Egészségügy | Betegségek » Dr. Lövey József - A daganatok sugárérzékenységének kísérletes és klinikai vizsgálata

A DAGANATOK SUGÁRÉRZÉKENYSÉGÉNEK KÍSÉRLETES ÉS KLINIKAI VIZSGÁLATA dr. Lövey József Témavezető: Prof. Dr Köteles György Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Budapest, 2004 1 Bevezetés A rosszindulatú daganatos betegek mintegy fele részesül sugárkezelésben betegségének lefolyása során [1]. A sugárkezelés fontos szerepet játszhat, mint kuratív gyógymód egyedül, vagy kemoterápiás kezeléssel párhuzamosan, úgy, mint adjuváns kezelés műtét előtt vagy után, végül, de nem utolsó sorban, mint igen hatékony palliatív kezelési módszer. A daganatok sugárérzékenységének és sugárérzékenységük növelésének vizsgálata a daganatellenes kutatás egyik fő irányvonalát képezi. Vizsgálatainkban a daganatok sugárérzékenyítésének és sugárérzékenységének különféle aspektusait vizsgáltuk kísérleti és klinikai körülmények között. A paclitaxel (PTX) hatékony kemoterápiás

szer, melynek sugárérzékenyítő hatását régóta vizsgálják [8,17,18]. Vizsgálataink során tanulmányoztuk a paclitaxel és sugárkezelés kölcsönhatásait humán laphámrák sejtvonalak proliferációjára, klonogén túlélésére, tumorigenitására, metasztatikus potenciáljára. A glioblasztómák motilitása malignitásuk fokával 2 párhuzamosan növekszik [2]. A PTX sugárérzékenyítő hátasát igen korán kimutatták astrocytoma sejtvonalakon [17]. Munkánk során azt vizsgálatuk, milyen hatással van a PTX és a sugárkezelés a humán glioblastoma sejtek motilitására. Az arachidonsav lebontás egyik útja a 12lipoxygenáz (12-LOX) enzimen keresztül vezet Régóta ismert, hogy a 12-LOX fontos szerepet játszik a prosztata daganatok progressziójában, angiogenezisében, valamint túlélési faktorként szerepel a daganatsejteket ért stressz állapotban [9,11-15]. Azt vizsgáltuk, hogy a 12-LOX működésének gátlása milyen módon befolyásolja a

prosztatarák sejtek sugárérzékenységét laboratóriumi körülmények között. A paclitaxelt sugárkezeléssel párhuzamosan többen alkalmazták fej-nyaki daganatok kezelésére [6,16]. Fázis II szintű vizsgálat keretén belül tanulmányoztuk a sugárkezeléssel párhuzamosan alkalmazott alacsony dózisú PTX hatását helyileg előrehaladott fej-nyaki daganatos betegeken. Az angiogenezis elengedhetetlen a daganatok fejlődéséhez [3]. Ennek megfelelően az érdeniztást számos daganat esetében prognosztikus, vagy prediktív tényezőnek tartják [4]. Prospektív tanulmány keretében 3 vizsgáltuk az érdenzitás változását a sugárkezelés hatására. Sugárkezelésben részesülő szájgarat-rákos betegnél a sugárkezelés előtt, valamint 20 Gy dózis leadását követően vett szövettani mintákból különböző patológiai paraméterek valamint az érdenzitás értékét határoztuk meg és vizsgáltuk összefüggésüket a kezelésre adott válasszal,

valamint a progresszió-mentes és teljes túléléssel. 4 2 Célkitűzések 1. A sugárérzékenyítés vizsgálata kísérletes rendszerekben a. A PTX és az ionizáló sugárzás hatása a humán kracinóma sejtvonalak progressziójára in vitro és in vivo b. A PTX és ionizáló sugárzás hatása a glioblasztóma sejtek motilitására c. A 12-lipoxygenáz enzim gátlásának hatása humán prosztatarák sejtvonalak sugárérzékenységére in vitro 2. Sugárkezeléssel párhuzamosan alkalmazott alacsony dózisú PTX klinikai vizsgálata helyileg előrehaladott fej-nyaki daganatos betegeken 3. Az érdenzitás és a sugárkezelés hatására létrejött érdenzitás változás prediktív értékének vizsgálata sugárkezelésben részesült fej-nyaki daganatos betegekben 5 3 Módszerek Kísérletes tanulmányok Az in vitro kísérletek során a sugárzás és paclitaxel kölcsönhatásait A431, KB és ECV306 humán laphámrák sejtvonalakon, illetve glioblastoma

sejtvonalakon vizsgálatuk, s 12-LOX gátlók esetében pedig PC3, LnCAP és DU-145 humán prosztatarák sejtvonalakat használtunk. Az in vivo kísérelteket máj-lép modellen, SCID egerekkel végeztük. Az egerek lépébe előzetesen in vitro kezelt A431 sejteket ültettük be. A laphámrák sejtek esetén 2 Gy dózisú sugárkezelést és rövid idejű, 10 perces paclitaxel kezelést alkalmaztunk 7 és 10 nM koncentrációkban egyedül és egymással kombinálva. A glioblastoma sejteket 0,5-20 Gy közötti sugárdózissal, és 5 és 10 nM koncentrációjú paclitaxellel és a két kezelés kombinációjával kezeltük. A prosztata sejtvonalak vizsgálatakor szelektív 12-LOX gátlókat alkalmaztunk. Baicaleint 3-15 µM koncentrációban, BHPP-t 10-50 µM koncentrációban. A sugárkezelés dózisa 0,25-5 Gy-ig 6 terjedt. A sejtek viabilitását és a proliferációt MTT teszttel, illetve BrDU beépülés mérésével vizsgáltuk. A hosszú távú túlélést standard klonogén

assay-vel tanulmányoztuk. A sejtvázat immuncytokémiai módszerrel ábrázoltuk. A glioblastoma sejtek mozgását speciális videomikroszkópos rendszerrel rögzítettük és mozgásukat matematikailag modelleztük. Sejtciklus analízist propídium-jodid jelöléssel lézer áramlásos citometriával végeztük. Az apoptózist TUNEL reakcióval vizsgálatuk. A sejtciklus szabályozásában és az apoptózisban részt vevő releváns fehérjéket Western blot analízissel mutattuk ki. Klinikai vizsgálatok Alacsony dózisú PTX és sugárkezelés párhuzamos alkalmazása helyileg előrehaladott fej-nyak daganatos betegeknél Helyileg előrehaladott szájüregi vagy szájgarat planocellularis karcinómában szenvedő betegeket vontunk be vizsgálatunkba. 1998-1999 során 26 beteget kezeltünk. A beteg 66 Gy dózisú sugárkezelést kaptak 7 napi 2 Gy frakciókkal, 6 MV energiájú lineáris gyorsító fotonnal. E mellett párhuzamosan megfelelő premedikációt követően heti

három alakommal alkalmanként 2 mg/m2 paclitaxelt kaptak intravénásan. Kontrollcsoportként klinikai jellemzőkben megegyező 30 azonos időszakban kezelt beteget választottunk, akik ugyanolyan sugárkezelésben részesültek, de nem kaptak alacsony dózisú paclitaxelt. A vizsgálat elsődleges végpontja az objektív válasz arány volt, a másodlagos végpontok a teljes és progressziómentes túlélés, valamint a melléhatások voltak. A választ arányt a WHO kritériumok szerint, a mellékhatásokat a NCI-Common Toxicity Cirteria alapján osztályoztuk. A túlélést KaplanMeier módszer segítésével becsültük, az összehasonlítást log rank teszttel végeztük. Az érdenzitás és sugárérzékenység összefüggésének vizsgálata helyileg előrehaladott fejányak daganato betegekben Harmincnégy sugárkezeléssel ellátott lokálisan előrehaladott fej-nyak daganatos beteget vizsgálatunk. A betegtől a sugárkezelést előtt és 20 Gy elérését követően 8

szövettani mintát vettünk. A szövettani mintákban immnuhisztológiai módszerrel, CD34 ellenes antitest és digitális képelemzés segítségével meghatároztuk a mikrovaszkuláris denzitást. Ezt követően a sugárkezelésre létrejött objektív választ arányt, a progressziómentes és teljes túlélést összevettük a sugárkezelés előtti, illetve utáni érdenzitás értékével. A túlélést ismét Kaplan-Meier módszerrel, az összehasonlító vizsgálatot log rank tesz segítségével végeztük. A különböző kliniko-patológiai tényezők és a túlélés összefüggéseinek vizsgálatára egy és többváltozós analízist végeztünk Cox regresszió alkalmazásával. 9 4 Eredmények Eredményeink azt mutatják, hogy a PTX és a besugárzás között jelentős kölcsönhatás észlelhető, mind a humán laphámrák, mind a glioblasztóma sejtek esetén. Mind az alacsony dózisú sugárkezelés, mind a rövid idejű, alacsony dózisú PTX a mikrotubulusok

aggregációját okozza. Egymás után alkalmazva őket azonban egymás hatását felfüggesztik. A rövid idejű PTX kezelés in vivo kísérletben fokozza a metasztatikus potenciált, míg sugárkezeléssel együtt adva a sugárkezelés ezt a hatást felfüggeszti [II,C]. Mind az alacsony dózisú sugárkezelés, mind az alacsony koncentrációban alkalmazott PTX növeli a glioblasztóma sejtek motilitását, míg a két kezelés kombinációja ezt a hatást megfordítja és a motilitást csökkenti [III]. Vizsgálataink alapján a 12-LOX enzim gátlása a prosztata daganatsejtek esetében a sugárzás hatását fokozta. Növelte az apoptotikus sejtek arányát, valamint csökkentette a daganatsejtek klonogén túlélését. Ez a hatás a vizsgált három sejtvonalból kettőben szupraadditív volt [E]. A sugárkezeléssel párhuzamosan 10 alkalmazott alacsony dózisú PTX adagolás könnyen kivitelezhető, költség hatékony és a beteg számára is jó tolerálható

kezelésnek bizonyult helyileg előrehaladott fej-nyaki daganatokban. A kiegészítő kezelések rövidtávon, 2 éves medián követésnél javították az összes túlélést, de ez a hatás 5 éves medián követésnél már nem volt szignifikáns. A paclitaxellel kezelt betegek mellé kontrollként választott betege adatinak elemzésekor azt találtuk, hogy a két kar között sem túlélés, sem mellékhatások szempontjából nincsen statisztikailag szignifikáns eltérés [I,IV,V, A,B,D]. Az utóbbi években végzett állatkísérletek eredményei alapján merült fel, hogy a sugárkezelés elsősorban az endotél sejtek pusztulását okozza, és ez által fejti ki daganatellenes hatását. Szájgarat daganatos betegeinken azt találtuk, hogy azon daganatok esetén, ahol a sugárzás hatására a daganatban az érdenzitás csökken, mind az objektív válasz arány, mind a teljes túlélés szignifikánsan jobbnak bizonyult [F,G]. 11 5 Megbeszélés Vizsgálataink számos

új eredményt hoztak a PTX és sugárkezelés, valamint a két kezelés kölcsönhatásaival kapcsolatban. A meglepő, a várttal ellentétes hatások, mint a PTX metasztázis serkentő hatása, vagy az alacsony dózisú sugárkezelés glioblasztóma motilitást növelő hatása, illetve a két kezelés kölcsönhatása révén létrejött változások, mind fontosak a sugárkezeléssel és PTX-el történő klinikai vizsgálatok tervezésében. A sugárkezelés a prosztaatrák egyik kuratív gyógymódja [7]. A 12-LOX enzim gátló vegyületek ígéretes jelöltek, hogy a későbbiekben klinikai körülmények között is sugárhatás fokozó szerként alkalmazhassuk őket. Első lépésben további in vivo kísérletek elvégzésére van szükség, melyek megerősítő eredménye esetén a hatóanyag fejlesztése megindulhat. Az alacsony dózisú PTX adagolás ígéretesnek tűnik a rossz állapotú fej-nyak daganatos betegek kezelésében. Valódi értékének meghatározásához,

illetve az alacsony dózisú PTX sugárérzékenyítő hatásának bizonyításához randomizált vizsgálatra van szükség. 12 Vizsgálatunkban a sugárkezelés hatására létre jött érdenzitás csökkenés hatékony prediktív faktornak bizonyult a szájgarat daganatos betegeknél. Ez az eredmény klinikai vizsgálat keretében támasztja alá a sugárkezelés, állatkísérletekben kimutatott endotél sejteken keresztül érvényesülő daganatellenes hatását [5]. Mindemellett az alacsony betegszám miatt további klinikai vizsgálatok szükségesek e hatás bizonyításához. 13 6 Az értekezés új megállapításai 1. Az alacsony dózisú besugárzás és az alacsony koncentrációjú paclitaxel kezelés nem várt következményeket okozhat a daganatsejteken, mint például a metasztatikus potenciál növelése, a laphámrák sejteken, vagy a glioblasztóma sejtek motilitásának növelése. A sugárkezelés és a paclitaxel mind serkentőleg, mind gátlólag

tudják egymás hatását befolyásolni, függően alkalmazott dózistól, illetve koncentrációtól. 2. A szelektív 12-LOX gátló vegyületek fokozták a sugárkezelés hatásán in vitro körülmények között. Ezen anyagok a sugárhatás fokozó vegyületek egy új csoportját képezhetik. 3. Az alacsony dózisú paclitaxel klinikai sugárérzékenyítőként szolgálhat rossz általános állapotú előrehaladott fej-nyaki daganatban szenvedő betegeknél. 14 4. Az érrendszer sugárkezelés hatására kialakuló változása a sugárzás hatékonyságának eredményes előrejelzője lehet. A sugárkezelés hatására létrejött alacsony érdenzitás a sugárkezelésre adott válasz és a teljes túlélés prediktora. 15 7 Az értekezés témájában megjelent közlemények Lektorált közlemények I. Lovey J, Koronczay K, Remenar E, Csuka O, Nemeth G. Radiotherapy and concurrent low-dose PTX in locally advanced head and neck cancer. Radiother Oncol 2003;68:1714

(IF:2,87) II. Lovey J, Fazekas K, Ladanyi A, Nemeth G, Timar J. Low-dose irradiation and shortexposure suboptimal-dose PTX adversely modulate metastatic potential of squamous carcinoma cells. Strahlenther Onkol 2003;179:812-8. (IF:2,880) III. Hegedus B, Zach J, Czirok A, Lovey J, Vicsek T. Irradiation and Taxol treatment result in non-monotonous, dose-dependent changes in the motility of glioblasztóma cells. J Neurooncol 2004;67:147-57 (IF:1,416) IV. Lovey J, Koronczay K, Remenar E, Csuka O, Nemeth G. Alacsony dózisú Taxol sugárérzékenyítés helyileg előrehaladott fej- 16 nyaki daganatokban Magy Onkol. 2001;45:201-206. V. Remenar E, Lovey J, Koronczay K, Csuka O, Nemeth G. Komplex onkoterápia eredményei előrehaladott stádiumú fejnyaki laphámrákos betegek Taxolsugárérzékenyítéssel és anélkül végzett primer sugárkezelését követően Magy Onkol. 2001;45:207-244 Hungarian Előadáskivonatok A. Lovey J, Koronczay K, Remenar E, Csuka O, Nemeth G. Low dose PTX

radiosenisitzation in locally advanced head and neck cancer ISRO-ICRO 30.012001-02022001 Radiother Oncol 58(Supp), S97 2001 B. Lovey J, Koronczay K, Remenar E, Csuka O, Nemeth G. Low dose PTX radiosenisitzation in locally advenced head and neck cancer ECCO 11, 21.102001-25102001 Eur J Cancer 37 (Supp6), S106, 2001 C. Lovey J, Fazekas K, Ladanyi A, Nemeth G, Timar J. In vitro / in vivo effects of Taxol on the antitumoral action of irradiation in experimental human tumor model ECCO 11, 21.102001-25102001 Eur J Cancer 37 (Supp6), S130, 2001 17 D. Csuka O, Lovey J, Remenar E, Koronczay K, Doleschall Z, Gaal D, Nemeth G. The effect of Taxol on the radiosenistivity of head and neck cancers. ISRO-ICRO 3001200102022001 Radiother Oncol 58(Supp), S97 2001 E. Lovey J, Timar J, Nie D Inhibition of 12LOX and in vitro radiosenistivity of human prostate cancer cell lines. ESSRB 2004, 24.082004-28082004 F. Lovey J, Lukits J, Remenar E, Koronczay K, Kasler M, Nemeth G, Timar J. Antiangiogenic

effects of radiotherapy predicts survival of inoperable head and neck squamous cell carcinoma. ESSRB 2004, 2408200428082004 G. Lovey J, Lukits J, Remenar E, Kasler M, Nemeth G, Timar J. Antiangiogenic effects of radiotherapy predicts survival of inoperable head and neck squamous cell carcinoma. ESTRO23, 24.102004-28102004 Radiother Oncol 74(Supp1), S153, 2004 Könyvfejezet Lovey J.: Radiosensitization [Sugárérzékenyítés] In: Radiotherapy [Sugárterápia] (ed: Németh G) Springer (2001) 18 8 Irodalom 1. Burnett NG, Benson RJ, Williams MV, Peacock JH. Improving cancer outcomes through radiotherapy. BMJ 2000;320:198-199 2. Chicoine MR, Silbergeld DL: The in vitro motility of human gliomas increases with increasing grade of malignancy. Cancer 75: 2904–2909, 1995 3. Folkman J Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Semin Oncol 2002;29(6 Supl 16):15-18. 4. Fox SB Tumor angiogenesis and prognosis Histopathology 1997;3:294-301. 5. Garcia-Barros M, Paris F,

Cordon-Cardo C, et al Tumor response to raidiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis. Science 2003;300:1155-1159. 6. Kies MS, Haraf DJ, Rosen F, et al Concomitant infusional PTX and fluorouracil, oral hydroxyurea, and hyperfractionated radiation for locally advanced squamous head and neck cancer. J Clin Oncol 2001;19:1961-1969. 7. Klein EA, Kupelian PA Localized prostate cancer: radiation or surgery? Urol Clin North Am 2003;30:305-330. 19 8. Leonard CE, Chan DC, Chou T-C, et al Paclitaxel enhances in vitro radiosensitivity of squamous carcinoma cell lines of the head and neck. Cancer Res 1996; 56:5198-5204 9. Pidgeon GP, Kandouz M, Meram A, Honn KV Mechanisms controlling cell cycle arrest and induction of apoptosis after 12-lipoxygenase inhibition in prostate cancer cells. Cancer Res 2002;62:2721-2727. 10. Schiff PB, Fant J, Horwitz SB Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature 1979;277:665-667. 11. Tang DG, Chen YQ and Honn KV Arachinoid lipoxygenases as

essential regulators of cell survival and apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:5241-5246. 12. Timar J, Bazaz R, Tang DG, Kimler V, Taylor JD, Honn KV. Post-translational regulation of surface integrin expression in tumor cells by 12(S)-HETE. Adv Exp Med Biol 1997;400B:75763 13. Timar J, Chen YQ, Liu B, Bazaz R, Taylor JD, Honn KV. The lipoxygenase metabolite 12(S)HETE promotes alpha IIb beta 3 integrinmediated tumor-cell spreading on fibronectin Int J Cancer 1992;52:594-603. 20 14. Timar J, Raso e, Dome B, et al Expression, subcellular localization and putative function of platelet-type 12-lipoxygenase in human prostate cancer cell lines of differenct metastatic potential. Int J Cancer 2000;87:37-43. 15. Timar J, Silletti S, Bazaz R, Raz A, Honn KV Regulation of melanoma-cell motility by the lipoxygenase metabolite 12-(S)-HETE. Int J Cancer 1993; 55:1003-10. 16. Tishler RB, Busse PM, Norris CM, et al An initial experience using concurrent PTX and radiation in the treatment

of head and neck malignancies. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1999;43:1001-1008. 17. Tishler RB, Geard CR, Hall EJ, et al Taxol sensitizes human astrocytoma cells to radiation. Cancer Res 1992;52:3495-3497. 18. Tishler RB, Schiff PB, Geard CR, et al Taxol: A novel radiation sensitizer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1992;22:613-617. 21