idején az extracelluláris tér glutaminsav-tartalma lecsökken. 6. A glutaminsavból GABA-t előállító GAD67 fehérjecsalád

embrionálisan megjelenő fehérjéi (GAD25, GAD44) az indukálatlan sejtekben ill. a fiatal neuronokban expresszálódnak. A teljes hosszágú GAD65 forma jelenléte a késői indukciós periódust, a neurális érés időszakát jellemezi. 7. GABA-t akkumuláló idegsejteket csak azokban a stádiumokban sikerült kimutatni, amikor a GAD44 és/vagy a GAD65 fehérje már jelen volt. 100 101 MEGBESZÉLÉS Az agy fejlődése során az idegszövetet felépítő neuronok és gliasejtek differenciálódása különböző progenitor-stádiumok térben és időben egymást követő sorozataként valósul meg. A folyamat szabályozásában a genetikai tényezők mellett a környezeti (sejtes és kémiai) faktorok is fontos szerepet töltenek be. Az elmúlt években számos szekretált molekuláról (növekedési faktorok, hormonok és neurotranszmitterek) bebizonyosodott, hogy szerepet játszik a proliferáció, differenciáció, migráció és neuronális túlélés folyamatainak

szabályozásában az idegrendszer kialakulása során. A kifejlett idegrendszerben „klasszikus neurotranszmitterként” ismert molekulák az idegrendszer érése alatt mindvégig jelen vannak a progenitorsejtek környezetében (Miranda-Contreras et al., 1998; 1999; 2000) és jelfogó receptoraik is kifejeződnek a sejtek felszínén jóval a szinaptogenezis megindulása előtt (Sah et al., 1997; Haydar et al., 2000; Maric et al, 2000) Az utóbbi 10 évben számos olyan tanulmány jelent meg, amely bizonyítja, hogy a neurotranszmitterek fejlődésreguláló anyagokként viselkednek az idegrendszer embrionális fejlődése során (LoTurco et al., 1995; Behar et al, 1996; Ma et al., 1998; Haydar et al, 2000; Nguyen et al, 2001) Doktori munkám során vizsgáltam a glutaminsav ionotróp receptorainak megjelenését és lehetséges funkcióit, ill. tanulmányoztam a glutaminsavból GABA-t előállító GAD fehérjecsalád tagjainak expresszióját az in vitro neuronális

elköteleződés jól jellemzett stádiumaiban. A kísérleteket egy p53-/- immortalizált, neuroektodermális sejtvonalon, az NE-7C2-n végeztem, melynek tenyészeteiben ATRA-kezelés hatására neuronok, majd ezt követően asztrogliasejtek differenciálódnak. I. Az NE-7C2 sejtek korai neuroektodermális fejlődési állapotot reprezentáló progenitorok Az idegrendszer embrionális fejlődése során a rövid távolságon - mindössze néhány sejtet magába foglaló mikrokörnyezeten - belül érvényesülő hatások vizsgálata és elemzése in vivo körülmények között nehezen megoldható feladat. A korai embrionális (E9 - E13) fejlődési állapotok in vivo vizsgálatát megnehezíti az embriók méhen belüli védettsége, a fejlődést szabályozó folyamatok nagyfokú összetettsége, 102 valamint az idegi progenitor sejtek térben és időben eltérő fejlettségi állapota – azaz heterogenitása. Az embrionális idegszövetből izolált primer tenyészetekben

a sejtek közötti heterogenitás az in vitro tenyésztés során is fennmarad, a kiültetett sejtek csak korlátozott mértékben őrzik meg progenitor sajátságaikat és néhány osztódás után differenciálódnak. A neurogenezis in vitro vizsgálatához olyan homogén sejtpopulációk nyújthatnak ideális modellt, amelyekben a sejtek azonos fejlődési potenciállal rendelkeznek és ezeket a tulajdonságaikat a fenntartás során megőrzik, de megfelelő indukció hatására idegszöveti sejttípusokká differenciálódnak. Amennyiben ezek a sejtek korlátlan osztódó-képességgel is rendelkeznek, a biokémiai és molekuláris biológiai kísérletek elvégzéséhez elegendő mennyiségű kiindulási sejttömeget produkálhatnak. Az idegi irányú elköteleződés tanulmányozására folytonosan osztódó sejtvonalak állíthatók elő perifériás eredetű idegrendszeri tumorokból (PC12 sejtvonal), ill. embrionális karcinómákból (P19, PCC-7, NTera-2) izolált sejtekből

Az embrionális karcinóma eredetű sejtvonalakban azonban a neuronok és asztrogliasejtek kialakulása mellett izomsejtek és fibroblasztok is differenciálódnak. A széles fejlődési potenciállal rendelkező embrionális őssejtek is igen eltérő sejttípusok kialakítására képesek. Folytonosan osztódó sejtpopulációk előállíthatók virális onkogének (v-raf, T-antigén) progenitorsejtekbe juttatásával, ám számolni kell azzal, hogy a beépülő onkogén módosíthatja a progenitorok fejlődési sajátságait. Immortalizált sejtek előállításának egy új módját kínálják azok a transzgenikus állatok, ahol a sejtciklus vagy programozott sejthalál regulációjában szerepet játszó gének működése kiesik. A p53 gén-kiütött egerekből izolált sejtek egy része spontán immortalizációt mutat funkcionális p53 fehérje hiányában (Harvey et al., 1993; Metz et al., 1995; Schlett and Madarász, 1997) A p53-/- egér embrió primer neuroepitél

sejtjeiből klónozással nyert master tenyészetekben különböző kromoszóma-készletű sejtpopulációk voltak jelen. Eddigi adataink szerint az immortalizált sejtvonalak a kétszeres kromszómaszámmal rendelkező populációból származnak. A jelenség azt jelzi, hogy a kromatin-állomány növekedése kezdetben szelektív előnyt jelenthet a primer neuroepiteliális sejtek szaporodásában. Hasonló kromoszómális instabilitást figyeltek meg p53-/- embrionális fibroblaszt sejtvonalak (Harvey et al., 1993), ill hematopoietikus sejtek hosszú távú 103 fenntartása esetében is (Metz et al., 1995), megerősítve, hogy a p53 fehérje fontos szerepet tölt be a kromoszómális integritás megőrzésében. A 100 feletti kromoszómaszámmal rendelkező sejtek megjelenése NE-7C2 sejtek tenyészeteiben szintén azt jelzi, hogy a sejtosztódást szabályozó folyamatok sérülnek funkcionális p53 gén hiányában. Az a tény, hogy a poliploid sejtek sosem válnak

meghatározóvá a tenyészetekben azt sugallja, hogy a génállomány egy határ fölötti növekedése hátrányos lehet a sejtek szaporodása során. Hasonló poliploid megakariocitákat figyeltek meg egy p53-/- eritroid sejtvonal esetében is (Metz et al., 1995), azonban ezen sejtek aránya sosem haladta meg az 1%-t a tenyészetekben. Az NE-7C2 sejtvonal további tenyésztése során a duplikált kromoszómaszám látszólag már nem jelentett előnyt a sejtek növekedésében. A sejtvonal stabilizációja során a kromoszómaszám n ≈ 3 érték felé közelít. Feltételezéseink szerint ez a genom-méret egyrészt biztosíthatja a szerzett előnyök további megtartását, másrészt nem igényli a sejtciklus időtartamának hátrányos megnövekedését. Hasonló kromoszómaszám csökkenést majd stabilizálódást figyeltünk meg egy másik p53-/- sejtvonal esetében is (NE-4C; Schlett and Madarász, 1997), ahol a kezdetben duplikált kromoszómaszámmal rendelkező sejtek

kromoszóma-állománya fokozatosan csökkent a sejtvonal fenntartása során. Érdekes megemlíteni, hogy mind az NE-7C2, mind az NE-4C sejtvonal esetében a kromoszómaszám csökkenése lelassult az átültetések számának emelkedésével, és mindkét sejtvonal esetében a kromoszómaszám a 60-s érték körül stabilizálódott. A folyamatos kromoszómaszám–vesztés ellenére a sejtek fenotípusa nem változott és ATRA kezeléssel minden passzázsban indukálható volt a neuronok kialakulása. Az általam alkalmazott módszerrel azonban csak a kromoszómák számának csökkenését tudtam regisztrálni. Miután a változó kromoszómaszám nem befolyásolta a neurális indukciót, fontos lenne megvizsgálni, hogy mely kromoszómák vesznek el, illetve a neurális fejlődésben szerepet játszó géneket hordozó kromoszómák többszörös kópiában maradnak-e fenn. A további kísérletek során olyan passzázs-számú NE-7C2 sejtekkel dolgoztam, amelyek

kromoszómaszáma a 60-s érték körül már stabilizálódott (p30-p60). Az NE-7C2 sejtvonal sejtjei indukálatlan állapotban epiteliális sejtekre jellemző alakkal rendelkeznek és a neurális progenitorok markerfehérjéjét, a nesztint 104 expresszálják. Letapadásfüggő növekedésük azt mutatja, hogy a sejtvonal sejtjei p53 fehérje hiányában sem tumorosan transzformáltak. A tenyészetekben kis gyakorisággal bekövetkező spontán neuronális differenciáció (> 1%) a sejtvonal idegrendszeri eredetét támasztja alá és bizonyítja, hogy a sejtekben a terminális differenciáció folyamata p53 fehérje hiányában is bekövetkezik. Az indukálatlan tenyészetekben kis gyakorisággal megjelenő neuronok fenotípusuk alapján (egy rövid, el nem ágazó nyúlvány és lekerekedett sejttest) egy korai fejlődési stádiumot képviselnek és további differenciációjukhoz valószínűleg sem a sejtes, sem a folyadékkörnyezet nem biztosít megfelelő

feltételeket. Indukálatlan tenyészetekben az idegszövet másik jellemző sejttípusa, az asztroglia nem volt kimutatható. A megfigyelés arra utal, hogy az asztroglia sejtek differenciációjához szükséges környezeti faktorok (sejtes és kémiai) nem állnak rendelkezésre a differenciálatlan sejtek tenyészeteiben. NE-7C2 sejtek tenyészeteiben neuronok nagyszámú differenciációját all-trans retinsav kezeléssel tudtam indukálni. A retinsav neuronális differenciációt indukáló hatását figyelték meg embrionális stem (ES) sejteken és embrionális karcinóma sejteken is (P19, Ntera-2), de ezeken a sejtvonalakon nem-neurális fejlődési irányok is indukálódtak. Az NE-7C2 sejtek tenyészeteiben ATRA kezeléssel csak idegszöveti típusú fejlődési irány volt kimutatható, tehát az NE-7C2 sejtvonal beszűkült progenitor potenciálja alapján már egy előrehaladottabb fejlődési stádiumot képvisel, mint az ES sejtek ill. az embrionális karcinóma

eredetű sejtvonalak Hasonló indukciós sajátságokat mutatott a laboratóriumunkban már korábban jellemzett p53-/- neuroektodermális NE4C sejtvonal is, amelyben ATRA kezelés hatására neuronok és asztroglia sejtek differenciálódtak (Schlett and Madarász, 1997). Felmerül a kérdés, hogy az általam használt ATRA koncentráció (10-6 M) mennyire tekinthető fiziológiás koncentrációnak. Mivel az all-trans retinsav igen instabil vegyület, mind fény, mind hőmérséklet hatására izomerizálódik, a retinsav egy jelentős része lebomolhat, mire a sejtekkel kapcsolatba kerül. Így a ténylegesen jelen lévő ATRA koncentráció az általam megadott értéknél jóval alacsonyabb lehet. A retinsav-kezelés csak a sejtek egy részét (~ 50%) készteti neuronális ill. gliális differenciációra. Az el nem kötelezett sejtek egy összefüggő monolayert hoznak létre a petricsésze felszínén. A differenciálódási folyamat során a neuronális morfológiájú sejtek

nem egyenletesen oszlanak el a tenyészetekben, hanem kisebb csoportokat 105 alkotnak. A tenyészetekben in vitro megfigyelhető nagyszámú differenciálatlan sejt, ill neuronok esetében megfigyelt csoportos megjelenési mintázat alapján feltételezhető, hogy a neuronális sejttípus-determináció folyamata során rövid hatótávolságú szabályozó folyamatok jelentős szerephez juthatnak. Az idegrendszer embrionális fejlődése során a részletesen tanulmányozott, közvetlen sejt-sejt kontaktuson alapuló laterális gátlás (Rooke and Xu, 1998) mechanizmusa által szelektálódnak ki a progenitorok közül azok a sejtek, amelyek idegsejtekké differenciálódnak. Laterális gátláshoz hasonló folyamatok működését sikerült korábban kimutatnom NE-7C2 sejtek ATRA-indukálta neurogenezise során (Varju P. szakdolgozat, 1997), mely valószínűsíti, hogy az in vitro neurogenezis során a neuronális fenotípus determináció szabályozása hasonló folyamatok

által megy végbe. A sejtvonal ATRA-indukálta neuronális differenciációja egymásra épülő fejlődési stádiumok sorozata, melyek jól jellemezhetők a differenciálódó sejtek alakjával és egyes neuron-specifikus fehérjék megjelenésével (4. táblázat) A neuronok differenciálódása során elsőként az N-tubulin fehérje mutatható ki a kisnyúlványos idegsejtek vázrendszerében, majd a NFL és NFM köztes filamentum fehérjék jelennek meg, amelyeket a neuronok érése során az NFH alegységek megjelenése követ. A mikrotubulus-asszociált fehérjék közül a Map2 formát mutattam ki NE-7C2 idegsejtekben. A központi idegrendszer fejlődése során a neuronok egymással szinaptikus kapcsolatok bonyolult hálózatát alakítják ki. A képződő szinapszisok felépítéséhez szükséges fehérjék a sejttestben szintetizálódnak és onnan szállítódnak a pre– és posztszinaptikus felszínekhez. A neurotranszmitterek raktározására szolgáló szinaptikus

vezikulumok membrán–asszociált fehérjéjéi közé tartozó szinapszin-I és szinaptofizin fehérjék jelenléte jelzi, hogy az NE–7C2 sejtek indukált neurogenezise során a szinapszisokra jellemző fehérjék expressziója is megindul. Felvetődik a kérdés, hogy milyen fejlődési stádiumig differenciálódnak az in vitro kialakuló neuronok. A hosszú ideig életben tartott tenyészetekben további vizsgálatokkal kell eldönteni, hogy kialakulnak–e működő szinapszisok és determinálódik-e az idegsejtek neurotranszmitter fenotípusa. A differenciált idegsejtek egy részében kimutatható jelentős mennyiségű GABA ill. az előállításáért felelős 106 “felnőtt” GAD enzimformák tartós jelenléte arra utalhat, hogy ezen idegsejtek GABAerg irányba differenciálódó neuronok. Asztroglia–sajátságú sejtek a neuronális aggregátumok belsejében jelentek meg elsőként az indukció második hetében, majd egyre nagyobb számban az

aggregátumokat övező területeken is. E megfigyelés alapján arra következtettem, hogy az asztrogliasejtek kialakulásához neuronok jelenlétére van szükség. Az idegrendszer embrionális fejlődése során az elsőként differenciálódó sejtek neuronális sajátságokat mutatnak, a gliális fehérjéket expresszáló progenitorok csak az első neurogenetikus hullám után jelennek meg. Megállapíthatjuk, hogy az NE-7C2 sejtvonal in vitro differenciációja során a neuron ill. asztroglia típusú sejtek szekvenciális indukciója jól követi az in vivo fejlődés időbeli mintázatát. Az idegszövetben nagy mennyiségben előforduló oligodendroglia sejtek korai ill. késői fejlődési stádiumaira jellemző fehérjéket (galaktocerebrozid ill mielin) az NE7C2 sejtek indukálatlan és ATRA-al indukált tenyészeteiben nem tudtam kimutatni Valószínűsíthető, hogy önmagában az ATRA és a hatására in vitro kialakuló idegsejtek és asztrogliális elemek nem

biztosítanak megfelelő feltételeket az oligodendroglia sejtek kifejlődéséhez. Az NE-7C2 sejtek ATRA-indukálta neuronális differenciációja jól meghatározott és reprodukálható lépéseken keresztül történik, amely lehetőséget ad a sejtvonal in vitro modell-rendszerként való felhasználására a neurogenetikus folyamatok lépéseinek tanulmányozására. 107 II. Ionotrop glutamát rceptorok az in vitro indukált neurogenezis alatt II./1 Sejtfelszíni NMDA receptorok a fiatal neuronok nyúlványelongációs szakaszában jelennek meg Annak ellenére, hogy az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban is expresszálnak NMDA receptor alegységeket, funkcionális NMDA-csatornákat csak a már nyúlványos idegsejteken sikerült kimutatni. Az NR2 alegységek közül az NR2A és NR2D mRNSeit már a proliferáló progenitorokban expresszálódtak és mRNS szintjeik az indukció során lényegesen nem változtak. Az alegységek expressziójának mértékét az NR1

alegység expressziós változásai nem befolyásolták. Az NR2A alegység fehérje-formáját ugyanakkor nem sikerült megbízható módon kimutatni. A Western blot analízis során a felnőtt patkány agyhomogenizátumból kimutatott érett fehérjéhez képest az NE-7C2 sejtek fehérjemintáiban két kisebb molekulatömegű fehérje jelent meg, igen kis mennyiségben. Az eredmény arra enged következtetni, hogy az NR2A alegység fehérje gyorsan degradálódik (Huh and Wenthold, 1999) vagy egy éretlen, poszt-transzlációs modifikációktól mentes (glikozilálatlan) formája termelődik (Portera-Caillau et al., 1996; Hall et al., 1997; Laurie et al, 1997) NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során az NR2C alegység mRNS-e nem volt kimutatható, mely utalhat a sejtvonal előagyi eredetére. Az idegrendszer fejlődése során ugyanis az NR2C alegység igen behatárolt expressziót mutat, főleg a kisagy területén és a talamuszban fordul elő (Monyer et al., 1991). Mivel az

NR2D alegységre specifikus ellenanyag nem volt kereskedelmi forgalomban a kísérletek végzése idején, a fehérje jelenlétét nem tudtam igazolni. Az NR2 alegységek közül az NR2B alegység expressziója időben egyezett a neurális hálózatok kialakulásával. Az NR2B fehérje csak neuronális sejtekben volt kimutatható és expressziós szintjének emelkedése jól korrelált a funkcionális NMDA csatornával rendelkező neuronok nagyszámú megjelenésével. Az NMDA-vezérelt Ca2+csatornával rendelkező sejtek számának növekedése a nyúlvány-rendszerek kialakulásának időszakában és az ezzel egyidőben emelkedő NR2B fehérjeszint azt valószínűsíti, hogy az NR2B alegységet tartalmazó NMDA receptor komplexumok a neuronális érési folyamatokban játszanak fontos szerepet. Funkcionális NMDA 108 csatornával rendelkező sejteket azonban már olyan fejlődési stádiumban is sikerült kimutatni, amikor az NR2B alegység fehérje még nem volt jelen.

Az adatok azt valószínűsítik, hogy ezeknek a receptoroknak a felépítésében NR2D alegységek vehettek részt. NR1 alegységet mind a proliferáló, mind a differenciálódó NE-7C2 sejtek expresszáltak. Az indukálatlan progenitorokban a legfőbb NR1 transzkriptum a C1 és C2 kazettákat egyaránt tartalmazta. A csak C1-t ill csak C2-t tartalmazó mRNS-k indukálatlan NE-7C2 sejtekben igen alacsony szinten expresszálódtak, de mennyiségük az indukció előrehaladtával emelkedett. A C2 kazetta tartalmú fehérje mennyiségi változása ellentétes tendenciát mutat a transzkriptum szintjének változásával, ami arra utal, hogy a C2 exont tartalmazó fehérje képződése transzkripciós és transzlációs szinten is szabályozott folyamat. A C2 kazettát tartalmazó fehérje szinte kizárólag a citoplazma frakcióban ülepedett, jelezvén, hogy a fehérje nem transzportálódik a sejtfelszínre. Az immuncitokémiai festések alapján a sejten belül raktározott fehérje

valószínűleg az ER vagy a Golgi membránokon belül található. Hogy mi lehet a pontos szerepe ezeknek a sejten belüli NR1 raktáraknak, és vajon a fehérje kikerül-e innen valaha a sejtfelszínre, nem tudjuk megválaszolni. A funkcionális NMDA csatornák hiánya az indukció első hetében azt sugallja, hogy az NR1 fehérje nem jut ki a felszínre és nem épül be funkcionális receptorba annak ellenére, hogy az NR2D alegység mRNSe már expresszálódik ebben az indukciós periódusban. Az NR2 alegységek NR1 alegységhez viszonyított késői megjelenése azt jelezheti, hogy a funkcionális csatornák kialakításának egyik tényezője az NR2 alegység limitált expressziója lehet (Hall and Soderling, 1997; Pérez-Otaño et al., 2001) Az NMDA csatornák hiánya az indukció első hetében azt mutatja, hogy az NE-7C2 neuronokban az NMDA receptorok sejtfelszíni expresszióját szabályozó folyamatok meggátolják, hogy a neuronok egy adott fejlődési stádium elérése

előtt sejtfelszíni NMDA receptorokat fejezzenek ki. Korábbi irodalmi adatok és saját eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a Cterminális exonoknak fontos szerepe van az NR1 fehérje sejten belüli transzportjában illetve a fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakításában. Az elmúlt években több kutatócsoport is arra a következtetésre jutott nem neurális eredetű expressziós rendszerekben (HEK 293 sejtvonal, Xenopus oocyta), hogy az NR1 alegység sejtfelszíni transzportjához és a funkcionális NMDA csatornák megjelenéséhez legalább egyféle 109 NR2 alegység koexpressziója szükséges (Blahos and Wenthold, 1996; McIlhinney et al., 1996, 1998; Huh and Wenthold, 1999) Azonban a csak neuronokban kimutatható NMDA receptorokat felépítő alegységek transzportját szabályozó folyamatok nem neurális eredetű sejtekben nem feltétlenül működnek, így az NMDA receptor alegységek sejten belüli lokalizációjának vizsgálatára ezek a rendszerek csak

korlátozott mértékben alkalmasak. A központi idegrendszeri eredetű NE-7C2 sejtvonal ATRAindukálta neurális differenciációja során megjelenő NMDA receptor alegység fehérjék sejtfelszíni transzportját az idegsejtekre jellemező intracelluláris környezetben tanulmányozhatjuk és a tapasztalt jelenségek jól közelítik az NMDA receptor alegységek transzportját in vivo is szabályozó folyamatokat. A nyúlványok stabilizációja és a neuronális hálózatok kialakulása idején NE7C2 sejtekben az NR1-a mRNS szintje tovább emelkedik és az N1 exont tartalamazó (NR1-b) transzkriptumok expressziója is megindul. Az N1 exonok expressziójával egyidőben jelennek meg az NMDA-indukált [Ca2+]IC emelkedések is, azaz az első funkcionális NMDA-vezérelt csatornák. Az N1 exon késői megjelenése NE-7C2 sejtekben jó egyezést mutat az in vivo (Laurie and Seeburg, 1994; Prybylowski et al., 2000) és in vitro adatokkal (Asahi et al., 1998), melyek szintén igazolják,

hogy az N1 exon relatíve későn expresszálódik a hippocampusz, talamusz és a kisagy neurális fejlődése során. Az extracellulárisan elhelyezkedő N1 kazetta beépülése az NR1 alegységbe megnöveli az ionáram amplitúdóját, lecsökkenti a receptor agonistaaffinitását és a receptor által deszenzitizált állapotban eltöltött időt (Zukin and Bennett, 1995; Rumbaugh et al., 2000), melyeknek fontos szerepe lehet a neurális hálózatok alakulása és a szinaptogenezis folyamán. Funkcionális NMDA receptorokat elsőként a neuronok nyúlvány-elongációja idején sikerült kimutatni. Ennek alapján feltételezhető, hogy az NMDA receptorok szerepet játszanak a neurit-növekedésben. Az indukció későbbi szakaszában, az idegsejt-hálózatok kialakulásával párhuzamosan, egyre nő a sejtfelszíni NMDA receptorokat tartalmazó sejtek száma. Irodalmi adatok szerint a receptorok fontos szerepet játszanak a nyúlványok növekedésében (Lipton and Kater, 1989)

valamint a növekedési kúpok irányválasztásában (Zheng et al., 1996), azaz szabályozzák a nyúlvány-hálozatok kialakulását. Az in vitro indukált neurogenezis során tapasztalt időbeli egybeesés is ezeket a megfigyeléseket támasztja alá. 110 NR2A NR2B NR2C NR2D GluR1flip GluR2flip GluR3flip GluR4flip Glutamát Glicin affinitás affinitás EC50 EC50 (µM) ~1.7 - 37 ~ 2.1 ~ 0.8 ~ 0.3 ~ 0.2 ~ 0.2 ~ 0.4 ~ 0.1 ~ 78.6 ~ 92.7 ~232.1 ~132.9 5. táblázat NMDA és AMPA receptorok glutamát affinitása, ill. a NMDA receptorok glicin affinitsa homomer receptorok esetében. A NMDA csatornák folyamatos aktivitása megemelheti az [Ca2+]IC szintet, amely neuronális halálhoz vezethet, ha az extracelluláris térben magas a glutaminsav koncentráció. Az indukció 4 napjától az NE-7C2 sejtek folyadékkörnyezetében a glutaminsav-tartalom nagymértékben csökkent (~ 5 µM). Ez a glutaminsav koncentráció az NMDA receptorokat még teljes mértékben aktiválni tudja (5.

táblázat; Mori és Mishina, 1995), az AMPA receptorokat, amelyek telítéséhez 100-200 µM glutamát szükséges, azonban már csak korlátozott mértékben aktiválja (5. táblázat; Nishimura et al., 2000) Az indukció során a sejtek – nagy valószínűséggel a már kialakult neuronok – jellegzetes glutaminsav transzporterek segítségével alacsony szintre állítják az extracelluláris tér glutaminsav koncentrációját, megvédve a sejteket a glutaminsav toxikus hatásaitól. Glutaminsav transzporterek jelenlétét már igen korai embrionális stádiumokban sikerült kimuatatni a VZ és IZ területén található progenitorokban és a KL területén található fiatal neuronokban (Sutherland et al., 1996; Furuta et al, 1997) Ezek a glutaminsav transzporterek a környezet ion-összetételétől függően vagy felveszik a glutaminsavat vagy éppen fordítva, a sejt belsejéből az extracelluláris térbe ürítik (Soeda et al., 1997) Tehát a glutaminsav transzporterek

egyrészt megvédik a sejteket a glutaminsav toxikus hatásaival szemben, másrészt lehetővé teszik a glutaminsav sejtekből való kiürítését még a szinapszisok kialakulása előtt (Sutherland et al., 1996; Soeda et al, 1997; Métin et al, 2000) A laboratóriumban jelenleg folyó vizsgálatok hamarosan tisztázzák, hogy mely glutaminsav transzporterek a felelősek a glutaminsav csökkentett szintjének kialakításáért az indukált neurogenezis meghatározott szakaszaiban. A tápfolyadék glutaminsav-koncentrációja azonban nem 111 ad felvilágosítást az egyes sejtek közvetlen környezetében valóban fenálló koncentráció-viszonyokról. Az alacsony glutamát-szint azonban lehetővé teszi, hogy a kibocsátott glutaminsav jelmolekulaként működjön a szomszédos sejtek kommunikációjában. II./2 Az NE-7C2 sejtek mind indukálatlan, mind indukált állapotban funkcionális AMPA receptorokat expresszálnak Az AMPA receptor alegység mRNS-k

expressziója NE-7C2 sejtekben jól követi az embrionális fejlődés során megfigyelt expressziós mintázatot (Monyer et al., 1991; Schererer and Gallo, 1998; Herbison and Simonian, 2001). Indukálatlan, folytonosan osztódó sejtekben csak a GluR4 alegység volt kimutatható, és mennyisége szinte alig változott a neuronális indukció során. Korábbi irodalmi adatok alapján feltételezhető, hogy az alegység homomer csatornák kialakítására is képes (Wenthold et al., 1996) Xenopus oocitában expresszáltatott homomer GluR4 csatornák Ca2+-ionokra nézve nagymértékű áteresztőképességet mutattak (Hollmann et al., 1991) AMPA hatására indukálatlan NE-7C2 sejtek felszíni membránjában kimutatott [Ca2+]IC emelkedés jelzi, hogy a GluR4 (ill. esetlegesen GluR3) alegységekből működőképes AMPA csatornák épülnek fel indukálatlan NE-7C2 sejtekben. Mivel depolarizáló koncentrációjú KCl hatására [Ca2+]IC emelkedést nem tudtunk detektálni indukálatlan

NE-7C2 sejtekben, továbbá az indukálatlan sejtek GluR2 alegységet sem expresszáltak, ezért a citoplazmában mért Ca2+-szint emelkedését a GluR4 (és esetlegesen GluR3) alegységekből felépülő AMPA csatornákon keresztül beáramló Ca2+ ionok okozhatták. Az adatok alapján azonban az is megállapítható, hogy AMPA hatására nem minden sejtben mérhető [Ca2+]IC emelkedés. A funkcionális heterogenitás jelzi, hogy az eredetileg egy-sejt eredetű sejtvonalon belül különbségek alakulhatnak ki a sejtek között, melyek megnyilvánulhatnak az eltérő AMPA receptor alegység expresszióban. Lokális mikrokörnyezetek kialakulására lehetőség nyílhatott a tenyészetekben, mivel a méréseket a sejtek kiültetésétől számított 48-72 óra után végeztem. Erre az időre – véleményem szerint – szükség volt, hogy a sejtek tripszinezéssel történő kiültetése után a sejtfelszíni receptorok regenerációja teljes mértékben megtörténjen. A

tenyészeten belül 2-3 nap eltelte után kialakuló eltérő mikrokörnyezetek befolyásolhatták az egyes sejtcsoportok GluR4 expresszióját. 112 Az indukció korai szakaszában (0-2 DIV) a domináns AMPA receptor alegység még mindig a GluR4 volt. Az indukció előrehaladtával a GluR4-t először a GluR2, majd a GluR1 alegység expressziója követte. Az indukció első hetének végére már mind a három alegység mRNS szintje jelentős mennyiséget ért el. Mint ahogy azt láthattuk az NMDA receptor alegységek ill. a GAD67 fehérjeforma esetében is, a transzkriptum jelenléte nem egyértelmű bizonyíték a fehérjeforma jelenlétére. Mivel a kísérletek végzése idején a laboratórium még nem rendelkezett AMPA receptor alegységekre specifikus ellenanyagokkal, az ATRA-indukálta neurogenezis során kialakuló AMPA receptorok lehetséges alegység összetételét nem tudtam vizsgálni. Differenciáltatott tenyészetekben az indukció 7-10. napján a neuronok egy

részében sikerült AMPA receptor agonista hatására [Ca2+]IC emelkedést detektálnom. Ebben a fejlődési stádiumban a GluR2 alegység mRNS-e már igen jelentős mennyiséget ért el. Miután a GluR2 alegység editációja nagy hatékonysággal lezajló folyamat (Sommer et al., 1991), ezért az alegység beépülése a receptorba nagymértékben csökkentheti annak Ca2+-áteresztő képességét (Hollmann et al., 1991) Ebben az esetben egyrészt akkor emelkedhet meg az [Ca2+]IC, ha I/ a sejtek felszínén vannak olyan AMPA receptorok is, amelyek nem tartalmaznak (editált) GluR2 alegységet, II/ ha az AMPA receptorok aktivitása által depolarizált membránban elhelyezkedő VDCC-kon keresztül Ca2+ ionok tudnak beáramlani a sejt belsejébe. Amennyiben a sejtek Ca2+-impermeábilis AMPA receptorokat expresszálnak és nem tartalmaznak VDCC-t, ezzel a módszerrel nem tudjuk kimutatni a funkcionális AMPA receptorokat. Az NE-7C2 sejtek tenyészetében differenciálódó neuronok

KCl-al történő depolarizációját Ca2+ ionok beáramlása követte, bizonyítva a VDCC-k jelenlétét a vizsgált neuronok felszínén. További kísérletes bizonyíték a VDCC-k csatornák jelenlétére, hogy az NMDA-által kiváltott [Ca2+]IC emelkedést nifedipinnel és conotoxinnal is csökkenteni lehetett, ami az L-típusú ill. neuron-specifikus VDCC-k jelenlétét, és az AMPA-kiváltott [Ca2+]IC emelkedésben játszott szerepüket igazolja. Ezen mérések alapján azonban még nem tudjuk megállapítani, hogy a jelen lévő AMPA receptorok tartalmaznak-e editált GluR2 alegységet vagy nem. Ennek az igen fontos kérdésnek az eldöntéséhez további kísérletek elvégzésére van szükség. E13 korból származó előagyi progenitorokon végzett vizsgálatok megmutatták, hogy a folytonosan osztódó, még elkötelezetlen idegi progenitorok nem rendelkeznek 113 funkcionális AMPA receptorokkal (Maric et al., 2000) Az első Ca2+-permeábilis AMPA receptorok a

progenitorok utolsó osztódása idején detektálhatók a ventrikuláris zónában található ill. az onnan kilépő sejteken (Maric et al, 2000), és úgy gondolják, fontos szerepük lehet a proliferáció – differenciáció átmenet szabályozásában a VZ területén. E135 embrionális korból származó szeletekben a KL és IZ sejtjei funkcionális AMPA receptorokat expresszálnak, de NMDA receptorokat nem (Metin et al., 2000) Amíg azonban az IZ sejtjei Ca2+-permeábilis AMPA receptorokkal rendelkeznek, addig a KL területén Ca2+-permeábilis és impermeábilis receptorok egyaránt előfordulnak (Maric et al., 2000) A differenciálatlan NE-7C2 sejtek AMPA receptor expresszió tekintetében egy igen korai fejlődési állapotot – az utolsó osztódás időszakát - reprezentálnak (Ca2+-permeábilis AMPA receptorokat expresszálnak), és az AMPA receptor alegységek indukció során megállapított expressziós mintázata is jól megfeleltethető az in vivo neurogenezis

során megfigyelt alegység-expressziók időbeni lefutásával. A tenyésztés során használt tápközeg glutaminsav-tartalma (8-12 µm) elegendő ahhoz, hogy aktiválja a GluR4 csatornákat. Az indukálatlan AMPA csatornáinak gátlása a neuronszám egyértelmű emelkedését eredményezte, jelezve, hogy a mitótikusan aktív progenitor sejteken jelenlévő AMPA receptorok egyik szerepe a differenciálatlan állapot fenntartása, az osztódóképesség megőrzése lehet. A hatás kismértékűnek mutatkozott az ATRA által előidézett neuronszám-változáshoz képest, ami jelzi, hogy ezen folyamatok szabályozásában az AMPA receptorok által közvetített hatás csak egyike a szabályozó mechanizmusoknak. Az AMPA receptorok gátlása a neuronális indukció teljes időtartama alatt az alkalmazott magasabb koncentrációban képes volt jelentős mértékben fokozni az ATRA által előidézett neurogenezist. A hatás jelentősnek mutatkozott, mivel a tenyészetekben mért

N-tubulin összmennyisége majdnem a duplájára emelkedett. A redukciós-kapacitás mérések alapján a tenyészetekben a sejtszám a kezelésektől függetlenül egyformának mutatkozott, így valószínűsíthető, hogy a neuronok arányának növekedése és nem az összsejtszám változása a felelős a mért magasabb értékért. Ezen kísérletek bebizonyították, hogy mind az indukálatlan sejtek, mind az indukált neuronok által expresszált AMPA receptorok aktiválódnak a tenyésztés során és fontos szabályozó szerepet játszanak a differenciáció folyamatának szabályozásában. 114 A szignál-transzdukciós útvonal, amelyen keresztül az AMPA receptorok szabályozó funkciója érvényesül, azonban nem ismert. Nagy valószínűséggel a receptorokon vagy a VDCC-n keresztül beáramló Ca2+-ion, mint másodlagos hírvivő aktiválja a sejten belüli jelátvivő kaszkádot és ezáltal kapcsolódhat olyan jelátviteli pályákhoz (MAP-Kináz kaszlád),

melyek a proliferáció / differenciáció szabályozását végzik (Hayashi et al., 1999). Az NE-7C2 sejtek fenntartása során az AMPA receptorok extracelluláris glutaminsav által történő aktivációja az osztódó / elkötelezetlen progenitor állapot fenntartásában játszhat szerepet, mely az ATRA-kezelés által felülírható program. Mivel azonban funkcionális AMPA receptort csak a sejtek egy részén sikerült kimutatni, valószínűleg más folyamatok is nagy jelentőséggel bírnak ezen események szabályozásában. Az indukált sejtek által expresszált AMPA receptorok egyik szerepe lehet az egyidejűleg jelen lévő NMDA receptorok aktivációjához szükséges depolarizáció megteremtése, mely eltávolítja a Mg2+-ionokat a receptor pórusából és ezáltal az átjárhatóvá válik Ca2+-ionok számára. II./3 A Ca2+-tranziensek jelentősége az idegrendszer embrionális fejlődése során Mára széles körben elterjedt az a tudományos felfogás, hogy az

elektromos aktivitás központi szerepet játszik az idegrendszer embrionális fejlődése során (Moody et al., 1998) A fejlődés korai szakaszában ezt az aktivitást „spontán” elektromos aktivitásnak nevezzük, és kialakulásában fontos szerepet tulajdonítanak az [Ca2+]IC dinamikus változásainak. A fejlődés korai szakaszában a neuronok intracelluláris Ca2+szintjében két típusú tranziens emelkedést írtak le: a Ca2+-tüskét és a Ca2+-hullámot A tüskék és hullámok nem egyedi jelenségek, hanem egymást követő Ca2+-szint emelkedések sorozatából állnak, melyek funkcióját az ismétlődések frekvenciája és amplitúdója kódolja (Spitzer and Ribera, 1998; Spitzer et al., 2000) Az Xenopus (karmosbéka) idegrendszer kialakulása során a Ca2+-tüskék szerepét leírták a korai K+áramok kifejlődésében (Desarmenien and Spitzer., 1991), a GABA immunreaktivitás kialakulásában (Spitzer et al., 1993) és a GABA-szintetizáló GAD67 mRNS

transzkripciójának szabályozásában (Watt et al., 2000) is A tranziens Ca2+-hullámok eddig leírt legfontosabb szerepe a neurit növekedés irányítása (Gu et al., 1994; Spitzer et al., 2000) a növekedési kúp területén a citoszkeletális átrendeződések szabályozása 115 által (Silver et al., 1990; Gomez et al, 1995) Fontos szerepet tulajdonítanak a Ca2+tranzienseknek továbbá a gén-expresszió transzkripciós és transzlációs szintű szabályozásában is (Barish et al., 1998) Rágcsálókban a szinaptogenezis előtti időszakban kimutatták a Ca2+-tranziensek szerepét a neuronok migrációjának szabályozásában (Komuro and Rakic, 1992; 1996), a neuronok differenciációjában (Itoh et al., 1997) és a neurális hálózatok kialakulásában (Wong et al, 1995) A Ca2+-tranziensek kialakításában részt vesznek mindazok a receptorok és ioncsatornák, amelyek lehetővé teszik a Ca2+-ionok mozgását az extracelluláris térből ill. az intracelluláris

raktárakból a citoplazma irányába Az NE-7C2 sejtek neuronális differenciációja során NMDA receptorok az indukció 10. napjától minden idegsejten kimutathatók voltak, AMPA receptorral az indukálatlan ill. az indukált sejtek 10-20%-a rendelkezett. Az [Ca2+]IC mérései megmutatták, hogy az NMDA és az AMPA is megemelte a citoszolikus Ca2+-szintet jelezve, hogy az ionotróp glutamát receptorok szerepet játszanak a Ca2+-tranziensek kialakításában. [Ca2+]IC további emelkedését idézik elő a membrán depolarizációja által aktivált VDCC-k is, melyek közül mind az általánosan előforduló L-típusú, mind a neuron-specifikus expresszióval jellemezhető (N, P és Q-típus) csatornák jelenlétét is sikerült farmakológiai módszerrel kimutatnom az indukció során. Az [Ca2+]IC megemelkedése kiváltható a mGluR-ok aktiválásával is (Nakahara et al., 1997) Ezen receptorok expresszióját nem vizsgáltam, de irodalmi adatok alapján feltételezhető, hogy

jelen vannak a korai neurális fejlődési stádiumokban (van den Pol et al., 1998) [Ca2+]IC emelkedést idézhet elő továbbá a GABAA receptorok aktiválása is, amelyek jelenlétét szintén igazolták VZ és IZ sejtjein (van den Pol et al., 1998; Métin et al., 2000) Az extracelluláris térből beáramló Ca2+ ionok Ca2+-indukálta Ca2+-ürítést idézhetnek elő az endoplazmatikus retikulumból (ER) RyR-on keresztül ill. a metabotróp receptorok által aktivált InsP3R-n keresztül is. Az intracelluláris szabad Ca2+-szintet befolyásoló receptorok és ioncsatornák valamint a sejten belüli Ca2+raktárak összehangolt működése alakítja ki azokat az [Ca2+]IC változási mintázatokat, amelyek kódolják a neuronok számára a környezeti faktorok közvetítette szignálokat. 116 III. Az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban ill az indukció korai szakaszában embrionális GAD fehérjéket expresszálnak, melyeket az érett neuronokban felvált a felnőtt GAD65

forma A gátló neurotranszmitter GABA és a szintéziséért felelős enzimek, a GAD fehérjék, valamint a GABA szignalizációs útvonal egyéb komponensei (GABA transzporterek és receptorok) már jóval a szinaptogenezis előtt jelen vannak a fejlődő idegrendszerben. A GABA valószínűleg metabolikus komponensként és a sejtek közötti kommunikáció paracrin/autokrin mediátoraként is működik (Varju et al., 2001a) In situ hibridizációs vizsgálatok (Katarova et al., 2000a) alapján ma már tudjuk, hogy a GAD65 és GAD67 mRNS-eket nagymértékben átfedő progenitor-populációk szintetizálják és hasonlóan a fejlett idegrendszerhez, a két forma a sejten belüli különböző GABA-raktárak feltöltésében juthat fontos szerephez az embrionális fejlődés során is. A gerincvelő területén zajló neurogenezis legkorábbi fejlődési stádiumaiban (Ma et al., 1992), de valószínűleg az idegrendszer más régióiban is (Behar et al, 1993; Katarova et al., 2000a)

az idegi progenitorok csak a rövidített, enzimatikusan inaktív GAD25 fehérjét tartalmazzák és nincs bennük kimutatható mennyiségű GABA. Technikai nehézségek miatt nem sikerült kimutatni GABA és különböző GAD formák kolokalizációját, de eredményeim egyértelműen mutatják, hogy az in vitro neurogenezis korai szakaszaiban csak az embrionális GAD formák vannak jelen, és expressziójuk tranziens időbeni lefutást mutat. A proliferáló NE-7C2 sejtek expresszálnak embrionális GAD mRNS formákat és kimutatható bennük a GAD25 fehérje. A GABA-produkcióra képes fehérjeformák, az embrionális GAD44, ill. a teljes hosszúságú GAD65 és GAD67 formák a folytonosan osztódó, el nem kötelezett sejtekben nincsenek jelen. Indukálatlan sejtekben ill a differenciáció korai szakaszában immuncitokémiai módszerrel GABA-t nem sikerült detektálni, amely alátámasztja az enzimatikus aktivitással rendelkező formák hiányát ezekben a fejlődési

stádiumokban. Az idegrendszer fejlődése során embrionális GAD mRNS-t és GAD25 fehérje expressziót mutattak ki a VZ osztódó sejtjeiben (Ma et al., 1992; Behar et al., 1993; 1994); pluripotens ES sejtekben (Bain et al, 1993) és különböző sejtvonalakban is (Bain et al., 1993; Bond et al, 1990; Katarova Zóya nem közölt eredményei). Mindezek alapján feltételezhető, hogy az embrionális GAD25 117 forma az idegsejtek elköteleződése és korai differenciációs folyamata során - ma még nem ismert - szerepet játszhat. Az enzimatikusan aktív GAD44 fehérje tranziens expressziót mutatott NE-7C2 sejtek indukciója során. A GAD44 expresszió időbeni eltolódása a GAD25 fehérjéhez képest azt feltételezi, hogy az embrionális GAD transzkripció emelkedése során elsőként az I-86 mRNS expresszálódik (GAD25 fehérjét kódolja), amelyet az I-80 mRNS expressziója követ, mely mind a két forma szintézisét lehetővé teszi. Az egér idegrendszer

embrionális fejlődése során hasonló szekvenciális expressziós mintázatot figyeltek meg az I-80 és I-86 transzkriptumok esetében (Szabó et al., 1994) Ellentétben a GAD25 formával, mely mind az elkötelezetlen, mind a differenciálódott sejtekben jelen volt, a GAD44 fehérjeforma csak a neuron sajátságokat mutató sejtekben expresszálódott. A konfokális mikroszkóp segítségével készített felvételek alapján a sejtekben a GAD44 fehérje mind a sejttest marginális zónájában, mind a nyúlványok proximális régiójában jelen volt. A GAD25 forma a neuronális sejttestek mellett a nyúlványok teljes hossza mentén megtalálható volt, ami alapján feltételezhetjük, hogy a két forma szubcelluláris lokalizációja nem teljesen átfedő. A GAD25 és GAD44 fehérjék különböző régióit foglalják magukba a GAD67 fehérjének és valószínűleg különböző funkciókat látnak el a neuronális differenciáció során. A GAD25 fehérje olyan szekvenciákat

hordoz, amelyek a sejten belüli célbajutattását ill a fehérje-fehérje interakciók kialakítását közvetítik a teljes hosszúságú GAD67 fehérjén belül. A GAD44 fehérjétől függetlenül is tud szintetizálódni és kódolására egy külön transzkriptum is specializálódott az embrionális fejlődés során. Ennek alapján feltételezhető, hogy szabályozó szerepet játszik az idegi elköteleződés során. A GAD44 fehérje a teljes hosszúságú GAD67 fehérjéből egy hosszabb régiót tartalmaz, mely magába foglalja az enzim kofaktor-kötő régióját és enzimaktív doménjét is. Korábbi in vitro mérési adatok alapján a fehérje képes a glutaminsavból GABA-t előállítani (Szabó et al., 1994) Annak ellenére, hogy a GAD44 rendelkezik enzimatikus aktivitással, fénymikroszkópos immuncitokémiai módszerrel nem sikerült GABA-t kimutatni olyan korai differenciációs stádiumokban (4 DIV), ahol a GAD44 már expresszálódott. Igen alacsony

(immuncitokémiai módszerrel nem kimutatható) mennyiségű GABA (mikro- és fentomoláris) azonban már részt vehet biológiai 118 folyamatokban, és befolyásolhatja a progenitorok proliferációját (LoTurco et al., 1995) és a fiatal neuronok migrációját (Behar et al., 1996; 1998) A neurogenezis előrehaladtával mindkét embrionális forma expressziója lecsökken és a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló transzkriptum válik meghatározóvá az indukció 10. napja után Tehát – hasonlóan a fejlődő embrionális idegrendszerhez – az in vitro neurogenezis során a GAD67 mRNS érési folyamata (az embrionális 7-es exonok alternatív hasítása) a neuronális differenciáció során szabályozott és meghatározott fejlődési stádiumokhoz köthető (Szabó et al., 1994) Annak ellenére, hogy a GAD67 mRNS nagy mennyiségbn kimutatható volt az indukció 10. napjától, a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét nem sikerült kimutatni egyetlen fejlődési

stádiumban sem. Valószínű, hogy transzlációs regulációs mechanizmusok is befolyásolják a GAD67 fehérje mennyiségét. Eredményeink valószínűsítik, hogy a GAD67 fehérje csak érett neuronokban ér el jelentős mennyiséget, amely állapot azonban nem alakul ki az NE-7C2 sejtek in vitro neurogenezisének két hete alatt. Xenopus embriókon végzett kísérletek megmutatták, hogy a kétéltűek neurogenezise során a GABA immunreaktivitást (Spitzer et al., 1993) és az xGAD67 (Xenopus GAD67) mRNS expresszióját (Watt et al., 2000) a spontán kialakuló Ca2+tranziensek szabályozzák, és a mesterségesen előidézett Ca2+ -tranziensek hasonló módon upregulálták a xGAD67 mRNS-t. A kísérletek azt is bebizonyították, hogy a Ca2+-tranziensek frekvenciája a meghatározó az xGAD67 transzkripció szempontjából. Hasonló változásokat az xGAD65 mRNS és fehérje esetében nem figyeltek meg (Pinal et al., 1997), ami alátámasztja a két forma eltérő szerepét a

neuronális fejlődés során Mai tudásunk alapján a gad65 génről egyféle transzkriptum íródik át. Igen alacsony szintű GAD65 expresszió a neuronális differencició korai szakaszában (4-6 DIV) is kimutatható volt. Az mRNS expresszió a maximumát a 7 napon érte el, melyet csak késéssel követett a GAD65 fehérje emelt szintje az indukció 10. napján Az mRNS és fehérje emelt expressziós szintje közötti eltolódás azt mutatja, hogy a fehérje mennyisége mind transzkripciós, mind transzlációs szabályozó folyamatok kontrollja alatt áll. Az embrionális formák membrán-frakcióban való dúsulása azt feltételezi, hogy ezen formák esetében a sejten belüli célba-juttatás mechanizmusa más, mint a teljes hosszúságú GAD67 forma esetében, mely főleg citoplazmában lokalizált (Erlander et 119 al., 1991; Kaufman et al, 1991) Mivel az embrionális formák csak a 7-es exon által kódolt aminosavakban térnek el a felnőtt formától, nagy

valószínűséggel ezen fehérjerészletek játszanak szerepet a fehérjék membránhoz való kiszállításában. A feltételezés igazolásához további kísérletek szükségesek, melyek során a kérdéses aminosavrészleteket más citoplazmatikus fehérjékhez kapcsolva vizsgálhatjuk azok sejten belüli célba juttatását. Annak ellenére, hogy mind a GAD65, mind az embrionális GAD formák a durva-membrán frakcióval ülepedtek, a membránhoz való kötődésük módja eltért. Ezt bizonyítja, hogy a GAD65 fehérje a TritonX-114 oldható membrán-frakcióban, míg az embrionális GAD25 és GAD44 formák a TritonX-114 oldhatatlan membrán-frakcióban dúsultak fel. Meg kell azonban említeni, hogy hasonlóan a GAD65 fehérjéhez, az embrionális formák egy kis része a citoplazmában marad (immuncitokémiai eredmények), ahogy azt eredetileg feltételezték a két fehérje szekvenciája alapján. Hasonló eredményeket mutatott a két fehérje szubcelluláris

lokalizációja transzfektált sejtvonalakon és embrionális extraktumok esetében is (Katarova Z., publikálaltlan eredmény). A GABA jelenlétét immuncitokémiai módszerrel az indukció 6. napjától tudtam kimutatni, amikor a domináns GAD forma a GAD44 volt. A GABA egyenletes eloszlást mutatott a neuron alakú sejtekben és kirajzolta az axonális növekedési kúpokat is. Hasonlóan az NE-7C2 sejtekhez, az idegrendszer korai fejlődési stádiumaiból izolált fiatal idegsejtek is erősen GABA-immunreaktív nyúlványokkal és növekedési kúpokkal jellemezhetők (Ganguly et al., 2001) Ezen adatok alapján feltételezhető, hogy a GABA szerepet játszik a növekedési kúpok irányításában és ezáltal az axonok targetszelekciójában is (Nguyen et al., 2001; Varju et al, 2001) A GAD65 fehérje upregulációjával egyidőben a GABA megjelenik a nyúlványok varikozitásaiban is, amelyek gyakorta jelzik a GABAerg sejtek axonjain a szinapszisok differenciálódását

(Umbriaco et al., 1995; Kanaani et al, 1999) Feltételezhetően a varikozitásokban előforduló GABA előállításáért a GAD65 fehérje a felelős, míg a GAD44 forma a sejttest és a proximális nyúlvány GABA-pozitivitását okozza. További kísérletek szükségesek annak megállapítására, hogy milyen szintű kolokalizációt mutatnak a különböző GAD formák és hogyan korrelál ezekkel a mintázatokkal a GABA térbeli és időbeli megjelenése. Mindezen kísérletek közelebb 120 vihetnek bennünket annak a kérdésnek a megválaszolásához, hogy vajon milyen szerepet játszanak az embrionális és felnőtt formák a különböző GABA-raktárak feltöltésében. Az indukció késői szakaszában (10-12 DIV) a neuronális nyúlványhálózatok stabilizálódásának idején az embrionális formák expressziója nagymértékben lecsökken és a GAD65 forma lesz a domináns a sejtekben. A GAD65 fehérje upregulációjával egyidőben a sejtek GABA-tartalma

is nő. Az embrionális és felnőtt GAD mRNS és fehérje formák specifikus és időben szabályozott megjelenése az embriogenezis során (Szabó et al., 1994) igen nagy hasonlóságot mutat ahhoz a mintázathoz, amit az NE-7C2 sejtek in vitro differenciációja során megállapítottam. Adataim azt jelzik, hogy a GAD fehérjék expressziója és a GABA-akkumuláció megjelenése része az idegsejt fenotípus kialakításának agyi környezetből kiszakított, regionális elköteleződés lehetőségével nem rendelkező progenitor sejtek esetében is. A GABA termelés és akkumuláció korai megjelenése azt sugallja, hogy a kismolekulájú aminosav-származék fontos szerepet játszik az idegsejt képződésben. A molekuláris mechanizmus és a szerep tisztázása további kísérleteket igényel, amelyekben az egysejt eredetű idegi progenitor vonalak fontos modell-rendszert biztosíthatnak. 121 LEGFONTOSABB KÖVETKEZTETÉSEK 1. Az NE-7C2 sejtek ATRA-indukálta in vitro

idegi elköteleződése során a neurogenetikus folyamatok egyes lépései hasonló módon játszódnak le az in vivo megfigyelt idegsejt fejlődés jelenségeihez. Az NE-7C2 sejtvonal tehát megfelelő in vitro modell-rendszerként szolgálhat a glutaminsav és GABA neurogenezisben játszott szerepének vizsgálatára. 2. Ionotróp glutamát receptorok az in vitro neurogenezis teljes időtartama alatt jelen vannak. Funkcionális AMPA receptorok már elkötelezetlen progenitorsejteken is megfigyelhetők és a progenitorok osztódásának szabályozásában is szerepet játszanak, míg az NMDA receptorok később, a neuronok nyúlványosodásának idején jelennek meg. A glutaminsav a neurogenezis folyamán mindvégig képes lehet az intracelluláris Ca2+-szint szabályozására. 3. Annak ellenére, hogy a GABAerg fenotípus az indukció késői szakaszában jelenik meg, a GABA-szintézisre képes enzimformák a neurogenezis korai stádiumaiban is expresszálódnak. Ezen adatok alapján

a korai GABA-szintézisnek a neurális fenotípus kialakításában lehet jelentősége. 4. Az enzimatikus aktivitással nem rendelkező GAD25 forma jelenléte a még osztódó progenitorokban és az újonnan kialakuló, fiatal neuronokban arra utal, hogy a fehérje az idegi progenitorsejtek differenciációja során juthat fontos szerephez. 122 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Madarász Emíliának köszönöm, hogy irányítása mellet végezhettem kutatómunkámat és hogy átsegített a szakdolgozat, majd a doktori fokozat megszerzése során felmerülő nem kevés problémán. Az együtt töltött majd 8 év alatt nemcsak felelősségteljes kutatót, de felnőtt embert is nevelt belőlem. A laboratóriumban kialakult baráti légkör feledhetővé tette a sokszor kudarcokkal járó kísérleteket és erőt adott a folytatáshoz. Köszönettel tartozom Környei Zsuzsának, Schlett Katalinnak, Herberth Balázsnak, Jelitai Mártának, Tárnok Krisztiánnak, Demeter Kornélnak,

Koncz Péternek, Szlávik Vandának és Markó Károlynak, amiért nemcsak munkatársaim, de barátaim is voltak az elmúlt időszakban. Dr Schlett Katalinnak és Ulrich Eiselnek külön is szeretném megköszönni az elvégzett PCR vizsgálatokat, amelyek jelentős mértékben hozzájárultak dolgozatom szakmai színvonalának emeléséhez. Köszönöm Dr Szabó Gábornak és Dr Katarova Zoyanak szakmai irányítását és segítségét, az együtt végzett munka során lehetőségem nyílt molekuláris biológiai módszerek elsajátítására. A munkacsoportjukkal közösen végzett kísérletek ill publikált cikkek doktori dolgozatom szerves részét képezik. Köszönettel tartozom Dr Tretter Lászlónak és munkatársainak, valamint Dr Környei Zsuzsának az extracelluláris glutamát-koncentráció fluorimetriás meghatározásában nyújtott segítségükért. Szeretném megköszönni Józsa Ildikónak, Csomor Zsuzsának, Vass Évának, Barabás Liának, Vörös

Erzsébetnek és Laczkó Ferencné Évi néninek a munkám során nyújtott segítségüket. Szeretném megköszönni Prof. Falus Andrásnak a lehetőséget, hogy konfokális mikroszkópjukat a rendelkezésünkre bocsátotta és Dr Kovács Péternek pedig hálával tartozom a képek elkészítése során nyújtott technikai segítségéért. Családomnak nem tudom eléggé megköszönni feltétlen szeretetüket és bizalmukat, amelyből mindig erőt tudtam meríteni. 123 IRODALOMJEGYZÉK Agarwal V. R, Sato S M (1993) Retinoic acid affects central nervous system development of Xenopus by changing cell fate. Mech Dev, 44: 167-173 Aghajanian G. K, and Bloom F E (1967) The formation of synaptic junctions in the developing rat brain: a quantitative electron microscopic study. Brain Res, 6: 716-727 Araneda R. C, Lan J-Y, Zheng X, Zukin S, and Bennett M L V (1999) Spermine and arcaine block and permeate N-methyl-D-aspartate receptor channels. Biophys J, 76: 2899-2911 Asada H., Kawamura

Y, Maruyama K, Kume H, Ding R-G, Kanbara N, Kuzume H, Sanbo M, Yagi T., Obata K (1997) Cleft palate and decreased brain γ-aminobutyric acid in mice lacking the 67kDa isoform of glutamic acid decarboxylase Proc Natl Acad Sci 94: 6496-6499 Asahi M., Hoshimaru M, Hojo M, Matsuura N, Kikuchi H, and Hashimoto N (1998) Induction of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1 in the immortalized neuronal progenitor cell line HC2S2 during neuronal differentiation into neurons. J Neurosci Res, 52: 699-708 Asai D. J, and Remolana N M (1989) Tubulin isotype usage in vivo: a unique special distribution of the minor neuronal-specific β-tubulin isotype in pheochromocytoma cells. Dev Biol, 132: 398-409 Bahn S., Volk B, and Wisden W (1994) Kainate receptor gene expression in the developing rat brain J Neurosci., 14: 5525-5547 Bain G., Ramkumar T P, Cheng J M, and Gottlieb D I (1993) Expression of the genes coding for glutamic acid decarboxylase in pluripotent cell lines. Mol Brain Res, 17: 23-30

Bally–Cuif L., Boncinelli E (1997) Transcription factors and head formation in vertebrates BioEssays, 19: 127–134. Bardoul M., Drian M J, and König N (1997) AMPA/kainate receptors modulate the survival in vitro of embryonic brainstem cells. Int J Dev Neurosci, 15:695-701 Barish M. E (1998) Intracellular calcium regulation of channel and receptro expression in the plasmalemma: potential sites of sensitivity along the pathways linking transcription, translation and insertion. J Neurobiol, 37: 146-157 Bates S., and Vousden K H (1996) p53 in signaling checkpoint: arrest or apoptosis Curr Opin Genet Dev., 6: 12-19 124 Behar T., Schaffner A, Laing P, Hudson L, Komoly S, and Barker J L (1993) Many spinal cord cells transiently express low molecular weight forms of glutamic acid decarboxylase during embryonic development. Dev Brain Res, 72: 203-218 Behar T., Ma W, Hudson L, and Barker J L (1994) Analysis of the anatomical distribution of GAD67 mRNA encoding truncated glutamic acid

decarboxylase proteins in the embryonic rat brain. Dev Brain Res., 77: 77-87 Behar T., Li Y-X, Tran H T, Ma W, Dunlap V, Scott C, and Barker J L (1996) GABA stimulates chemotaxis and chemokinesis of embryonic cortical neurons via calcium-dependent mechanisms. J Neurosci, 16: 1808-1818 Behar T. N, Schaffner A E, Scott C A, O’Connell C, and Barker J L (1998) Differential response of cortical plate and ventricular zone cells to GABA as a migration stimulus. J Neurosci, 18: 6378-6387. Belhage B., Hansen G H, Elster L, Schousboe A (1998) Effects of gamma-aminobutyric acid (GABA) on synaptogenesis and synaptic function. Perpect Dev Neurobiol, 5: 235-246 Bennet J. A, and DingledineR (1995) Topology profile for a glutamate receptor: three transmembrane domains and a channel lining reentrant membrane loop. Neuron, 14: 373-384 Bigge C. F (1999) Ionotropic glutamate recptors Curr Opin Chem Biol 3: 441-447 Binder L. I, Frankfurter A, Kim H, Caceras A, Payne M R, and Rebhun L I (1984)

Heterogeneity of microtubule-associated protein 2 during rat brain development. Proc Natl Acad Sci USA, 81: 5613-5617. Binder L. I, Frankfurter A, and Rebhun L I (1985) The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol, 101: 1371-1378 Blahos J. and Wenthold R J (1996) Relationship between N-methyl-D-aspartate receptor NR1 splice variants and NR2 subunits. J Biol Chem, 271: 15669-15674 Bleakman D., Schoepp D D, Ballyk B, Bufton H, Sharpe E íf, Thomas K, Ornstein P L, and Kamboj R. K (1996) Pharmacological discrimination of GluR5 and GluR6 kainate receptror subtypes by (3S, 4aR, 6R, 8aR)-6-[2-(1(2)H-tetrazole-5-yl)ethyl)decahydroisoquinoline-3 carboxylic acid. Mol. Pharmacol, 49: 581-585 Bleakman D., and Lodge D (1998) Neuropharmacology of AMPA and kainate receptors Neuropharmacology, 37:1187-204. 125 Bond R. W, Wyborsky R J, and Gottlieb D I (1990) Developmentally regulated expression of an exon containing a stop codon in the gene for glutamic acid

decarboxylase. Proc Natl Acad Sci, 87: 8771-8775. Bond J. A, Wyllie F S, and Wynford-Thomas D (1994) Escape from senesence in human diploid fibroblasts induced directly by mutant p53. Oncogene, 9: 1885-1889 Bosma P. T, Blázquez M, Collins M A, Bishop J D, Drouin G, Priede I G, Docherty K, and Trudeau V. L (1999) Multiplicity of glutamic acid decarboxylases (GAD) in vertebrates: molecular phylogeny and evidence for a new GAD paralog. Mol Evol Biol, 16: 397-404 Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248-254 Brewer G. J, and Cotman C W (1989) NMDA receptor regulation of neuronal morphology in cultured hippocampal neurons. Neurosci Letters, 99: 268-273 Brilliant M. H, Szabó G, Katarova Z, Kozak C A, Glaser T M, Greenspan R J, and Housman D E (1990) Sequences homologous to glutamic acid decarboxylase cDNA are present on mouse chromosome 2 and 10. Genomics, 6:

115-122 Brion J. P, Guilleminot J, Couchie D, Flament-Durand J, and Nunez J (1988) Both adult and juvenile tau microtubulue-associated proteins are axon specific in the developing and adult rat cerebellum. Neuroscience, 25: 139-146 Burnashev N., Khordorova A, Jonas P, Helm P J, Wisden Q, Monyer H, Seeburg P H, and Sakmann B. (1992) Calcium permeable AMPA/kainate receptros in the fusiform cerebellar glial cells Science, 256: 1566-1570. Catterall W. A and Striessnig J (1992) Receptor sites for Ca2+ channel antagonists Trends Pharmacol Sci., 13: 256-262 Chambon P. (1996) A decade of molecular biology of retinoic acid receptors FASEB J, 10: 940–954 Chang Y-C., and Gottlieb D I (1988) Characterisation of the proteins purified with monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase. J Neurosci, 8: 2123-2130 Chatterton J. E, Awobuluyi M, Premkumar L S, Takahashi H, Talantova M, Shin Y, Cui J, Tu S, Sevarino K. A, Nakanashi N, Tong G, Lipton S A, and Zhang D (2002) Excitatory glycine

receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature, 415: 793-798 126 Cherubini E., Gaiarsa J L, and Ben-Ari Y (1991) GABA: an excitatory transmitter in early postnatal life. Tends Neurosci, 14: 5115-519 Chessler S. D, and Lernmark A (2000) Alternative splicing of GAD67 results in the synthesis of a third form of glutamic-acid decarboxylase in human islets and other non-neural tissues. J Biol Chem., 275: 5188-92 Christgau S., Schierbeck H, Aanstoot H J, Aagaard L, Begley K, Kofod H, Hejnaes K, and Baekkeskov S. (1991) Pancreatic beta cells express two autoantigenic forms of glutamic acid decarboxylase, a 65-kDa hydrophilic form and a 64-kDa amphiphilic form which can be both membrane-bound and soluble. J Biol Chem, 266: 21257-21264 Christgau S., Aanstoot H J, Schierbeck H, Begley K, Tullin S, Hejnaes K, and Baekkeskov S (1992) Membrane anchoring of the autoantigen GAD65 to microvesicles in pancreatic beta-cells by palmitoylation in the NH2-terminal domain. J Cell

Biol, 118: 309-320 Ciabarra A. M, Sullivan J M, Gahn L G, Pecht G, Heinemann S, Sevarino K A (1995) Cloning and characterization of χ-1: a developmentally regulated member of a novel class of the ionotropic glutamate receptor family. J Neurosci, 15: 6498-508 Condie B. G, Bain G, Gottlieb D I, and Capecchi M R (1997) Cleft palate in mice with a targeted mutation in the γ-aminobutyric acid-producing enzyme glutamic acid decarboxylase 67. Proc Natl. Acad Sci, 94: 11451-11455 Conlon R. A (1995) Retinoic acid and pattern formation in vertebrates Trends Genet, 11: 314–319 Corcoran J. (1998) What are the molecular mechanisms of neural tube defects? Bioessays, 20: 6-8 Curtis D. R, Phillis J W, and Watkins J C (1959) Chemical excitation of spinal neurons Nature, 183: 611-612. Dahl D., and Bignami A (1986) Neurofilament phosphorilation in development A sign of axonal maturation? Exp. Cell Res, 162: 220-230 Damjanov I., Clark R K, Andrews P W 1(984) Cytoskeleton of human embryonal carcinoma

cells Cell Differ. 15: 133-9 Das S., Sasaki Y F, Rothe T, Premkumar L S, Takasu M, Crandall J E, Dikkes P, Conner D A, Rayudu P. V, Cheung W, Chen H-S V, Lipton S A, and Nakanashi N (1998) Increased NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A. Nature, 393: 377-381. 127 Del Rio J. A, Martínez A, Auladell C, and Soriano E (2000) Developmental history of the subplate and developing white matter in the murine neocortex. Neuronal organisation and relationship with the main afferent systems at embryonic and perinatal stages. Cereb Cortex, 10: 784-801 Desarmenien M. G, and Spitzer N C (1991) Role of calcium and protein kinase C in development of the delayed rectifier potassium current in Xenopus spinal neurons. Neuron, 7: 797-805 Donehower L. A, Harvey M, Slagle B L, McArthur M J, Montgomery C A Jr, Butel J S, and Bradley A. 1(992) Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature; 356: 215-221 Dráberová

E., Lukaš Z, Ivanyi D, Viklickỳ V, and Dráber P (1998) Expression of class III β-tubulin in normal and neoplastic human tissues. Histochem Cell Biol, 109, 231-239 Durston A. J, Timmermans J P M, Hage W J, Hendriks H F J, de Vries N J, Heideveld M, Nieuwkoop P. D (1989) Retinoic acid causes an anteroposterior transformation in the developing central nervous system. Nature, 340: 140-144 Edwards M. K, S, and McBurney M W (1983) The concentration of retinoic acid determines the differentiated cell types formed by a teratocarcinoma cell line. Dev Biol, 98: 187-191 Egebjerg J., and Heinmann S F (1993) Ca2+ permeability of unedited and edited versions of the kainate selective glutamate receptror GluR6. Proc Natl Acad Sci USA, 90: 755-759 Ehlers M. D, Fung E T, O´Brien R J, and Huganir R L (1998) Splice variant-specific interaction of the NMDA receptor subunit GluRζ1 with neuronal intermediate filaments. J Neurosci, 18: 720730 Erdö S. L, and Wolff J R (1990) γ-aminobutyric acid

outside the mammalian brain J Neurochem, 54: 363-372. Erlander M. G, Tillakaratne N J K, Feldblum S, Patel N, and Tobin A J (1991) Two genes encode distinct glutamate decarboxylases. Neuron, 7: 91-100 Fanarraga M. L, Avila J, and Zabala J C (1999) Expression of unphosphorilated class III β-tubulin isotype in neuroepithelial cells demonstrates neuroblast commitment and differentiation. Eur J Neurosci., 11: 517-527 Ferreira A., and Caceras A (1992) Expression of the class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. J Neurosci Res, 32: 516-529 128 Fletcher E. J, and Lodge D (1996) New developments in the molecular pharmacology of AMPA and kainate receptors. Pharmacol Ther, 70: 65-89 Flint A. C, Dammerman R S, and Kriegstein A R (1999) Endogenous activation of metabotropic glutamate receptors in neocortical development causes neuronal calcium oscilations. Proc Natl Acad. Sci, 96: 12144-12149 Furuta A., Rothstein J D, and Martin L J (1997) Glutamate transporter protein

subtypes are expressed differentially during rat CNS development. J Neurosci, 17: 8363-75 Gallo V., Pende M, Scherer S, Molne M, and Wright P (1995) Expression and regulation of kainate and AMPA receptors in uncommitted and committed neural progenitors. Neurochem Res, 20: 549560 Ganguly K., Schinder A F, Wong S T, and Poo M (2001) GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell, 105: 521-32 Gao X-B., van den Pol A N (2000) GABA release from mouse axonal growth cones J Physiol, 523: 629-637. Gilbert S. F (1991) Developmental Biology Third edition, Sinauer Associates, Inc Sunderland, Massachusettes; 155-200 oldalak. Green L. A, and Tischler A S (1976) Establishement of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci, 73: 24242428 Gomez T. M, Snow D M, and Letourneau P C (1995) Characterisation of spontaneous calcium transients in nerve growth cones

and their effect on growth cone migration. Neuron, 14: 12331246 Gryenkiewicz G., Poenie M, and Tsien RY (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem, 260: 3440-3450 Gu X., Olson E C, and Spitzer N C (1994) Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J Neurosci, 14: 6325-6335 Hall R. A, and Soderling T R (1997) Differential surface expression and phosphorilation of N-methylD-aspartate receptor subunits NR1 and NR2 in cultured hippocampal neurons J Biol Chem, 272: 4135-4140. 129 Hall R. A, Hansen A, Andersen P H, and Soderling T R (1997) Surface expression of the AMPA receptor subunits GluR1, GluR2, and GluR4 in stably transfected baby hamster kidney cells. J Neurochem., 68: 625-630 Hansen G. H, Belhage B, Schousboe A, and Meier E (1987) Temporal development of GABA agonist induced alterations in ultrastructure and GABA receptor expression in cultured cerebellar granule cells. Int J Dev

Neurosci, 5: 263-269 Hansen J. J, Flemming J S, Lund T M, Nielsen B, Reinhardt A, Breum I, and Krogsgaard-Larsen P (1995) AMPA receptor agonists: structural, conformational and stereochemical aspects. Krogsgaard-Larsen P. Hansen J J (Eds) Excitatory amino acid receptors: Design of agonists and antagonists. Ellis Horwood, Chichester, UK Harvey M., Sands A T, Weiss R S, Hegi M E, Wiseman R W, Pantazis P, Giovanella B C, Tainsky M. A, Bradly A, and Donehower L A (1993) In vitro growth characteristics of embryo fibroblasts isolated from p53-deficient mice. Oncogene, 8: 2457-2467 Hayashi T., Umemori H, Mishina M, Yamamoto T (1999) The AMPA receptor interacts with and signals through the protein tyrosine kinase Lyn. Nature, 397: 72-6 Haydar T. F, Wang F, Schwartz M L, and Rakic P (2000) Differential modulation of proliferation in the neocortical ventricular and subventricular zones. J Neurosci, 20: 5764-5774 Henion P. D, and Weston J A (1994) Retinoic acid selectively promotes the survival

and proliferation of neurogenic precursors in cultured neural crest cell populations. Dev Biol, 161: 243-250 Herberth B., Pataki Á, Jelitai M, Schlett K, Deák F, Spät A, and Madarász E (2002) Changes of KCl sensitivity of proliferating neural progenitors during in vitro neurogenesis. J Neurosci Res, 67: 574-582. Herkert M., Röttger S, and Becker C (1998) The NMDA receptor subunit NR2B of neonatal rat brain: complex formation and enrichment in axonal growth cones. Eur J Neurosci 10, 1553-1562 Hollmann M., Hartley M, and Heinemann S (1991) Ca2+ permeability of KA-AMPA--gated glutamate receptor channels depends on subunit composition. Science 252: 851-3 Hollmann M., Boulter J, Maron C, Beasley L, Sullivan J, Pecht G, and Heinemann S (1993) Zinc potentiates agonist-induced currents at certain splice variants of the NMDA receptor. Neuron, 10: 943-954. Hollmann M., and Heinemann S (1994) Cloned glutamate receptors Annu Rev Neurosci, 17: 31-108 130 Hughes P. E, Alexi T, and

Schreiber S S (1997) A role for the tumour suppressor gene p53 in regulating neuronal apoptosis. Neuroreport 8: 5-12 Huh K-H., and Wenthold R J (1999) Turnover analyses of glutamate receptors identifies a rapidly degraded pool of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit, NR1, in cerebellar granule cells. J Biol. Chem, 274: 151-157 Hume R. I, Dingledine R, and Heinemann S F (1991) Identification of a site in glutamate receptor subunits that controls calcium permeability. Science, 253: 1028-1030 Hsu C-C., Davis K M, Jin H, Foos T, Floor E, Chen W, Tyburski J B, Yang C-Y, Schloss J V, and Wu J-Y. (2000) Association of L-glutamic acid decarboxylase to the 70-kDa heat shock protein as a potential anchoring mechanism to synaptic vesicles. J Biol Chem, 275: 20822-20828 Imrik P., and Madarasz E (1991) Importance of cell-aggregation during induction of neural differentiation in PCC-7 embryonal carcinoma cells. Acta Physiol Hung;78: 345-58 Itoh K., Ozaki M, Stevens B, and Fields R D (1997)

Activity-dependent regulation of N-cadherin in DRG neurons: Differential regulation of N-cadherin , NCAM and L1 by distinct patterns of action potentials. J Neurobiol, 33: 735-748 Ji F, Kanbara N, Obata K (1999) GABA and histogenesis in fetal and neonatal brain lacking both the isoforms of glutamic acid decarboxylase. J Neurosci Res 33:187-194 Jones-Villeneuve E. M V, McBurney M W, Rogers K A, and Kalnins V I (1982) Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. J Cell Biol 94: 253-262. Jonas P., and Burnashev N (1995) Molecular mechanisms controlling calcium entry through AMPA-type glutamate channels. Neuron, 15: 987-990 Kanaani J., Lissin D, Kash S F, and Baekkeskov S (1999) The hydrophilic isoform of glutamate decarboxylase, GAD67, is targeted to membranes and nerve terminals independent of dimerisation with the hydrophobic membrane-anchored isoform, GAD65. J Biol Chem, 274: 37200-37209. Kang M. K, and Park N H (2001) Conversion of

normal to malignant phenotype: telomere shortening, telomerase activation, and genomic instability during immortalization of human oral keratinocytes. Crit Rev Oral Biol Med, 12: 38-54 Kash S. F, Johnson R S, Tecott L H, Noebels J L, Mayfield R D, Hanahan D, and Baekkeskov S (1997) Epilepsy in mice deficient in the 65-kDa isoform of glutamic acid decarboxylase. Proc Natl. Acad Sci, 94: 14060-14065 131 Katarova Z., Szabó G, Mugnaini M, and Greenspan R J (1990) Molecular identification of the 62 kd form of glutamic acid decarboxylase from mouse. Eur J Neurosci, 2: 190-202 Katarova Z., Sekerková G, Prodan S, Mugnani E, and Szabó G (2000a) Domain-restricted expression of two glutamic acid decarboxylase in midgestation mouse embryos. J Comp Neurol, 424: 607-627. Katarova Z, McIlhinney JAR, Churchill G and Szabó G (2000b) Subcellular distribution and activity of in vitro expressed glutamic acid decarboxylase (GAD) forms. Eur J Neurosci, 12: Suppl 11, p 42. Kaufman D. L, Houser C R,

and Tobin A J (1991) Two forms of the gamma-aminobutyric acid synthetic enzyme glutamate decarboxylase have distinct intraneuronal distribution and cofactor interaction. J Neurochem, 56: 720-723 Kawai F., and SterlingP (1999) AMPA receptors activates a G-protein that supresses a cGMP-gated current. J Neurosci, 19: 2954-2959 Keinänen A., Arvola M, Kuusinen A, and Johnson M (1997) Ligand recognition in glutamate receptors: insights from mutagenesisof the soluble alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid (AMPA)-binding domain of glutamate receptor type D (GluR-D). Biochem Soc Trans, 25: 835-838. Kelly B. M, Gillespie C S, Sherman D L, and Brophy P J (1992) Schwann cells of the myelinforming phenotype express neurofilament protein NF-M J Cell Biol, 118: 397-410 Kim H. Y, Sapp D W, Olsen R W, and Tobin A J (1994) GABA alters GABAA receptor mRNAs and increases ligand binding. J Neurochem, 62: 2334-2337 Komuro H., and Rakic P (1992) Selective role of N-type calcium channels

in neuronal migration Science, 257: 806-809. Komuro H., and Rakic P (1993) Modulation of neuronal migration by NMDA receptors Science, 260: 95-97. Komuro H., and Rakic P (1996) Intracellular Ca2+-fluctuations modulate the rate of neuronal migration Neuron, 17: 275-285. Kornau H. C, Schenker L T, Kennedy M B, and Seeburg P (1995) Domain interaction between NMDA receptor subunits and the postsynaptic density protein PSD-95. Science, 269: 1737-1740 132 Köhler M., Burnashev N, Sakmann B, and Seeburg P H (1993) Determinants of calcium permeability in bith TM1 and TM2 of high affinity kainate receptor channels: diversity by RNA editing. Neuron, 10: 491-500. Krizbai I. A, Katarova Z, Szabó G, Parducz A, and Wolff J R (2000) Modulation of the truncated GAD25 by estrogen in the olfactory bulb of adult rats. Neuroreport, 11: 791-794 Krogsgaard-Larsen P., Madsen U, Ebert B, and Hansen J J (1994) Krogsgaard-Larsen P Hansen J J (Eds) Excitatory amino acid receptors: Design of agonists and

antagonists. Ellis Horwood, Chichester, UK. Laemmli U. K (1970) Cleavage of stuctural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685 Lauder J. M, Han V K M, Henderson P, Verdoorn T, and Towle A C (1986) Prenatal ontogeny of the GABAergic system in the rat brain: an immunocytochemical study. Neuroscience, 19: 465493 Lauder J. M (1993) Neurotransmitters as growth regulatory signals: the role of receptors and second messengers. Trends Neurosci, 16: 233-240 Laurie D. J, Wisden W, and Seeburg P H (1992) The distribution of thirteen GABAA receptor subunit mRNAs in the rat brain. III Embryonic and postnatal development J Neurosci, 12: 4151141172 Laurie D. J, and Seeburg P H (1994) Regional and developmental heterogeneity in splicing of the rat brain NMDAR1 mRNA. J Neurosci, 14: 3180-3194 Laurie D. J, Bartke I, Schoepfer R, Naujoks K, and Seeburg P H (1997) Regional, developmental and interspecies expression of the four NMDAR2 subunits, examined using

monoclonal antibodies. Mol. Brain Res, 51: 23-32 Lazarewicz J. W, Wrob1ewski J T, Palmer M E, and Costa E (1989) Reduction of disulfide bonds activates NMDA sensitive glutamate receptors in primary cultures of cerebellar granule cells. Neurosci. Res Commun, 4: 91-97 Lee M. K, and Cleveland D W (1996) Neuronal intermediate filaments Annu Rev Neurosci, 19: 187217 Lee Y-H., Fang K-M, Yang C-M, Hwang H-M, Chiu C-T, and Tsai W (2000) Kainic acid induced neurotrophic activities in developing cortical neurons. J Neurochem, 74: 2401-2411 133 Lendhal U., Zimmerman L, and McKay R (1990) CNS stem cells express a new class of intermediate protein. Cell, 60: 585-595 Lerma J., Paternain A V, Rodríguez-Moreno A, and López-García J C (2001) Molecular Physiology of Kainate receptors. Pharmacol Rev, 81: 971-998 Lewis S. A, and Cowan N J (1988) Complex regulation and functional versatility of mammalian α− and β-tubulin isotypes during differentiation of testis and muscle cells. J Cell Biol,

106: 20232033 Lin J. W, Wyszynski M, Madhavan R, Sealock R, Kim J U, and Shang M (1998) Yotiao, a novel protein of neuromuscular junction and brain that interacts with specific splice variants of NMDA receptor subunit GluRζ1. J Neurosci, 18: 2017-2027 Lipton S. A and Kater S B (1989) Neurotransmitter regulation of neuronal outgrowth, plasticity and survival. Trends Neurosci, 112: 265-270 Livingstone L. R, White A, Sprouse J, Livanos E, Jacks T, and Tisty T D (1992) Altered cell cycle arrest and gene amplification potential accompany loss of wild type p53. Cell, 70: 923-935 Lomeli H., Mosbacher J, Melcher T, Hoger T, Geiger J R P, Kuner T, Monyer H, Higuchi M, Bach A., and Seeburg P H (1994) Control of kinetic properties of AMPA receptor channels by nuclear RNA editing. Science, 266: 1709-1713 LoTurco J. J, Blanton M G, and Kriegstein A R (1991) Initial expression and endogenous activation of NMDA channels in early neocortical development. J Neurosci, 11: 792-799 LoTurco J. J, Owens D

F, Heath M J S, Davis M B E, and Kriegstein A R (1995) GABA and glutamate depolarise cortical progenitor cells and inhibit DNA synthesis. Neuron, 15: 255-262 Lovinger D. M, White G, and Weight F F (1989) Ethanol inhibites NMDA-activated ion current in hippocampal neurons. Science, 243: 1721-1724 Lumsden A., and Krumlauf R (1996) Patterning the vertebrate neuraxis Science, 274: 1109–1114 Ma W., Behar T, Maric D, Maric I, Barker J L (1992) Neuroepithelial cells in the rat spinal cord express glutamate decarboxylase immunoreactivity in vivo and in vitro. J Comp Neurol, 325: 257-270. Ma W., and Barker J L (1995) Complementary expression of transcripts encoding GAD67 and GABAA receptor α4, β1 and γ1 subunits in the proliferative zone of the embryonic rat central nervous system. J Neurosci, 15: 2547-60 134 Ma W., Liu Q Y, Maric D, Sathanoori R, Chang Y H, and Barker J L (1998) Basic FGF-responsive telencephalic precursor cells express functional GABA(A) receptor/Cl-channels in

vitro. J Neurobiol., 35:2 77-86 Madden D. R (2002) The structure and function of glutamate receptor ion channels Nat Rev Neurosci 31: 91-101Manabe I., and Owens G K (2001) Recruitment of serum response factor and hyperacetylation of histones at smooth muscle-specific regulatory regions during differentiation of a novel P19derived in vitro smooth muscle differentiation system. Circ Res 88: 1127-34 Manzoni O., Prezeau L, Marin P, Bockaert J, and Fagni L (1992) Nitric oxide-induced blockade of NMDA receptors. Neuron, 8: 653-662 Maric D., Liu Q-Y, Grant G M, Andreadis J D, Hu Q, Chang Y H, Barker J, Pancrazio J J, Stenger D. A, and Ma W (2000) Functional ionotropic glutamate receptors emerge during terminal cell division and early neuronal differentiation of rat neuroepithelial cells. J Neurosci Res, 61: 652662 Marshall H., Studer M, Pöpper H, Aparicio S, Kuroiwa A, Brenner S, Krumlauf R (1994) A conserved retinoic acid response element required for early expression of the homeobox gene

Hoxb-1. Nature, 370: 567-571 Martin D. L, and Rimvall K (1993) Regulation of gamma-aminobutyric acid synthesis in the brain J Neurochem., 60: 395-407 Martin D. L, Hongcheng L, Martin S B, and Wu S J (2000) Structural features and regulatory properties of the brain glutamate decarboxylases. Neurochem Int, 37: 111-119 Mayer M. L, and Vyklicky L Jr (1989) Concanavalin A selectively reduces desensitization of mammalian neuroneal quisqualate receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 86: 1411-1415 Mayer M. (1998) Ion-binding sites in NMDA receptors: classical approaches provide the numbers Nature Neurosci., 1: 433-434 McBurney M. W, Jones-Villeneuve E M, Edwards M K S, and Anderson P J (1982) Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature, 299: 165-167. McCool B. A, Pin J-P, Harpold M M, Brust P F, Stauderman K A, and Lovinger D M (1998) Rat group I metabotropic glutamate receptors inhibit neuronal Ca2+ channels via multiple signal transduction

pathways in HEK 293 cells. J Neurophysiol, 79: 379-391 135 McIlhinney R. A J, Molnár E, Atack J R, and Whiting P J (1996) Cell surface expression of the human N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1a requires the co-expression of the NR2A subunit in transfected cells. Neuroscience, 70: 989-997 McIlhinney R. A J, Le Bourdellés B, Molnár E, Tricaud N, Streit P, and Whiting P J (1998) Assembly, intracellular targeting and cell surface expression of the human N-methyl-D-aspartate receptor subunits NR1a and NR2A in transfected cells. Neuropharmacology, 37: 1355-1367 Meguro H., Mori H, Araki K, Kushiya E, Kutsuwada T, Yamazaki M, Kumanishi T, Arakawa M, Sakimura K., and Mishina M (1992) Functional characterization of a heteromeric NMDA receptor channel expressed from cloned cDNAs. Nature, 357: 70-74 Meier E., Hertz L, and Schousboe A (1991) Neurotransmitters as developmental signals Neurochem Int., 19: 1-15 Menezes J. R L, and Luskin M B (1994) Expression of neuron-specific tubulin

defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. J Neurosci, 14: 53995416 Metz T., Harris A W, and Adams J M (1995) Absence of p53 allows direct immortalization of hematopoietic cells by the myc and raf oncogenes. Cell, 82: 29-36 Métin C., Denizot J P, and Ropert N (2000) Intermediate zone cells express calcium-permeable AMPA receptors and establish close contact with growing axons. J Neurosci, 20: 696-708 Miranda-Contreras L., Mendoza-Briceno R V, and Palacios-Pru E L (1998) Levels of monoamine and amino acid neurotransmitters in the developing male mouse hypothalamus and in histotypic hypothalamic cultures. Int J Dev Neurosci, 16: 403-12 Miranda-Contreras L., Benitez-Diaz P R, Mendoza-Briceno R V, Delgado-Saez M C, and PalaciosPru E L (1999) Levels of amino acid neurotransmitters during mouse cerebellar neurogenesis and in histotypic cerebellar cultures. Dev Neurosci, 21: 147-58 Miranda-Contreras L., Ramirez-Martens L M, Benitez-Diaz P R,

Pena-Contreras Z C, MendozaBriceno R V, and Palacios-Pru E L (2000) Levels of amino acid neurotransmitters during mouse olfactory bulb neurogenesis and in histotypic olfactory bulb cultures. Int J Dev Neurosci, 18: 83-91. Mishina M., Sakimura K, Mori H, Harabayashi M, Uchino S, and Nagahari K (1991) A single amino acid residue determinates the Ca2+ permeability of AMPA selective glutamate receptor channels. Biochem. Biophys Res Commun, 180: 813-821 136 Moody W. J (1998) Control of spontaneous activity during development J Neurobiol, 37: 97-109 Monyer H., Seeburg P H, and Wisden W (1991) Glutamate operated channels: Developmentally early and mature forms arise by alternative splicing. Neuron, 6: 799-810 Monyer H., Sprengel R, Schoepfer R, Herb A, Higuchi M, Lomeli H, Burnashev N, Sakmann B, and Seeburg P (1992) Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes. Science, 256: 1217-1221 Monyer H., Burnashev N, Lauri D J, Sakmann B, and Seeburg H (1994)

Developmental and regional expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors. Neuron, 12: 529540 Mori H, and Mishina M. (1995) Structure and function of NMDA receptor channel neuropharmacology, 34: 1249-1237. Mosmann T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 65: 55-63 Mothet J-P., Parent A T, Wolosker H, Brady R O, Linden D J, Ferris C D, Rogawski R A, and Snyder S. H (2000) D-serine is an endogenous ligand for the glycine site of N-methyl-D- aspartate receptor. Proc Natl Acad Sci, 97: 4926-4931 Murphy A., Breen K C, Long A, Feighery C, Casey E B, and Kelleher D (1993) Neurofilament expression in human T-lymphocytes. Immunology, 79: 167-170 Nakahara K., Okada M, and Nakanashi S (1997) The metabotropic glutamate receptor mGluR5 induces calcium oscillations in cultured astrocytes via protein kinase C phosphorylation. J Neurochem, 69: 1467-1475. Nakanashi N.,

Shneider N A, and Axel R (1990) A family of glutamate receptor genes: evidence for the formation of heteromultimeric receptors with distinct channel properties. Neuron, 5: 569-581 Nishimura S., Hzuka M, Wakamori M, Akiba I, Imoto K, and Barsoumian E L (2000) Stable expression of human homomeric and heteromeric AMPA receotir subunits in HEK293 cells. Rec. Channels, 7: 139-150 Nguyen L., Rigo J-M, Rocher V, Belachew S, Malgrange B, Rogister B, Leprince P, and Moonen G (2001) Neurotransmitters as early signals for central nervous system development. Cell Tissue Res., 305: 187-202 137 Obata K., Fukuda T, Konishi S, Ji F-Y, Mitoma H, and Kosaka T (1999) Synaptic localization of the 67,000 mol. Wt isoform of glutamate decarboxylase and transmitter function of GABA in the mouse cerebellum lacking the 65,000 mol. Wt isoform Neuroscience, 93: 1475-1482 Okabe S., Miwa A, and Akado H (1999) Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor

GluRζ1 subunit. J Neurosci 19: 7781-7792 Owens D. F, Boyce L H, Davis M B E, Kriegstein A R (1996) Excitatory GABA responses in embryonic and neonatal cortical slices demonstrated by gramicidin perforated-patch recording and calcium imaging. J Neurosci, 16: 6414-6423 Owens D. F, Liu X, and Kriegstein A R (1999) Changing properties of GABA(A) receptor-mediated signalling during early neocortical development. J Neurophysiol, 82: 570-83 Paschen W., Schmitt J, Gissel C, and Dux E (1997) Developmental changes of RNA editing of glutamate receptor subunits GluR5 and GluR6: in vivo versus in vitro. Dev Brain Res, 98: 271280 Paupard M-C., OConnell M A, Gerber A P, Zukin R S (2000) Patterns of developmental expression of the RNA editing enzyme rADAR2. Neuroscience, 95: 869-79 Pérez-Otaño I., Schulteis C T, Contractor A, Lipton S A, Trimmer J S, Sucher N J, and Heinemann S. F (2001) Assembly with the NR1 subunit is required for surface expression of NR3Acontaining NMDA receptors J Neurosci,

21: 1228-1237 Peters G. (1994) Stifled by inhibitions Nature, 371: 204-205 Pfeiffer S.E, Jakob H, Mikoshiba K, Dubois P, Guenet JL, Nicolas JF, Gaillard J, Chevance G, and Jacob F. (1981) Differentiation of a teratocarcinoma line: preferential development of cholinergic neurons. J Cell Biol, 88: 57-66 Pinal C. S, Cortessis V, and Tobin A J (1997) Multiple elements regulate GAD65 transcription Dev Neuroci., 19: 465-475 van den Pol A. N, Gao X-B, Patrylo P R, Ghosh P K, and Obrietan K (1998) Glutamate inhibits GABA excitatory activity in developing neurons. J Neurosci, 18: 10749-10761 Portera-Cailliau C., Price D L, and Martin L J (1996) N-Methyl-D-Aspartate receptor proteins NR2A and NR2B are differentially distributed in the developing rat central nervous sytem as revealed by subunit-specific antibodies. J Neurochem, 66: 692-700 138 Prybylowski K., Rumbaugh G, Wolfe B B, and Vicini S (2000) Increased exon 5 expression alters extrasynaptic NMDA receptors in cerebellar neurons. J

Neurochem, 75: 1140-1146 Reichling D. B, Kyrozis A, Wang J, MacDermott A B (1994) Mechanisms of GABA and glycine depolarization-induced calcium transients in rat dorsal horn neurons. J Physiol, 476: 411-421 Riederer B., and Matus A (1985) Differential expression of distinct microtubule-associate proteins during brain development. Proc Natl Acad Sci USA, 82: 6006-6009 Riederer B., Cohen R, and Matus A (1986) MAP5: a novel microtubule-associate protein under strong developmental regulation. J Neurocytol, 15: 763-775 Riederer B., Zagon I M, and Goodman S R (1987) Brain spectrin (240/235) and brain spectrin (240/235E): differential expression during mouse brain development. J Neurosci, 7: 864-874 Riederer B. M, Monnet-Tschudi F, and Honegger P (1992) Development and maintanance of the neuronal cytoskeleton in aggregated cell cultures of fetal rat telencephalon and influence of elevated K+ concentrations. J Neurochem, 58: 649-658 Rivera C., Voipio J, Payne J A, Ruusuvuori E, Lahtinen H,

Lamsa K, Privola U, Saarma M, and Kaila K. (1999) The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarising during neuronal maturation. Nature 397: 251-255 Roberson M. D, Toews A D, Goodrum J F, and Morell P (1992) Neurofilament and tubulin mRNA expression in Schwann cells. J Neurosci Res, 33: 156-162 Rodriguez-Moreno A., and Lerma J (1998) Kainate receptor modulation of GABA release involves a metabotropic function. Neuron, 20: 1211-1218 Rooke J. E, and Xu T (1998) Positive and negative signals between interacting cells for establishing neural fate. Bioessays, 20: 209-14 Rosemund C., Stein-Bach Y, and Stevens C (1998) The tetrameric structure of a glutamate receptor channel. Science, 280: 1596-1599 Rumbaugh G., Prybylowski K, Wang J F, and Vicini S (2000) Exon 5 and spermine regulate deactivation of NMDA receptor subtype. J Neurophysiol, 83: 1300-1306 Sah D. W, Ray J, and Gage F H (1997) Regulation of voltage- and ligand-gated currents in rat hippocampal progenitor cells in vitro. J

Neurobiol, 32: 95-110 Sakimura K., Morita T, Kushiya E, and Mishina M (1992) Primary structure and expression of the γ2 subunit of the glutamate receptro channel selective for kainate. Neuron, 8: 267-274 139 Sather W. A, Tanabe T, Zhang J-F, Mori Y, Adams M E, and Tsien R W (1993) Distinctive biophysical and pharmacological properties of class A (BI) calcium channel α1 subunits. Neuron 11: 291-303. Schererer S. E and Gallo V (1998) Expression and regulation of kainate and AMPA receptors in the rat neural tube. J Neurosci Res 52: 356-368 Schlett K., and Madarász E (1997) Retinoic acid induced neural differentiation in a neuroectodermal cell line immortalised by p53-deficiency. J Neurosci Res 47: 405-417 Serafini R., Ma W, Maric D, Maric I, Lahjouji F, Sieghart W, and Barker J (1998) Initially expressed early rat embryonic GABAA receptor Cl- ion channel exhibit heterogeneous channel properties. Eur. J Neurosci, 10: 1771-1783 Sheikh S. N, and Martin D L (1996) Heteromers of

glutamate decarboxylase isoforms occur in rat cerebellum. J Neurochem, 66: 2082-2090 Shi Y., Velt B, and Baekkeskov S (1994) Amino acid residues 24-31 but not palmitoylation of cysteine 30 and 45 are required for membrane anchoring of glutamic acid decarboxylase, GAD65. J Cell Biol., 124: 927-934 Shaw G., and Weber K (1982) Differential expression of neurofilament triplet proteins in brain development. Nature, 298: 277-279 Silver R. A, Lamb A G, and Bolsover S R (1990) Calcium hotspots caused by L-channel clustering promote morphological changes in neuronal growth cones. Nature, 343: 751-754 Simeone A., Avantaggiato V, Moroni M C, Mavilio F, Arra C, Cotelli F, Nigro V, and Acampora D (1995): Retinoic acid induces stage–specific antero–posterior transformation of rostral central nervous system. Mech Dev 51: 83–98 Simonian X. S, and Herbison A E (2001) Differing, spatially restricted roles of ionotropic glutamate receptors in regulating the migration of GnRH neurons during

embryogenesis. J Neurosci, 21: 934-943. Small B. G, Baker S R, Rubio A, Ballyk B A, Hoo K E, Mandelzys A, Kamboj R, Lodge D, and Bleakman D. (1997) LY339434, a GluR5 selective kainate receptor agonist Br J Pharmacol, 122: p59. Soeda H., Tatsumi H, and Katayama Y (1997) Neurotransmitter release from growth cones of rat dorsal root ganglion neurons in culture. Neuroscience, 77: 1187-99 140 Sommer B., KeinänenK, Verdoorn T A, Wisdwn W, Burnashev N, Herb A, Köhler M, Takagi T, Sakmann B., and Seeburg P H (1990) Flip and flop: a cell-specific functional switch in glutamate-operated channels of the CNS. Science, 249: 1580-1585 Sommer B., Köhler M, Sprengel R, and Seeburg P H (1991) RNA editing in the brain controls a determinant of ion flow in glutamate gated channels. Cell, 67: 11-19 Soghomonian J. J, and Martin D L (1998) Two isoforms of glutamate decarboxylase: why? Trends Pharmacol. Sci 19: 500-505 Solimena M., Aggujaro D, Muntzel C, Dirkx R, Butler M, De Camilli P, and Hayday A

(1993) Association of GAD-65, but not of GAD-67, with the Golgi complex of transfected Chinese hamster ovary cells mediated by the N-terminal region. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 3073-7 Spitzer N. C, de Baca R C, Allen K A, and Holliday J (1993) Calcium dependence of differentiation of GABA immunoreactivity in spinal neurons. J Comp Neurol, 337: 168-175 Spitzer N. C, and Ribera A B (1998) Development of electrical excitability in embryonic neurons: mechanisms and roles. J Neurobiol, 37: 190-197 Spitzer N. C, Lautermilch N J, Smith R D, and Gomez T M (2000) Coding of neuronal differentiation by calcium transients. BioEssays, 22: 811-817 Spoerri P. E (1988) Neurotrophic effects of GABA in cultures of embryonic chick brain and retina Synapse, 2: 111-122. Stork O., Ji F-Y, Kaneko K, Stork S, Yoshinobu Y, Moriya T, Shibata S, and Obata K (2000) Postnatal development of a GABA deficit and disturbance of neural functions in mice lacking GAD65. Brain Res, 865: 45-58 Sullivan K. F (1988)

Structure and utilization of tubulin isotypes Annu Rev Cell Biol, 4: 687-716 Sutherland M. L, Delaney T A, and Noebels JL (1996) Glutamate transporter mRNA expression in proliferative zones of the developing and adult murine CNS. J Neurosci 16: 2191-207 Swanson G. T, Green T, and Heinemann S F (1998) Kainate receptors exhibit differential sensitivities to (S)-5-iodowillardiine. Mol Pharmacol, 53: 942-949 Szabó G., Katarova Z, and Greenspan R (1994) Distinct protein forms are produced from alternatively spliced bicistronic glutamic acid decarboxylase mRNAs during development. Mol Cell Biol 14: 7535-7545. 141 Takimoto R., El-Deiry W S (2001) DNA replication blockade impairs p53-transactivation Proc Natl Acad Sci U S A. 98: 781-3 Tarnawa I., Farkas S, Berzsenyi P, Pataki A, and Andrasi F (1989) Electrophysiological studies with a 2, 3-benzodiazepine muscle relaxant: GYKI 52466. Eur J Pharmacol 167: 193-199 Tarnawa I., and Vizi E S (1998) 2,3-benzodiazepine AMPA antagonists Restor

Neurol Neurosci, 13: 41-57. Taylor J., and Gordon-Weeks P R (1991) Calcium-independent γ-aminobutyric acid release from growth cones: role of γ-aminobutyric acid transport. J Neurochem, 56: 273-280 Tillakaratne N. J, Medina-Kauwe L, and Gibson K M (1995) Gamma-aminobutyric acid (GABA) metabolism in neural and non-neural tissues. Comp Biochem Physiol A Physiol, 112: 247263 Tingley W. G, Ehlers M D, Kameyama K, Doherty C, Ptak J B, Riley C T, and Huganir R L (1997) Characterization of protein kinase A and protein kinase C phosphorylation of the Nmethyl-D-aspartate receptor NR1 subunit using phosphorylation site-specific antibodies. J Biol Chem. 272: 51157-5166 Traynelis S. F, and Cull-Candy S G (1991) Pharmacological properties and H+ sensitivity of excitatory amino acid receptor channels in rat cerebellar granule neurons. J Physiol (London), 433: 727763 Tyner S. D, Venkatachalam S, Choi J, Jones S, Ghebranious N, Igelmann H, Lu X, Soron G, Cooper B., Brayton C, Hee Park S, Thompson T,

Karsenty G, Bradley A, and Donehower L A (2002) p53 mutant mice that display early ageing-associated phenotypes. Nature, 415: 45-53 Umbriaco D., Garcia S, Beaulieu C, and Descarries L (1995) Relational features of acetylcholine, noradrenaline, serotonin and GABA axon terminals in the stratum radiatum of adult rat hippocampus. Hippocampus 5: 605-20 Vallano M. L (1998) Developmental aspects of NMDA receptor function Neurobiology 12: 177-204 Varju P. (1997) Neurogenezis in vitro vizsgálata p53-deficiens, immortalizált neuroepiteliális sejtvonalakon. Szakdolgozat Varju P., Katarova Z, Madarász E, and Szabó G (2001) GABA signalling during development: new data and old questions. Cell Tissue Res 305: 239-246 Verdoorn T. A, Burnashev N, Monyer H, Seeburg P H and Sakmann B (1991) Structural determinants of ion flow through recombinant glutamate receptor channel. Science, 252: 1715-1718 142 Verdoorn T., Johansen T, Drejer J, and Nielsen E (1994) Selective block of recombinant GluR6

receptors by NS-102, a novel non-NMDA receptor antagonist. Eur J Pharmacol, 269: 43-49 Villasante A., Wang D, Dobner P, Dolph P, Lewis S A, and Cowan N J (1986) Six mouse α-tubulin mRNAs encode five distinct isotypes: Testis-specific expression of two sister genes. Mol Cell Biol., 6: 2409-2419 Wang D., Villasante A, Lewis S A, and Cowan N J (1986) The mammalian β-tubulin repertoire: Hematopoietic expression of a novel, heterologous β-tubulin isotype. J Cell Biol, 103: 19031910 Wang Y., and Durkin J P (1995) α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, but not Nmethyl-D-aspartate , activates mitogen-activated protein kinase through G-protein βγ-subunits in rat cortical neurons. J Biol Chem, 270: 22783-22787 Wang Y., Small D L, Stanimirovic D B, Morley P, and Durkin J P (1997) AMPA receptor mediated regulation of a Gi-protein in cortical neurons. Nature, 389: 502-504 Watanabe M., Inoue Y, Sakimura K, and Mishina M (1992) Developmental changes in distribution of NMDA

receptor channel subunit mRNAs. Neuroreport 3: 1138-40 Watanabe M., Inoue Y, Sakimura K, and Mishina M (1993) Distinct distribution of five N-methyl-Daspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain J Comp Neurol, 338: 377-390 Watanabe M., Fukaya M, Sakimura K, Manabe T, Mishina M, and Inoue Y (1998) Selective scarcity of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum (mossy fiber-recipient layer) of the mouse hippocampal CA3 subfield. Eur J Neurosci 10: 478-487 Watt S. D, Gu X, Smith R D, and Spitzer N C (2000) Specific frequencies of spontaneous Ca2+ transients upregulate GAD 67 transcripts in embryonic spinal neurons. Mol Cell Neurosci 16: 376-87. Wenthold R. J, Petralia R S, Blahos J II, and Niedzielski A S (1996) Evidence for multiple AMPA receptor complexes in hippocampal CA1/CA2 neurons. J Neurosci 16: 1982-9 Westmoreland J. J, Hancock C R, and Condie B G (2001) Neuronal development of embryonic stem cells: a model of GABAergic neuron differentiation. Biochem

Biophys Res Com 284: 674-680 White E. (1994) p53, guardian of Rb Nature, 371: 21-22 143 Wong L. A, Mayer M L, Jane D E, and Watkins J C (1994) Willardiines differentiate agonist binding sites for kainate- versus AMPA-preferring glutamate receptors in DRG and hippocampal neurons. J Neurosci 14: 3881-3897 Wong R. O, Chernjavsky A, Smith S J, and Shatz C J (1995) Early functional neural networks in the developing retina. Nature, 374: 716-718 Zhang L., Zheng X, Paupard M-C, Wang A P, Santchi L, Friedman L K, Zukin S R, and Bennett M V. (1994) Spermine potentiation of recombinant N-methyl-D-aspartate receptors is affected by subunit composition. Proc Natl Acad Sci USA, 91: 10883-10887 Zheng J.Q, Wan JJ, and Poo MM (1996) Essential role of filopodia in chemotropic turning of nerve growth cone induced by a glutamate gradient. J Neurosci 16: 1140-1149 Zheng X., Zhang L, Durand G M, Bennett MV, and Zukin R S (1994) Mutagenesis rescues spermine and Zn2+ potentiation of recombinant NMDA

receptors. Neuron, 12: 811-818 Zheng X., Zhang L, Wang A P, Bennett M L V and Zukin R S (1999) Protein kinase C potentiation of N-methyl-D-aspartate receptor activity is not mediated by phosphorylation of N-methyl-Daspartate receptor subunits. Proc Natl Acad Sci 96: 15262-15267 Zhou L-M., Gu Z-Q, Costa A M, Yamada K A, Mansson P E, Giordano T, Skolnick P, and Jones K A. (1997) (2S,4R)-4-methylglutamic acid (SYM 2081): a selective, high-affininty ligand for kainate receptors. Pharmacol Exper Therap 280: 422-427 Ziegra C. J, Willard J M, and Oswald R E (1992) Coupling of a purified goldfish brain kainate receptor with a pertussis toxin-sensitive G protein. Proc Natl, Acad Sci USA, 89: 4134-4138 Zimmerman L., Parr B, Lendhal U, Cunningham M, and McKay R (1994) Independent regulatory elements in the nestin gene direct transgene expression to neural stem cells or muscle precursors. Neuron, 12: 11-24. Zukin R. S, and Bennett M V L (1995) Alternatively spliced isoforms of the NMDAR1 receptor

subunit. Trends Neurosci 18: 306-313 144