Kémia | Biokémia » Fehérjék és enzimek tételek

BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK Fehérjék és enzimek tételek 1. Standard aminosavak általános kémiai jellemzése, csoportosításuk  Standard aminosavak általános kémiai jellemzése         Standard aminosavaknak azt a 20 aminosavat nevezzük, melyek az emberi szervezet fehérjéinek felépítésében vesznek részt, de nem minden fehérjemolekulában vesz részt mind a 20 aminosav. Ezek az aminosavak mind L, -aminosavak. A húszféle aminosav variációs lehetősége és a változatos molekulatömeg bőven elegendő a természetben található 1012 fehérjeféleség megvalósulásához. Az összes ilyen aminosav karboxil- (COOH) és aminocsoportot (NH 2 ) tartalmaz az -szénatomon. Az egyes aminosavak különböző oldalláncokkal rendelkeznek, melyek eltérő méretet, töltést és fizikokémai tulajdonságokat biztosítanak. A glycin (Gly) és

a prolin (Pro) kivételével az összes aminosav tartalmaz aszimmetrikus C-atomot, így optikailag aktív molekulák (L-aminosavak). Az aminosavak vizes oldatban ionok, protondonorok vagy protonakceptorok lehetnek az oldat pH-jától függően. Az aminosavak abszorpciós spektrumának maximuma általában 220 nm alatti hullámhosszon van. Kivétel az aromás aminosavak (triptofán: 285, tirozin: 280, fenilalanin: 260).  Az aminosavak csoportosítása   A fehérjék szerkezetének és funkcionális sajátosságainak megértéséhez az aminosavakat az oldalláncok szerint öt különböző csoportra osztjuk. Oldallánc szerinti csoportosítás  1. Apoláros, nem aromás oldalláncú aminosavak  alanin, valin, leucin, izoleucin, glycin, prolin  hidrofób oldalláncok  a glycin helyén van a polipeptidlánc legnagyobb flexibilitása, míg a prolin helyén a szekunder gyűrűbe zárt aminocsoport miatt merev konformáció alakul ki  2. Aromás aminosavak 

fenilalanin, tirozin, triptofán, hisztidin  hidrofób kölcsönhatásokat alakítanak ki  a tirozin hidroxilcsoportja H-hidakat alakíthat ki BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK   3. Poláros, töltéssel nem rendelkező oldalláncú aminosavak  szerin, treonin, cisztein, aszparagin, glutamin, metionin  a funkciós csoportok H-hidakat képeznek vízzel, így ezek hidrofilek  a cisztein másik cisztein molekulával vízkilépés kíséretében diszulfidhidat képezhet  4. Savas karakterű oldalláncú aminosavak  aszparaginsav (aszparát) és a glutaminsav (glutamát)  5. Bázisos karakterű oldalláncú aminosavak  lizin, arginin és a hisztidin Karakterisztikus funkciós-csoportok szerinti csoportosítás  1. Monoamino-monokarbonsavak  glycin, alanin, valin, leucin, izoleucin  2. Monoamino-dikarbonsavak  aszparaginsav, aszparagin,

glutaminsav, glutamin  3. Diamino-monokarbonsavak  lizin, arginin  4. Oxo-aminosavak  szerin, treoinin  5. Kéntartalmú aminosavak  cisztein, metionin  6. Aromás aminosavak  fenilalanin, tirozin, triptofán, hisztidin  7. Iminosavak  prolin BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 2. 1. fejezet Aminosavak disszociációja, pK értékei, izoelektromos pont  AS-ak disszociációja, pK-értékei, Ip               Az aminocsoport a prolin kivételével az aminosavakban primer amin, amitől az lenne várható, hogy az ammóniánál erősebben bázikus, de az -aminosavak esetében az azonos szénatomhoz kapcsolódó karboxilcsoport elektronszívó hatása csökkenti az elektronküldő szénlánc hatását és az -aminocsoportok az ammóniával azonos báziserősséget mutatnak. A legtöbb aminosav

-aminocsoportjának pK-értéke 9-10 közé esik. A karboxilcsoportok erősebb savak, mint az azonos szénatomszámú karbonsavak, mivel az -aminocsoport elektronegatív nitrogénje szívja a kerboxilcsoportról az elektronokat, így a proton könnyebben disszociál. A legtöbb -karboxil pK-értéke 2-3 közé esik. Az aminosavak többsége fiziológiás pH-érték mellett ikerionos szerkezetet képez: karboxilcsoport deprotonált (-), az aminocsoport protonált (+) állapotban van. Ekkor az aminosav nettó töltése 0. Azt a pH-értéket, amely mellett egy aminosav oldat egészére jellemző az ikerionos szerkezet, izoelektromos pontnak nevezzük. Monoamino-monokarbonsavak esetében az izoelektromos pont: pK C  pK N . pH i  2 Ha az oldalláncban savi illetve bázikus csoport van, akkor a szerkezeti formák töltésének vizsgálata dönti el, melyik két csoport pK s értékeinek számtani közepét kell venni. A monoamino-dikarbonsavak esetében az -karboxilcsoport

pK s -értéke a legalacsonyabb (legkönyebben deprotonálódik), ezért a pK sC és a pK sR értékek számtani középpontjában van az az izoelektromos pont, ahol a két karboxilcsoport közül az egyik deprotonálódott (-), így ez ellensúlyozza az -aminocsoport (+) töltését. Hasonló meggondolás alapján a diamino-monokarbonsavak esetében a két bázikus csoport pK-értékének számtani közepe adja azt az izoelektromos pontot, ahol egyensúlyt tart a karboxilcsoport (-) töltésével. A monoamino-monokarbonsavaknak kettő, az oldalláncban ionizálható csoportot tartalmazó aminosavaknak három inflexiós pontjuk van a titrálási görbén, melyek a pK-értékeknek felelnek meg. A pK-értékek körüli pH-tartományban (  1) az aminosavak pufferként viselkednek. Az infelxiós pontok közötti tartomány(ok)ban található(k) az izoelektromos pont(ok), amit I p -vel is szokás jelölni. A hisztidin oldalláncának pK-értéke a fiziológiás tartományban van

(6), ezért az a szervezet egyik fontos szerves puffere. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK A: glicin B: aszparaginsav C: arginin D: hisztidin BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 3. 2. fejezet Peptidkötés, a kötés konfigurációja, a peptidek elnevezése  Peptidkötés     A fehérjékben az aminosavak peptidkötéssel kapcsolódnak egymáshoz. Az egyik aminosav α-COOH-csoportjának –OH-részét veszíti, a következő aminosav α-NH 2 -csoportjának H-ét veszíti. Így vízkilépés mellett kialakul a peptidkötés vagy amidkötés a N (NH) és a C (C=O) között. A kialakult kötés savamidkötés, a létrejött peptid szubsztituált amidnak tekinthető, illetve felfogható úgy is, mint acilezett amin.  A peptidkötés konfigurációja       A

beépülő első aminosav -aminocsoportja szabad marad, ezt N-terminális résznek nevezzük. A végső aminosav -karboxilcsoportja szintén szabad, ez a peptid Cterminális része Az eredetileg karboxilcsoportból származó C=O kötés és az aminocsoportból származó N-H kötés delokalizált kötésrendszert alkot (az O és N között húzható a szaggatott vonal). Ennek oka, a karbonilcsoport erősen elektronegatív oxigénje, ami megszívja a peptidkötés nitrogénjének nemkötő elektronpárját. A nitrogénnél δ+ -alakul ki, az oxigénnél δ-. Ezzel kialakul egy olyan kötés az O-C-N között, ahol a szabad rotáció gátolt. Peptidekben és fehérjékben itt transz-helyzet alakul ki, így az oldalláncok taszító hatása kevésbé érvényesül. A peptidkötés hat atomja (C=O, N-H és a csoportokhoz kapcsolódó egy-egy szomszédos α-C) egy síkban helyezkedik el  peptidsík. Mivel a peptidkötéshez kapcsolódó két α-C-atom a -kötések körül

szabadon elfordulhat, elmondható, hogy minden peptidkötés egy adott síkban van, a különböző peptidkötések síkjai viszont egymáshoz képest elfordulhatnak, létrehozva különböző térbeli konformációkat. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK    Az elfordulás csak az αC-N között (forgásszög: Φ) illetve az αC-C között (forgásszög: Ψ) lehetséges. Pozitív értékeket kapnak a forgásszögek, ha az αC-atom irányából tekintve az elfordulás iránya megegyezik az óramutató járásával. Ellenkező esetben a forgásszög értéke negatív. A forgásszögeket az oldalláncok kölcsönhatásai is befolyásolják.  A peptidek elnevezése    A peptidek aminosavakból álló oligo- vagy polimerek, amelyekben az aminosavakat savamid kötések (peptidkötések) kapcsolják össze. Peptideknek általában a 100-nál kevesebb aminosavból álló

polimereket hívjuk, melyek molekulatömege 10 kDa alatt van. A peptidek elnevezése acilezett aminosavként történik, vagyis a szabad karboxilcsoporttal rendelkező C-terminális aminosav tartja meg eredeti nevét, míg a többi az eredeti triviális névből –il képzővel alkotott előtagként szerepel, legelöl az N-terminális aminosav nevével. Pl: szerinből, glicinből és valinból álló tripeptid  szeril-glicil-valin (Ser-Gly-Val). BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 4. A fehérjék primer és szekunder szerkezete. A szekunder szerkezetet rögzítő kötések. Az α-keratin.  A fehérjék primer szerkezete        A primer szerkezetet az aminosavak kapcsolódási sorrendje és az azok között kialakuló peptidkötések jelentik. A peptidkötésben a C- és N-atomok közötti távolság nem jelez sem tisztán -, sem tisztán -kötéseket,

hanem a két lehetséges távolság közötti átmenetet mutatja. Ez -elektron delokalizáció miatt jön létre. A peptidkötésben a hat atom egy síkban helyezkedik el és az O az H-hez képest, illetve a két α-C-atom egymáshoz képest midig transz-helyzetet foglal el. A C-N kötésben a -delokalizáció miatt rotáció nem lehetséges. Az α-C és a karbonil C-atom között, illetve az α-C és a N között -kötések vannak, tehát a szabad rotáció bekövetkezhet. A rotáció mértékét befolyásolja az oldalláncok szerkezete. A rotáció mértékétől függően a peptidekben stabil és instabil konformációk jöhetnek létre, illetve további szabályosan ismétkődő szerkezetek.  A fehérjék szekunder szerkezete    A szekunder szerkezet a peptidsíkok rotációjától függő konformáció. A szerkezetet a peptidkötés amid N és karbonil O atomjai között kialakuló H-kötések rögzítik (más-más peptidkötések között). A

röntgendiffrakciós vizsgálatok a fehérjékben periodikusan rendezett szerkezetet mutatnak, melynek két fajtája ismert: az α-hélix és a β-lemez, mely szerkezetekben a H-kötések száma maximális. α-hélix  A peptidsíkok az N-αC közötti tengelyen (Φ) valamint az αC-C=O közötti tengelyen (Ψ) olyan szöggel fordulnak el, hogy egy helikális szerkezet alakul ki, amelyeket H-kötések stabilizálnak.  A hélixben egymástól 4 peptidkötés-távolságra lévő amid N-je és a karbonil O-je között alakul ki a H-híd, mely a hélix hossztengelyére majdnem párhuzamos. (Az 1 és 4, 2 és 5, 3 és 6, 4 és 7, stb peptidsíkok között alakul ki a H-kötés.)  Egy csavarmenet 3,6 aminosavrészből áll, és a csavarmenet az óramutató járásával megegyező (jobbmenetes). Egy csavarmenet magassága 0,54 nm (5,4 Å). Kiszámolható, hogy egy aminosavra 0,15 nm-nyi menetmagasság jut  Az aminosavak oldalláncai a hélix külső felszínén „lógnak ki”.

BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK        A hélix lumene nem, üreges, hanem kitöltött a molekulaméretek és a peptidsíkok tekeredésének köszönhető „közelkerülés” miatt. A H-hidaknak köszönhetően az α-hélix szerkezete stabil, de az építő aminosavak oldalláncától függően ez a szerkezet lazulhat, vagy akár meg is szakadhat. Apoláros, kis térfogatú oldalláncok stabilizálják a hélixet (Ala, Val, Leu, Hys, Phe, Met). Poláros, ionos, nagy térfogatú oldalláncok lazítják a hélixet (Tyr, Glu, Lys, Ser, Arg, Cys). Megszakad a hélix olyan helyeken, ahol prolin foglal helyet. Ennek az az oka, hogy a prolin α-N-atomja egy merev gyűrű tagja, így a peptidsík megfelelő forgása az N-αC között nem jöhet létre. Éppen ezért a prolin N-atomja Hkötés kialakítására sem képes Az α-hélix nem feltétlenül jellemző a

polipeptidlánc teljes hosszára. Vannak olyan területek, ahol nem található szabályosan ismétlődő struktúra. Itt a helikális szerkezet megszakad, és szabálytalan formában folytatódik. Ezeket a területeket random coilnak nevezzük. β-redőzött lemez  Akkor alakul ki, ha a peptidsíkok a tengelyek körül egymáshoz képest úgy fordulnak el, hogy egy kinyújtott, ún. „cikk-cakk” szerkezet alakul ki  A peptidkötések úgy kerülhetnek egymáshoz közel, hogy két polipeptidlánc egymás mellett helyezkedik el, vagy egy polipeptidlánc úgy tekeredik fel, hogy annak különböző szakaszai kerülnek egymás közelségébe.  Ha a H-hidak az egymás mellett párhuzamosan elhelyezkedő szakaszok peptidjei között jönnek létre úgy, hogy orientációjuk a szerkezet hossztengelyére merőleges, akkor β-redőzött lemez alakul ki.  A láncok lehetnek paralell vagy antiparalell szerkezetűek attól függően, hogy milyen a lefutásuk iránya.  Paralell

a lemez akkor, ha az egymás mellé kerülő polipeptidlánc-szakaszok N- és C-terminális végeinek iránya megegyezik.  Antiparalell a lemez akkor, ha az egymás mellé kerülő polipeptidláncszakaszok N- és C-terminális végeinek iránya ellentétes.  Az oldalláncok váltakozva a lemez síkja alá és fölé orientálódnak.  A β-redőzött lemez szerkezetet főleg apoláros, kis oldallánccal rendelkező aminosavak alkotják (Gly, Ser, Ala, Val, Met). Cistein nem fordul elő, diszulfid-híd nincsen.  Példa fehérje a fibroin, ami a selyemben található. Itt antiparalell láncok rendeződnek egymás fölé, melyben ismétlődő szekvencia (Ser-Gly-Ala-Gly) található. Szerin és alanin oldalláncai az egyik oldalon, a glicin „oldallánca” a másik oldalon foglal helyet.  Az egymás fölötti lemezek között van der Waals kölcsönhatás lép föl.  A β-redőzött lemez sem folyamatos, itt is találhatunk megszakításokat, például a lemezek

„visszafordulásánál”, melyek szükségesek a legtöbb fehérje globuláris alakjának felvételéhez. Ilyen megszakítás a β-turn, ami az α-hélix szerkezetéhez hasonlít, de nem az, mert a H-híd az 1. és 3, a 2 és 5, 3. és 6, stb peptidsík között jön létre A β-turn második (páros) eleme nagyon gyakran prolin. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  Az α-keratin         Az α-keratin a fibrózus fehérjék csoportjába tartozik, funkcióját tekintve ún. struktúrprotein. Fő komponense a bőrnek és származékainak (haj, szőrzet, köröm, karom, csőr, prém, gyapjú). Szerkezetének alapja 2 olyan jobbmenetes α-hélix, melyekben helyenként nem helikális szakasz is megfigyelhető, de a hosszirányú felépülést ez nem szakítja meg. A két jobbmenetes α-hélix egymásköré tekeredve kialakít egy ún. balmenetes szuperhélixet

(supercoil). A szuperhélixet az α-hélix AS-oldalláncok apoláros csoportjai közötti van der Waals-kötések és diszulfid-hidak tartják össze. (Az α-hélixben sok a cisztein) Két szuperhélix egymással újra összetekeredik, egy ismét jobbmenetes helikális struktúrát kialakítva, amit protofibrillumnak nevezünk. A protofibrillumot is diszulfid-hidak rögzítik. A protofibrillumok nyolcasával egymás mellé rendeződve mikrofibrillumokat alkotnak, melynek keresztmetszete lehet kör vagy négyzet alakú. A protofibrillumok mindkét esetben úgy rendeződnek egymáshoz, hogy a kialakuló mikrofibrillum középpontjában üreg képződik, tehát a mikrofibrillum egy kör vagy négyzet alapú „cső”. Az α-keratinban lévő diszulfidhidak száma meghatározza a fibrózus szálak rigiditását. Kevés S-S kötés esetén jelentős flexibilitás alakul ki (gyapjú, haj), míg sok S-S kötés keményíti a fehérjét és az anyagot (karom, csőr). BIOKÉMIA –

FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 5. A globuláris fehérjék tercier szerkezete. A harmadlagos szerkezet kialakulásának termodinamikai értelmezése, a szerkezetet stabilizáló kötések.  A globuláris fehérjék tercier szerkezete     A szekunder szerkezeti egységeket is tartalmazó polipeptidláncban további kölcsönhatások révén a primer szekvenciákban távol eső aminosavak egymáshoz közel kerülve a polipeptidlánc háromdimenziós, globuláris formát alakíthat ki. A fehérje háromdimenziós, biológiailag aktív konformációját ún. natív komformációnak nevezzük. Ha a polipeptidlánc 200-nál több AS-at tartalmaz, egyetlen láncból különálló „gombolyagok” alakulhatnak ki; ezek a domainek. A domaineket a laánc egy peptidrészlete köti össze. A különböző domainek a fehérjén belül különböző funkcióval bírhatnak. Jó példa erre a

fibronektin, melynek egyik domainje az ECM kollagénjéhez kötődik, más domainje a sejt egy transzmembrán fehérjéjéhez, harmadik része pedig kettős diszulfid-kötéssel kapcsolódik a másik fibronektin molekula hasonló domainjéhez. Így a fibronektin mintegy „kihorgonyozza” a sejtet a kötőszövet ECM-ához.  A harmadlagos szerkezet kialakulásának termodinamikai értelmezése   Az egész story termodinamikai hátterében nettó entrópianövekedés áll. A fehérje térszerkezetének kialakulásával az eredetinél rendezettebb, alacsonyabb entrópiájú szerkezet alakul ki, tehát a fehérje entrópiaváltozása negatív ( S prot  0 ).  Mivel a szervezetben a fehérjék vizes közegben vannak jelen, azok 3Dszerkezetének kialakulásával párhuzamosan a víz rendezetlenebb, magasabb entrópiájú állapotba kerül ( S H 2O  0 ). Ez ellensúlyozza a fehérje entrópianövekedését. A stabilizáló kötések kialakulásával a folyamat

entalpiája is csökken ( H  0 ), mivel a kötések kialakulása exoterm folyamat. A szabadentalpia változás előjelét az szabja meg, hogy a két ellentétes folyamat milyen viszonyban áll egymással: G  H  TS . Az elő szervezetben lévő hőmérsékleti tartományban aránylag mérsékelt, de negatív szabadentalpia változás követi a folyamatot, ami tehát spontán végbe megy.     A harmadlagos szerkezetet stabilizáló kötések BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  Apoláros kölcsönhatások  van der Waals kötések  Hidrogén-hidak  szekunder szerkezetben csak a peptidsíkban van  tercier szerkezetben az oldalláncok között is kialakulhatnak H-kötések  főleg a poláros oldalláncokra jellemző (Ser, Thr, Tyr, Gln, Asn, stb.)  kialakulhat poláros oldallánc és peptidkötés között, illetve két poláros

oldallánc között  Ionos kötés (ionpárok)  negatív és pozitív töltésű oldalláncok között alakulhat ki.  inkább a belső, hidrofób régióra jellemző, mivel a külső, hidrofil burok alkotói a vízzel létesítenek ionos kötéseket  ezek a kölcsönhatások megszűnnek, ha a pH elég magas vagy alacsony ahhoz, hogy a bázikus vagy a savanyú aminosav elveszítse töltését (pH-függő denaturáció)  S-S diszulfidhidak  nem szükségszerű a kialakulása, inkább csak kiegészíti az előbbi hármat  nem minden fehérjében van jelen, inkább azokban, amelyek a sejtből exportra kerülnek  egy enzim, az ún. diszulfid-izomeráz szabályozza, hogy a megfelelő CysCys AS-pár között alakuljon ki a diszulfid-kötés BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 6. Kollagén és elasztin szerkezete. A kollagén bioszintézise  A kollagén szerkezete 

                A kollagén a fibrózus fehérjék közé tartozik, a kötőszövet fő alkotóeleme. A szervezet összes fehérjetartalmának kb. 25%-át teszi ki A csont, porc, inak szalagok, bőr, érfal, üvegtest alkotásában kitüntetett szereppel bír. A kollagének tropokollagén alegységekből épülnek fel, amelyekben három, egyenként 1000 aminosavat tartalmazó lánc található. A három polipeptidlánc egyenkét egy-egy balmenetes hélixet alkot, melyek összetekeredve egy jobbmenetes szuperhélixet alkotnak. A kollagénben a helikális szerkezet nem α-hélix. A hélix egy menete 3 AS-at tartalmaz. A tropokollagén molekula hossza 300 nm, átmérője 1,5 nm. A láncokat alkotó aminosavak összetételétől függően 14 féle kollagénmolekulát lehet megkülönböztetni, de általánosságban jellemző a nagy Gly- (39%) és Pro(25%) tartalom. A fehérjeszintézishez felhasznált 20 aminosavon kívül tartalmaz még

4hidroxiprolint és 5-hidroxilizint is. Ezek nem ilyen aminosavként épülnek be a láncba, hanem a kész fehérjemolekulán utólag hidroxilálódnak. A prolin és a lizin utólagos hidroxilálását egy-egy enzim végzi (prolin hidroxiláz és a lizin hidroxiláz), melynek működéséhez C-vitamin szükséges. Súlyos C-vitamin hiányban kialakuló skorbut-betegségnek azért jellemző tünete a kapillárisvérzés, mert az érfal szerkezete hibás a hibás kollagénszintézis miatt. A hidroxilizin elsősorban szénhidrát oldalláncok kialakításában, a hidroxiprolin a molekula stabilitásában, illetve a hármas hélix kialakításában játszik szerepet. Magas prolin tartalom a molekula rigiditásának fokozódásához vezet. A kollagén ciszteint nem tartalmaz. A kollagénmolekula nagy szakítószilárdsága az ellentétes irányban feltekeredő hélixek alkotta szerkezetnek köszönhető. A kollagénben tipikus AS-szekvencia alakul ki: Gly-X-Y, ahol tehát minden harmadik AS

a Gly. Az X és Y gyakran prolin illetve hidroxiprolin A hidroxilizin OH-csoportjához gyakran (tehát nem minden esetben) galaktózglukoz diszacharid egység kapcsolódik, így a fehérje glikoproteinné válik. A molekula stabilitását fokozza, hogy kovalens keresztkötések alakulnak ki egy tropokollagén molekulán belül, illetve két vagy több tropokollagén molekula között. A keresztkötések létrejöhetnek két Lys között, vagy két hydroxylizin és egy lizin között. Két Lys között is kétféle képen Keresztkötés két lizin között 1.  az egyik lizinből először lizinaldehid (allizin) keletkezik lizin-oxidáz és O 2 jelenlétében  majd az allizin Schiff-bázist képez egy másik lizinnel, ami redukció után kovalens kötést eredményez BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  Keresztkötés két lizin között 2.  először mindkét lizinmolekula

allizinné alakul  majd köztük aldolkötés alakul ki  Keresztkötés két hidroxilizin és egy lizin oldallánca között  hármas keresztkötés jön létre, ami ún. hidroxi-pridin szerkezetet alakít ki  A kollagénben tehát kétféle kötés biztosítja a stabilitást. A három helikális polipeptidlánc között H-hidak alakulnak ki (NH- és O=C között; gyakori a Gly - H - - Pro kötésszerkezet), illetve a lizin-allizin, allizin-allizin kovalens kötések. A tropokollagén egységek egymá mellett kb. ¼-rész eltolással nagyobb szerkezeteket, ún. mikrofibrillumokat alkotnak A tropokollagén egységek egymás mellett illetve egymás után kapcsolódnak, de egy sorban elhelyezkedő tropokollagének között kb. 40 nm méretű „hiány” keletkezik. Csontszövetben azt a hiányt tölti ki a szervetlen állomány, a hidroxilapatit. Jellemző EM-os felvételeken a kollagénben mutatkozó harántcsíkolat, ami annak köszönhető, hogy ha keresztben rajzolunk

„résszélességnyi” (40 nm) sávokat, akkor felváltva alakulnak ki olyan sávok, amelyek teljesen telítettek protokollagénnel, illetve olyanok, amelyekben található a hosszanti elrendeződésben keletkező rés.     Az elasztin szerkezete          Az elasztin a kötőszövet elasztikus fehérjéje. Ms: 64000 – 66000 Da A kollagénhez hasonlóan rendkívül gazdag Gly-ben és Pro-ban, ezenkívül nagymennyiségű Ala fordul elő, de a kollagénhez képest kevés a hidroxiprolin és nincsen hidroxilizin. Az elasztin rostok tropoelasztin polipeptidből épülnek föl, melyben helikális struktúra található. A tropoelasztinban található hélix sem az α-hélixre, sem a kollagén-hélixre nem hasonlít. Gyakran fordulnak elő a polipeptidláncban Val-Pro-Gly-Val szekvenciák, melyek β-fordulatok kialakítását teszik lehetővé. A helikális szakaszokat (β-spirál) Lys-ben és Ala-ban gazdag nem helikális szekvenciák (random

coil) kapcsolják össze. Az elasztinban is találhatók keresztkötések, melyek más szerkezetűek, mint a kollagénben, de ezekben is a lizinek játszanak fontos szerepet. Az elasztin rendkívüli flexibilitását a keresztkötések jellegének és a tropoelasztin helikális szerkezetének köszönheti. Ez a flexibilitás biztosítja az erek falának rugalmasságát, a ligamentumok nyújthatóságát. Az elasztinban kétféle keresztkötéssel találkozhatunk. Az egyik, a már kollagénből ismert lizin-allizin illetve allizin-allizin kötés, a másik a dezmozin-keresztkötés, amit három allizin és egy lizin alkot úgy, hogy maguk közé zárva kialakítanak egy pridin gyűrűt. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  A kollagén bioszintézise             A kollagének a fibroblasztokban szintetizálódnak, de prekurzor formában, mint

prokollagének. A prokollagének annyiban különböznek a tropokollagénektől, hogy azoknál hosszabbak, mind az N-, mind a C-terminális végükön találhatók ún. extenziós peptidek. Az extenziós peptidek között a C-terminális végen S-S hidak alakulhatnak ki, hiszen abban is eltérnek a tropokollagénektől, hogy kevés bennük a Gly és a Pro, ugyanakkor található bennük Cys. Az extensióz peptideknek köszönhető, hogy a tropokollagének nem alakítanak ki intracellulárisan rosszul oldódó aggregátumokat, és hogy a fibroblasztokból kijuthatnak az ECM-ba. A kollagének szintézise is, mint minden fehérjéé a szabad riboszómákon kezdődik. Az itt képződő rövid szakasz N-terminális végén egy olyan szignálszekvencia van, amit az SFR felismer és megköt. A megkötött peptidszakaszt, mRNS-t, és riboszómát az SFR az endoplazmás retikulumhoz szállítja, és annak felszínén folytatódik a szintézis. A dER-en képződött α-lánc ún.

pre-prokollagén, mert még propeptid és szignálpeptid kapcsolódik hozzá. Az α-lánc belép a dER lumenébe, ahol a szignálpeptid levágódik, majd a kiválasztott helyzetű prolin és lizin AS-kat a hidroxilázok hidroxilálják (Cvitamin!). A hidroxilált α-lánc vezikuláris úton a Golgiba jutnak, ahol a hidroxilizin molekulák glikozilálódnak (galaktóz-glukoz diszacharid egység). A három α-lánc még a Golgiban kialakítja a szuperhélixet. A TGN-ről leváló vezikulumokkal a prokollagén molekulák a sejtmembrán alá szállítódnak, ahonnan exocitózissal ürülnek az extracelluláris térbe. A sejtfelszín proteolítikus enzimjei, a peptidázok lehasítják az extenziós propeptideket, így kialakul a tropokollagén. A tropokollagének extracellulárisan polimerizálódnak kollagénné a sejtmembrán invaginációiban. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 7. A

fehérjék primer szerkezetének analízise  A fehérjék primer szerkezetének analízise  A peptidek és fehérjék primer szerkezetén azok aminosav-sorrendjét értjük. Az elsődleges szerkezet különleges fontosságú, mert tulajdonképpen minden információt tartalmaz, amely a peptid vagy fehérje natív szerkezetének kialakulásához szükséges.  A peptidek szerkezetvizsgálata a peptid izolálásával és tisztításával indul. Erre többféle megoldás is adott, pl. gélelektroforézis, oszlop-kromatográfia, immun-blot Az izolált peptidekben a diszulfidhidakat a primer szerkezet vizsgálata előtt célszerű eltűntetni. Ezt erélyes oxidációval lehet elérni (pl perhangyasavval) Ha a peptid nagyobb, célszerű kisebb darabokra hasítani, amit célszerű specifikus endopeptidázokkal végezni, amikor is a kapott darab C-terminális aminosava ismert. Nagyobb peptideknél, fehérjéknél a végső szekvencia összerakása érdekében legalább két, de

inkább több különböző helyen hasító módszert kell kombinálni, mert a végső sorrend csak az így kapott mozaikok összerakásával állapítható meg.     Mindkét terminálist meg lehet határozni exopeptidáz enzimekkel is. Ezek az Nterminális (aminopeptidázok) vagy a C-terminális (karboxipeptidázok) felől sorban hasítják le az aminosavakat, ezért a hidrolizátumban legelőször megjelenő aminosav a terminális helyzetű.  Az Edman-reakcióban olyan reagenst (PITC; fenil-izotiocianát) használunk, amely specifikusan az N-terminális aminosavhoz kötődik, és (PTC)-peptid képződik. Ezután az N-terminális aminosav leválasztható a peptidről, amikor is egy (PTC)AS N-term és 1 AS-val rövidebb peptid keletkezik, melynek ekkor az eredetileg 2. aminosavja lesz az N-terminális. Ezután a reakció ismételhető. A különböző PTC-aminosav származékok kromatográfiával azonosíthatók. A módszer előnye, hogy a szekvenálás

automatizálható, mert az N-terminális felől az aminosavak sorban alakíthatók át származékká, a műveletek sorrendje és ideje programozható. Az erre a célra szerkesztett szekvenátorok ma már rutinszerűen végzik a peptidek aminosav-sorrend analízisét.    A szekvencia meghatározásának legkorszerűbb módszere a nukleinsav-sorrendből visszafelé történő meghatározás. Mivel ma már a nukleinsavak sorrendjének meghatározása nem jelent különösebb technikai problémát, a fehérje szekvenciájáért felelős mRNS-nek megfelelő DNS-szakaszt kell szekvenálni és a nukleotidsorrendből a genetikai kód segítségével a fehérje aminosav-sorrendje könnyen meghatározhtaó. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 8. 3. fejezet A globuláris proteinek általános jellemzése  A globuláris proteinek csoportja     A fehérjéket egy bizonyos

csoportosítás szerint három fő csoportba oszthatjuk. Ezek a fibrózus fehérjék, a gobuláris fehérjék és egy harmadik, a kettő közötti átmenetet képező csoport. A fibrózus fehérjék hosszúkás alakúak, méretük jellemző paraméter az A/B>10 hányados, ami a hossz és a keresztmetszeti átmérő arányát fejezi ki. A fibrózus fehérjék vízben, sóoldatban oldhatatlanok. Jellemző a fibrózus szerkezet a kollagénre, elsztinra, általában a struktúrproteinekre. A globuláris fehérjék gömbhöz hasonló szerkezetet vesznek fel, az A/B<10 hányados a jellemző. Vízbe, sóoldatban jól oldódnak Jellemző szerkezet a funkcionális fehérjékre (globulinok, albumin, mioglobin, hemoglobin, antitestek, stb.) Az ármeneti csoportba olyan proteinek tartoznak, amelyek morfológiailag a fibrózus proteinekhez hasonlítanak, ugyanakkor vízben, sóóoldatban jól oldódnak. Ilyen pl. a miozin, fibrinogén  A globuláris proteinek szerkezete    

     A globuláris proteinek szerkezete chierarchikus felépítésű. A primer szerkezet a kapcsolódó AS-sorrendet jelenti, a szekunder szerkezet tartalmazhat α-hélixet, βlemezt, rendezetlen szerkezetet. A gömb alak annak köszönhető, hogy a polipeptidlánc több helyen ívalakú hurkot, visszahajlást hoz létre. A β-görbület gyakori szerkezeti elem, főleg a „gömb” felszínén. A β-görbület hurkát az 1. AS C=O és a 4 AS N-H csoportjai között H-kötés rögzíti A görbületben a 2. AS gyakran prolin A másodlagos szerkezeti elemek kombinálódásával kialakulhatnak ún. szuperszekunder szerkezeti egységek, mint pl. a β-α-β egység, illetve a βkanyarulat egység Egyes szekunder szerkezeti típusok adott fehérjékben hiányozhatnak is. Ilyen pl a mioglobin és hemoglobin, ahol csak α-hélixek vannak, melyeket random coil szakaszok kötnek egymáshoz. A fehérje háromdimenziós gömb alakja a tercier szerkezet révén alakul ki. A

harmadlagos szerkezetben nyeri el a globuláris fehérje a biológiailag aktív, ún. natív szerkezetét. A szekvenciában távol álló AS-ak térben egymás közelébe kerülhetnek. Ha a polipeptidlánc 200 AS-nál többet tartalmaz, egyetlen láncból különálló „gombolyagok”, ún. domainek alakulnak ki, melyeket a lánc egy peptidszakasza köt össze. A harmadlagos szerkezet kialakulása termodinamikailag nettó szabadentalpia csökkenéssel magyarázható. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  Globuláris fehérjék vizes oldatban     A globuláris fehérje „gömbjét” vizsgálva kiderül, hogy a polipeptidlánc N- és Cterminális végei a periféria felé mutatnak, s itt helyezkedik el a töltéssel rendelkező, illetve poláros oldalláncok többsége is. A gömb belsejében „apoláros mag” helyezkedik el, ahová a fehérje mintegy „eldugja” a víz

elöl az apoláros (hidrofób) oldalláncait. Ha az elsődleges szerkezetből adódóan az apoláros magban poláros, netán ionos oldalláncok vannak, akkor azok belekényszerülnek a szerkezetbe. Ugyanígy a periférián elhelyezkedő esetleges apoláros oldalláncok. A periférián elhelyezkedő poláros oldalláncokat a vízmolekulák megfelelő orientációja hidrátburokkal veszi körül. Ez szükséges a fehérje oldatban tartásához.  Globuláris fehérjék ionos karaktere    A fehérje ionos karakterét a + és – töltések aránya határozza meg, mert a nettó töltés delokalizálódik. A + és – töltések aránya pH-függő. Savas közegben a + töltés, bázikus közegben a – töltés jellemző. Az a pH-érték, ahol a fehérje nettó töltése nulla, az izoelektromos pont. Ezen a ponton a fehérje oldat labilissá válik, a fehérje oldékonysága minimum értékre esik. (Az izoelektromos pontban a hidrátburok „megbolondul”.)  A globuláris

szerkezetet stabilizáló kötések  A tercier struktúrát van der Waals kölcsönhatások, H-hidak, ionos kötések és esetlegesen előforduló diszulfidhidak stabilizálják. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 9. 4. fejezet Fehérjék denaturációja  A natív állapot   Az elsődleges, másodlagos, harmadlagos, egyes esetekben negyedleges szerkezet egy adott proteinben elengedhetetlen a biológiai funkció ellátásához. Azt a szerkezetet, amelyben a fehérje a biológiai funkcióját betölteni képes, natív állapotnak nevezzük.  Denaturáció    A denaturáció olyan az a folyamat, ami kapcsán a fehérje elveszíti a natív állapotára jellemző szerkezetét, így a biológiai funkcióját is. A denaturáció szabadentalpianövekedéssel jár, a ΔG = 12  5 kcal/mol. Ha a denaturációs folyamat szabadentalpia-értékeit koordinátarendszerben

ábrázoljuk, akkor kitűnik, hogy a folyamat első felében, „útban” a natív és denaturált állapot között a szabadentalpia nagyobb értéket vesz föl, mint a denaturált állapotra jellemző érték. A denaturáció általában a fehérje oldékonyságának csökkenését is eredményezi, lásd kicsapás.  Denaturáló tényezők  Jelentős pH-változás  Mivel a fehérjék oldalláncainak töltése pH-függő, így annak jelentős változása esetén az ionpárok megszűnhetnek, a stabilizáló ionos kötések felszakadnak, ezenkívül a védő hidrátburok is fellazul, megszűnik.  A töltésváltozás a H-hidak felbomlását is előidézheti.  Hőmérséklet emelkedése  A hőmozgásban (vibrációs és rotációs mozgások) tárolt kinetikai energia felülkerekedik a stabilizáló másodlagos kötések kötési energiáján, így azok felszakadnak.  Denaturáló vegyületek  Urea, Guanidin  H-híd kötéseket alakítanak ki a meglévők

felbontásával, így a másodlagos és a harmadlagos szerkezet felbomlik.  Na-dodecyl sulphat (SDS)  Detergens vegyület.  A molekula hosszú, apoláros része a fehérje apoláros oldalláncaival (víztől eldugott apoláros mag) apoláros kölcsönhatást alakít ki, így az „kitekeredik”. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  Reverzibilis, irreverzibilis denaturáció    Ha a denaturációt okozó hatások megszüntetésével a fehérje natív állapota spontán helyreáll, vagy megfelelő módszerekkel helyreállítható, akkor a denaturáció reverzibilis. Ilyen denaturáció következik be a könnyűfémek sóinak (pl (NH 4 ) 2 OH, NaCl, MgCl 2 ) vagy szerves oldószerek (etanol, aceton, kloroform, széntetraklorid, stb.) hatására A natív komformáció külső beavatkozással történő visszaállítását renaturációnak nevezzük. Ha a natív állapot

nem áll spontán vissza és külső beavatkozással sem állítható vissza, akkor a denaturáció irreverzibilis. Ilyen danaturáció következik be egyes szerves savak (triklórecetsav, szulfoszalicilsav) vagy nehézfémek (Pb, Hg) hatására. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 10. A fehérjék natív szerkezete kialakulásának sorrendje  A fehérjék natív szerkezete kialakulásának sorrendje 1. Primer szerkezet kialakulása  Az AS-szekvencia meghatározza a natív állapot konformációját.  Nem minden AS jelentősége egyforma, amire bizonyíték az, hogy azonos funkciójót ellátó, különböző fajokból izolált fehérjékben azonos vagy nagyon hasonló a konformáció, de a primer szerkezetben akár 50%-os vagy annál nagyobb eltérés is lehetséges.  Vannak kitüntetett AS-ak, amelyek azonosak (még a szekvencián belüli helyzetük is) a különböző

szekvenciákban. Ezek alapvető fontosságúak a végleges konformáció kialakításában. 2. Szekunder szerkezet kialakulása  α-hélixek  β-lemez  β-turn  random coil  szuperszekunder egységek 3. Tercier szerkezet kialakulása  szerkezetstabilizáló kölcsönhatások és kötések  van der Waals  H-hidak  ionpárok 4. Diszulfid hidak  csak a fehérjék egy részére jellemző  Cys-t feltételez BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 11. Ribonukleáz denaturálása és renaturálása  Ribonukleáz denaturálása és renaturálása            Anfisentől származó kísérleti bizonyíték az elsődleges szerkezet és a natív konformáció kialakulása közötti összefüggésre. A ribonukleázban négy darab S-S diszulfid híd van, melyek merkaptoetanol (HO-CH 2 -CH 2 -SH) és urea jelenlétében

redukálódnak (H-t vesznek fel és az egy S – S kötés helyett két S – H kötés alakul ki) a merkaptoetanol hatására. A H-hidak az urea hatására felbomlanak. Ezen folyamatok hatására a fehérje kitekeredik és elveszíti enzimaktivitását. Ha egyszerre eltávolítjuk a közegből a merkaptoetanolt és az ureát is, akkor az oldott oxigén hatására a ribonukleáz lassan reoxidálódik és visszanyeri natív konformációját. Ha viszont a denaturált fehérje mellől először csak a ME-t távolítjuk el, az urea jelenlétében kialakulhatnak S – S kötések, de rossz helyen és ebben az esetben csak 1%-ban tapasztalható enzimaktivitás. Ez azért van így, mert ha egy fehérjében 4 S-S kötés alakulhat ki (tehát 8 darab Cys van a primer szerkezetben) akkor a különböző variációs lehetőségek 105 egyenlő valószínűségű kombinációt eredményeznek, ami azt jelenti, hogy a korrekt natív struktúra véletlenszerű kialakulásának kb. 1% a

valószínűsége (A S – S hidak random alakulnak ki.) Az urea eltávolítása után a H-hidak újra kialakulhatnak a fehérje elsődleges szerkezetének megfelelően, ha nyomnyi mennyiségű ME jelenlétében a „rossz” S – S hidak redukálódnak. Majd a nyomnyi ME eltávolítása és további reoxidáció során a ribonukleáz felveheti újra a natív konformációját. Ha a S-S kötések kialakulása teljesen gátolt, mert a Cys-ket erélyes oxidációval ciszteinsavvá alakítottuk (egy S-S kötés átalakul kettő SO 3 H kötéssé), akkor a denaturáció irreverzibilis Konklúzióként megállapíthatjuk, hogy először a natív konformációt is befolyásoló primer szerkezet, majd a szekunder, tercier szerkezet és az azt rögzítő H-kötések alakulnak ki, legvégül a megfelelő S-S kötések. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK

12. A mioglobin szerkezete és funkciója. A hem prosztetikus csoport a mioglobinban. CO és O 2 kötés.  A mioglobin szerkezete        A mioglobin egyetlen polipeptidláncból (153 AS) és a hozzá kapcsolódó hemből álló globuláris protein, melynek molekulatömege 17.800 Da A lánc kb. 75%-a α-hélix, közöttük random coil-ok A hélixeket az N-terminális végtől a C-terminális végig ABC-sorrendben számozzuk, A-tól H-ig. Az egyes hélixeket alkotó AS-akat számozzuk (A 1 , A 2 , , A n az „A”- hélixben). A fehérje centrumában apoláros oldalláncok vannak, kivéve két His-t (F 8 és E 7 ). Az ionos és poláros oldalláncok a felszín felé orientálódnak, de itt is megtalálhatók apoláros oldalláncok is. A protein centrumában elhelyezkedő két His közül az F 8 -at proximális hisztidinnek, míg az E 7 -et disztális hisztidinnek nevezzük.

 A mioglobin funkciója   A mioglobin a váz- és szívizom oxigéntároló fehérjéje. Akkor „lép működésbe”, ha a hemoglobin oxigéntranszportja által az izom rendelkezésére álló oxigén kevés az aktuális igénybevételhez. (Lásd: 12 tétel)  A hem prosztetikus csoport a mioglobinban         A hem (Fe-protoporfirin IX) tulajdonképpen nem más, mint egy Fe2+-ion (3d6) és négy darab pirrolgyűrű által alkotott kelátkomplex. A vas a hemben a tertapirrol gyűrűrendszer közepén mind a négy nitrogénhez kötődik, ezenkívül két további koordinatív kötésre képes a hem síkjának két oldalán. Az egyik kötéssel a globinhoz kapcsolódik, a proximális Hys révén, a másik az O 2 -kötőhely. A hem apoláros oldalláncai (metil, vinil) a mioglobin apoláros magján apoláros kölcsönhatást létesítenek. A két propionát oldallánc (COO-) a molekula felszíne felé orientált. A disztális Hys kívül van a

koordinációs szférán. A dezoxi-Mb-ban a vas 0,3-0,4 Å magasságig kiemelkedik proximális Hys felé a tetrapirrol síkjából. Az oxigén ugyan a vas hatodik koordinációs kötőhelyéhez kapcsolódik, de az oxiMb-ban a vas nem oxidálódik! BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  CO és O 2 kötés       Ebben a folyamatban van nagyon fontos szerepe a disztális Hys –nek (E 7 ). CO affinitása a hem vasionjához nagyobb, mint az oxigéné, azzal stabilabb komplexet képez. Ha nem lenne a disztális Hys, akkor a vasionhoz a CO úgy tudnak kötődni a hatodik ligandumként, hogy a C  O kötéstengelye a pirrolgyűrűk síkjával 90o-os szöget zárna be, ami a kb. 25000-szer stabilabb komplexet jelentene, mint az oxigénnel alkotott kelát. Ez gyakorlatilag menthetetlen mérgezést jelentene Mivel a disztális Hys „oldallánca” közel van a vas

oxigénkötőhelyéhez, így a C  O kötéstengelye a pirrol-gyűrűrendszer síkjával mintegy 120o-ot zár be, ami a COhem komplex stabilitását század részére csökkenti, így kb 250-szer stabilabb komplex, mint az O 2 -hem. Ez az állapot tiszta O 2 -lélegeztetéssel bizonyos mértékig rendezhető. Az oxigén mindig molekula (O 2 ) formájában kötődik. Az oxigénkötés képessége a vas oxidáltsági állapotától függ. O 2 -kötésre csak a ferro-hem [Fe(II)] alkalmas. A ferro oxidált formája, a ferri-hem [Fe(III)  methemoglobin] nem. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 13. A mioglobin O 2 -telítése  A mioglobin O 2 -telítése   A mioglobinban a hem-komplex hatodik ligantuma a molekuláris O 2 . Mivel az izomban mindig található oxigént kötött és nem kötött mioglobin is, a disszociáció miatt, így felírható a disszociációs egyensúly az M

 O2  MO reakcióegyenletre. [ M ][O2 ] (1) [ MO2 ] Mivel vizes oldatban (és a szövetek is annak tekinthetők) az O 2 -koncentráció az pO 2 lineáris függvénye, ezért a K D -érték jelentéktelen változása mellett az [O 2 ] a pO 2 -vel helyettesíthető, ami azért is ésszerű, mert sokkal könnyebben mérhető. [ M ]  pO2 K D  (2) [ MO2 ] Könnyen belátható, hogy a teljes mioglobinmennyiség az az oxi-Mb és a dezoxiMb összege. Így ha az oxi-Mb mennyiséget elosztjuk a teljes mioglobinmennyiséggel, akkor megkapjuk a százalékos O 2 telítési értéket (T). [ MO2 ] T (3) [ MO2 ]  [ M ] A (3) egyenletből leolvasható, hogy ha [MO 2 ] = [M], akkor T = 0,5. Ebben az esetben a (2) egyenletből látható, hogy K’ D = pO 2 (= p 50 ). Ha K’ D = pO 2 , akkor a pO 2 az az érték, amely mellett a mioglobin félig telített O 2 vel. A (2) egyenletből kifejezzük az oxi-Mb koncentációt: [ M ]  pO2 [ MO2 ]  (4) K D Ha ezt az

oxi-Hb-koncentráció alakot behelyettesítjük a (3) egyenletbe: [ M ]  pO2 K D (5) T [ M ]  pO2  [M ] K D Ha az (5) egyenletben a szükséges egyszerűsítéseket elvégezzük: pO2 (6) T pO2  K D x A (6) egyenleten látható, hogy ez beilleszthető az y  egyenletbe, ami a xk hyperbola egyenlete. Ez bizonyítéka annak, hogy a mioglobin O 2 telítettsége a pO 2 hyperbolikus függvénye. KD           BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 14. A fehérjék negyedleges szerkezete, kötések. A hemoglobin szerkezete és funkciója. Sarlósejtes anaemia, (HbS) molekulaszerkezeti sajátságai.  A fehérjék negyedleges (kvaterner) szerkezete     Akkor beszélünk negyedleges szerkezetről, ha különálló polipeptidlánc „gomolyagok” mint monomerek (alegységek) kapcsolódnak egymáshoz oligomereket alkotva.

Az oligomerek a kapcsolódó monomerek számától függően lehetnek dimerek, tetramerek, stb.; általában páros számú monomerek kapcsolódnak Ha azonos monomerek kapcsolódnak, akkor homooligomerről, ha különbözőek, akkor heterooligomerről beszélünk. A negyedleges szerkezet főként sejten belüli funkcionális fehérjékre jellemző, amelyek biológiai folyamatok szabályozását is végzik.  A negyedleges szerkezetet stabilizáló kötések   A monomereket különböző kovalens és nem kovalens kötések kapcsolhatják egymáshoz. Ilyen lehet pl. apoláros kölcsönhatás (London), H-híd, ionpárok, S-S diszulfidhidak (ritkábban fordul elő).  A hemoglobin szerkezete          A humán hemoglobinok között megkülönböztetünk felnőtt (HbA) és embrionális (HbF) hemoglobint. A HbA 2 α- és 2 β-alegységből álló tetramer, melynek molekulatömege 64.500 Da. Az α-alegységek 141 AS-ból állnak, melyek 7 α-hélixbe

rendeződnek. A β-alegységek 146 AS-ból állnak, melyek 8 α-hélixbe rendeződnek. Az α- és β-alegységekben 25 AS- azonos, azonos helyen. Ezen monomerek tercier strukturája is nagyon hasonló, de annyi eltérésről tudni kell, hogy az α-alegység Cterminális AS-a Arg, míg a β-monomer C-terminális AS-a His. A negyedleges szerkezetben két α- és két β-alegység (melyek egyenként is globulárisak) alkot egy kb. gömb alakú tetramert tetraéderes elrendeződésben (6,5 nm × 5,5 nm × 5 nm). Az alegységek között apoláros kölcsönhatások, H-hidak, ionpárok stabilizálnak, kovalens kötés nem található. A kovalens kötés hiányának köszönhetően a konformáció flexibilis. A hemoglobinban valamennyi alegység tartalmaz hem prosztetikus csoportot, így egy Hb molekula 4 O 2 -ligandot tud megkötni. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  A hemoglobin funkciója

   A Hb a vvt-ben az O 2 -transzportot ellátó globuláris protein. A vvt-ben igen nagy számban van jelen (3×108 db / vvt.) A köztudattal ellentétben a Hb a CO 2 -transzportban nem vesz részt, pontosabban csak igen jelentéktelen mennyiségben.  A sarlósejtes anaemia, a HbS molekulaszerkezeti sajátságai        A betegséget 1904-ben Chicagoban fedezték fel, amikor egy színes bőrű diák vérében sarló alakú vvt-eket találtak egy vérvétel alkalmával. 1949-ben Linus Pauling felfedezése (HbS) adta meg a magyarázatot az elváltozásra. A HbS egyetlen AS-ban tér el a HbA-tól: a β-lánc 6. AS-a Glu helyett Val Ez a körülmény a HbS fizikai-kémiai tulajdonságainak megváltozását okozza, hiszen a Glu kifejezetten ionos karakterű, míg a mutáció folytán beépült Val apoláros. A megváltozott tulajdonságok következménye, hogy a dezoxi-HbS oldékonysága csökken, és a sejten belül aggregálódik, ami hosszú helikális

Hb-polimerek képződéséhez vezet. Az ilyen módosult Hb-polimerek 14 szálból álló hélixet alkotnak. A helikális aggregátum megnyújtja a sejtalakot, megváltoztatja a vvt. ozmotikus rezisztenciáját, és kialakul a sarlósejtes anaemia. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 15. A hemoglobin O 2 -telítése. Kooperativitás, allosztéria, a 2,3-bifoszfoglicerát szerepe. Foetalis hemoglobin (HbF).  A hemoglobin O 2 -telítése. Kooperativitás, allosztéria              A hemoglobin mind a négy láncához (2α2β), azok perifériáján kapcsolódik egy-egy hem prosztetikus csoport, tehát a Hb 4 O 2 megkötésére képes. Az első O 2 ligand hemhez kötése megkönnyíti a második, ez utóbbi a harmadik, ez pedig a negyedik ligand kötődését. Ezt a jelenséget kooperativitásnak nevezzük K D1 >K D2 >K D3 >K D4 . K D1 /K D4

= ~300 A kooperativitásra utal, hogy a Hb telítési görbéje nem hyperbolikus függvény forma, hanem szigmoid. A Hb oxigénkötése megváltoztatja annak negyedleges szerkezetét. Oxigén hatására a Fe2+ és a porfiringyűrű térbeli viszonya módosul, az oxigén nélkül a gyűrű síkjából 0,06 nm-t kiemelkedő Fe2+ oxigént kötve a gyűrű síkjában helyezkedik el. Az oxigén mintegy behúzz a gyűrűbe a hem-vasat. Mivel a vas kovalensen kapcsolódik a gyűrűhüz, ezért az oxilálása megváltoztatja a láncok kapcsolatát is. A láncok egymáshoz képest elmozdulnak Az oxigenálás hatására megváltoznak az α- és β-láncok közötti H-kötések és apoláros kölcsönhatások, valamint felszakad a deoxi-Hb-t stabilizáló 8 ionpár. A fentiekből kitűnik, hogy a dezoxi-Hb szerkezete feszesebb, amit „Tkonformáció”-nak („Tense”) nevezünk, míg az oxi-Hb szerkezete lazább, amit „Rkonformáció”-nak („Relax”) nevezünk. A T-konformációt 8 ionos

keresztkötés merevíti 8 ionpár között: a C-terminális karboxilcsoportok és az N-terminális aminocsoportok között (α 1 -α 2 között egy-egy a két végen), a C-terminális karboxilcsoportok és az α-láncban adott pozícióban található Lys között (β 2 -α 1 valamint β 1 -α 2 között egy-egy), végül Asp-Hys között (a β 1 és a β 2 láncon belül egy-egy) és Asp-Arg között (α 1 -α 2 és α 2 -α 1 között egyegy). Az ilyen ionos kötések kialakulása akadályozza az oxigénkötést, a Tkonformációban a szubsztráthoz (O 2 ) való affinitása kisebb a Hb-nak. Mivel a negyedlages szerkezetben kialakuló alegységek közötti kölcsönhatás nem a ligandkötő helyeket érintik (a jelenség: allosztéria), ezért a Hb allosztérikus protein. Allosztérikus effektornak nevezzük azokat a nem fehérje szerkezetű molekulákat. amelyek a fehérjéhez kapcsolódva befolyásolják annak működését (aktivitását). Az allosztérikus effektor hatása lehet

fokozás (aktivátor) vagy gátlás (inhibitor), de nem lehet ki- vagy bekapcsolás. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  A 2,3-biszfoszforglicerát (2,3-BPG) szerepe          A 2,3-BPG a vvt-ekben igen nagy mennyiségben termelődik. A 2,3-BPG a dezoxi-Hb-hoz kötődik. A kötődik ekvimoláris, 1 tetramer Hbmolekula egy molekula 2,3-BPG-t köt A Hb 2,3-BPG kötőhelyét a β-láncok négy His illetve 2 Lys AS-a alakítja ki. A 2,3-BPG-nek fiziológiás körülmények között öt negatív töltése van. A pozitív töltésű AS-oldalláncok és a negatív töltésű 2,3-BPG közötti kölcsönhatások olyan kötődést hoznak létre, melyek stabilizálják a dexoxi-Hb negyedleges szerkezetét. A 2,3-BPG az oxi-Hb-hoz nem kötődik, mert az oxigenálódás hatására a láncok elmozdulása miatt a 2,3-BPG kötőhely megváltozik, és „szűk” lesz a

számára. Megváltozik a kötőhelyeket kialakító aminosavak közti távolság is, így a Hb O 2 -t és 2,3 BPG-t nem köthet egyszerre. Ha a vvt. nem tartalmaz 2,3-BPG-t, a Hb telítési görbéje hasonló lesz a Mb görbéjéhez. A tárolt vér 2,3-BPG-tartalma folyamatosan csökken, ezért oxigén-affinitása nő. Ez kedvezőtlen transzfúziók esetén, amikor a vérpótlás egyik legfontosabb célja az oxigénszállító kapacitás biztosítása. Ezért a tárolt vérhez inozint adnak, amelyből a vvt-ekbe bejutva 2,3-BPG képződik a glikolízis során. Végül is a 2,3-BPG egy allosztérikus effektor.  A foetalis hemoglobin (HbF)     A HbF két α- és 2 γ-láncból áll. Kevésbé köti a 2,3-BPG-t, mint a HbA, így oxigénaffinitása nagyobb. Ez a körülmény elősegíti az O 2 bejutását az anyai keringésből a magzati keringésbe. A magzati vvt-ekben lévő dezoxi-HbF az anyai vvt-ekben lévő oxi-HbA-tól kapja az oxigént a placentáris keringésben.

A HbF telítési görbéje szintén szigmoid, de meredeksége a Mb hyperbolája és a HbA szigmoid-görbéje közé esik. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 16. A hemoglobin O 2 -telítése a pH függvényében (Bohr-effektus)  A Bohr-effektus      A Hb protonokat és CO 2 -ot is köt, illetve szállít. Megfigyelés szerint a pH csökkenésével a Hb oxigénaffinitása csökken: pH 7,6 valamint a szövetekben szokásos pO 2 mellett a Hb az O 2 80%-át visszatartja, míg pH 6,8 mellett ugyanez a retenció csak 45%. A metabolizmus során a Hb által leadott O 2 mintegy 80%-ából CO 2 lesz, és ennek kb. 15%-a Hb-hoz kötődik Intenzívebb metabolizmus esetén több CO 2 termelődik és az O 2 szükséglet is nő. Fokozott izomműködésben a laktáttermelés is megemelkedik, minek hatására a vér pH-ja csökken, a Hb telítési görbéje jobbra tolódik. Ez a

Bohr-effektus.     Itt lép be a Mb szerepe az izmokban, mert ha az izom oxigénellátását a Hb már nem tudja biztosítani a helyi laktátfelhalmozódás okozta pH-csökkenés miatt, akkor a Mb disszociálja le az oxigént, aminek az oxigénaffinitása egyébként jóval nagyobb, mint a Hb-é. A Mb sem protont, sem CO 2 -t nem tud kötni. A képződött CO 2 , ill. a protonok egy részét a Hb úgy köti meg, hogy a β-lánc Nterminális aminocsoportjával karbamátot (-OOC-HN-R) képez A tüdő alveolusaiban a Hb leadja a CO 2 -t és a protonokat, és O 2 -t köt meg, mivel a vérnél jóval magasabb a pO 2 . Megjegyzendő, hogy a CO 2 -transzport fő útvonala a vérben a bikarbonáttranszport, nem pedig a CO 2 -Hb. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 17. Az enzimek általános tulajdonságai. Reakciósebesség és mérése, enzimaktivitás egységek. Az enzim hatása a

reakció egyensúlyára és az aktivációs energiára. A hőmérséklet és a pH hatása az enzimaktivitásra.  Az enzimek általános tulajdonságai          Az enzimek definíció szerint olyan katalizátorok, melyek a szervezetben lejátszódó egyes biokémiai reakciók sebességét 106 – 1012 ×-es mértékben növelik a nem katalizált reakciókhoz képest. Közös tulajdonsága az enzimeknek, hogy fehérjék (az elmúlt években néhány RNSről is bebizonyították), melyek aktív centrummal rendelkeznek. Az aktív centrum az enzimmolekulának az a része, melyhez kötődve a szubsztrát poduktummá alakul. Molekulatömegük 1,5×104 – 106 Da. Mivel fehérjék, ezek is denaturálhatók Szerkezetükre jellemző, hogy egy vagy több polipeptidláncból állnak. Elmondható az enzimekről, hogy specificitás jellemzi a működésüket, mely a szubsztrátok közötti „válogatásban” nyilvánul meg. Abszolút specificitásról beszélünk,

ha az enzimnek egyetlen szubsztrátja van. Szintén közös tulajdonságként elmondható, hogy számos enzim aktivitása szabályozható. Fontos részlet az enzim-katalizált reakciókra, hogy az enzimek a kémiai reakciót mindkét irányban képesek katalizálni. Egy bizonyos élőlényben előforduló, azonos szubsztrát(ok) azonos reakcióját katalizáló, ám elsődleges szerkezetükben különböző enzimeket izoenzimeknek nevezzük. Azokat az enzimeket, melyek fémiont is tartalmaznak (akár a szerkezeti stabilitáshoz, akár az enzimreakcióhoz szükséges) metalloenzimeknek nevezzük. Az enzimeket az általuk katalizált reakció jellege szerint hat osztályba sorolták, melyek a következők szerint csoportosítják az enzimeket:  Oxidoreduktázok: redox-reakciókat katalizálnak.  Transzferázok: funkciós csoportokat visznek át egyik S-ról a másikra, vagy ugyanazon S egyik csoportjáról a másikra. A foszfotranszferázokat kinázoknak is szokták nevezni. 

Hidrolázok: víz segítségével hasítanak el különböző kötéseket.  Liázok: a katalizált reakció során víz, ammónia, szén-dioxid vagy valamilyen más molekula adódik egy molekulához, vagy vonódik el egy molekulától.  Izomerázok: különböző típusú izomerációkat (cisz-transz, aldóz-ketóz, epimerizáció, stb.) katalizáló enzimek  Ligázok: úgy kapcsolnak össze különböző molekulákat, hogy ehhez egyidejűleg magas energiájú foszfátkötés hasításából származó energia szükséges. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  Reakciósebesség és mérése, enzimaktivitás egységek   A reakciósebesség a kémiai anyagmennyiség időbeli változása. A reakciók időbeli lefolyását kísérletileg minden olyan tulajdonsággal követhetjük, amely a reakció során időben változik, és egyértelműen kapcsolatba hozható a vizsgált

anyag összetételének változásával. Ilyen lehet gázreakcióknál a nyomás, oldatreakcióknál a koncentráció. A reakciósebességet a reakciósebességi-egyenlet felhasználásával számíthatjuk:  k 1  A B  C  D   k 2 v1  k1 [ A][ B]      v 2  k 2 [C ][ D] A katalitikus reakcióban az elérhető maximális reakciósebesség részben az enzim mennyiségétől, részben annak katalitikus képességétől függ. A katalitikus képességet az átviteli szám jellemzi, amely azt mutatja meg, hogy egy Emolekula időegység alatt hány S-molekula átalakulását képes katalizálni. (A MM-modellben ezt a k 3 fejezi ki) Különböző E-ek átviteli száma 0,1 – 106 /sec között van. Az enzimaktivitás mértéke a katal. Akkor 1 kat az enzim aktivitásának mértéke, ha másodpercenként 1 M szubsztrátot alakít át. A katal dimenziója mól/dm3/sec, vagy M/sec. Az enzimdiagnosztikában az enzimaktivitás más mértéke

használatos, eszerint 1 egység (U = unit) = 1 mol átalakított szubsztrát/perc (= mol/min). Az enzimek tisztítása során szokás beszélni az enzim fajlagos aktivitásáról, ami az egységnyi mennyiségű fehérjére eső enzimaktivitást jelenti. Mértékegysége a mol/min/mg fehérje .  Az enzimek hatása a reakció egyensúlyára és az aktivációs energiára       Az enzimek jellemző tulajdonsága, hogy a reakciósebességet növelik, de a reakció egyensúlyát nem befolyásolják. Minden egyensúlyra vezető reakcióra jellemző, hogy a reakció egyszerre két irányban zajlik le, s a reakció abszolút sebességét a két különböző irányú sebesség különbsége határozza meg, s egyben a reakció irányát is kijelöli. Egyensúlyról akkor beszélünk, ha a két irányba mutató reakciósebesség egyenlővé válik. Ekkor ugyanannyi termék alakul vissza kiindulási anyaggá, mint amennyi kiindulási anyag alakul át termékké.

Ha v 1 = v 2 , tehát beállt az egyensúly, felírhatjuk az egyensúlyi állandót: k [C ][ D] K 1  k 2 [ A][ B] Az egyensúlyi állandó nem változik, akár van jelen enzim, akár nincsen. Az enzim az egyensúly elérését gyorsítja. Az enzimek csökkentik a kémiai reakció aktiválási energiáját, így csökkenti azt az időt, ami alatt a rendszer eléri a reakcióhoz szükséges E a -t, tehát a reakció sebessége nő. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK   Ha az enzim aktív helye éppen komplementere a kiindulási anyagnak, akkor nem történik meg a katalitikus reakció, mert az ES-komplex termodinamikailag alacsonyabb energiájú lesz, amihez még több energiát kell befektetni az E a eléréséhez. A S és a P stabil kémiai szerkezete között az átalakuló molekulának (ES) egy ún. tranzíciós állapotba kell kerülnie, melyben átmenetileg mind a

kiindulási szerkezethez, mind a végtermék szerkezetéhez tartozó energiaszintnél magasabb energiaszintet ér el. Ez az átmeneti energiaszint-emelkedés gátja a reakciónak Ha magas az energia, lassú a reakció, mert időegység alatt nagyon kevés molekula éri el az E a -értéket. Az enzim aktív centruma kiegészítője az átmeneti állapot szerkezetének, ezáltal stabilizálni képes a tranzíciós állapotot és így csökkenti az aktiválási energiát.  A hőmérséklet és a pH hatása az enzimaktivitásra       Az enzimekre jellemző tulajdonság, hogy csak meghatározott környezeti feltételek mellett (pH, T, ionerősség, stb.) működnek A hőmérséklet emelése minden kémiai reakció sebességét fokozza, hiszen a Maxwell – Boltzmann féle kinetikai energia-eloszlás szerint egyre több molekula rendelkezik az aktivációs energiához közeli vagy megegyező energiával. A fehérjék azonban -tehát az enzimek is- a fiziológiásnál

magasabb hőmérsékleten denaturálódnak, ezért enzimaktivitásuknak hőmérsékleti optimuma van. A denaturálódási hőmérséklet alatt a hőmérséklet emelése exponenciálisan sokszorosára emeli a reakciósebességet (Arrhenius-egyenlet), ám amikor az enzim hőmérsékleti denaturációt szenved, a reakciósebesség rohamosan zuhan arra a szintre, mely sebesség katalizátor jelenléte nélkül lenne mérhető. Ez az érték nem nulla ugyan, de a katalizált reakciósebességhez képest elhanyagolható. Az enzimek aktivitása egy bizonyos pH-tartományban általában optimumot mutat, de vannak olyan enzimek is, amelyek jól működnek egy meglehetősen széles pH-tartományban, szerkezetük, konformációjuk nem sérül. Az enzimaktivitást a pH-függvényében ábrázolva harang-görbéhez jutunk, mely görbének a maximuma jelöli ki az x-tengelyen azt a pH-tartományt, melyben az enzim aktivitása optimális. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK

BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 18. Az enzim aktív centruma. A szubsztrátkötő és a katalitikus hely Az enzimreakciók specificitása (pl. szerin proteázok)  Az enzim aktív centruma       Az enzimmolekulának azt a részét, amely a működésének (katalízis) központja, aktív centrumnak nevezzük. Az aktív centrum felépítésében az enzimmolekulának csak kis része vesz részt. Azok az aminosavoldalláncok, amelyek az aktív centrum kialakításában vesznek részt, a polipeptidlánc elsődleges szerkezetét jelentő aminosavszekvenciákban gyakran egymástól távol helyezkednek el és csak az enzim harmadlagos szerkezetének kialakulásakor kerülnek egymás közelébe, és alakítják ki azt a pontos, háromdimenziós struktúrát, ami az aktív centrumot jelenti. A legtöbb

enzim aktív helye nem teljesen merev szerkezetű és nem is teljesen preformált. Vannak olyan enzimek, melyek működésükhöz prosztetikus csoportot vesznek segítségül. Ezek kis molekulatömegű, nem polipeptid természetű molekulák, gyakran vitamin természetű anyagok származéka, ami ugyancsak az aktív centrumhoz kötődik. Vannak olyan enzimek is, amelyekben egy fémion is fontos szerepet játszik az aktív hely felépítésében.  A szubsztrátkötő és a katalítikus hely       A szubsztrátok az enzimmolekulának egy speciális régiójához kötődnek, mely régiót szubsztrátkötő helynek nevezünk. A szubsztrátkötő hely az aktív centrum része. A S-kötő helyet alkotó oldalláncok és a S között gyenge, reverzibilis kölcsönhatások sokasága biztosítja a kapcsolódást. A S-kötő hely pontos térbeli kiegészítője a S harmadlagos szerkezetének, amely tény az enzim specificitását is előidézi. A S és a S-kötő hely

oldalláncai közötti kölcsönhatás a S szerkezetében is torzulást okozhat, ami hozzájárulhat a tranzíciós állapot kialakulásához. A S-E kapcsolódásnak két modellje ismeretes. A kulcs – zár modell szerint a Skötő hely térben pontosan meghatározott szerkezete már az enzim szabad állapotában is pontos kiegészítője a S szerkezetének. Az indukált illeszkedés modell azt mondja, hogy a S és a S-kötő helyet alkotó egyes csoportok kölcsönhatása hozza létre a komplementer szerkezetet. Az enzimek szerkezete megengedi, hogy rajtuk több, különféle kötőhely egyszerre, koordináltan funkcionáljon és ezért léteznek olyan enzimek, melyek több reakciót képesek összekapcsolni. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK    A katalitikus hely az aktív centrumnak azon oldalláncait jelenti, melyek részt vesznek a S átalakításának folyamatában. A

katalitikus hely az, ami meghatározza a katalízis mechanizmusát, mely a legtöbb esetben néhány fontos részfolyamaton, illetve azok kombinációin alapul. Ezek közé tartozik a sav-bázis katalízis, a kovalens katalízis, az entrópia effektus.  Az enzimreakciók specificitása        Az enzimek szerkezete olyan mértékben specializálódott molekulával történő kapcsolatra, hogy csak azzal nagyon molekulát képes felismerni. Adott esetben már nagyon kis különbségek (mint diaszterteoizoméria) esetében sem jön létre a kapcsolat. Az ilyen enzimek nagyon specifikusak a szubsztrátjukra nézve. Ugyancsak specifikus az enzim abból a szempontból, enzimmolekula a szubsztrátnak csak bizonyos átalakulását másfajta reakcióhoz egy másik enzim szükséges. egy-egy bizonyos analóg szerkezetű pl. enantioméria, hogy egy adott képes katalizálni, A proteázok azok az enzimek, melyek a fehérjék peptidkötéseinek hidrolítikus

bomlását katalizálják. A peptidkötések bomlása vizes fázisban spontá is irreverzibilisen bekövetkezik (jelentősen exergonikus), de fiziológiás pH- és hőmérsékleti viszonyok között nagyon lassú folyamat, ezért használja a szervezet a proteázokat katalizátorokként ehhez a folyamathoz. A szerin proteázok jellegzetessége, hogy az aktív centrum katalítikus helyét AspHis-Ser alkotja. Az enzim által felismert szubsztrátban az enzim aktív centruma és a peptidkötés szén-, illetve nitrogénatomja között labilis kötés alakul ki, és egy olyan intermedier jön létre, amely víz jelenlétében gyorsan hidrolizál.  A folyamat lépései:  A fiziológiás pH-n disszociált állapotban lévő Asp 102 protont von el a His 57 től, ez viszont a Ser 195 -től von el protont.  Így reaktívvá lett téve a Ser, ami megtámadja a szubsztrátban lévő stabil peptidkötést és a karbonilcsoportot (C=O) tartalmazó töredékkel instabil kovalens kötést

létesít, míg a peptidkötésben részt vevő N oldalához tartozó töredéken szabad NH 2 vég alakul ki és disszociál az enzimről.  A Ser 195 -höz instabil észterkötéssel (O–C=O) csatlakozó töredék hidrolítikus hasítása a leglassúbb mozzanata a reakciónak. Egy vízmolekula megbontja ezt az észterkötést.  Az újonnan kialakuló szabad COOH-tal rendelkező második töredék is szabadon disszociálhat az enzimről.  A vízmolekulából származó proton helyreállítja a katalítikus helyhez tartozó csoportok eredeti állapotát.  Ilyen mechanizmussal működik a kimotripszin a duodenumban. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 19. A koenzimek szerepe az enzimaktivitásban  A koenzim      Az enzimek egy jelentős része katalitikus funkciója betöltéséhez (aktiválódásához) egy koenzimnek nevezett segédmolekulát igényel. A

koenzimek általában hőstabil, kis molekulatömegű anyagok, gyakran olyan molekulák származékai, amelyeket a szervezet csak kis mennyiségben vagy egyáltalán nem tud előállítani, ezért vitaminként a táplálékból vesz fel. Prosztetikus csoportnak nevezzük a koenzimet, ha az az enzimmel nagyon szoros kapcsolatot (kovalens kötést) teremt. Ebben az esetben a kialakuló komplex a holoenzim, míg a koenzimtől megfosztott, inaktív enzim az apoenzim. A prosztetikus csoport és az enzim közötti kapcsolat lehet kovalens és nem kovalens kötés is. Előfordulhat az is, hogy a koenzim az enzimmel laza, asszociációs-disszociációs viszonyban áll, úgy viselkedik, mint egy szubsztrát. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 20. Multienzim komplexek, izoenzimek. Az izoenzimek klinikai jelentősége.  Multienzim komplexek      A fehérjék negyedleges

szerkezetének kialakításán túl egy további szerveződési szintjét eredményezi, hogy bizonyos enzimek, amelyek külön-külön is jól definiált funkciót töltenek be, összekapcsolódhatnak ún. multienzim komplexszé Az élő sejten belül több enzim ilyen multienzim komplex formájában működik. Az egymással szoros kapcsolatban lévő enzimek egymással összefüggő reakciókat, reakciósorokat katalizálhatnak. A kapcsolat lehetővé teszi, hogy az intermedier molekulák, az egyik enzim aktív helyéről közvetlenül a másik enzim aktív helyére kerüljön. A sorban egymást követő első enzim produkuma szubsztrátja a második enzimnek, stb. Ez a felállás azért is kedvező, mert lehetővé teszi, hogy kis mennyiségű intermedier molekula is gyors reakciót hozzon létre. (Nem kell az enzimnek „,megkeresnie” a szubsztrátját. Előfordulhat, hogy nem önálló enzimek kapcsolódnak össze multienzim komplexszé, hanem egyetlen polipeptidlánc rendelkezik

több különböző aktv hellyel.  Izoenzimek   Egy bizonyos élőlényben előforduló, azonos szubsztrát(ok) azonos reakcióját katalizáló, ám elsődleges szerkezetükben különböző enzimeket izoenzimeknek nevezzük. Az izoenzimek különbözhetnek egymástól szabályozásukban, a sejten belüli elhelyezkedésükben, különböző sejtek vagy sejttípusok közti megoszlásukban, a katalizált reakciójuk sebességében, stabilitásukban, stb.  Izoenzimek klinikai jelentősége     Bizonyos szervek, sejttípusok károsodása az intracelluláris enzimek kiáramlásához, ezen enzimek vérplazmai koncentrációjának emelkedéséhez vezet. Léteznek olyan enzimek, vagy egyes enzimek bizonyos szervre jellemző olyan izoenzim változatai, melyek megjelenése, koncentrációjának emelkedése a vérplazmában jól meghatározható jele lehet az adott szerv károsodásának. Más esetekben a betegség lefolyásának menetét lehet figyelemmel kísérni a

vérplazmai izoenzimek szintjének monitorozásával. A klinikai diagnosztikában gyakran használt enzimek a GOT (glutamát-oxálacetáttranszamináz), a GPT (glutamát-piruvát-transzamináz) izoenzimek. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK    Gyakran használnak enzimeket a vérplazmában előforduló és bizonyos betegségeket jellemző vagy előidéző, magas koncentrációt elérő nem fehérje természetű anyagok koncentrációjának meghatározásához (pl. koleszterin, triglicerid). Ezek immobilizált enzimek, melyek valamilyen hordozóhoz vannak rögzítve és a kimutatandó anyaggal egy színes vagy színessé tehető produktum képződését katalizálják. Az enzimkémia és az immunológia együttes alkalmazásának eredménye az ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Ebben az esetbe az enzim, mint indikátor működik. Ag-At reakció létrejöttét, ill

mennyiség viszonyait az első At ellen előállított, és azzal reagáló második At-hez kovalensen kötött enzim által produkált színes, vagy fényeffektust létrehozó termék alapján tudják meghatározni. Felhasználnak enzimeket terápiás célra is. A legismertebb példa erre a véralvadékot oldó proteázok alkalmazása. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 21. A Michaelis – Menten kinetika. A reciprok ábrázolás levezetése, jelentősége.  Nem katalizált és enzim-katalizált reakciók kinetikája        Reakciósebesség (v) alatt az időegység alatt átalakuló S vagy időegység alatt képződő P mennyiségét értjük. A nem katalizált reakciók sebessége a kiindulási anyag(ok) koncentrációjának a függvénye. Enzim katalizálta reakció sebessége sokkal nagyobb, azonban egy adott mennyiségű enzim jelenlétében vizsgálva a

reakciót, a reagáló anyag koncentrációjának emelése egy bizonyos koncentrációtartomány felett már nem okoz észrevehető sebességnövekedést. Azt a koncentráció-szintet, mely felett már nem tapasztalható reakciósebességemelkedés, telítési koncentrációnak nevezzük. Ilyenkor a rendszer megközelítőleg az elérhető maximális reakciósebeséggel (v max ) működik. A maximális sebességet akkor éri el a rendszer, ha minden E-molekula S-t köt, azaz ES-komplex formájában van jelen, nincs több szabad E, minden E-molekula dolgozik. Elméletileg ez csak végtelen nagy [S]-nál következik be, a telítési Skoncentrációnál azonban ez az érték gyakorlatilag megközelíthető A telítési [S]-felett már S-hozzáadás nem növeli a reakciósebességet, a S szempontjából nulladrendűvé vált a reakció, hiszen a reakciósebességet tovább nem befolyásolja a kiindulási anyag koncentrációja. Ha a rendszerben lévő enzim mennyiségét növeljük, ezzel

már tovább növelhetjük a reakció sebességét.  A Michaelis – Menten modell   Az L. Michaelistől és M Mententől származó modell írja le az enzimek által katalizált legegyszerűbb reakció menetét. A modell lényege, hogy a katalizált reakció elkerülhetetlen eleme a specifikus ES-komplex létrejötte. A legegyszerűbb katalizált reakciót a következő egyenlet írja le: k ES 1   ES  E  P k3 (1)   k 2   ES szabad E-ből és szabad S-ból jön létre k 1 sebességi állandóval, mely folyamat reverzibilis. Az ES szét is eshet szabad E-re és szabad S-ra k 2 sebességi állandóval Másrészt viszont P csak az ES-komplexen keresztül keletkezhet, az átalakulás után ES szétesik P-ra és szabad E-re k 3 sebességi állandóval. Ha a reakciónak csak a kezdeti sebességét vizsgáljuk, amikor még [P] elhanyagolható, akkor P visszaalakulásának sebessége nullának tekinthető, és az ES-ből (E + P)-vé

történő átalakulást egyirányúnak tekintehtjük. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK          A modell egyszerű kezelésének kritériumai  A [P] oly kicsiny, hogy a visszaalakulásának sebessége nullának, az ES  E + P reakció egyirányúnak tekinthető.  A [S] nagyságrendekkel nagyobb, mint az [E], így a vizsgált időtartam alatt az eredeti [S] 0 -hoz képest gyakorlatilag elhanyagolható mennyiségű S alakul át. Ilyen körülmények mellett [S] ≈ [S] 0 ([S] 0 -értékét mi állítjuk be) Ha a modell értelmezéséhez szükséges feltételeket betartjuk, akkor a kiválasztott [S] mellett mérhető v-érték a vizsgálat időtartama alatt állandó. A P képződésének sebessége az [ES]-tól függ: v  k 3  ES  (2) Adott teljes enzimkoncentráció mellett [E t ] az E-molekulák egy része szabad Emolekulaként, más

része ES-komplexként van jelen: E t   ES   E  (3) Mint azt már láttuk, a maximális reakciósebességet akkor érjük el, ha a teljes Emennyiség kötött, tehát ES-komplexben van jelen. Ebben az esetben [ES] = [E t ], a maximális sebesség tehát: v max  k 3  E t  (4) A fentiekből belátható, hogy egy tetszőlegesen kiválasztott [S]-nál mérhető reakciósebesség úgy aránylik a lehetséges maximális reakciósebességhez, mint az ennél a [S]-nál kialakuló [ES] aránylik az [E t ]-hez: ES  (5) v  v max E t  Mi határozza meg az [ES] az általunk választott [S] mellett? Az (1) egyenletből látható, hogy [ES] attól függ, hogy a kialakulásának sebessége hogyan viszonylik az elbomlás sebességéhez. Az ES-kialakulni csak egyféle képen tud, ahol v 1 = k 1 [E][S]. Elbomlani azonban kétféle képen tud Vagy szétesik szabad E-re és szabad S-ra k 2 sebességi állandó mellett, vagy átalakul k 3 sebességi

állandóval szabad E-mé és P-má. Az ES-komplex elbomlásának sebessége tehát (k 2 + k 3 )[ES] A reakció megindulása után hamar beáll a stacionárius állapot (steady state), melyre jellemző, hogy ES kialakulásának és elbomlásának sebessége egyenlő: k1  E   S   (k 2  k 3 )  ES  (6) Az egyensúlyi állapotot leíró egyenletből (6) az [ES] komplex koncentrációja kifejezhető:   E   S   (k 2  k 3 )  ES k1 ES   E   S  k 2  k3 k1   k2  k3 összefüggésből adódó érték konstans, ezt Michaelis-konstansnak (K M ) k1 nevezzük. Ezt az alakot ha behelyettesítjük az [ES]-t kifejező egyenletbe, a következőt kapjuk: ES   E   S  (7) KM Ha figyelembe vesszük a (3) egyenletet, akkor a (7) a következő képen módosítható: A BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK

E t   E   S   E    KM Helyettesítsük be [ES] és [E t ] kifejezett értékét az (5) egyenletbe, majd végezzük el a lehetséges egyszerűsítéseket: E  S  KM S  v   S   K M v max E  S   E  Km Ez utóbbi egyenletet átrendezve a Michaelis – Menten-egyenlet szokásos formájához jutunk: v  S   v max S   K M (8) A különböző [S]-nál mérhető reakciósebesség értékét egy derékszögű hiperbola egyenlete írja le. Vizsgáljuk meg azt az esetet, amikor a reakciósebesség éppen a fele a maximális reakciósebességnek, vagyis v = 0,5 v max : S   v max 0,5 v max  S   K M S   K M  2  S  K M  S        A fentiek szerint a K M számértékileg egyenlő azzal a [S]-val, amely mellett egy adott enzimmennyiség az általa elérhető maximális reakciósebesség

felét éri el. A K M definíciója megadható úgy is, hogy az az enzimnek a szubsztráthoz való affinitását mutatja meg. Minél kisebb a K M értéke, annál nagyobb a S-hoz való affinitás. A különböző enzimek K M értéke 10-7 és 10-2 mol/l között van általában és meghatározott körülmények között jellemző az enzim bizonyos szubsztráthoz fűződő viszonyára. Minél kisebb a K M értéke, annál alacsonyabb [S] mellett képes az enzim „dolgozni”. Fiziológiás körülmények között az enzimek általában a K M értékéhez közel álló [S]-nál működnek. A Michaelis – Menten-modell és az ennek segítségével levezetett egyenlet a létező legegyszerűbb E-reakciókra vonatkozik, csupán egyetlen S-ot vesz figyelembe. A legtöbb esetben azonban legalább két S vesz részt e reakcióban, mely reakciókat csak bonyolult módon lehet modellezni. Lehet az ilyen reakció szekvenciális, amikor előbb az egyik, majd a másik S kötődik az enzimhez egy

hármas komplexet képezve és az átalakulás, majd a P-ok disszociációja is csak a hármas komplex kialakulása után történik meg. A szekvenciális reakciók között vannak olyanok, melyekben a S-ok csak meghatározott sorrendben kötődhetnek, és vannak olyanok, melyekben ez véletlenszerű. A ping-pong reakciók közé tartoznak szok, melyekben az első S kötődését és átalakulását követi az első P disszociációja és csak ezután kötődik az E-hez a második S, melynek átalakulása a második P-ot képezi. Ebben a típusban nem alakul ki hármas komplex. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK  A reciprokábrázolás levezetése, jelentősége      Egy enzim K M és v max értékét meghatározhatjuk, ha megmérjük az enzim által katalizált reakció kezdeti sebességét különböző [S]-nál. Ezek meghatározásához a derékszögű hiperbola

egyenletét (Michaelis – Mentenegyenlet) különböző lehetséges módokon transzformálták, így egyenes egyenletté alakították. Ezzel egyszerűbbé és jobban áttekinthetővé vált a K M és a v max értékek számítása. Az ismert linearizálási forma közül a Lineweaver – Burk-féle kettős-reciprok ábrázolást meglehetősen gyakran használják. A reciprok értékekhez úgy jutunk, hogy a Michaelis – Menten-egyenlet mindkét oldalának vesszük a reciprokát: 1 K M  S   v S   v max A lehetséges egyszerűsítések elvégzése után a következőhöz jutunk: 1 KM 1 1    v v max S  v max A fenti egyenlet behelyettesíthető az y = ax + b egyenletbe, tehát a függvény 1 1 lineáris. Ha x = 0, akkor y = . Ha y = 0, akkor x =  . v max v max BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 22. Az enzimek allosztérikus szabályozása. A

foszfofruktokináz szabályozása.  Az enzimek allosztérikus szabályozása           Az enzimek egy igen nagy csoportjára jellemző tulajdonság, hogy az aktív centrumhoz tartozó S-kötőhelyen kívül van még más ligand vagy ligandok számára is kötőhelye. Ezeket az enzimeket allosztérikus enzimeknek nevezzük Ez a kötőhely a S-étól eltérő szerkezetű ligand kötésére alkalmas második (vagy harmadik) kötőhely az enzimmolekula szerkezetének az aktív helyétől jól megkülönböztethető részét foglalja el, amit allosztérikus kötőhelynek nevezünk. Az aktív centrum és az allosztériuks kötőhely közötti funkcionális kapcsolatot az enzim harmadlagos (egyes esetekben negyedleges is) szerkezetének, az enzim konformációjának a változása biztosítja (allosztériuks konformációváltozás), ami akkor következik be, ha a S-kötő helyre vagy az allosztérikus kötőhelyre bekötődik a megfelelő ligand. Az

allosztérikus helyre ún. allosztériuks effektorok kötődhetnek Az allosztérikus effektorok lehetnek aktivátorok vagy inhibitorok. Ha aktivátor kötődik az allosztérikus kötőhelyhez, akkor az enzim szerkezete úgy változik meg, hogy a katalízisre alkalmasabbá válik. Ha inhibitor kötődik, akkor a katalitikus tevékenység gátlódik. Az aktivátornak és az inhibitornak lehet külön-külön allosztériuks kötőhelye, de kötődhetnek ugyanoda is. Az allosztérikus szabályozás fontos jellemzője, hogy az effektorok kötődése ugyanolyan típusú gyenge kölcsönhatásokon alapul, mint a S-é, ezért a folyamat reverzibilis. Az allosztériuks enzimeket két osztályba oszthatjuk:  K-osztály: allosztérikus aktivátor hatására olyan konformációváltozás történik, ami elősegíti a S kötődését, a K M értéke csökken, nő az enzim affinitása a S-hoz.  V-osztály: allosztérikus enzim hatására a katalízisben résztvevő aminosav oldalláncok

legmegfelelőbb orientációt veszik fel, segítve a reakciót, növelve a v max értékét. (k 3 értéke nő) Az allosztérikus inhibitorok is többféle módon fejthetik ki hatásukat. Vannak olyan inhibitorok, melyeknek a kötődése hatására létrehozott vagy stabilizált konformáció nem alkalmas a S kötődésére. Ezzel gyakran együtt jár az is, hogy a S kötődése olyan konformációban stabilizálja az E-t, ami nem teszi lehetővé az inhibitor kötődését. Ha a kétféle ligand kölcsönösen kizárja a másik kötődésének lehetőségét, akkor az allosztérikus inhibitor jelenlétében mérve az enzim aktivitását, kompetitív gátlás kinetikai képét kapjuk (látszólagos kompetitív gátlás). BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK         Az allosztériuks inhibitorok egy másik csoportja nem befolyásolja az E S-kötő képességét,

de olyan konformációváltozást hoz létre, ami erősen csökkenti a reakciósebességet, non-kompetitív kinetikai képet adva. A S-tól eltérő szerkezetű allosztérikus effektorok hatását heterotrop hatásnak nevezzük. Heterotrop hatás létrejöhet egyetlen polipeptidláncból álló allosztérikus enzimeken is. Homotróp hatásról beszélünk, ha egyetlen fajta molekula, enzimek esetén maga a S, képes betölteni az allosztérikus ligand szerepét is. Ennek magyarázata az oligomer enzimek negyedleges szerkezetét érintő konformációváltozás, tehát csak több polipeptidláncból álló oligomer enzimeknél figyelhető meg. Ha egy oligomer enzim egyetlen alegységének S-kötő helyéhez kötődik be egy ligand, az nem csak az érintett alegység, hanem az egész molekula konformációját megváltoztatja. Ezért a ligand az első alegység számára S, míg a többi alegység számára allosztérikus effektor. Homotróp hatás esetén megfigyelhető a

kooperativitás jelensége: az elsőként bekötődő ligand a többi alegység számára allosztérikus aktivátorként müködik, elősegíti a további ligandok kötődését. Ezt a jelenséget pozitív kooperativitásnak is nevezzük. A homotrop kooperatív hatás a Michaelis – Menten-modell által leírt, derékszögű hiperbolának megfelelő telítési görbétől eltérő, jellegzetes szigmoid telítési görbét eredményez. Kis [S] mellett a S kötődésének valószínűsége kicsi Az első bekötődő S azonban úgy változtatja meg az E negyedleges szerkezetét, hogy a következő ligand kötődésének a valószínűsége megnövekszik, a [S] növelésével a telítési görbe meredeken emelkedni kezd. A homotrop kooperatív hatás fiziológiai jelentősége az, hogy a szigmoid telítési görbének megfelelően az enzim valódi működésének tartományát sokkal szűkebb [S]-keretek között tartja, és így a ligand koncentrációjának változásával, sokkal

élesebb működésbeli változásokat hoz létre, mint a Michaelis-egyenlet szerinti szubsztrátkötés. Csökkenő [ligand] esetén sokkal nagyobb mértékben veszíti el ligandját egy ilyen fehérje, mint egy nem allosztérikusan szabályozott, és ennek komoly regulációs jelentősége lehet. Az allosztériuks szabályozás minden formájának elsőrendű szerepe van a sejten belüli anyagcserefolyamatok összehangolásában, a különböző anyagcsereutak sebességének szükség szerinti gyorsításában vagy lassításában.  Enzimek gátlása  A gátlás lehet reverzibilis, amikor az inhibitor molekula gyengén kötődik az enzimhez, és arról könnyedén disszociálni képes, és lehet irreverzibilis, amikor az inhibitor legtöbbször kovalensen kötődik az enzimhez, amelyről ezért csak nagyon lassan, vagy egyáltalán nem disszociál.  Reverzibilis gátlás esetén, ha az inhibitor a szubsztrát enzimhez való kötődését akadályozza, kompetitív

gátlásról beszélünk. Ekkor a szubsztrát és az enzim versenyvben van egymással a szubsztrátkötő-helyért. Mivel inhibitor bekötődése után a szubsztrát már nem képes kötődni, ezért a kompetitív inhibitor csökkenti az ES-komplex kialakulásának valószínűségét adott [S] mellett. Amennyiben azonban a [S]-t növeljük, az ES-komplex kialakul  BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK          A kompetitív inhibitor tehát nem változtatja meg a végtelen [S] mellett kialakuló reakciósebességet (V max ), azonban látszólag növeli a K M -értéket (tehát csökkenti az enzim szubsztrát iránti affinitását). Valódi kompetitív inhibitorok azok a molekulák, melyek szerkezetükben nagyon hasonlítanak a szubsztrátra, és ezért az enzimen a szubsztrátkötő-helyhez képesek kötődni. A kompetitív gátlás kinetikai képét

olyan inhibitorok is kialakíthatják, melyek allosztérikusan kötődnek. Ennek megfelelően a kinetikai kép alapján azt nem lehet megállapítani, hogy az inhibitor hova kötődött az enzimen. Antimetabolitoknak nevezzük az enzimek természetes szubsztrátjára hasonlító gátlószereket, melyek bizonyos anyagcsereutak blokkolásával fejtik ki a hatásukat, és ez a hatás egyes esetekben a gyógyító tevékenységben is felhasználható. A non-kompetitív gátlás esetén az inhibitor az aktív centrum valamely katalízisben részt vevő csoportjához kötődik, tehát a reakciót gátolja. Ezt a fajta gátlást nem lehet felfüggeszteni a [S] emelésével, a gátlás a maximális reakciósebesség, a V max csökkenésével jár (mintha az enzim mennyisége csökkenne), míg a K M változatlan marad. Ezt a fajta gátlást csak az inhibitor eltávolításával lehet felfüggeszteni (pl. intenzív dialízissel). Az unkompetitív gátlás a több szubsztrátos enzimek

bonyolultabb viszonyai között előforduló gátlási forma, mely esetben az inhibitor nem ugyanahhoz az enzimhez kötődik, mint a szubsztrát. Jellegzetessége, hogy mind a V max , mind a K M csökken.  A foszfofruktokináz szabályozása      A foszfofruktokináz a glikolízis reakcióiban játszik fontos szerepet. Mint a neve is mutatja (kináz), foszforilációt végző enzim. A foszfofruktokináz I a fruktóz-6-foszfátot foszforilálja fruktóz-1,6-biszfoszfáttá, mely reakció irreverzibilis. A foszfofruktokináz II a fruktóz-6-foszfátot fruktóz-2,6-biszfoszfáttá alakítja át. A foszforuktokináz I aktivitását több allosztérikus aktivátor és inhibitor szabályozza. A leghatékonyabb aktivátor a fruktóz-2,6-biszfoszfát, az AMP Inhibitor az ATP, amely szubsztrátja is az enzimnek, a citrát és a zsírsavak. A glikolízis sebessége a sejt energiaállapotának megfelelően az ATP, illetve az AMP hatására változik. BIOKÉMIA –

FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK    Az ATP allosztérikusan gátolja a foszforuktokináz I-t, aminek az eredménye lesz a glikolízis lassulása az [ATP] emelkedésével párhuzamosan. Az [ATP]-val ellentétesen változik az [AMP] (éhség-szignál), az AMP pedig allosztérikus aktivátora az enzimnek. Így amikor a sejt energiakészlete fogytán van, csökken az ATP-szint, tehát csökken az allosztérikus gátlás is. Ezzel párhuzamosan emelkedik az AMP-szint, ami allosztérikusan aktiválja a foszfofruktokináz I-t. Ennek eredményeként fokozódik a glikolízis. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 23. Az enzimaktivitás szabályozása kompartmentalizációval, a génexpresszió szabályozásával, proteolítikus aktivitással. (Példák)  Az enzimaktivitás szabályozása

kompartmentalizációval        A kompartmentalizáció azt jelenti, hogy egyes enzimek a sejten belül bizonyos „rekeszekben” helyezkednek el, és e rekeszekben kialakuló lokális [S] határozza meg működésüket. Kompartmentalizációs rekeszeknek tekintjük a multienzim komplexek által létrehozott szerkezetet is, amely akár sejtorganellumon belül, akár a citoszolban is létrejöhet. A kompartemntalizációval történő szabályozás lehetővé teszi az anabolikus (felépítő) és a katabolikus (lebontó) folyamatok térbeli elválasztását a sejten belül. Példa erre, hogy a zsírsavak szintézise a citoplazmában történik, míg lebontása a mitokondriumokban. A szabályozás megvalósulása abban rejlik, hogy az intracelluláris membránok növelik a diffúzió által meghatározott reakciók sebességét. Kísérletes úton bizonyították, hogy ha egy sejten belül a citoszolban egymástól 5 Å távolságra elhelyezünk egy szabad E-t és

S-ját, akkor a pusztán diffúzó szabályozta random mozgás miatt átlagosan 30 percet vett igénybe, míg a két komponens egymásra talál. Ellenben ha az E egy intracelluláris membránhoz rögzül (pl Golgi, ER) és ettől 5 Å távolságra elhelyezünk a citoszolban egy S-t, akkor az egymásra találás átlagosan 20 másodpercet vett igénybe. Mindehhez hozzájárul az is, hogy bizonyos szubsztrátok a membránban jobban mozognak.  Az enzimaktivitás szabályozása a génexpresszió szabályozásával   A génexpressziós szabályozás megvalósulhat transzkripciós és posttranszkripciós (mRNS érése, magból kijutása, féléletideje, fehérjeszintézis szabályozása, stb.) szinten A génexpresszió fokozásával nyílván az enzim koncentrációja növelhető, így a reakciótérben az [ES] is emelkedik, ami a reakciósebesség emelkedéséhez vezet.  Az enzimaktivitás szabályozása proteolítikus aktivitással    Ez a fajta szabályozás a az

enzimek szintézis utáni kovalens módosítással történő szabályozásának egyik példája. A proteolízis limitált, ami azt jelenti, hogy a proteázok jól meghatározott helyen lévő peptidkötések bontását végzik. (Ha a proteolízis teljes lenne, az enzim-fehérje aminosavakra esne szét.) Leggyakrabban a proteázok szabályozása történik így, főleg a szerin-proteázokra jellemző. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK      Ezek az enzimek inaktív proenzim (zimogén) formájában szintetizálódnak, éppen azért, hogy a szintézis helyén még ne tudják kifejteni enzimatikus hatásukat. Aktiválásuk úgy történik, hogy egy másik proteáz molekula limitált proteolízist véges a proenzimen, és az így kialakuló rövidebb, vagy több darabból álló polipeptidlánc tudja kialakítani az aktív enzimre jellemző térszerkezetet. A bélcsatornában

működő enzimek ezetében a már aktiválódott proteázok autokatalízis szerűen is részt vehetnek a limitált proteolízis kivitelezésében, de szükség van az egymást aktiváló proteázok (proteáz-kaszkád) közreműködésére is. A limitált proteolízissel történő aktiválódás irreverzibilis, a fehérje elsődleges szerkezetét változtatja meg. Ha az aktivált enzimre már nincsen szükség, akkor az vagy lebomlik, vagy gátlómolekula kötődik hozzá. A szabályozásra példa a pancreas által termelt kimotripszinogén átalakulása aktív kimotripipszinné.  A duodenumba kerülve aktiválódik.  A tripszin (dudenumban található proteáz) elhasítja a peptidkötést a 15. Arg és a 16. Ile között Így kialakul a π-kimotripszin, ami már rendelkezik proteáz aktivitással.  A π-kimotripszin másik π-kimotripszin molekulát aktivál (autokatalízis) úgy, hogy a 14-15. Ser-Arg és a 147-148 Thr-Asp dipeptideket hasítja ki Kialakul az enzim stabil

formája, az α-kimotripszin. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 24. 5. fejezet Az enzimaktivitás szabályozása reverzibilis kovalens módosítással  Szabályozás reverzibilis kovalens módosítással             Az allosztérikus enzimeknél megismert, többszörös gyenge kölcsönhatáson, azaz pillanatszerű asszociáción-disszociációk alapuló szabályozási mechanizmuson kívül létezik egy másik mechanizmus is, amely magasabbrendű szervezetekben éppen olyan általános és nagy jelentőségű szabályozási rendszer kialakulását teszi lehetővé, mint az allosztérikus szabályozás. Ez a szabályozási mechanizmus a kovalens módosítás. Ez a mechanizmus leggyakrabban az enzim-fehérje foszforilációjándefoszforilációján alapul. Mivel a módosítás kovalens, nem megy végbe önmagától, a kovalens kötés

létrejöttét illetve elbontását katalizáló speciális enzimekre van szükség. A módosítás valamivel több időt igényel, és tartósabb kapcsolódást biztosít, mint az allosztérikus szabályozás. A foszforilációért felelős molekulák a proein-kinázok (transzferázok csoportja), melyek az ATP γ-helyzetű P i -jait viszik át a fehérjére, észterkötés kialakítva az AS-sorrendben pontosan meghatározott helyen lévő szerin/treonin vagy tirozin oldalláncának OH-csoportjával. A bekövetkező foszforiláció módosítani képes a fehérje harmadlagos szerkezetét, és így megváltoztatja annak funkcionális állapotát. Bizonyos enzimek esetében a foszforiláció aktiválólódást, mások esetében gátlást eredményez. A defoszforilációt katalizáló enzimek a protein-foszfatázok (hidrolázok csoportja), a kinázok által létrehozott észterkötést hidrolítikusan bontják, mellyel a kinázok által kiváltott hatás ellenhatását érik el. A

protein-kinázok specifikus enzimek, ami abban mutatkozik meg, hogy milyen enzimet és annak mely pontján foszforilálnak. A foszfatázok szubsztrát-spcificitása kisebb, mint a kinázoké. A kinázok aktiválódása különböző ligandok által indukált allosztérikus szabályozás (pl. cAMP dependens kinázok, Ca2+-kalmodulin dependens kinázok) vagy egy másik kinázzal történő foszforiláció útján megy végbe (foszforilációs kaszkád). A foszforilációs kaszkádok működésének nagy szerepe van az szignáltranszdukcióban. A reverzibilis fehérjefoszforilációnak leggyakrabban az extracelluláris jelre adott sejtválaszok kialakulásában, illetve a sejtproliferáció és differenciálódás szabályozásában van fontos szerepe. Egy másik kovalens módosítás a limitált proteolízis, ám az a folyamat irreverzibilis. (Lásd: 23 tétel) BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK

25. A szerin proteázok működési mechanizmusa  A szerin proteázok működési mechanizmusa    A proteázok azok az enzimek, melyek a fehérjék peptidkötéseinek hidrolítikus bomlását katalizálják. A peptidkötések bomlása vizes fázisban spontá is irreverzibilisen bekövetkezik (jelentősen exergonikus), de fiziológiás pH- és hőmérsékleti viszonyok között nagyon lassú folyamat, ezért használja a szervezet a proteázokat katalizátorokként ehhez a folyamathoz. A szerin proteázok jellegzetessége, hogy az aktív centrum katalítikus helyét AspHis-Ser alkotja. Az enzim által felismert szubsztrátban az enzim aktív centruma és a peptidkötés szén-, illetve nitrogénatomja között labilis kötés alakul ki, és egy olyan intermedier jön létre, amely víz jelenlétében gyorsan hidrolizál.  A folyamat lépései:  A fiziológiás pH-n disszociált állapotban lévő Asp 102 protont von el a His 57 től, ez viszont a Ser 195 -től

von el protont.  Így reaktívvá lett téve a Ser, ami megtámadja a szubsztrátban lévő stabil peptidkötést és a karbonilcsoportot (C=O) tartalmazó töredékkel instabil kovalens kötést létesít, míg a peptidkötésben részt vevő N oldalához tartozó töredéken szabad NH 2 vég alakul ki és disszociál az enzimről.  A Ser 195 -höz instabil észterkötéssel (O–C=O) csatlakozó töredék hidrolítikus hasítása a leglassúbb mozzanata a reakciónak. Egy vízmolekula megbontja ezt az észterkötést.  Az újonnan kialakuló szabad COOH-tal rendelkező második töredék is szabadon disszociálhat az enzimről.  A vízmolekulából származó proton helyreállítja a katalítikus helyhez tartozó csoportok eredeti állapotát.  Ilyen mechanizmussal működik a kimotripszin a duodenumban. BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS

ENZIMEK 26. A metabolikus utak szabályozásának alapelvei. A sebesség-meghatározó lépés megtalálása, termodinamikája.  A metabolikus utak szabályozásának alapelvei    Az allosztérikus szabályozás minden formájának elsőrendű szerepe van a sejten belüli anyagcserefolyamatok összehangolásában, a különböző anyagcsereutak sebességének szükség szerinti gyorsításában vagy lassításában. A különböző anyagcsereutakat katalizáló enzimsorok működésének szabályozása általában az út első specifikus lépését katalizáló enzimmel történik, amely allosztérikus enzim szokott lenni. Ennek az enzimnek az allosztérikus aktivátora vagy inhibitora koncentrációjának változásán keresztül érzékeli, hogy az általa irányított reakciósornak gyorsan, lassan vagy éppen egyáltalán nem kell működnie.  A sebesség-meghatározó

lépés megtalálása, termodinamikája    A K M , a V max és az in vivo [S] ismeretében azonosítani lehet egy metabolikus út sebesség-meghatározó lépését, amely döntő jelentőséggel bír a folyamat fiziológiás szabályozásában és farmakológiai beavatkozások megtervezésében. A metabolikus útban szereplő enzimek maximális aktivitásának összehasonlításával el lehet dönteni egy reakció egyensúlyi vagy nem-egyensúlyi jellegét. A sorban megelőző vagy követő reakcióhoz képest magas V may egyensúlyi reakcióra utal (ΔG≈0), míg alacsony V max nem-egyensúlyira (ΔG<<0). G  G 0  RT ln [termék ] [ subsztrát ] ahol ΔG0’ a standard szabadenergia változása pH=7.0 mellett     A reakció nem-egyensúlyi jellege szükséges, de nem elégséges feltétele a sebességmeghatározó szerepnek. Ha a [S] lényegesen alacsonyabb az enzim K M -értékénél, a [S] ingadozása a katalitikus aktivitás arányos

változásához vezet és így a metabolikus útban az anyagáramlás a rendelkezésre álló szubsztráttól és nem az enzimtől függ. Ezzel szemben a K M -hez képest magas in vivo [S] jelentős változása kis hatást gyakorolna a katalitikus aktivitásra. Így megállapítható, hogy nagy valószínűséggel az a nem-egyensúlyi reakció lesz a sebesség-meghatározó, amely in vivo telítve van szubsztráttal. Ennek megfelelően, mivel az enzim aktivitása függ a pH-tól és a hőmérséklettől, ezért a metabolikus szabályozás is változik izomunkában (pH csökken) vagy lázas állapotban (T emelkedik). BIOKÉMIA – FEHÉRJÉK ÉS ENZIMEK 27. Membrántranszporterek kinetikai tulajdonságai  Membrántranszport kinetikája      A facilitált diffúzió sok szempontból hasonlít az enzimreakciókhoz, bár a folyamatban nem keletkezik új termék. A

transzporter saját ligandjának felismerése specifikus sztereokémiailag is, a transzport kompetitív és non-kompetitív módon egyaránt gátolható. A transzport sebessége ábrázolható a transzportálandó anyag koncentrációjának függvényében, és az összefüggés típusos szaturációs görbét mutat. Megállapítható a V max és a Michaelis-Menten-állandó analógiájára a K t . A transzporterek integráns membránfehérjék, általában több TM régióval, amelyben hidrofil aminosav-oldalláncok hozzák létre azt a csatornát, amelyen az anyagok áthaladnak