Biology | Studies, essays, thesises » Dr. Bognár János - In vitro növényi rendszerek

dr Bognár János In vitro növényi rendszerek Az élet egyik alapfeltétele a szüntelen, dinamikus kapcsolat az élő és környezete között. A sajátosan szervezett élő rendszerek határfelületein folyamatos anyag, energia-, és információcsere történik, az élő és környezete egy állandó, szoros és dinamikus kapcsolatrendszerben állnak. Az élő termodinamikailag egy sajátos nyílt rendszer. Ez a bonyolult szövevényes hálózathoz hasonlítható kölcsönhatás az élő rendszeren belül is működik. Az egyes részek bioelektromos impulzusokkal , vagy vegyi jelekkel tájékoztatják egymást pillanatnyi állapotukról, működésükről. Így áll elénk az érzékeny, változó és mégis sziklaszilárd csoda amit hétköznapjainkban csak egyszerűen életnek nevezünk. Az állatoktól és az embertől eltérően a soksejtű növény minden élő sejtje teljes értékű /embernél, állatnál ez csak az őssejtekre igaz!/, totipotens, vagyis az adott fajra

jellemző teljes genetikai, biokémiai, élettani potenciállal rendelkezik és megfelelő körülmények között képes lehet önálló vagy programozott, irányított fejlődésre. A növénysejt totipotenciáját Haberlandt a XX. század elején így fogalmazta meg: bármely növényi sejt-beleértve a haploid spórákat is- a megternékenyített petesejthez hasonlóan a fajra jellemző összes genetikai adottságokkal rendelkezik. A totipotens egység a külső szabályozók/pl növényi homonok/ hatására a természetes/in vivo/ viszonyoknak megfelelő, de attól jelentősen eltérő anyagcserét, morfológiát, anatómiai szerveződést – összefoglaló néven: morfogenezist/ pl organogenezis, szomatikus embriogenezis/ is mutathat. Az anyanövényekből kivett izolált sejtek, szövetek vagy szervek növekedésének és fejlődésének a fenntartása laboratóriumi/ mesterséges-in vitro/ körülmények között a növényi sejt és szövettenyésztés sajátos módszere

és tudománya. A módszer a növényi testről leválasztott élő sejtek azon tulajdonságát használja ki, hogy megfelelő tenyésztési körülmények között képesek visszanyerni vagy megőrizni osztódóképességüket, bármilyen növényi sejttípussá átalakulhatnak, szervképzést valósíthatnak meg vagy teljes növény regenerálódhat belőlük. A technikával, és az elméleti tudásanyag birtokában olyan feltételeket biztosíthatunk, amely lehetővé teszi a kivágott rész/ inokulum/ növekedését, differenciálódását esetleg meghatározott irányú programozott továbbfejlődését. A kezdetben élettani, fejlődéstani, biokémiai, citogenetikai alapkutatásokban alkalmazott technikát ma már gyakorlati célból: in vitro vegetatív szaporításra, vírusmentes szaporítóanyag és a mesterséges mag előállítására, bioaktív anyagok termelésére, génbank tárolásra és genetikai, növénynemesítési célokra is felhasználják. A növényi

szövettenyésztés módszerei és sajátos szemléletmódja a növényi biotechnológia elméleti és gyakorlati alkalmazásainak alapvető feltétele! A teljes/intakt/ növény korrelációs kapcsolataiból izolált növényi részek in vitro tenyésztése mesterséges táptalajon (szilárd, folyékony), steril és klimatizált feltételek között történik. A tápközeg összetétele nagyon különböző lehet, több száz receptet ismertet a szakirodalom. A tápközegek változó mennyiségben tartalmaznak makro- és mikroelemeket, vitaminokat, szén- és energiaforrás vegyületeket/ legtöbbször szacharózt/, továbbá különböző növekedést szabályozó anyagokat/pl növényi hormonok/ és komplex kiegészítőket/ pl kókusztej/. A tápközeget gyakran a mikrobiológiában általánosan használt egyáltalán nem olcsó agarral szilárdítják. A növényi szövettenyészetek, mindig axenikusak, azaz baktérium- és gombamentesek. A sterilitás alapkövetelmény!

Ennek oka, hogy az izolált, leválasztott inokulum és a belőle fejlődő tenyészet általában már nem képes önállóan az életéhez szükséges összes szerves anyagot előállítani – (a hiányzókat, vagy azok előanyagait a sejtek a táptalajokból veszik fel) – a szerves szénforrást és a tápközeg többi anyagait a nem kívánatos baktériumok és egyéb mikroorganizmusok is kedvelik és a fertőzött tenyészetekben gyorsan elszaporodnak. Idővel természetesen a zárt rendszernek tekinthető táptalaj anyagai elfogynak és ezért szükséges a tenyészet ismétlődő átoltása, amit passzálásnak nevezünk. Így jutunk az ismételt átoltásokkal korlátlan ideig fenntartható növényi sejtvonalakhoz, szervtenyészetekhez a szubkultúrákhoz. Elvileg akár egyetlen sejtből is lehetne indítani tenyészetet, de a gyakorlatban egy minimális méretet, sejtszámot alkalmaznak a gyorsabb szaporodás érdekében. Természetesen a tápközegre inkubált inokulumnak

is sterilnek kell lennie, ezt általában felületi sterilizálással érik el új tenyészetek indításakor. A szubkultúrák átoltásakor a mikrobiológiában alkalmazott eljárásokkal lehet biztosítani a folyamatos sterilitást. A korrelációs kapcsolatainak rendszeréből kivett/ izolált/ rész, mesterségesen biztosított feltételek között/ in vitro/ is életben tartható, sajátos működése elkülönítve gyakran egyszerűbben tanulmányozható, fejlődése az egésztől függetlenül programmozható és genetikai készlete –genomja – könnyebben manipulálható Az in vitro növényi rendszerek fontosabb csoportjai/1./ – sejttenyészetek A totipotens növényi sejtek kontrollált laboratóriumi körülmények között fenntartott in vitro tenyészetei eredetüket és szerveződésük szintjeit tekintve nagyon különbözőek és ennek a változatosságnak megfelelően széles körben sokféle célra felhasználhatók. A korábbi klasszikusnak nevezhető

csoportosítás alapja a tenyészet fejlődéstani állapota. Ha az in vitro rendszer zömmel differenciálatlan sejteket tartalmaz, esetleg egyszerű szövetekből áll sejttenyészetnek tekintjük: 1. A kallusz osztódó parenchimatikus sejtekből álló differenciálatlan sejttenyészet, amely lehet kemény-gömbös, vagy szivacsos-lágy szerkezetű, színe változó. A kallusz (hegszövet) bármilyen élő szövetből előállítható, ha a táptalaj ionkoncentrációja magas, és növényi hormonokat (elsősorban auxinokat) tartalmaz. A 2,4-D /diklór fenoxi ecetsav/ például kifejezetten kalluszosító szintetikus auxin. A sejtek változatos alakúak, méretűek és genetikailag instabilak, gyakori ebben a rendszerben a mutáció. Az első átoltások során erősen változik a sejtek növekedése, habitusa, anyagcseréje. Csak több átoltás után stabilizálódik a tenyészet. A növényi szövettenyésztés hőskorában mindenki kalluszt akart létrehozni és

hormonvariációkkal hajtás-, gyökér- és teljes növényregenerációt, esetleg szomatikus embriogenezist indukálni a sejtekből. Napjainkban a kallusz a genetikai instabilitás miatt visszaszorul, gyakran nem kívánatos melléktermék, a sejtszuszpenziók létrehozásához azonban ma is nélkülözhetetlen. 2. A sejtszuszpenziók folyékony tápközegben tartott diszpergált sejtek Általában közvetett módon kalluszból állithatók elő. A sejtek befulladásának elkerülését rázatással, keverőlapátokkal, vagy levegő áramoltatással/un airlift/ biztosítják. A sejtek zöme kisebb nagyobb aggregátumokat képez, csak elvétve találunk a sejtszuszpenziókban magányos sejteket. A rendszer növekedése gyorsabb, biomassza termelése nagyobb mint a kalluszé, hiszen sejtjeinek jobb a tápanyag ellátása. Annak dacára, hogy ezeket az in vitro rendszereket nehezebb és drágább fenntartani elsősorban a speciális rázógépek, fermentorok és a szabályozó

szoftverek ára miatt, a modern növényi biotechnológia néhány területén egyre jobban terjednek. A szuszpenzióban lehet napjainkban a legjobb hatásfokkal indukálni a szomatikus embriogenezist, amikor vegetatív diploid sejtekből hormonális indukció hatására szabályos növényi embriók fejlődnek. Ismerünk technológiákat, melyekkel ezeket az embriókat szinkronizált tenyészetekben millió számra tudják produkálni és normális kifejlődésüket biztosítani, majd megfelelő eljárással kapszulázni, vagy szétvágható szalagra/embrio tape/ csomagolni tápanyaggal és más regulátorokkal együtt. Az így előállított mesterséges mag és üzemi kiültetése az un „folyékony vetés”/ fluid drilling/ ma már nem utópia. A sejtszuszpenziók kontrollált laboratóriumi körülmények között felhasználhatók arra is, hogy sejtjeik „kis biokémiai üzemek” módjára, értékes vegyületek állítsanak elő. Sőt a sejtszuszpenziós kultúrák új

molekulák szintézisére is képesek, melyek az intakt növényekben nem léteznek. Ez nem meglepő, hiszen in vitro rendszerekben a sejteket erős stresszhatás éri, melyre a sejtek génműködésük /génexpressziójuk/ megváltozásával válaszolnak. A mikrobiális kultúráktóll eltérően a növényi szuszpenziós tenyészetek sejtjei kezdetben osztódnak, növekednek, a hatóanyag termelés csak a gyarapodási szakasz befejeződésével, később kezdődik. Egy élesztő, vagy antibiotikum termelő mikrogomba sejtjei kezdettől fogva folyamatosan termelik hatóanyagaikat. Ezt ismerve a növényi szuszpenziós tenyészetekben gyakran először egy növekedésre, majd később egy hatóanyag termelésre optimalizált táptalajt alkalmaznak. Ez utóbbi táptalaj a hormonok mellett tartalmazhatja a hatóanyag felépítésében szerepet játszó alapvegyületeket/un „prekuzor” anyagokat/ és speciálisan a hatóanyag termelést serkentő un „elicitor” molekulákat.

Mindezekkel a sejt korábbi hatóanyagtermelése akár százszorosára is fokozható. Általános törekvés, hogy a laboratóriumi kis térfogatú tenyészetekből kilépve félüzemi/un „pilot”-rendszer/, majd üzemi térfogatokban történjen a termelés. A léptéknövelés/ scale up/ azonban nem egy egyszerű edénycsere, számos új technikai és élettani problémával jár. A növényi sejtfermentáció a mikrobiális fermentációhoz hasonlítva még gyermekcipőben tipeg. Nem kell nagy jóstehetség ahhoz, hogy rohamléptű fejlődést jelezzünk előre ezen a területen. 3. A sejtfal mesterséges eltávolításával a növényi sejtek különleges formái izolált protoplasztok nyerhetők, melyeket az állati sejtekhez hasonlóan csupán egy külső sejtmembrán határol. Az ép csupán határmembránnal körülvett izolált protoplasztok ozmotikusan stabilizált közegben az eredeti sejt alakjától függetlenül egységesen gömb alakúak. A preparált

protoplasztokat sokféle kutatási célra fel lehet használni. Alapkutatások körébe tartozik, de nagyon fontos kérdés a sejt határfelületeinek ismerete a határmembrán/plazmalemma/ szerkezete, összetétele, vagy a sejtfal szintézis kezdeti szakasza. A protoplaszt ezekhez a vizsgálatokhoz ideális objektum. A növényi biotechnológia izgalmas területe az izolált protoplasztok egyesítése/ fuziója /, a szomatikus sejthibridizáció és ezt követően a hibrid sejtekből újra – most már azonban a szülőktől eltérő genommal rendelkező – növények regenerálása. Jelenleg a protoszplatfúzióra kétféle módszert alkalmaznak: a protoplaszt-szuszpenziókat összekeverik, és ehhez polietilén-glikolt (PEG) adnak, vagy pedig elektromos impulzussal kezelik a sejteket( elektrofúzió un fúziós kamrában).A fúzió maga általában jó hatásfokkal megvalósítható, további komoly gondot jelent azonban a fúziós termékek szétválasztása. Általában a

tápközeget használják a szelekcióra, de kapható lézeres sejtválogató berendezés is erre a célra. Az első protoplasztokat az enzimes eljárással 1960-ban izolálták, nem sokkal ezután már kísérleteztek a protoplasztok fúziójával is. Először sikeresen egy adott faj protoplasztjainak fúziójával dupla vagy magasabb kromoszómaszámú poliploid un homokarion sejthibrideket és növényeket állítottak elő. 1971-ben sikerült először két dohányfaj protoplasztjainak fuziójából szomatikus dohány fajhibrid növényt létrehozni.Ez már heterokarion sejthibrid, hiszen két faj protoplaszt fúziójából jött létre. 1978-ban a burgonya és paradicsom protoplasztok fuziójával keletkezett sejthibridekből először Németországban neveltek fel intergenerikus nemzetséghibrid növényeket. Magyar kutatók 1987ben állították elő a dohány-sárgarépa sejthibridbekből a NICA nevű intergenerikus hibrid növényt. Napjainkban számos mutáns

hibridnövényt ismer a tudomány és a gyakorlat, melyek létrehozásában a protoplaszt fúziós, vagy az irányított génbevitel technika szerepet játszott. A protoplaszt fúzió nem egy célzott, irányított beavatkozás. Pontosan előre nem lehet jelezni az eredményt Nem lehet tudni, hogy milyen tulajdonságok stabilizálódnak végül, és bizony a kiszámíthatatlanság miatt hátrányos tulajdonságok is megjelenhetnek. A már említett burgonya-paradicsom hibridek egy része inkább a paradicsomra hasonlít( angol nevüket magyarra fordítva:burdicsom), míg a másik részénél inkább a burgonya jellegek a meghatározók( az előbbiek alapján ez a pargonya). Számos további kísérlet igazolta, hogy a szomaklonális variabilitás állandó eleme ezeknek a kísérleteknek. Az irányított génbevitelnél a várható eredmény jobban előre jelezhető. Idegen DNS szakaszok, vagy akár teljes kromoszómák bejuttatására és ezen az úton un transzgénikus(TM) növények

létrehozására könnyebben adott a lehetőség a sejtfal mentes protoplaszt állapotban. Ilyenkor közvetítőként általában az Agrobacterium mikroorganizmusok néhány faját használják a biotechnológiában. Ma inkább ezen a területen látunk rohamos fejlődést, különösen az ellenálló, rezisztens fajták létrehozásánál. A ma használt génmódosított(GMO) növények zöme irányított génbevitellel létrehozott valamilyen tényezőre rezisztens fajta. A dohány protoplaszt genomba beépített szentjánosbogár luciferáz gén és az így létrehozott megfelelő körülmények között világító levelű dohány inkább a technika távlatait mutató modell értékű szenzáció. Az izolált protoplasztok felhasználásának is meg vannak a határai, azonban a modern növényi biotechnológia kelléktárában egyszerűen nélkülözhetetlenek. Az in vitro növényi rendszerek fontosabb csoportjai/2./ – szervtenyészetek Az in vitro növényi rendszerek jól

körülhatárolt csoportját képezik a szervkultúrák, melyekben az inokulum és a tenyészet – legalább részben – szervi differenciáltságot mutat. A vegetatív és a szaporító szervek in vitro rendszerei eltérő fejlődésűek és gyakorlati alkalmazásuk is nagyon különböző. Ennek alapján indokolt a szervtenyészeteket vegetatív és generatív csoportokra különíteni A leggyakoribb vegetatív szervtenyészetek a gyökér-, és a hajtáskultúrák. A gyökértenyészetek voltak ez első mai értelemben vett in vitro növényi szervkultúrák. Tudománytörténeti jelentőségű az 1934-ben White által létesített ma is fenntartott paradicsom gyökértenyészet. Azóta közel 2000 passzálást ért meg és a belőle fejlődött gyökérzet összesített hossza mértéktartó számítások szerint már körbeérte az egyenlítőt! A gyökértenyészetek az átlagosnál egyszerűbb táptalajon, alacsonyabb cukorszinten és sötétben is nagyon jól fejlődnek

. Amennyiben természetes fényen tartják őket gyakran sötétítik a tápközeget aktív szénnel. Gyakorlati szempontból igen jelentősek a hajtástenyészetek. Az in vitro vegetatív szaporítás ma már széles körben alkalmazott technológia. Elméletileg azonos az in situ vegetatív szaporítással, az elkülönítést az inokulum kisebb mérete és a steril technológia alkalmazása indokolja. Mindkét esetben a testi sejtekből fejlődik az új egyed az utódok tehát genetikailag azonosak, klón értékűek. Az in vitro klónozás elvi alapja a totipotencia Bármely vegetatív szerv lehet inokulum – a tipikus hajtáskezdemény/ rügy/ inokulum mellett előfordulhat levél, hipokotil, epikotil, gumó, hagyma stb. A gyakorlatban inokulumként általánosan használt hajtáskezdeményeknél a hajtásfejlődés. már eredetileg részlegesen determinált Ezt erősítjük tovább a tápközeg hormonjaival. A technológia kiindulási inokuluma lehet kipreparált

hajtástenyészőkúp., melyet általában a vírusmentes szaporítóanyag előállítására használnak. Nagyobb/ 1-2 cm/ és könnyebben preparálható az un mikrodugvány, amely lehet: csúcsrügyes szárdarab, vagy egy szárköz hónaljrüggyel, – utóbbiak az un nodális szegmenetek. A tényleges szaporítás a vegetatív multiplikáció álalában sokszorozó tápközegen a csúcsdominanciájú fajoknál a hajtástengely darabolásával/ nodális szegmentekkel/ történik. Amennyiben a dominancia nem kifejezett a vegetatív sokszorozás tőosztással is lehetséges/ pl tőlevélrózsás fajok- Gerbera/. A kultúrákban gyakran megjelenő módosult hajtások, járulékos szervek/ embrioidok, protokormok, minigumók, minihagymák stb/ felhasználása tovább növelheti a multiplikációs rátát. A szaporítási szakaszban a genetikai instabilitás elkerülése érdekében a kalluszképzést igyekeznek elkerülni. A kiültetés kezdeti fázisa A szaporított hajtások

gyökereztetése a technológia következő lépése. Ez szerencsés esetben spontán történik, ha mégis szükséges a gyökérfejlődés hormonális indukciója kevés gondot okoz. A kritikus fázis általában a szaporított anyag kiültetése. Az in vitro szaporítás napjainkban általánosan használt technológia a dísznövényektől/pl epifita orchideák/ kezdve az erdei fák, gyümölcsök/pl szőlő/, zöldségfélék számos mezőgazdaságilag jelentős faj/pl burgonya, cukornád/ esetében egyaránt. A nemesítők előszeretettel alkalmazzák nemzedékgyorsításra, és fontos szerepe van a genetikai tartalékok megőrzését szolgáló génbankokban is. A generatív szervtenyészetek a virág, gyakrabban egyes virágrészek in vitro rendszerei. Gyakorlati szempontból legfontosabbak a portok kultúrák Az izolált portokokban a mikorspóra/ pollen/ fejlődésének korai stádiumában közvetlenül a redukciós osztódás után a továbbfejlődés iránya még nem

teljesen determinált. Ez adja az elvi lehetőségét annak, hogy a a haploid pollensejt fejlődését az in vitro portokkultúrában a természetes mikrogametogenezis helyett sporofiton irányba térítsük el. Így a táptalajon a pollenszemekből nem pollentömlő fejlődik, hanem haploid sejtek, vagy szervek keletkeznek. Az in vitro androgenezis során először gyakran soksejtes pollen alakul ki, amelyből embrió-, vagy organogenezissel feles ploidszintű un androgenetikus haploid növények fejlődnek. A portokkultúra gyakorlati jelentőségét nem ezek a kisebb méretű, meddő virágokat hozó terméketlen, gyakran albinó haploid növények jelentik, hanem a belőlük kromoszóma kettőzéssel előállított un doubled haploid/ DH/ alakok. Androgenetikus dihaploid növényeket/DH növényeket/ kaphatunk spontán rediploidizációval, vagy kolhicin kezeléssel. Spontán rediploidizáció előfordulhat gyakran haploid növények virágaiban. Az így kapott DH magvak

valószínűleg a haploid (n) növényeken kialakuló gaméták (n) keletkezésének és spontán fúziójának (2n) eredményei. A rediploidizálás klasszikus módja a haploid növények, illetve azok hajtás- vagy virágrügyeinek, kolchicines kezelése. A homozigóta egyedekben a recesszív tulajdonságok megjelenése jóval gyakoribb, mint egy kevert diploid populációban. A dihaploidok gyakorlati jelentőségét az adja, hogy homozigóta stabil, további szelekciót nem igénylő tiszta származéksorok, amelyek további genetikai, nemesítési programok biztos kiindulási alapjai A klasszikus genetikában ezeket a homozigóta vonalakat hosszadalmas beltenyésztéssel, sorozatos visszakeresztezésekkel/ back cross/ állítják elő. A DH növények segítségével ez az idő minimum felére csökkenthető és jóval kisebb területet igényel, hiszen az alapanyagot laboratóriumban, üvegházban tartják. A hibridkukorica vetőmagtermesztés alapfeltételét jelentő

beltenyésztett vonalak előállításának és általában a mezőgazdasági növények hibrid nemesítésének idejét/ általában 8-10év/ ezzel az eljárással legalább felére lehet csökkenteni. A termőtáj in vitro rendszerei kipreparált termékenyítetlen magház/ ovarium/ és magkezdemény/ ovulum/ tenyészetek. Az embriózsák haploid sejtjeiből fejlődő egyedek a ginogenetikus haploid növények. Erősebb növekedésűek mint pollen eredetű társaik, az albinizmus itt egyáltalán nem jellemző, a virágaik meddőek. Diploidizálással ezekből a növényekből kapjuk a ginogenetikus dihaploidokat. Ezeknek a tenyészeteknek előállítása a bonyolult preparálás miatt nehézkesebb, a táoközegek bonyolultabbak, a hatásfok is kisebb, ezért a nemesítésben inkább a pollen eredetű dihaploid növényeket használják. A termőtáj in vitro rendszereit azonban más területeken széles körben alkalmazzák. Az in vitro beporzás izolált magház, vagy magkezdemény

beporzása táptalajon. A termőtáj különböző ploidia fokú sejtjeit indukálhatjuk ezzel a módszerrel szomatikus embriogenezisre/ pl apogámia a diploid sejtekből; in vitro partenogenezis az embriózsák haploid sejtjeiből/. A beporzáshoz használt pollent előzetesen inaktiválják így megtermékenyítésre képtelenek, azonban nélkülözhetetlen induktorok ezekben a folyamatokban Az in vitro megtermékenyítésben az izolált rendszerben szabályos kettős megtermékenyítés történik: életképes pollen termékenyíti meg a lombikban az embriózsák petesejtjét és a központi sejtet. Általában akkor alkalmazzák, amikor a bibe/bibeszál inkompatibilitás miatt a virág bibeszálban gátolt a pollentömlő fejlődése és természetes úton nem valósul meg a megtermékenyítés. Az embriótenyészetek gyakorlati jelentőségét az adja, hogy olyan esetekben is kaphatunk növényeket, amikor in vivo az embriógenezisnek valamilyen akadálya van, pl. élettani

összeférhetetlenség, fiziológiai inkompatibilitás Végeredményben így olyan új faj- és nemzetséghibrideket tudunk előállítani, amely a fellépő inkompatibilitás miatt a természetben nem jöhetnek létre. Összefoglalva: az in vitro szervtenyészetekben a növény vegetatív szerveit a virágok portokjait, vagy magházait tenyésztjük steril, ellenőrzött körülmények között. Az in vitro szaporítás tulajdonképpen ivartalan szaporítás, melyben az új egyed testi sejtekből alakul ki és nem a zigótából. Az így keletkezett utódok genetikailag azonosak, sem a kiinduló növénytől, sem egymástól elvben nem különböznek. A generatív szervtenyészetekkel a növénynemesítés eljárásainak hatékonyságát növelő dihaploid/ DH /növényeket állíthatunk elő. Az in vitro megtermékenyítéssel és az embrió kultúrákkal a biológiai sokféleség növelésére nyílik lehetőségünk